JP2020511145A - 改良されたｌｉワクチンアジュバント - Google Patents

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Abstract

本発明は、核酸構築物を含むワクチン、例えば、DNA構築物を含むワクチン、特に、抗原性タンパク質またはペプチドをコードする配列に機能的に連結された不変鎖をコードする配列を含む核酸構築物を含むワクチンに関する。このワクチンは免疫応答の増強を刺激する。【選択図】なし

Description

本発明は、免疫応答の刺激を改善するための方法に関する。
免疫学、特にワクチン技術に関する免疫学における現在の知見にもかかわらず、多数の病原体に対して、適切なワクチンが利用可能でない。HIV（ヒト免疫不全ウイルス）、HTLV（ヒトTリンパ球向性ウイルス）、結核およびHCV（C型肝炎ウイルス）の広範な大流行は、依然として、有効なワクチン接種の手の届かないところにあり、一方、エボラおよび他の新興病原体は、我々の医療制度を圧倒する脅威を与えている。同様に、世界中のテロ行為の増加は、潜在的な伝染病を、ラッサおよびマールブルグのような致死的病原体を含むように拡張させている。
ワクチンは予防用（それは、実際の感染が生じる前に投与される）または治療用（この場合、それは、既に体内に存在する病原体に対する免疫応答を惹起または促進する）でありうる。どちらのワクチン接種方法も、確固たる免疫応答の確立を要する。感染またはワクチン接種により活性化される免疫応答はT細胞、B細胞および抗原提示細胞のような幾つかの細胞型ならびに幾つかの異なる分子、主に抗原、MHC分子、T細胞受容体、B細胞受容体およびその他多数の相互作用に基づく。
抗原は、MHC分子により抗原提示細胞の表面上で提示されるペプチド断片を含む。抗原は外来性（すなわち、病原体由来）でありうる、またはその生物自体（いわゆる、自己抗原）に由来しうる。MHC分子は、「主要組織適合複合体」（以下、MHCと称する）として公知の特定の染色体領域によりコードされる多型遺伝子ファミリーを代表するものである。MHC分子の2つのクラス、すなわち、MHCクラスI（MHC-I）およびMHCクラスII（MHC-II）が存在する。
ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞の表面上に存在するMHCクラスII（MHC-II）分子により提示された抗原により刺激される。MHC-II分子は小胞体内で合成される。合成中、それらは、MHC-II分子が自己抗原でローディングされるのを妨げる様態で、不変鎖（li）と合体する。MHC-II分子および不変鎖は特定の細胞内区画における細胞表面へシグナル配列により輸送される。該区画がその内容物のプロセシングにより成熟するにつれて、それはリソソームから後期エンドソーム（エンドサイトーシス小胞との融合の後）へ、そしてMHCクラス区画（MIIC）へと進行する。エンドサイトーシス小胞は外来抗原、例えば、タンパク質分解切断細菌ペプチド断片を含有する。これらの断片は、それらの分解により、MHC-II分子上にローディングされるように準備される。MHC-II分子は、2つの部分のプロセスにおいて、不変鎖により遊離される。該プロセスにおいては、まず、不変鎖がタンパク質分解されて、MHC-II結合ドメインにおいて、CLIPと称されるペプチドのみが残り、次にHLA-DM分子によりCLIPが除去される。ついで、MHC-II分子は外来抗原と自由に結合し、形質膜とのMIIC小胞の融合の後、これらを細胞表面上に提示する。これは体液性免疫応答を開始させる。このとき、提示された抗原はヘルパーT細胞の活性化を刺激し、これが今度は幾つかの手段によりB細胞を刺激し、これは最終的に抗体分泌細胞に分化する。
プロフェッショナル抗原提示細胞または活性化組織常在細胞が細胞内オルガネラ由来の抗原をMHCクラスII上に提示すると、ヘルパーT細胞は細胞免疫反応にも関与しうる。このように、CD4+ T細胞は、サイトカインおよびケモカインを分泌することにより炎症を調整し、抗原提示細胞に刺激を与える。
抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合した抗原をT細胞傷害性細胞のT細胞受容体が認識すると、細胞性免疫応答の重要なエフェクターメカニズムが始動される。MHC-I分子は、典型的には、MHC-IIと結合する不変鎖のような機能性分子とは結合しない。更に、小胞体内に既に存在する抗原がMHC-I分子にローディングされる点で、抗原提示分子へのMHC-IのプロセシングはMHC-II分子の場合と異なる。MHC-I分子により提示される抗原は、典型的には、抗原提示細胞自体により合成されたタンパク質の、プロテアソームにより切断されたペプチド断片である。これらのタンパク質は、細胞自身のDNAによりコードされる異常タンパク質、または該細胞に感染したウイルスもしくは他の病原体に由来するタンパク質でありうる。この原則の例外は抗原提示細胞の特殊なサブセットに存在する。これらの細胞は細胞外抗原を取り込み、それらをMHCクラスI上に提示して、細胞傷害性Tリンパ球応答を刺激する。この細胞サブセットにおいては、MHCクラスI分子はMHCクラスII結合不変鎖によっても結合される。MHCクラスI関連タンパク質分解系は実質的に全ての細胞に存在する。
それらの2つのタイプのT細胞の機能は、それらの名称により示唆されるとおり、有意に異なる。細胞傷害性T細胞は、細胞の直接溶解により、およびγ-インターフェロンのようなサイトカインを分泌することにより、細胞内病原体および腫瘍を根絶する。主な細胞傷害性T細胞はCD8+ T細胞であり、これは抗原特異的でもある。ヘルパーT細胞も細胞を溶解しうるが、その主な機能は、B細胞（抗体産生細胞）、抗原提示細胞および他のT細胞の活性を促進するサイトカインおよびケモカインを分泌することであり、したがって、抗体媒介性および細胞傷害性T細胞媒介性応答メカニズムを含む、外来抗原に対する免疫応答を広範に増強する。CD4+ T細胞は免疫応答における主要ヘルパーT細胞表現型である。
伝統的なワクチンは、死滅した病原性株または弱毒化病原性を有する株のいずれかである生物全体に基づいている。弱毒化が不十分な場合またはワクチン製造中の死滅工程で多数の生物が生存した場合、これらのワクチンは、それらが予防を意図する疾患を誘い込むリスクを有する。更に、そのようなワクチンは感染力の低下を示し、しばしば、不十分な免疫原性を有していて、ワクチン接種による防御は不十分である。
病原生物からの個々の抗原性タンパク質に基づく新規ワクチンを開発するために、分子生物学的技術が用いられている。概念的には、生物全体ではなく抗原性ペプチドを使用すると、病原性が回避される一方で、最も免疫原性である抗原を含有するワクチンが得られる。しかし、与えられたタンパク質またはポリペプチドの最適な抗原を選択することは困難であることが判明しており、更に、純粋なペプチドまたは炭水化物は弱い免疫原である傾向があることが判明している。
遺伝的（DNAまたはRNA）ワクチンは予防用ワクチンおよび治療用ワクチンの両方の開発のための新しく有望な候補である。結果的に生じる免疫応答の強度はベクター（すなわち、裸DNA、ウイルスベクター、生弱毒化ウイルスなど）の効力、抗原の発現レベルおよび組換え抗原自体（すなわち、高い又は低いアフィニティのMHC結合体、多少なりとも限定されたTまたはB細胞レパートリーに関して選択される構造的決定因子など）の組合せにより決定される。一般に、免疫記憶の効率的な誘導は、免疫記憶の効果の多数をもたらすCD8+（細胞傷害性）T細胞およびB細胞とのCD4+（ヘルパー細胞）T細胞の相互作用を要し、または該相互作用から利益を得ることは間違いないと考えられている。しかし、ウイルスベクターワクチンと比較した場合の通常のDNAワクチンの潜在的欠点の1つはヒトにおけるそれらの低い免疫原性である。この低い免疫原性の、考えられうる1つの原因は、抗原プロセシングおよびヘルパーT細胞への提示のためのMHC II経路への細胞内生成抗原のアクセスの制限、ならびにプロフェッショナル抗原提示細胞上の産生抗原量である。
いくつかの特定の実施形態においては、本発明は、免疫応答の、改善された刺激を提供し、ある実施形態においてはまた、それが生じる様態は該応答の動態を増強し、同時に、該応答を拡張および／または改善し、一方、幾つかの実施形態においては、とりわけ、最新技術において記載されているワクチン接種方法の前記欠点を回避する。特に、指向性のある、特異的な及び迅速な免疫系刺激のための新規系が、全ての動物のワクチン接種を改善するために、本発明により利用可能となった。
不変鎖への抗原の融合により達成される抗ウイルスCD4+およびCD8+ T細胞応答が、不変鎖内にプロテアーゼ切断部位を導入することにより更に改善されることが、本発明により見出された。また、驚くべきことに、プロテアーゼによる融合タンパク質の切断に際して、該分子の他の免疫刺激特性に対する実質的な悪影響を伴うことなく、融合タンパク質が細胞外間隙内に分泌されることが判明した。したがって、本発明の構築物は、バランスの取れた免疫応答をもたらす。
配列の説明
配列番号1：ヒト不変鎖アイソフォームp35のアミノ酸配列。
配列番号2：ヒト不変鎖アイソフォームp35をコードするヌクレオチド配列。
配列番号3：ヒト不変鎖アイソフォームp33のアミノ酸配列。
配列番号4：ヒト不変鎖アイソフォームp43のアミノ酸配列。
配列番号5：ヒト不変鎖アイソフォームp43をコードするヌクレオチド配列。
配列番号6：ヒト不変鎖アイソフォームp41のアミノ酸配列。
配列番号7：ヒト不変鎖アイソフォームcのアミノ酸配列。
配列番号8：ヒト不変鎖アイソフォームcをコードするヌクレオチド配列。
配列番号9：マウス不変鎖p31のアミノ酸配列。
配列番号10：マウス不変鎖p31をコードするヌクレオチド配列。
配列番号11：マウス不変鎖p41のアミノ酸配列。
配列番号12：マウス不変鎖p41をコードするヌクレオチド配列。
配列番号13：Cavia porcellus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号H0UZ94）。
配列番号14：Heterocephalus glaber不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G5C391）。
配列番号15：Fukomys damarensis不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号A0A091E9W3）。
配列番号16：Rattus norvegicus第2アイソフォーム不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号P10247-2）。
配列番号17：Rattus norvegicus第1アイソフォーム不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号P10247）。
配列番号18：Myotis lucifugus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G1QEN4）。
配列番号19：Myotis davidii不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号L5LQM9）。
配列番号20：Myotis brandtii不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号S7N2W2）。
配列番号21：Pteropus alecto不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号L5L1G3）。
配列番号22：Pan troglodytes verus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号A5A6L4）。
配列番号23：Pongo abelii不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号Q5RFJ4）。
配列番号24：Pan troglodytes不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号H2QRT2）。
配列番号25：Gorilla gorilla gorilla不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G3R7S6）。
配列番号26：Nomascus leucogenys不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G1RHB8）。
配列番号27：Macaca mulatta不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号I0FWR3）。
配列番号28：Macaca fascicularis不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G7P8P8）。
配列番号29：Macaca mulatta不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G7MVM5）。
配列番号30：Macaca mulatta不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号I0FWR4）。
配列番号31：Macaca mulatta不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号F7E9S4）。
配列番号32：Papio anubis不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号A0A096MM48）。
配列番号33：Chlorocebus sabaeus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号A0A0D9RGK4）。
配列番号34：Callithrix jacchus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号F7ENM4）。
配列番号35：Felis catus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号M3VXS2）。
配列番号36：Mustela putorius furo不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号M3YQS4）。
配列番号37：Loxodonta africana不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G3TJE1）。
配列番号38：Loxodonta africana不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G3U7Y6）。
配列番号39：Sus scrofa不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号Q764N1）。
配列番号40：Camelus ferus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号S9XLT6）。
配列番号41：Bos mutus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号L8I7V9）。
配列番号42：Bos taurus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号Q7JFY1）。
配列番号43：Bos taurus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号Q29630）。
配列番号44：Equus caballus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号F6TGS3）。
配列番号45：Equus caballus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号Q9MXD5）。
配列番号46：Oryctolagus cuniculus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G1SKK3）。
配列番号47：Otolemur garnettii不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号H0WQB3）。
配列番号48：Tupaia chinensis不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号L9KN01）。
配列番号49：Ictidomys tridecemlineatus不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号I3MCR9）。
配列番号50：Sarcophilus harrisii不変鎖のアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号G3X0Q6）。
配列番号51：resリンカーのアミノ酸配列。
配列番号52：resリンカーをコードするヌクレオチド配列。
配列番号53：HAタグのアミノ酸配列。
配列番号54：HAタグをコードするヌクレオチド配列。
配列番号55：li/fur/Intをコードするヌクレオチド配列。
配列番号56：li/fur/Intのアミノ酸配列。
配列番号57：例示的なフューリン切断部位。
配列番号58：SP-albをコードするヌクレオチド配列。
配列番号59：SP-albのアミノ酸配列。
配列番号60：SP-alb-19-30をコードするヌクレオチド配列。
配列番号61：SP-Alb-19-30のアミノ酸配列。
配列番号62：li-19-30をコードするヌクレオチド配列。
配列番号63：li-19-30のアミノ酸配列。
配列番号64：li-fur-19-30をコードするヌクレオチド配列。
配列番号65：li-fur-19-30のアミノ酸配列。
配列番号66：OVA257-264（SIINFEKL）ペプチド配列。
配列番号67：黒色腫関連レトロウイルスp15Eタンパク質のペプチド。
配列番号68：ポリヌクレオチド配列をコードするIT4var19抗原。
配列番号69：ポリヌクレオチド配列をコードするPFLCINvar30抗原。
種々のアジュバントの存在下のOVA抗原のMHCI発現の分析 - 種々のhAd5-OVA構築物による感染の後のJAWSII細胞の表面上のOVAのMHCI提示。 種々のアジュバントの存在下のOVA抗原のMHCI発現の分析 - hAd5-IT4var19-PFCLINvar30構築物での右足蹠における免疫化の後のT細胞リクルートメントを表す足蹠腫脹測定。 種々のアジュバントの存在下のOVA抗原のMHCII発現の分析。この図は、MHCII-OVAに特異的なT細胞により認識される、種々のhAd5-OVA構築物に感染したJAWSII細胞の表面上のOVAのMHCII提示を表すIL-2レベルを示す。 図4Aおよび4B：コード化抗原IT4var19およびPFClinvar30の発現の分析。（A）は、種々のhAd5-IT4var19-PFCLINvar30ウイルスにより感染したVERO細胞のSN（上清）でのウエスタンブロットによるPFCLINvar30の特定を示す。VERO細胞に50MOI/細胞で感染させ、48時間後にSNを回収した。（B）は、hAd5-IT4var19-PFCLINvar30によるCOS7細胞の感染の後の、上清中の変性条件および非変性条件でのウエスタンブロットによるPFCLINvar30の特定を示す。 図5A〜5D：コード化抗原IT4var19およびPFClinvar30の発現の分析。これらのグラフは、hAd5-IT4var19-PFCLINvar30によるCOS7細胞の感染の後の、上清または細胞ライセート中の発現タンパク質によるEPCRへの結合の分析を示す。 図５Ａの続きである。 図５Ａの続きである。 図５Ａの続きである。 図6A〜6F：対照と比較した場合の、li-furアジュバントの存在下のhAd5の後で誘導されたIT4var19およびPFCLINvar30に対する抗体応答のタイムライン。（A）および（B）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp- alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）（血清を1:50に希釈した）でのBalb/Cマウスの免疫化の（A）2週間後または（B）6週間後の、IT4var19を認識する抗体の検出を示す。（C）および（E）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのBalb/Cマウスの免疫化の10週間後の、IT4var19を認識する抗体の検出を示す。血清を1:50に希釈し、3倍希釈でウェルに加えた。吸光度および希釈度をlog（X）軸上にプロットし（E）、曲線下面積を計算し、（C）上にプロットした。（D）および（F）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのBalb/Cマウスの免疫化の10週間後の、PFCLINvar30を認識する抗体の検出を示す。血清を1:50に希釈し、3倍希釈でウェルに加えた。吸光度および希釈度をlog（X）軸上にプロットし（F）、曲線下面積を計算し、（D）上にプロットした。 図６Ａの続きである。 図６Ａの続きである。 図６Ａの続きである。 図６Ａの続きである。 図６Ａの続きである。 図7A〜7D：対照と比較した場合の、li-furアジュバントの比較のためのhAd5ワクチン接種の後で誘導されたIT4var19およびPFCLINvar30に対する抗体。（A）および（C）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-Cterm-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-d17-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのBalb/Cマウスの免疫化の10週間後の、IT4var19を認識する抗体の検出を示す。血清を1:5に希釈し、2倍希釈でウェルに加えた。吸光度および希釈度をlog（X）軸上にプロットし（C）、曲線下面積を計算し、（A）上にプロットした。（B）および（D）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-Cterm-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Δ17-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのBalb/Cマウスの免疫化の10週間後の、PFCLINvar30を認識する抗体の検出を示す。血清を1:5に希釈し、2倍希釈でウェルに加えた。吸光度および希釈度をlog（X）軸上にプロットし（D）、曲線下面積を計算し、（C）上にプロットした。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 図７Ａの続きである。 図8A〜8B：liアジュバントの比較のためのAd5ワクチン接種後のIT4var19およびPFCLINvar30に対する阻害抗体の測定。（A）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）（血清を1:50に希釈した）でのBalb/Cマウスの免疫化の後の、第10週の血清からのEPCRへのIT4var19の結合を阻害する抗体の検出を示す。（B）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのBalb/Cマウスの免疫化の後の、第10週の血清からのEPCRへのPFCLINvar30の結合を阻害する抗体の検出を示す。血清を1:50に希釈した。 図9A〜9E：Ad5ワクチン接種後に誘導された交差反応性抗体の特定。（A）Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、（B）Ad5-SP-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、（C）Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、（D）Ad5-li-Cterm-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、（E）Ad5-d17-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのワクチン接種の10週間後のBalb/cマウスの血清において、マルチプレックス（multiplex）により交差反応性抗体を検出した。血清を1:50に希釈し、種々のCIDR（システイン・リッチ・ドメイン間領域）タンパク質でコーティングされたビーズと共にインキュベートし、ついでビーズへの結合を発光により検出した。 図９Ａの続きである。 図９Ａの続きである。 図９Ａの続きである。 図９Ａの続きである。 図10A〜10D：C57BL/6マウスにおいて対照と比較した場合の、li-furアジュバントの存在下のhAd5の後で誘導されたIT4var19およびpFLCINvar30に対する抗体応答のタイムライン。（A）、（B）および（C）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのC57BL/6マウスの免疫化の（A）2週間後、（B）6週間後または（C）10週間後の、IT4var19を認識する抗体の検出を示す。（D）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのC57BL/6マウスの免疫化の10週間後の、PFCLINvar30を認識する抗体の検出を示す。血清を1:50に希釈した。 図１０−１の続きである。 図11A〜11B：C57BL/6マウスにおいて対照と比較した場合の、li-furアジュバントの存在下のhAd5の後のIT4var19およびpFLCINvar30に対する阻害抗体。（A）および（B）は、Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-Sp-alb-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）、Ad5-li-IT4var19-PFCLINvar30（N=5）でのC57BL/6マウスの免疫化の後の、第10週の血清からのEPCRへの（A）IT4var19または（B）PFCLINvar30の結合を阻害する抗体の検出を示す。血清を1:50に希釈した。 図12A〜12C：Ad5免疫化後のMelARV癌に対する抗体応答の分析。（A）は、Ad5-li-fur-p15E（N=5）またはAd5-li-fur-p15E（N=5）での免疫化および2×105個のB16F10gp細胞でのチャレンジの後で計数された肺転移の数を示す。（B）および（C）は、Ad5-li-fur-p15E（N=5）またはAd5-li-fur-p15E（N=5）でのC57BL/6の免疫化の90日後の、p15Eタンパク質を認識する抗体の検出を示す。血清を1:25に希釈し、2倍希釈でウェルに加えた。吸光度および希釈度をlog（X）軸にプロットし（B）、曲線下面積を計算し、（C）上にプロットした。 図１２−１の続きである。 不変鎖のドメインの図示。 種々の抗原の分泌および形態。 阻害アッセイによるCIDR検出の図示。（1）血清およびCIDRタンパク質を予め混合する。コンホメーションCIDRを認識する抗体がタンパク質に結合する。（2）プレートをEPCR（CIDRの天然リガンド）でコーティングする。（3）血清-CIDR混合物をプレートに添加する。血清からの抗体に結合したCIDRはその天然リガンドに結合できず、洗い落される。抗体に結合していないCIDRはEPCRに結合し、洗い落されない。（4）CIDR上のタグを認識する二次抗体を添加する。 ・シグナル無し = CIDRのその天然リガンドへの結合は抗体により阻害された。 ・蛍光シグナル = 抗体はCIDRのその天然リガンドへの結合を阻害することができなかった。 マウスp31 li（上配列）およびヒトp33 li（下配列）のアライメント。 不変鎖OVA連結構築物からの細胞上清に対するELISAの結果。 図18〜20：MHCII分子と相互作用する不変鎖およびモデルメカニズムの図示。膜に結合したli-Agはエンドソーム内に再び取り込まれて、CD4+ T細胞を活性化する。 図18〜20：MHCII分子と相互作用する不変鎖およびモデルメカニズムの図示。膜に結合したli-Agはエンドソーム内に再び取り込まれて、CD4+ T細胞を活性化する。 図18〜20：MHCII分子と相互作用する不変鎖およびモデルメカニズムの図示。膜に結合したli-Agはエンドソーム内に再び取り込まれて、CD4+ T細胞を活性化する。 図21A〜21B：実施例において使用された種々のAd5構築物の図示。（A）は、設計された5つのhAd5ベクターを示し、これらは全て、IT4var19-PFCLINvar30（CIDR1.1）および異なる形態の不変鎖-フューリンまたは分泌シグナルをコードしている。挿入抗原はヒトCMVプロモーター（huCMV）およびシミアンウイルス40（SV40）ポリアデニル化シグナルと隣接していた。（B）は、設計された5つのhAd5ベクターを示し、これらは全て、chOVAおよび異なる形態の不変鎖-フューリンをコードしている。挿入抗原はヒトCMVプロモーター（huCMV）およびシミアンウイルス40（SV40）ポリアデニル化シグナルと隣接していた。
発明の詳細な説明
本発明は、核酸構築物を含むワクチン、例えば、DNA構築物を含むワクチン、特に、抗原性タンパク質またはペプチドに機能的に連結された不変鎖をコードする配列を含む核酸構築物を含むワクチンであって、プロテアーゼの切断部位が該不変鎖内に導入されている、ワクチンに関する。
第1の態様においては、本発明は、
a．少なくとも1つの不変鎖またはその変異体、およびこれに機能的に連結された
b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
をコードする配列を含む核酸構築物であって、
・該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
・該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により（場合により）、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、核酸構築物に関する。
もう1つの態様においては、本発明は、免疫応答の刺激における使用のための、本明細書に記載されている核酸構築物に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、免疫応答の刺激により後続投与ワクチンまたは同時投与ワクチンの効力を増強するためのプライマーとしての使用のための、本明細書に記載されている核酸構築物に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、免疫応答の増強によりプライマー投与ワクチンの効力を増強する際の使用のための、本明細書に記載されている核酸構築物に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、
a．少なくとも1つの不変鎖またはその変異体、およびこれに機能的に連結された
b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
を含むキメラタンパク質であって、
・該不変鎖またはその変異体のC末端の部分が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
・該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、キメラタンパク質に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている核酸構築物を含む送達ビヒクルに関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている送達ビヒクルを個体に投与するための方法であって、該投与が、針注射、遺伝子銃、ジェット注射、エレクトロポレーション、超音波および流体力学的送達からなる群から選択される、方法に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている核酸構築物を個体に投与するための方法であって、該投与が、針注射、遺伝子銃、ジェット注射、エレクトロポレーション、超音波および流体力学的送達からなる群から選択される方法に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている核酸構築物を含む細胞に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているキメラタンパク質を認識しうる抗体に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている抗体の使用であって、該抗体が結合するタンパク質を検出するためのアッセイにおける使用に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、
a．少なくとも1つの不変鎖またはその変異体、および
b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
をコードする核酸配列を含む組成物であって、
・該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
・該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、組成物に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、医薬としての使用のための、
a．少なくとも1つの不変鎖またはその変異体、および
b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
をコードする核酸配列を含む組成物であって、
・該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
・該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、組成物に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載されている送達ビヒクルを含むワクチン組成物に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、医薬の製造における、本明細書に記載されている送達ビヒクルを含む組成物の使用に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、ワクチンの製造における使用のための、本明細書に記載されている送達ビヒクルに関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、
c．少なくとも1つの不変鎖、およびこれに機能的に連結された
d．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
をコードする配列を含む核酸構築物を含むウイルスベクターであって、
・該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
・該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、ウイルスベクターに関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、
e．配列番号1〜8のいずれか1つの少なくとも1つの不変鎖、およびこれに機能的に連結された
f．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
をコードする配列を含む核酸構築物を含むアデノウイルスベクターであって、
・該不変鎖のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
・該不変鎖がフューリン切断部位と、該プロテアーゼ切断部位のC末端および該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインとを含む、アデノウイルスベクターに関する。
更にもう1つの態様においては、本発明はパーツキット（kit in parts）であって、
a．本明細書に記載されている核酸構築物を含む組成物、
b．該組成物を投与するための医学的装置または他の手段、および
c．該パーツキットの使用説明
を含むパーツキットに関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているワクチン組成物を動物に投与することを含む、動物における免疫応答を誘導するための方法に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、
・本明細書に記載されている核酸構築物を製造する工程、
・該核酸構築物を個体に投与する工程
を含む、遺伝的免疫化のための方法に関する。
更にもう1つの態様においては、本発明は、
a．本明細書に記載されている核酸構築物、または本明細書に記載されている組成物を準備する工程、
b．工程a）の核酸構築物または組成物を個体に投与し、それにより、個体における免疫応答を刺激することにより、個体の免疫系を初回刺激（プライミング）する工程
を含む、ワクチンの効力を増強するための方法に関する。
定義
アデノウイルス：二本鎖DNA含有ウイルスの一群。アデノウイルスを遺伝的に修飾して、それを複製不能または条件付き複製不能にすることが可能である。この形態で、アデノウイルス構築物またはアデノベクターとして、それらはワクチン接種または遺伝子治療のための遺伝子送達ビヒクルとして使用されうる。
アジュバント：投与される免疫原性決定因子／抗原／核酸構築物と混合されることにより、該決定因子に対する免疫応答を増強または改善する任意の物質。
アミノ酸：インビボで合成されるタンパク質および酵素を含む（したがってアミノ酸の修飾を含む）ペプチドやポリペプチドに存在する任意のアミノ酸を含む任意の合成または天然アミノカルボン酸。本明細書においては、アミノ酸なる語は「アミノ酸残基」なる語と同義で用いられ、少なくとも1つの他の種（例えば、2つ、例えば3つ、例えば4つ以上の他の種）と反応した、示されているアミノ酸を包含する意である。アミノ酸なる一般用語は天然アミノ酸および非天然アミノ酸の両方を含み、これらはいずれも、「D」または「L」異性体でありうる。典型的には、この語は、20種類の一般的に見いだされる天然アミノ酸のいずれかを意味する。
抗体：免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の活性部分。抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン分子、または免疫活性を保有するそのフラグメントである。
抗原：クローン的に分布した免疫受容体（T細胞またはB細胞受容体）に結合しうる任意の物質。通常、ペプチド、ポリペプチドまたは多量体ポリペプチド。抗原は、好ましくは、免疫応答を惹起しうる。
追加刺激（ブースト；追加免疫刺激）：ブースター注射または投与により追加刺激することは、同一物質の過去の投与により惹起された免疫応答を維持するために、初回投与後の或る時点で投与される免疫化物質（例えば、ワクチン）の追加用量を投与することである。
担体：免疫応答の誘導を補助するために抗原と結合させる物質または化合物。
キメラタンパク質：2以上の完全または部分的な遺伝子または一連の（非）ランダム核酸のスプライシングにより生じたヌクレオチド配列によりコードされる遺伝的に操作されたタンパク質。
補体：抗体の機能を「補う」作用を有する複合的な一連の血液タンパク質。補体は細菌を破壊し、炎症を引き起こし、免疫反応を調節する。
サイトカイン：成長または分化モジュレーターであり、これは本発明における非限定因子であり、本発明および特許請求の範囲の解釈を限定すべきではない。サイトカインに加えて、接着もしくはアクセサリー分子またはそれらの任意の組合せは、単独で、またはサイトカインと組合せて使用されうる。
CTL：細胞傷害性Tリンパ球。T細胞受容体と共にCD8を発現し、したがって、クラスI分子により提示された抗原に応答しうるT細胞の亜群。
送達ビヒクル（運搬ビヒクル）：ヌクレオチド配列またはポリペプチドまたはその両方を少なくとも1つの媒体から別の媒体に輸送しうる実体、例えばウイルスベクター。
断片（フラグメント）：これは、核酸またはポリペプチドの非全長部分を示すために用いられる。したがって、断片自体も、それぞれ、核酸またはポリペプチドである。
個体：鳥類、哺乳類、魚類、両生類または爬虫類の任意の種または亜種。より適切には哺乳類、より適切にはヒト。
不変鎖：小胞体および後続の細胞区画においてMHC II分子と結合しそれを安定化する内在性膜タンパク質糖タンパク質。ここで、不変鎖なる語は、ヒト不変鎖に対して或る類似性を有する、天然に存在する又は人工的に生成された全ての完全長または断片化相同遺伝子およびタンパク質を含む。不変鎖は本明細書においてはliと略称される。
単離：本明細書に開示されている核酸、ポリペプチドおよび抗体に関して用いられる「単離された」は、これらが、それらの天然環境、典型的には細胞環境の成分から特定され、分離され、および／または回収されていることを意味する。本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体は、好ましくは、単離されており、本発明のワクチンおよび他の組成物は、好ましくは、単離された核酸、ポリペプチドまたは単離された抗体を含む。
MHC：主要組織適合性複合体であり、MHCの2つの主要サブクラス、すなわち、クラスIおよびクラスIIが存在する。
核酸：遺伝情報を伝達するヌクレオチドの鎖または配列。本発明に関しては、核酸はデオキシリボ核酸（DNA）である。
核酸構築物：遺伝的に操作された核酸。典型的には、幾つかの要素、例えば、遺伝子またはその断片、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリAテール、リンカー、ポリリンカー、機能的リンカー、マルチクローニング部位（MCS）、マーカー、終止コドン、他の調節要素、内部リボソーム進入部位（IRES）などを含む。
機能的リンカー：核酸またはポリペプチドの生物学的プロセシングを保証する様態で、核酸構築物または（キメラ）ポリペプチドの2つの部分に共に結合するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列。
病原体：疾患の特定の原因因子、特に生物学的因子、例えばウイルス、細菌、プリオンまたは寄生生物であって、その宿主に疾患を引き起こしうるものであり、感染因子とも称される。
ペプチド：配列を定める、アミド結合により連結された複数の共有結合アミノ酸残基。この用語はオリゴペプチドおよびポリペプチドと同様に用いられる。天然および／または非天然アミノ酸はペプチド結合または非ペプチド結合により連結されうる。ペプチドなる語は、当技術分野で公知の化学反応または酵素触媒反応により導入される翻訳後修飾をも含む。この用語はポリペプチドの変異体または断片を意味しうる。
医薬担体（製薬担体）：賦形剤または安定剤とも称される。使用される用量および濃度で曝露された細胞または個体に対して無毒性である。しばしば、生理的に許容される担体はpH緩衝水溶液である。生理的に許容される担体の例には、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースもしくはデキストリン；キレート剤、例えばEDTA；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（商標）、ポリエチレングリコール（PEG）およびPLURONICS（商標）が含まれる。
複数：少なくとも2つ。
プロモーター：RNAポリメラーゼが結合して1以上の近傍構造遺伝子によるメッセンジャーRNAの転写が開始される、DNA鎖における結合部位。
シグナルペプチド：細胞内のタンパク質の最終的な位置を決定するアミノ酸の短い配列であり、ソーティング・ペプチドとも称される。
siRNA：内因性RNAを（配列特異的な様態で）標的化して分解し、それにより、遺伝子産物の量を減少させる低分子干渉RNA（siRNA）。
界面活性剤：界面活性剤が溶解している液体の表面張力を低下させうる表面界面物質。界面活性剤は、親水性である極性基と、疎水性であり、しばしば脂肪鎖から構成される非極性基とを含有する化合物である。
ワクチン：動物において免疫応答を誘導しうる物質または組成物。本明細書においては免疫原性組成物とも称される。免疫応答は、生物において記憶を誘導する免疫応答（体液性／抗体および／または細胞性）であり、初回応答ではなく2度目の応答に感染因子が遭遇すると、宿主生物に対するその影響が低減される。本発明のワクチンは予防用および／または治療用医薬として投与されうる。該組成物は以下のうちの1以上を含みうる：抗原、liに機能的に連結された1以上の抗原を含む核酸構築物、担体、アジュバントおよび医薬担体。
変異体：与えられた参照核酸またはポリペプチドの「変異体」は、該参照核酸またはポリペプチドに対して或る程度の配列相同性／同一性を示すが該参照核酸またはポリペプチドと同一ではない核酸またはポリペプチドを意味する。
免疫応答
ワクチンは予防用に使用可能であり、実際の感染が生じる前に投与され、あるいは治療用に使用可能であり、この場合、それは、既に体内に存在する病原体に対する免疫応答を惹起または促進する。どちらのワクチン接種方法も、確固たる免疫応答の確立を要する。感染またはワクチン接種により活性化される免疫応答はT細胞、B細胞および抗原提示細胞のような幾つかの細胞型ならびに幾つかの異なる分子、主に抗原、MHC分子、T細胞受容体、B細胞受容体およびその他多数の相互作用に基づく。
抗原は、MHC分子により抗原提示細胞の表面上で提示されるペプチド断片を含む。抗原は外来性（すなわち、病原体由来）でありうる、またはその生物自体（いわゆる、自己抗原）に由来しうる。MHC分子は、「主要組織適合複合体」（以下、MHCと称する）として公知の特定の染色体領域によりコードされる多型遺伝子ファミリーを代表するものである。MHC分子の2つのクラス、すなわち、MHCクラスI（MHC-I）およびMHCクラスII（MHC-II）が存在する。
ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞の表面上に存在するMHCクラスII（MHC-II）分子により提示された抗原により刺激される。MHC-II分子は小胞体内で合成される。合成中、それらは、MHC-II分子が自己抗原でローディングされるのを妨げる様態で、不変鎖（li）と合体する。MHC-II分子は、特定の細胞内区画における細胞表面へ、不変鎖におけるシグナル配列により輸送される。該区画がその内容物のプロセシングにより成熟するにつれて、それはリソソームから後期エンドソーム（エンドサイトーシス小胞との融合の後）へ、そしてMHCクラス区画（MIIC）へと進行する。エンドサイトーシス小胞は外来抗原、例えば、タンパク質分解切断細菌ペプチド断片を含有する。これらの断片は、それらの分解により、MHC-II分子上にローディングされるように準備される。MHC-II分子は、2つの部分のプロセスにおいて、不変鎖により遊離される。該プロセスにおいては、まず、不変鎖がタンパク質分解されて、MHC-II結合ドメインにおいて、CLIPと称されるペプチドのみが残り、次にHLA-DM分子によりCLIPが除去される。ついで、MHC-II分子は外来抗原と自由に結合し、形質膜とのMIIC小胞の融合の後、これらを細胞表面上に提示する。これは体液性免疫応答を開始させる。このとき、提示された抗原はヘルパーT細胞の活性化を刺激し、これが今度は幾つかの手段によりB細胞を刺激し、これは最終的に抗体分泌細胞に分化する。
抗原提示細胞上のMHCクラスI分子に結合した抗原をT細胞傷害性細胞のT細胞受容体が認識すると、細胞性免疫応答が開始される。MHC-I分子は、MHC-IIと結合する不変鎖のような機能性分子とは結合しない。更に、小胞体内に既に存在する抗原がMHC-I分子にローディングされる点で、抗原提示分子へのMHC-IのプロセシングはMHC-II分子の場合と異なる。MHC-I分子により提示される抗原は、典型的には、抗原提示細胞自体により合成されたタンパク質の、プロテアソームにより切断されたペプチド断片である。これらのタンパク質は、細胞自身のDNAによりコードされる異常タンパク質、または該細胞に感染しており、そのタンパク質合成装置に寄生するウイルスもしくは他の病原体に由来するタンパク質でありうる。MHCクラスI関連タンパク質分解系は実質的に全ての細胞に存在する。
それらの2つのタイプのT細胞の機能は、それらの名称により示唆されるとおり、有意に異なる。細胞傷害性T細胞は、細胞の直接溶解により、およびγ-インターフェロンのようなサイトカインを分泌することにより、細胞内病原体および腫瘍を根絶する。主な細胞傷害性T細胞はCD8+ T細胞であり、これは抗原特異的でもある。ヘルパーT細胞も細胞を溶解しうるが、その主な機能は、B細胞（抗体産生細胞）および他のT細胞の活性を促進するサイトカインを分泌することであり、したがって、抗体媒介性および細胞傷害性T細胞媒介性応答メカニズムを含む、外来抗原に対する免疫応答を、それは広範に増強する。CD4+ T細胞は免疫応答における主要ヘルパーT細胞表現型である。
核酸構築物
本発明の1つの態様は、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結された少なくとも1つの不変鎖またはその変異体をコードする配列を含む核酸構築物であって、該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、核酸構築物に関する。
核酸構築物は、遺伝的に操作された核酸であると理解される。核酸構築物は、幾つかの要素、例えば非複製性線状核酸、環状発現ベクター、自律複製性プラスミドまたはウイルス発現ベクターでありうる。核酸構築物は、遺伝子またはその断片、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリAテール、リンカー、ポリリンカー、機能的リンカー、マルチクローニング部位（MCS）、マーカー、終止コドン、内部リボソーム侵入部位（IRES）、および組込みのための宿主相同配列、または他の定められた要素（これらに限定されるものではない）を含みうる。本発明の核酸構築物は前記要素の全て、またはそれらの任意の組合せ部分を含みうると理解されるべきである。核酸構築物を操作するための方法は当技術分野でよく知られている（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら編, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい）。
該核酸構築物を構成する核酸残基は、1つの実施形態においては、修飾されうる。該修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、リボシル化、硫化およびその他からなる群から選択されうる。
本発明の核酸構築物は、1つの実施形態においては、DNAから構成されうる。もう1つの実施形態においては、該核酸構築物は、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、ロックド核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、インターカレーション核酸（INA）、ツイスティッド・インターカレーション（Twisted intercalating）核酸（TINA）、ヘキシトール核酸（HNA）、アラビノ核酸（ANA）、シクロヘキサン核酸（CNA）、シクロヘキセニル核酸（CeNA）、グリセロール核酸（GNA）、スレオシル核酸（TNA）、ギャップマー（Gap-mer）、ミックスマー（Mix-mer）、モルホリノまたはそれらの組合せからなる群から選択される核酸から構成されうる。
コドン最適化および縮重核酸配列
異種宿主における機能性タンパク質の発現は現代のバイオテクノロジーの基礎である。残念ながら、多数のタンパク質はそれらの元のコンテキスト以外においては発現されることが困難である。それらは、非正準（non-canonical）ヌクレオチドコードを用いる生物に由来する、または所望の宿主においてめったに用いられないコドンに富む遺伝子に由来する発現制限性調節要素を含有しうる。遺伝子合成の速度および効率の改善は最大のタンパク質発現のための完全な遺伝子再設計を実施可能にしている。例えば、タンパク質発現は、研究中の遺伝子のコドン頻度が宿主発現系のコドン頻度と合致する場合に劇的に改善しうる。例えば、再設計戦略は最適なコドンバイアスの利用だけでなく、mRNA構造要素の改変ならびに翻訳および開始領域の修飾をも含みうる。コドン最適化のための技術は当業者に公知であり、GenScript Corporationのような商業的供給業者により行われうる。
本発明の不変鎖またはその変異体を含む核酸構築物は、配列番号1〜50、より適切には配列番号1〜8（ヒト不変鎖）のいずれかに開示されているアミノ酸配列に対応する本発明の不変鎖またはその変異体を含むアミノ酸配列をタンパク質（すなわち、アミノ酸）への翻訳により産生する任意の方法により、コドン最適化されうると理解される。
同様に、本発明の不変鎖を含む核酸構築物は、免疫応答を刺激するために該核酸構築物が使用されうる任意の動物（任意の脊椎動物、哺乳類、魚類または鳥類を含む）のアミノ酸配列に対応する本発明の不変鎖またはその変異体を含むアミノ酸配列をタンパク質（すなわち、アミノ酸）への翻訳により産生する任意の方法により、コドン最適化されうる。
コドンバイアス：コドンバイアスは、原核生物の遺伝子発現における単一の最も重要な要因であると確認されている。与えられたコドンが遺伝コードにおいて出現する度合は、生物間、高レベルおよび低レベルで発現されるタンパク質間、更には、同じオペロンの異なる部分間で有意に異なる。この理由は、ほぼ確実に、好ましいコドンが、細胞内で利用可能な同族（コグネイト）tRNAの存在量と相関しているからである。この関係は、翻訳系を最適化すること、およびコドン濃度をイソ受容体tRNA濃度と釣り合わせることに役立つ。
低使用頻度コドンの置換：一般に、遺伝子が含有する希少（rare）コドンが多ければ多いほど、異種タンパク質がその特定の宿主系内で妥当なレベルで発現される可能性は低くなる。希少コドンがクラスター内または該タンパク質のN末端部分内に存在すると、これらのレベルはより一層低くなる。希少コドンを、アミノ酸配列の修飾を伴うことなく、宿主系のコドンバイアスをより密接に反映する他のコドンで置換することは、機能性タンパク質の発現レベルを増加させうる。
問題のあるコドンの排除：生物が時間の5%〜10%未満しか用いない任意のコドンは、それがどこに由来するかに無関係に、問題を引き起こしうる。この場合も、接近または隣接しているコドンは、それらが分離して存在しうる場合より大きな影響を、タンパク質発現に及ぼしうる。希少コドン、および終止シグナルとして読取られうるコドンを排除することにより、低発現または無発現の事象が予防されうる。
哺乳類宿主におけるウイルスタンパク質の発現：ウイルス遺伝子であっても、該遺伝子が適切に調製されていれば、哺乳類細胞系において成功裏に発現されうる。ウイルス遺伝子の高密度の情報負荷はリーディングフレームの重複を頻繁に引き起こす。多数のウイルス遺伝子はコード配列内にシス作用性の負の調節配列をもコードしている。所望のタンパク質のみを発現させるだけでなく、調節エレメントを破壊し、それによりタンパク質産生を増強するように、ウイルス遺伝子は再合成されうる。ウイルスのコドン最適化はDNAワクチン研究において特に有用である。なぜなら、それは標的の免疫原性を増強するからである。
他の制約：コドンバイアスは遺伝子発現において大きな役割を果たすが、発現ベクターおよび転写プロモーターの選択も重要である。タンパク質のN末端領域を囲むヌクレオチド配列は希少コドンの存在と開始AUGに直接隣接するコドンの種類との両方に対して特に感受性である。また、翻訳とmRNAの安定性との間に何らかの相互作用が存在する。
遺伝暗号の縮重：前記から言えることは、遺伝暗号は重複性を有するが、多義性（アンビギュイティ）を有さないことである。例えば、コドンGAAおよびGAGは共にグルタミン酸を指定するが（重複性）、それらはいずれも他のアミノ酸を指定しない（多義性を有さない）（完全な相関性に関しては、以下のコドン表を参照されたい）。1つのアミノ酸をコードするコドンはそれらの3つの位置のいずれかにおいて異なりうる。遺伝暗号の縮重は、サイレント突然変異の存在を説明するものである。縮重が生じるのは、4つの塩基のトリプレットコードが20種類のアミノ酸および終止コドンを指定するからである。
この表は20種類のアミノ酸、開始コドンおよび終止コドンならびに64種類の可能なコドンを示す。mRNAの方向は5'から3'である。
同義置換：サイレント突然変異または置換は、タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらさないDNA突然変異である。それらは非コード領域内（遺伝子の外側またはイントロン内）に存在することが可能であり、あるいは、それらは、最終的なアミノ酸配列を変化させない様態でエクソン内に存在することが可能である。フレーズ（phrase）サイレント突然変異または置換は、しばしば、フレーズ同義突然変異または置換と互換的に用いられるが、同義突然変異または置換は前者の下位範疇であり、エクソン内でのみ生じる。
本発明の不変鎖またはその変異体を含む核酸構築物は、配列番号1〜50、より適切には配列番号1〜8（ヒト不変鎖）のいずれかに開示されているアミノ酸配列に対応する本発明の不変鎖またはその変異体を含むアミノ酸配列をタンパク質（すなわち、アミノ酸）への翻訳により与える同義置換を含みうると理解される。
同様に、本発明の不変鎖を含む核酸構築物は、免疫応答を刺激するために該核酸構築物が使用されうる任意の動物（任意の脊椎動物、哺乳類、魚類または鳥類を含む）のアミノ酸配列に対応する本発明の不変鎖またはその変異体を含むアミノ酸配列をタンパク質（すなわち、アミノ酸）への翻訳により与える同義置換を含みうる。
同義アミノ酸への非同義置換：非同義置換はアミノ酸の変化を引き起こす。しかし、アミノ酸は該アミノ酸の特性に従い分類され、あるアミノ酸の、別のアミノ酸による置換は、該置換が同義アミノ酸を与える場合、該アミノ酸を含むタンパク質の機能または特性に影響を及ぼさない可能性がある。そのような置換は保存的置換または突然変異と称されうる。これは、1つのアミノ酸の、生化学的に類似したアミノ酸による置換をもたらす、DNAまたはRNA配列の変化である。
したがって、本発明による不変鎖またはその変異体を含む核酸構築物は、不変鎖の変異体を含むアミノ酸配列をタンパク質（すなわち、アミノ酸）への翻訳により与える非同義置換を含みうると理解され、ここで、該非同義置換は、同義である1以上のアミノ酸の置換をもたらす。
同義置換は、疎水性アミノ酸の、別の疎水性アミノ酸による置換；親水性アミノ酸の、別の親水性アミノ酸による置換；極性アミノ酸の、別の極性アミノ酸による置換；非極性アミノ酸の、別の非極性アミノ酸による置換；正荷電アミノ酸の、別の正荷電アミノ酸による置換；負荷電アミノ酸の、別の負荷電アミノ酸による置換；中性アミノ酸の、別の中性アミノ酸による置換；多義性（アンビギュアス）アミノ酸の、その対応アンビギュアス荷電アミノ酸による置換（例えば、イソロイシンおよびロイシン、アスパラギンおよびアスパラギン酸、ならびにグルタミンおよびグルタミン酸）；芳香族アミノ酸の、別の芳香族アミノ酸による置換；脂肪族アミノ酸の、別の脂肪族アミノ酸による置換；または任意のアミノ酸の、アラニンによる置換を含みうる。これらの置換は等価（equal-value）置換と称されうる。
スプライス変異体
選択的スプライシングはRNAスプライシング変異メカニズムであり、この場合、一次遺伝子転写物であるプレmRNAのエクソンが分離され、再結合して代替的リボヌクレオチド配列を生成する。ついで、これらの一次結合（linear combination）は、特異的かつ唯一（ユニーク）のアミノ酸配列が指定される翻訳の過程を経て、アイソフォームタンパク質またはスプライス変異体を与える。このようにして、選択的スプライシングは遺伝的発現を利用して、より多様なタンパク質の合成を促進する。真核生物においては、選択的スプライシングはより高い効率のための重要な段階である。なぜなら、情報が遥かに効率的に保存されうるからである。原核生物のコード様態であれば2つのタンパク質に十分であるに過ぎない長さを有するDNA配列において、幾つかのタンパク質がコードされうる。
本発明の核酸構築物は、1つの実施形態においては、複数の抗原性ペプチドもしくは抗原性ペプチドの断片および／または複数の不変鎖もしくはその変異体が得られるように設計されうる。
1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物は少なくとも1個、例えば2個、例えば3個、例えば4個、例えば5個、例えば6個、例えば7個、例えば8個、例えば9個、例えば10個、例えば11個、例えば12個、例えば13個、例えば14個、例えば15個、例えば16個、例えば17個、例えば18個、例えば19個、例えば20個の、抗原性ペプチドまたは該抗原性ペプチドの断片のスプライス変異体を含む。
該複数の抗原性ペプチドスプライス変異体は同一または非同一抗原性ペプチドを含みうる。
もう1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物は少なくとも1個、例えば2個、例えば3個、例えば4個、例えば5個、例えば6個、例えば7個、例えば8個、例えば9個、例えば10個、例えば11個、例えば12個、例えば13個、例えば14個、例えば15個、例えば16個、例えば17個、例えば18個、例えば19個、例えば20個の、不変鎖またはその変異体のスプライス変異体を含む。
適切には、本発明の構築物は単一の不変鎖またはその変異体と単一の抗原性ペプチドまたは該抗原性ペプチドの断片とを含む。
該複数の不変鎖ペプチドスプライス変異体は同一または非同一不変鎖またはその変異体を含みうる。
1つの実施形態においては、不変鎖の、少なくとも1つのスプライス変異体は、天然全長不変鎖を含む。もう1つの実施形態においては、不変鎖の、少なくとも１つのスプライス変異体は、不変鎖の変異体を含む。更にもう1つの実施形態においては、不変鎖の、少なくとも1つのスプライス変異体は、該liがli-KEY領域のLRMKアミノ酸残基を含まない、不変鎖の変異体を含む。もう1つの実施形態においては、不変鎖の、少なくとも1つのスプライス変異体は、前記liがCLIPドメインのM81およびM99残基を含まない、不変鎖の変異体を含む。1つの実施形態においては、li-KEY領域のLRMKアミノ酸残基は欠失または置換されている。もう1つの実施形態においては、不変鎖またはその変異体はCLIPドメインのM81およびM99残基を含まない。
したがって、スプライス変異体は同一もしくは非同一の抗原性ペプチドおよび／または同一もしくは非同一の不変鎖もしくはその変異体の任意の組合せを含みうる。
このようにして、不変鎖の種々のドメインまたは領域を含む配列（エクソン）を「シャッフル」して、選択的スプライシングにより不変鎖の変異体を得ることが可能である。このようにして、抗原性ペプチドの種々のドメインまたは領域を含む配列（エクソン）を「シャッフル」して、選択的スプライシングにより該抗原性ペプチドの変異体を得ることも可能である。
不変鎖
「不変鎖」なる語は、「li」または「CD74」としても公知であり、非多型II型内在性膜タンパク質を意味する。該タンパク質はリンパ球成熟および適応免疫応答における複数の機能を有する。特に、liは、エンドサイトーシス経路への、新たに合成されたMHC IIの標的化を保証し、該経路において、複合体が抗原性ペプチドに遭遇しうる（Pieters J. (1997) Curr. Opin. Immunol., 9: 8996）。また、liはMHCクラスIシャペロンとして機能すること（Morrisら, (2004) Immunol. Res., 30: 171-179）、およびそのエンドソーム標的化配列により、共有結合抗原に対するCD8+ T細胞ではなくCD4+の刺激を促進すること（Dieboldら, (2001) Gene Ther. 8: 487-493）が示されている。
ヒト不変鎖に関しては、p33、p35、p41およびp43と一般に称される4つの異なるアイソフォームが公知である（Strubinら, 1986, EMBO Journal, 5: 3483-3488）。配列番号1および配列番号2は、それぞれ、ヒト不変鎖p35アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に対応する。配列番号3はヒト不変鎖p33アイソフォームのアミノ酸配列に対応する。配列番号4および配列番号5は、それぞれ、ヒト不変鎖p43アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に対応する。配列番号6はヒト不変鎖p41アイソフォームのアミノ酸配列に対応する。ヒトp33およびp41に関しては、ヒトp35およびp43アイソフォームは、翻訳の選択的（alternative）開始ゆえに、N末端に追加的な16残基を含む。ヒトp33およびp35と比較して、ヒトp41およびp43アイソフォームは、不変鎖のC末端領域内にインフレームで挿入された追加的ドメイン（エキソン6bの選択的スプライシング）を含む。ヒトp33およびp35と比較して2つのエクソンを欠く追加的ヒトアイソフォームcの配列はGenbankにおいて入手可能である（アクセッションBC024272）。配列番号7および配列番号8は、それぞれ、ヒト不変鎖cアイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に対応する。適切には、不変鎖は不変鎖のヒトp33、p35、p41、p43またはcアイソフォームに由来する。
不変鎖は以下の幾つかのドメインを含む：ヒト不変鎖p35およびp43変異体における小胞体保持シグナル（「ERR」または「ER」）（ヒト不変鎖配列番号1における1〜16位）に続くソーティング（標的化）ペプチド（「リソソーム標的化配列」または「エンドリソソーム・ソーティング配列」（「ESS」）としても公知）（ヒト不変鎖配列番号1における17〜46位、マウス不変鎖配列番号9における1〜29位）を含むサイトゾルドメイン、膜貫通ドメイン（「TM」、ヒト不変鎖配列番号1における47〜72位、マウス不変鎖配列9における30〜55位）、およびそれ自体はKEY領域（ヒト不変鎖配列番号1における93〜96位、マウス不変鎖配列番号9における76〜79位）、隣接CLIP領域（ヒト不変鎖配列番号1における97〜120位、マウス不変鎖配列番号9における80〜103位）を含む内腔ドメイン。CLIP領域はコアCLIPペプチド（ヒト不変鎖配列番号1における103〜117位、マウス不変鎖配列番号9における86〜100位）および三量体化ドメイン（ヒト不変鎖配列番号1における134〜208位、マウス不変鎖配列番号9における117〜191位；Mittendorfら, (2009) Expert Opin. Biol. Ther., 9:71-78; Strumptner-Cuvelette and Benaroch, 2002, Biochem. Biophys. Acta, 1542: 1-13）を含む。内腔ドメインの残部は、膜貫通領域とKEY領域との間（ヒト不変鎖配列番号1における73〜92位、マウス不変鎖配列番号9における56〜75位）または三量体化ドメインの下流（ヒト不変鎖配列番号1における209〜232位、マウス不変鎖配列番号9における192〜215位）に位置する2つの高柔軟性領域を含む。
不変鎖はニワトリ、ウシ、イヌ、マウス、ラットおよびヒトのような幾つかの生物において特徴づけられている。1つの実施形態においては、不変鎖は脊椎動物由来であり、より好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。使用される不変鎖は、好ましくは、ワクチン接種を受けることになる生物の不変鎖である。1つの実施形態においては、不変鎖と、宿主生物または被治療体とは、同じ種のものである。
マウス不変鎖に関しては、ヒト不変鎖アイソフォームp33およびp41にそれぞれ対応する2つのアイソフォーム（p31およびp41）のみが公知である。配列番号9および配列番号10は、それぞれ、マウス不変鎖p31アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に対応する。配列番号11および配列番号12は、それぞれ、マウス不変鎖p41アイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列に対応する。適切には、不変鎖の断片は不変鎖のマウスp31またはp41アイソフォームに由来する。
1つの実施形態においては、不変鎖は、配列番号1〜50のいずれか1つに列挙されているポリペプチド配列、より適切には、配列番号1〜8のいずれか1つのヒト不変鎖である。
不変鎖の変異体
不変鎖の変異体は、不変鎖（例えば、配列番号1〜50の不変鎖配列、またはより適切には、配列番号1〜8のヒト不変鎖のいずれか1以上）と配列同一性のレベルを共有し、または不変鎖（例えば、配列番号1〜50の不変鎖配列、またはより適切には、配列番号1〜8のヒト不変鎖のいずれか1以上）の断片でありうる。
1つの実施形態においては、不変鎖の変異体は、配列番号1〜50、またはより適切には、配列番号1〜8のヒト不変鎖のいずれか1以上に対して少なくとも80%、より適切には少なくとも85%、より適切には少なくとも90%、より適切には少なくとも95%、より適切には少なくとも97%、より適切には少なくとも98%、より適切には少なくとも99%の同一性を有するポリペプチド配列である。
1つの実施形態においては、該変異体は、配列番号3のいずれかに記載されている不変鎖の任意の部分からの少なくとも40アミノ酸の断片である。これは、残基1〜40、10〜50、20〜60、25〜65、30〜70、35〜75、40〜80、45〜85、50〜90、55〜95、60〜100、65〜105、70〜110、75〜115、80〜120、85〜125、90〜130、95〜135、100〜140、105〜145、110〜150、115〜155、120〜160、125〜165、130〜170、135〜175、140〜180、145〜185、150〜190、155〜195、160〜200、165〜205、170〜210および175〜216を含む断片を含む。これはまた、前記で挙げられているいずれかの断片をそのいずれかの側に5残基拡張したものを含む。それは更に、少なくとも50残基、少なくとも60残基、少なくとも70残基、少なくとも80残基、少なくとも90残基、少なくとも100残基、少なくとも110残基、少なくとも120残基、少なくとも130残基、少なくとも140残基、少なくとも150残基、少なくとも160残基、少なくとも170残基、少なくとも180残基、少なくとも190残基、少なくとも200残基、および少なくとも210残基の断片を含む。
配列番号3に対して少なくとも85%の配列同一性、例えば少なくとも90%の配列同一性、例えば少なくとも91%の配列同一性、例えば少なくとも92%の配列同一性、例えば少なくとも93%の配列同一性、例えば少なくとも94%の配列同一性、例えば少なくとも95%の配列同一性、例えば少なくとも96%の配列同一性、例えば少なくとも97%の配列同一性、例えば少なくとも98%の配列同一性、例えば99%の配列同一性の任意の前記断片が本発明の範囲内に含まれる。
適切には、該不変鎖またはその変異体は該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に対する免疫応答を増強しうる。
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列の比較
2つの密接に関連するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を比較する目的で、第1配列と第2配列との間で「配列同一性パーセント（%）」が計算されうる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと同一または同じであると言えるのは、それらがそれらの全長にわたって100%の配列同一性を共有する場合である。配列内の残基は、左から右に、すなわち、ポリペプチドの場合にはN末端からC末端に、ポリヌクレオチドの場合には5'から3'に番号が付けられる。2以上のポリペプチド配列の文脈における「同一」またはパーセンテージ「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて又は手動アライメントおよび目視検査により比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大一致が得られるように比較されアライメント（整列）された場合に、2以上の配列または部分配列が同一である、または同じアミノ酸残基の特定のパーセンテージ（すなわち、特定された領域にわたって70%の同一性、所望により、75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性）を有することを意味する。この定義は試験配列の相補体に関するものでもある。場合によっては、同一性は、少なくとも250アミノ酸長、例えば300アミノ酸または350アミノ酸である領域にわたって存在しうる。適切には、該比較は、（誘導体配列に対して）参照配列の全長に対応するウィンドウにわたって行われる。
配列比較の場合、1つの配列が参照配列として働き、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、後続の座標を指定し、配列アルゴリズム・プログラム・パラメーターを指定する。デフォルト・プログラム・パラメータが使用可能であり、あるいは代替パラメータが指定されうる。ついで配列比較アルゴリズムが、プログラム・パラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列に関する配列同一性パーセンテージ（割合)を計算する。
本明細書中で用いる「比較ウィンドウ」は、2つの配列が最適にアライメント（整列）された後、配列が同番号の連続的位置の参照配列と比較されうるセグメントを意味する。比較のための配列アライメントの方法は当技術分野でよく知られている。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジー・アライメント・アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、または手動アライメントおよび目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編, 1995補遺)を参照されたい）により行われうる。
有用なアルゴリズムの一例はPILEUPである。PILEUPは、プログレシブ・ペアワイズ・アラインメントを用いて、関連配列の一群から複数の配列アライメントを生成して、関連性および配列同一性パーセンテージを示す。それはまた、該アライメントを生成するために用いたクラスタリング関係を示すツリーまたは系統樹をプロットする。PILEUPはFeng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)のプログレシブ・アライメント法の単純化を用いる。用いる方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)に記載されている方法に類似している。該プログラムは、5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸の最大長をそれぞれが有する300個の配列をアライメントさせうる。マルチプル・アラインメント法は2つの最も類似した配列のペアワイズ・アラインメントから開始して、2つのアラインメント配列のクラスターを生成する。ついで、このクラスターは、アライメント配列の、2番目に高い関連性を有する配列またはクラスターに対してアライメントされる。2つの配列クラスターは、2つの個々の配列のペアワイズ・アラインメントの単純な拡張によってアライメントされる。最終的なアライメントは一連のプログレシブ・ペアワイズ・アライメントにより達成される。該プログラムは、配列比較の領域に関する特定の配列およびそれらのアミノ酸座標を指定することにより、ならびにプログラム・パラメーターを指定することにより実行される。PILEUPを使用して、以下のパラメーターを用いて、参照配列を他の試験配列と比較して、配列同一性の割合の関係を決定する：デフォルト・ギャップ・ウェイト（3.00）、デフォルト・ギャップ長ウェイト（0.10）および重み付きエンド・ギャップ。PILEUPは、GCG配列解析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン7.0（Devereauxら, Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984)）から入手可能である。
配列同一性の割合および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムのもう1つの例はBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschulら, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschulら, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov/におけるウェブサイト)から公に入手可能である。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアライメントされた場合に何らかの正の値の閾値スコアTと一致し又はそれを満たすクエリ配列内の長さWの短いワードを特定することにより、高スコア配列ペア（HSP）を特定することを含む。Tは隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら, 前掲）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有する、より長いHSPを見つけるために、検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加されうる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターM（マッチ残基のペアに関するリウォード（報酬）スコア；常に> 0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティースコア；常に<0）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリング・マトリックスが使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は以下の場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大達成値から量X減少した場合；累積スコアが、1以上の負のスコアの残基アライメントの累積ゆえに、ゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、TおよびXはアライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は11のワード長（W）、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列用のBLASTPプログラムは3のワード長、および10の期待値（E）、および50のBLOSUM62スコアリングマ
トリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）アライメント（B）、10の期待値（E）、M=5、N=-4、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の尺度の1つは最小総和確率（P（N））であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然生じる確率の指標を与える。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小総和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
配列間の「差異」は、第1配列と比較した場合の、第2配列の位置における単一残基の挿入、欠失または置換を意味する。2つの配列は1つ、2つ又はそれ以上のそのような差異を含有しうる。第2配列における挿入、欠失または置換は、その他の点では第2配列が第1配列と同一である場合（100%の配列同一性）、配列同一性の割合の低下をもたらす。例えば、同一配列が9残基長である場合、第2配列における1つの置換は88.9%の配列同一性を与える。同一配列が17アミノ酸残基長である場合、第2配列における2つの置換は88.2%の配列同一性を与える。
あるいは、第1の参照配列を第2の比較配列と比較する目的で、第2配列を生成するために第1配列に施された付加、置換および／または欠失の数が確認されうる。付加は第1配列への1つの残基の付加（第1配列のいずれかの末端における付加を含む）である。置換は、第1配列における1つの残基の、1つの異なる残基による置換である。欠失は、第1配列から1つの残基の除去である（第1配列のいずれかの末端における欠失を含む）。
幾つかの実施形態においては、少なくとも1つの不変鎖の少なくとも1つの領域、ペプチドまたはドメインが少なくとも1つの不変鎖の領域、ペプチドまたはドメインに対して付加、欠失または置換される。そのような領域、ペプチドまたはドメインは少なくとも1つの該不変鎖または別のタンパク質に由来しうる。それは合成物であってもよい。
1つの実施形態においては、不変鎖をコードする配列に対してシグナルペプチドが付加、除去または置換される。シグナルペプチドは、細胞内のタンパク質の最終的な位置を決定するアミノ酸の短い配列であり、ソーティング・ペプチドとも称される。細胞内区画、例えば小胞体、ゴルジ装置およびゴルジ装置を含む種々の区画、核、原形質膜、ミトコンドリアおよびこれにおける種々の間隙および膜、ペルオキシソーム、リソソーム、エンドソームおよび分泌小胞などへのタンパク質の位置を決定するシグナルペプチドは全て、本開示の範囲内に含まれる。好ましい実施形態は不変鎖のリソソーム標的配列のみを含む。もう1つの好ましい実施形態は不変鎖のKEY領域のみを含む。シグナルペプチドは不変鎖に由来しうる。
幾つかの実施形態においては、少なくとも1つの不変鎖のTRIMドメインに対してTRIMドメインが付加、除去または置換される。TRIMドメインは、不変鎖の三量化をもたらす三量体化ドメインである。配列番号3に記載されているヒト不変鎖のTRIMドメインは、残基134〜208に伸長する領域に対応する。配列番号9に記載されているマウス不変鎖のTRIMドメインは、残基118〜192に伸長する領域に対応する。
1つの実施形態においては、TRIMドメインは不変鎖に由来し、例えば、不変鎖中に存在する天然TRIMドメインでありうる。適切には、TRIMドメインは、配列番号1〜50、より適切には配列番号1〜8に挙げられている不変鎖配列におけるTRIMドメインと同じ配列を有する。もう1つの実施形態においては、それは別のタンパク質に由来する。更にもう1つの実施形態においては、それは合成物である。幾つかの実施形態においては、不変鎖のTRIMドメインに対して付加、除去または置換されるTRIMドメインはTRIMドメインのみを含む。他の実施形態においては、それは、不変鎖の他のいずれの領域またはドメインをも伴わないN末端隣接配列またはC末端隣接配列と共にTRIMドメインを含む。他の好ましい実施形態はTRIM領域に対するN末端またはC末端隣接配列のみを含み、TRIM領域自体を含有しない。隣接は、C末端のTRIM領域から10残基内、20残基内または24残基内の任意のアミノ酸、あるいはN末端のTRIM領域から10残基内、20残基内、30残基内、40残基内、50残基内、75残基内または100残基内のアミノ酸を意味する。
もう1つの実施形態は、少なくとも1つの不変鎖のCLIP領域の除去、付加または置換に関する。前記のとおり、CLIP領域の付加または置換は、選択された1以上の不変鎖の変異体における既存のCLIP領域を付加する、あるいはそれを、同じ若しくは他の生物の不変鎖からのCLIP領域または同じ若しくは他の生物からのCLIP領域の変異体により置換する選択肢を含む。変異体CLIP領域は、前記のとおり、単一または複数の核酸の置換、欠失または付加により作製された、CLIP領域の特異的に作製された突然変異体でありうる。好ましい実施形態はCLIP領域のみを含み、あるいは不変鎖の他のいずれの領域またはドメインをも含有しないN末端隣接配列またはC末端隣接配列と共にCLIP領域を含む。他の好ましい実施形態はCLIP領域に対するN末端またはC末端隣接配列のみを含み、CLIP領域自体を含まない。隣接はCLIP領域から10残基内、20残基内、30残基内、40残基内、50残基内、75残基内または100残基内の任意のアミノ酸を意味する。
もう1つの実施形態は、少なくとも1つの不変鎖のエンドソーム・ソーティング・シグナルの除去、付加または置換に関する。前記のとおり、エンドソーム・ソーティング・シグナルの付加または置換は、選択された1以上の不変鎖の変異体における既存のエンドソーム・ソーティング・シグナルを付加する、あるいはそれを、同じ若しくは他の生物の不変鎖からのエンドソーム・ソーティング・シグナルまたは同じ若しくは他の生物からのエンドソーム・ソーティング・シグナルの変異体により置換する選択肢を含む。変異体エンドソーム・ソーティング・シグナルは、前記のとおり、単一または複数の核酸の置換、欠失または付加により作製された、エンドソーム・ソーティング・シグナルの特異的に作製された突然変異体でありうる。好ましい実施形態はエンドソーム・ソーティング・シグナルのみを含み、あるいは不変鎖の他のいずれの領域またはドメインをも含有しないN末端隣接配列またはC末端隣接配列と共にエンドソーム・ソーティング・シグナルを含む。他の好ましい実施形態はエンドソーム・ソーティング・シグナルに対するN末端またはC末端隣接配列のみを含み、エンドソーム・ソーティング・シグナル自体を含まない。隣接はエンドソーム・ソーティング・シグナルから10残基内、20残基内、30残基内、40残基内、50残基内、75残基内または100残基内の任意のアミノ酸を意味する。
1つの実施形態においては、膜貫通ドメインは、不変鎖をコードする配列に対して付加、除去または置換される。膜貫通ドメインは、タンパク質が細胞膜内に固定されて、それが細胞膜内に埋め込まれることを可能にする短いアミノ酸配列である。
本発明の1つの実施形態においては、liの膜貫通ドメインの全部または一部は、例えばケモカイン受容体CCR6 TM6のような任意の他のタンパク質からの対応セグメントにより置換されうる。
本発明のもう1つの実施形態においては、liの膜貫通ドメインの全部または一部はケモカイン受容体CCR6 TM6からの対応セグメントにより置換されうる。
幾つかの実施形態においては、不変鎖断片は更に、膜への該断片の固定を可能にする又は促進するミリストイル化（myriostylation）部位を含みうる。
特定の実施形態においては、不変鎖断片はシグナルペプチドドメイン、膜貫通ドメインおよび三量体化ドメインを含む。適切には、膜貫通ドメインは、配列番号1〜50、より適切には配列番号1〜8のいずれか1つの膜貫通ドメインと同じ配列を有する。膜貫通ドメインは、配列番号3の残基50〜115に伸長する領域を含みうる。
プロテアーゼ切断部位
本明細書中で用いるプロテアーゼ切断部位は細胞内プロテアーゼ切断部位を意味する。本明細書に開示しているのは、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結された少なくとも1つの不変鎖またはその変異体をコードする配列を含む核酸であり、ここで、該不変鎖のC末端は該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、該不変鎖またはその断片はプロテアーゼ切断部位を含む。
プロテアーゼ切断部位は、本明細書に開示されている核酸によりコードされる不変鎖に含まれるアミノ酸配列であって、細胞内プロテアーゼにより認識されプロセシングされうるアミノ酸配列であると理解される。換言すれば、該ポリペプチドは、該ポリペプチド内のペプチド結合の加水分解をプロテアーゼが行うことを可能にする部位を含む。適切には、プロテアーゼ切断部位は本発明の構築物に対して異種であり、すなわち、該構築物の構成要素、すなわち、該不変鎖または抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片内に天然では存在しない。適切には、切断はトランス-ゴルジネットワークにおいて生じる。
プロテアーゼ切断部位は細胞内プロテアーゼにより認識される。幾つかの実施形態においては、細胞内プロテアーゼは小胞体のプロテアーゼまたはトランス-ゴルジネットワーク・プロテアーゼ（最も適切には、トランス-ゴルジ・ネットワーク・プロテアーゼ）であり、適切には、フューリンおよびサブチリシン様プロテアーゼからなる群から選択される。フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素のファミリーに属するプロテアーゼであり、これは潜在性前駆体タンパク質をその生物学的に活性な産物へとプロセシング（処理）する。フューリンは、前駆体タンパク質をその対を成す（ペアード）塩基性アミノ酸プロセシング部位において効率的に切断しうるカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンはゴルジ体内において富化されており、この部位において、それは、他のタンパク質をそれらの成熟活性形態へと切断するように機能する。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列の直下流でタンパク質を切断する。細胞前駆体タンパク質をプロセシングすることに加えて、フューリンは多数の病原体によっても利用される。例えば、HIV、インフルエンザおよびデング熱ウイルスのようなウイルスのエンベロープタンパク質は、完全に機能性となるためにはフューリンまたはフューリン様プロテアーゼにより切断される必要がある。炭疽毒素、シュードモナス外毒素およびパピローマウイルスも宿主細胞内へのそれらの初期侵入中にフューリンによりプロセシングされる必要がある。サブチリシン様プロテアーゼは、サブチラーゼの群に属する非特異的プロテアーゼ（セリンプロテアーゼ）であるサブチリシンと同様の機能性を有するプロテアーゼである。
驚くべきことに、不変鎖内へのプロテアーゼ切断部位の挿入は、抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結された不変鎖の分泌をもたらすことが見出された。幾つかの実施形態においては、プロテアーゼ切断部位はサブチリシン様プロテアーゼの切断部位である。他の実施形態においては、好ましいプロテアーゼ切断部位はフューリン切断部位である。
核酸におけるフューリン切断部位のようなプロテアーゼ切断部位をコードする配列を設計および導入する方法は当業者に公知である。プロテアーゼは、当技術分野で公知の認識配列により、その標的を認識する。フューリンの場合、フューリンは多数の切断部位を認識し、その一例はRXR/KR（アルギニン、任意のアミノ酸、アルギニンまたはリジン、アルギニン）である。フューリン切断部位を分析するためのデータベースが利用可能であり、当業者に公知である。適切な切断を保証するためには、複数のプロテアーゼ切断部位が導入されうると理解される。例えば、プロテアーゼ切断部位は、互いに隣接した2つのプロテアーゼ切断部位を含みうる。好ましいフューリン切断部位は配列SGRRARRRARRSGR（配列番号57）である。
プロテアーゼ切断部位は不変鎖またはその変異体内に含まれる。本発明の範囲内には、プロテアーゼ切断部位が不変鎖の末端、例えばC末端またはN末端に位置する核酸構築物、およびプロテアーゼ切断部位が不変鎖の内部に存在する構築物が含まれる。好ましい実施形態においては、プロテアーゼ切断部位の導入は核酸構築物のオープンリーディングフレームを破壊しない。
プロテアーゼ切断部位は不変鎖内挿入されることが可能であり（すなわち、プロテアーゼ切断部位の存在は不変鎖のいずれのアミノ酸の欠失または置換をも引き起こさない）、あるいは、プロテアーゼ切断部位は不変鎖のアミノ酸の1以上または完全な領域を置換しうる。
適切には、プロテアーゼ切断部位は、ESSのC末端、より適切には、膜貫通ドメインのC末端、より適切には、KEY領域のC末端、より適切には、CLIP領域のC末端に位置し、各場合において、抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に位置する。
適切には、プロテアーゼ切断部位は、不変鎖のC末端とESSとの間、より適切には、不変鎖のC末端と膜貫通領域との間に、より適切には、不変鎖のC末端とKEY領域との間、より適切には、不変鎖のC末端とCLIP領域との間に位置する。
より適切には、プロテアーゼ切断部位は、ESSとTRIMドメインとの間、より適切には、膜貫通領域とTRIMドメインとの間、より適切には、KEY領域とTRIMドメインとの間、より適切には、CLIP領域とTRIMドメインとの間に位置する。
前記のとおり、不変鎖は、幾つかのドメイン、例えば、少なくとも1つのTRIMドメイン、少なくとも1つのシグナルペプチド、少なくとも1つのCLIPドメイン、少なくとも1つのエンドソーム・ソーティング・シグナルおよび少なくとも1つのミリストイル化部位を含みうる。幾つかの実施形態においては、該核酸構築物は、プロテアーゼ切断部位が前記ドメインのいずれにも含まれないように設計される。他の実施形態においては、該核酸構築物は、プロテアーゼ切断部位が前記ドメインのいずれかに含まれるように設計される。プロテアーゼ切断部位は不変鎖内に挿入されることが可能であり、あるいは、プロテアーゼ切断部位は、不変鎖内に天然で存在する領域を置換することが可能であり、その結果、プロテアーゼ切断部位を含有する不変鎖の全長が、プロテアーゼ切断部位を含有しない不変鎖の全長と実質的に同じになることが可能である。好ましい実施形態においては、このように置換された領域は、不変鎖にとって重要または必須である活性をもたらさない。好ましい実施形態においては、プロテアーゼ切断部位は、TRIMドメイン、シグナルペプチド、CLIPドメイン、エンドソーム・ソーティング・シグナルまたはミリストイル化（ミリオスチル化）部位ではない不変鎖の領域を置換する。
好ましい実施形態においては、プロテアーゼ切断部位はCLIPドメインとTRIMドメインとの間に位置する。プロテアーゼ切断部位は、例えば、TRIMドメインの直上流またはCLIPドメインの直下流に位置しうる。理論により束縛されるものではないが、TRIMドメインの上流におけるプロテアーゼ切断部位の挿入は不変鎖の三量体化を阻まないこと、および生じるポリペプチドは三量体であることが仮定される。
プロテアーゼ切断部位は、CLIPドメインの上流、例えば、エンドソーム・ソーティング・シグナルの直下流にも挿入されうる。
もう1つの好ましい実施形態においては、プロテアーゼ切断部位は、TRIMドメインの下流、例えば、TRIMドメインの直下流または不変鎖のC末端に位置する。そのような実施形態においては、不変鎖の三量体化が阻まれること、および生じるポリペプチドが単量体であることが仮定される。
したがって、プロテアーゼ切断部位の配置は、核酸構築物によりコードされるポリペプチドの単量体形態が望ましいのか又は三量体形態が望ましいのかに応じて設計されうる。
抗原
抗原は、免疫応答を惹起しうる少なくとも1つのエピトープを含有するポリペプチドである。抗原、抗原性配列、抗原性タンパク質、抗原性断片および免疫原なる語は本明細書では互換的に用いられる。エピトープ（抗原決定基としても公知である）は、免疫系により認識される抗原配列の部分である。適切には、この認識は問題のエピトープへの抗体、B細胞またはT細胞の結合によりもたらされる。抗体またはB細胞が結合するエピトープはB細胞エピトープと称され、T細胞が結合するエピトープはT細胞エピトープと称される。適切には、結合は、1×105 M-1以上または1×106 M-1、1×107 M-1、1×108 M-1以上の、抗体またはT細胞受容体（TCR）とそれぞれのエピトープとの間の結合定数での結合と定義される。「エピトープ」なる語はコンホメーションエピトープおよび非コンホメーションエピトープを意味する。コンホメーションエピトープおよび非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在下、前者への結合が喪失し、後者への結合が喪失しない点で区別される。T細胞エピトープは非コンホメーションエピトープであり、すなわち、それは直鎖状であり、一方、B細胞エピトープはコンホメーションまたは非コンホメーションエピトープでありうる。直鎖状B細胞エピトープは、典型的には、5〜20アミノ酸長の種々の長さを有する。
適切には、抗原配列は病原体に由来する。抗原配列は、適切には、ウイルス、細菌、原生動物および多細胞寄生生物からなる群から選択される病原体に由来する。もう1つの実施形態においては、抗原配列は、がん（以下、癌と称される）細胞に由来する。
幾つかの実施形態においては、前記の少なくとも1つの不変鎖は、少なくとも2つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結される。したがって、幾つかの実施形態においては、抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片の数は3、4、5、6、8もしくは10またはそれ以上である。幾つかの実施形態においては、各不変鎖要素および各抗原性要素は、以下に記載するとおり、互いに機能的に連結される。
抗原は、例えば、ヒト病原体もしくは非ヒト病原体、例えば、ヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染する細菌、真菌、寄生微生物もしくは多細胞寄生生物、または癌細胞もしくは腫瘍細胞に由来しうる（例えば、それらから入手可能である）。1つの実施形態においては、抗原は組換えタンパク質、例えば組換え原核生物タンパク質である。
本発明の1つの目的は、病原生物、癌特異的ポリペプチドおよび抗原ならびに異常な生理学的応答に関連するタンパク質またはペプチドに由来する抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは該タンパク質もしくはペプチドの断片を含むことであるが、これらに限定されるものではない。
より好ましくは、本発明の1つの目的は、以下のタイプの病原体、すなわち、ウイルス、微生物および寄生生物のいずれかに由来する抗原を含むことである。哺乳類病原体、すなわち、哺乳動物を特異的に標的化する病原体から抗原を得ることが好ましい。ヒト病原体から抗原を得ることがより好ましい。一般に、ヒト病原体に関連していることが判明している任意の抗原が使用されうる。
もう1つの実施形態においては、鳥類病原体、すなわち、鳥類または家禽を特異的に標的化する病原体から抗原を得ることが好ましい。ニワトリ（gallus gallus domesticus）から抗原を得ることがより好ましい。一般に、鳥類病原体に関連していることが判明している任意の抗原が使用されうる。
更にもう1つの実施形態においては、魚類病原体、すなわち、魚類を特異的に標的化する病原体から抗原を得ることが好ましい。養魚場で飼育されうる魚類から抗原を得ることがより好ましい。一般に、魚類病原体に関連していることが判明している任意の抗原が使用されうる。
ウイルス抗原
好ましい実施形態においては、少なくとも1つの抗原は以下のウイルス科（それらに限定されるものではない）のいずれかに由来しうる：アデノウイルス科、アレナウイルス科、アストロウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科およびトガウイルス科。
幾つかの実施形態においては、少なくとも1つの抗原は、レトロウイルス、フラビウイルス科ウイルス、オルトミクソウイルス、ヘルペスウイルス科、アレナウイルス、フィロウイルス科、ポックスウイルス科およびパポバウイルス科からなる群から選択されるウイルスに由来しうる。
1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）に由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルスおよび黄熱病ウイルスからなる群から選択されるフラビウイルス科ウイルスに由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスBおよびインフルエンザウイルスCから選択されるオルトミクソウイルスに由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタインバーウイルスからなる群から選択されるヘルペスウイルス科ウイルスに由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、ルホウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルスおよびホワイトウォーターアロヨウイルスからなる群から選択されるアレナウイルスに由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスからなる群から選択されるフィロウイルス科ウイルスに由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも１つの抗原または抗原配列は、天然痘ウイルスのようなポックスウイルス科ウイルスに由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも１つの抗原または抗原配列は、パピローマウイルスのようなパポバウイルス科ウイルスに由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis、結核菌）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis、炭疽菌）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属種およびビブリオ（Vibrio）属種からなる群から選択される細菌に由来しうる。もう1つの実施形態においては、少なくとも1つの抗原または抗原配列は、プラスモジウム（Plasmodium）属種、例えばプラスモジウム・ファルシパルム（P. falciparum、熱帯熱マラリア原虫）、プラスモジウム・ビバックス（P. vivax、三日熱マラリア原虫）、プラスモジウム・ノウレシ（P. knowlesi、二日熱マラリア原虫）またはプラスモジウム・マラリエ（P. malariae、四日熱マラリア原虫）、リーシュマニア（Leishmania）属種、およびトリパノソーマ（Trypanosoma）属種、例えばトリパノソーマ・ブルセイ（T. brucei）、トリパノソーマ・クルージ（T. cruzi）、トリパノソーマ・ローデシエンス（T. rhodesiense）、トリパノソーマ・ビバックス（T. vivax）またはトリパノソーマ・コンゴレンス（T. congolense）からなる群から選択される寄生生物に由来しうる。
幾つかの実施形態においては、前記の少なくとも1つの抗原性タンパク質またはペプチドは、以下のものからなる群から選択され、および／または以下のいずれかの、少なくとも1つの抗原性断片でありうる：水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-GP）、インフルエンザA NS-1（非構造タンパク質1）、インフルエンザA M1（マトリックスタンパク質1）、インフルエンザA NP（核タンパク質）、LCMV NP、LCMV GP、エボラGP、エボラNP、マウスガンマヘルペスウイルスM2、M3およびORF73（例えば、MHV-68 M2、M3およびORF73）、ニワトリ卵白アルブミン（OVA）、またはヘルパーT細胞エピトープ。
微生物抗原
幾つかの実施形態においては、前記の少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片は微生物に由来する。より詳細には、少なくとも1つの抗原は以下の非網羅的一覧の1つに由来しうる：Anthrax (Bacillus anthracis)、Mycobacterium tuberculosis、Salmonella (Salmonella gallinarum、S. pullorum、S. typhi、S. enteridtidis、S. paratyphi、S. dublin、S. typhimurium)、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Corynebacterium diphtheriae、Bordetella pertussis、Campylobacter、例えばCampylobacter jejuni、Crytococcus neoformans、Yersinia pestis、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberculosis、Listeria monocytogenes、Leptospira属種、Legionella pneumophila、Borrelia burgdorferi、Streptococcus属種、例えばStreptococcus pneumoniae、Neisseria meningitides、Haemophilus influenzae、Vibrio属種、例えばVibrio cholerae O1、V. cholerae非O1、V. parahaemolyticus、V. parahaemolyticus、V. alginolyticus、V. furnissii、V. carchariae、V. hollisae、V. cincinnatiensis、V. metschnikovii、V. damsela、V. mimicus、V. fluvialis、V. vulnificus、Bacillus cereus、Aeromonas hydrophila、Aeromonas caviae、Aeromonas sobria、Aeromonas veronii、Plesiomonas s
higelloides、Shigella属種、例えばShigella sonnei、S. boydii、S. flexneriおよびS. dysenteriae、腸毒性大腸菌 (Enterovirulent Escherichia coli EEC) (Escherichia coli - 腸内毒素原性 (ETEC)、Escherichia coli - 腸管病原性 (EPEC)、Escherichia coli O157:H7腸管出血性 (EHEC)、Escherichia coli - 腸管侵入性 (EIEC))、Staphylococcus属種、例えばS. aureusおよび特にバンコマイシン中間体／耐性種 (VISA/VRSA)または多剤耐性種（MRSA）、Cryptosporidium parvum、Brucella属種、例えばB. abortus、B. melitensis、B.ovis、B. suisおよびB. canis、Burkholderia malleiおよびBurkholderia pseudomallei、Chlamydia psittaci、Coxiella burnetii、Francisella tularensis、Rickettsia prowazekii、Histoplasma capsulatumおよびCoccidioides immitis。
好ましい実施形態においては、前記の少なくとも1つの抗原性タンパク質またはペプチドは、Mycobacterium tuberculosis、Bacillus anthracis、Staphylococcus属種およびVibrio属種の群から選択される微生物に由来する。
寄生生物抗原
1つの実施形態は、コードされる少なくとも1つの抗原性タンパク質またはペプチドが寄生生物由来である、核酸構築物に関する。
本発明のもう1つの実施形態は、前記病原体のいずれかに由来する少なくとも2つの抗原性タンパク質またはペプチドの組合せを含む核酸構築物に関する。
好ましくは、該抗原は、以下のもの（それらに限定されるものではない）からなる群から選択される寄生生物に由来する：Plasmodium属種、例えばPlasmodium malariae、Plasmodium ovale、Plasmodium vivax、Plasmodium falciparum、Endolimax nana、Giardia lamblia、Entamoeba histolytica、Cryptosporidum parvum、Blastocystis hominis、Trichomonas vaginalis、Toxoplasma gondii、Cyclospora cayetanensis、Cryptosporidium muris、Pneumocystis carinii、Leishmania donovani、Leishmania tropica、Leishmania braziliensis、Leishmania mexicana、Acanthamoeba属種、例えばAcanthamoeba castellaniiおよびA. culbertsoni、Naegleria fowleri、Trypanosoma cruzi、Trypanosoma brucei rhodesiense、Trypanosoma brucei gambiense、Isospora belli、Balantidium coli、回虫(Ascaris lumbricoides)、鉤虫(Necator Americanus、Ancylostoma duodenal)、蟯虫(Enterobius vermicularis)、回虫(Toxocara canis、Toxocara cati)、糸状虫(Dirofilaria immitis)、糞線虫類(Stronglyoides stercoralis)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、フィラリア(Wuchereria bancrofti、Brugia malayi、Onchocerca volvulus、Loa loa、Mansonella streptocerca、Mansonella perstans、Mansonella ozzardi)、アニサキネ(Anisakine)幼虫(Anisakis simplex (ニシン虫)、Pseudoterranova(Phocanema, Terranova) decipiens (タラまたはアザラシ虫)、Contracaecum属種、Hysterothylacium (Thynnascaris属種) Trichuris trichiura、無鉤条虫(Taenia saginata)、有鉤条虫(Taenia solium)、魚類条虫類(Diphyllobothrium latum)、瓜実条虫(Dipylidium caninum)、腸管吸虫(Fasciolopsis buski)、血吸虫(Schistosoma japonicum、Schistosoma mansoni) Schistosoma haematobium)、肝吸虫(Clonorchis sinensis)、東洋肺吸虫(Paragonimus westermani)、および羊肝吸虫(Fasciola hepatica)、Nanophyetus salmincolaおよびN. schikhobalowi。
好ましい実施形態においては、前記の少なくとも1つの抗原性タンパク質またはペプチドは、Plasmodium属種、Leishmania属種およびTrypanosoma属種の群から選択される寄生生物に由来する。
家畜抗原
本発明の1つの態様は、家畜、特に商業的に重要な動物、例えばブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ウサギ、ミンク、マウス、ラット、イヌ、ネコ、家禽、例えばニワトリ、シチメンチョウ、キジなど、魚類、例えばマス、サケおよび他の養殖種に感染する因子または疾患に由来する抗原および／または抗原配列に関する。少なくとも1つの抗原または抗原配列が由来しうるこの場合の疾患または因子の例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：炭疽病、オージェスキー病、ブルータング、ブルセラ症、例えばBrucella abortus、Brucella melitensisまたはBrucella suis；クリミアコンゴ出血熱、エキノコックス症／包虫症、ピコルナウイルス科ウイルス、口蹄疫を引き起こすアフトウイルス属、特に、免疫学的に異なる以下の7つの血清型のいずれか：A、O、C、SAT1、SAT1、SAT2、SAT3、Asia（アジア）1、またはハートウォーター（Heartwater）、日本脳炎、レプトスピラ症、新世界螺旋虫（Cochliomyia hominivorax）、旧世界螺旋虫（Chrysomya bezziana）、パラ結核、Q熱、狂犬病、リフトバレー熱、牛疫、旋毛虫症、野兎病、水疱性口内炎または西ナイル熱;ウシ疾患、例えばウシアナプラズマ症、ウシバベシア症、ウシ性器カンピロバクター症、ウシ海綿状脳症、ウシ結核、ウシウイルス性下痢、伝染性ウシ胸膜肺炎、地方病性ウシ白血病、出血性敗血症、伝染性ウシ鼻気管炎／伝染性膿疱性外膣炎、ランピースキン病、悪性カタル熱、タイレリア症、トリコモナス症またはトリパノソーマ症（ツェツェ伝染）；ヒツジおよびヤギの疾患、例えばヤギ関節炎／脳炎、伝染性無乳症、ヤギ伝染性胸膜肺炎、ヒツジ流行性流産（ovine chlamydiosis）、マエディビスナ、ナイロビヒツジ病、ヒツジ精巣上体炎（Brucella ovis）、小反芻獣疫、サルモネラ症（S. abortusovis）、スクレイピー、羊痘および山羊痘；ウマ疾患、例えばアフリカ馬疫、伝染性ウマ子宮炎、交疫、ウマ脳脊髄炎（東部）、ウマ脳脊髄炎（西部）、ウマ伝染性貧血、ウマインフルエンザ、ウマピロプラズマ病、ウマ鼻肺炎、ウマウイルス性動脈炎、鼻疽、スラ（Trypanosoma evansi）またはベネズエラウマ脳脊髄炎;ブタ疾患、例えばアフリカブタ熱、豚コレラ、ニパウイルス脳炎、ブタ嚢虫症、ブタ生殖および呼吸器症候群、ブタ水疱病または伝染性胃腸炎；トリ疾患、例えばトリクラミジア症、トリ伝染性気管支炎、トリ伝染性喉頭気管炎、トリマイコプラズマ症（M. gallisepticum）、トリマイコプラズマ症（M. synoviae）、アヒルウイルス肝炎、ニワトリコレラ、ニワトリ腸チフス、高病原性トリインフルエンザAまたはB、特にH5N1、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）、マレック病、ニューカッスル病、プルーラム病またはシチメンチョウ鼻気管炎；ウサギおよびげっ歯類疾患、例えばウイルス腸炎、粘液腫症またはウサギ出血性疾患；魚類疾患、例えば流行性造血壊死、伝染性造血壊死、コイ春ウイルス病、ウイルス性出血性敗血症、伝染性膵壊死、伝染性サケ貧血、流行性潰瘍性症候群、細菌性腎疾患（Renibacterium salmoninarum）、ギロダクチルス症（Gyrodactylus salaris）、マダイ・イリドウイルス病；または他の疾患、例えばラクダ痘またはリーシュマニア症。
更にもう1つの実施形態は、前記抗原のいずれかに対して少なくとも85%の同一性を有する抗原性ペプチドまたはタンパク質である、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片に関する。アミノ酸間の相同性または同一性は、既に記載されているBLOSUMスコアリングマトリックスのいずれかにより計算されうる。
癌抗原
1つの実施形態は、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片が癌特異的ポリペプチドまたは癌抗原に由来する、核酸構築物に関する。
多数のタンパク質／糖タンパク質が特定されており、あるタイプの癌に関連づけられている。これらは癌特異的ポリペプチド、腫瘍関連抗原または癌抗原と称される。一般に、癌腫瘍に関連していることが判明している任意の抗原が使用されうる。癌特異的抗原が見いだされうる1つの方法は、減算分析、例えば種々のマイクロアレイ分析、例えばDNAマイクロアレイ分析によるものである。本明細書においては、健常者と癌患者との間、癌患者群の間または同一患者における健常組織と癌組織との間で遺伝子発現パターン（該遺伝子によりコードされるRNAまたはタンパク質のレベルで見られるもの）を比較する。ほぼ等しい発現レベルを示す遺伝子は互いに「減算」されて、健常組織と癌組織との間で異なる遺伝子／遺伝子産物が残る。このアプローチは当技術分野で公知であり、新規癌抗原を同定する方法または所定の患者もしくは患者群に特異的な遺伝子発現プロファイルを作成するための方法として用いられうる。これが特定した抗原は、単一抗原も、それらが見出された可能性のある組合せも共に、本発明の範囲に含まれる。
好ましくは、少なくとも1つの抗原は、以下のものからなる群から選択される癌特異的ポリペプチド（それらに限定されるものではない）に由来する：MAGE-3、MAGE-1、gp100、gp75、TRP-2、チロシナーゼ、MART-1、CEA、Ras、p53、B-カテニン、gp43、GAGE-1、BAGE-1、PSA、MUC-1、2、3およびHSP-70、TRP-1、gp100/pmel17、ベータ-HCG、Ras突然変異体、p53突然変異体、HMWメラノーマ抗原、MUC-18、HOJ-1、サイクリン依存性キナーゼ4（Cdk4）、カスパーゼ8、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルスHPV 6、11、16、18、31および33型、Bcr-Ablチロシンキナーゼ、癌胎児性抗原（CEA）、テロメラーゼならびにSV40ラージT。
1つの実施形態は、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片が、p53、HER-2/neu、テロメラーゼおよびメラノーマ抗原の群から選択される癌特異的ポリペプチドに由来する、核酸構築物に関する。
異常な生理学的反応に関連する抗原
1つの実施形態は、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片が、異常な生理学的応答に関連するポリペプチドに由来する、核酸構築物に関する。そのような異常な生理学的反応には、自己免疫疾患、アレルギー反応、癌および先天性疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。それらの例の非網羅的な一覧には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬およびクローン病のような疾患が含まれる。
本明細書に記載されている抗原のいずれかの2以上を組合せることは本発明の範囲内である。
機能的リンカー
本発明の1つの態様は、少なくとも1つの不変鎖またはその変異体が少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結されており、不変鎖のC末端が抗原性タンパク質またはペプチドのN末端に機能的に連結されている、核酸構築物に関する。したがって、機能的リンカーは不変鎖と抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片との間に配置される。
不変鎖と抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片との間の機能的リンカーは、直接的な連結、またはスペーサー領域を介した連結である。機能的リンカーなる語は、核酸またはポリペプチドの生物学的プロセシングを保証する様態で核酸構築物またはキメラポリペプチドの2つの部分に共に結合するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列と理解される。機能的リンカーが直接的な連結である場合、オープンリーディングフレームまたはオープンリーディングフレームの断片のいずれかをそれぞれがコードする2つの核酸は互いに直接隣接して、そしてまた、それによりインフレームで配置される。機能的リンカーがスペーサー領域を介したものである場合、少なくとも1つの不変鎖および少なくとも1つの抗原性ペプチドをそれぞれコードするヌクレオチドの間に一連のヌクレオチドが挿入される。スペーサー領域が単に、オープンリーディングフレームを保持する様態で本発明の少なくとも2つの要素を連結する一連のヌクレオチドである、またはスペーサー領域が1以上のシグナルまたは別個の要素（後記に定められているもの）をコードしうる実施形態は、本開示の範囲内である。
適切には、不変鎖は、リンカー配列であるスペーサー領域により、抗原配列に間接的に連結される。適切には、リンカー配列はグリシンおよびセリンを含み、より適切には、グリシンおよびセリンからなり、より適切には、リンカー配列は配列GlySerを含み、より適切には、配列GlySerからなる。あるいは、リンカー配列は「AscI」リンカーを含み、または「AscI」リンカーからなり、該リンカーは、ポリヌクレオチド配列AGGCGCGCCによりコードされるポリペプチド配列ArgArgAlaを有するリンカーである。あるいは、リンカー配列は「res」リンカーを含み、または「res」リンカーからなり、該リンカーは、ポリヌクレオチド配列AGCGATCGCTATTTAAATAGGCGCGCC（配列番号52）によりコードされるポリペプチド配列SerAspArgTyrLeuAsnArgArgAla（配列番号51）を有するリンカーである。あるいは、リンカー配列はヒトインフルエンザ血球凝集素（HA）タグ（ポリペプチド配列番号53、ポリヌクレオチド配列番号54）を含み、より適切には、それからなる。
適切には、リンカー配列は、50個以下、より適切には30個以下、より適切には10個以下、より適切には5個以下の残基からなる。
もう1つの実施形態においては、機能的リンカーは、クラスII MHC分子の少なくとも1つのヘルパーエピトープをコードするスペーサー領域を含む。ヘルパーエピトープの一例はジフテリア毒素のような免疫原性決定基である。特にジフテリア毒素B断片COOH末端領域はマウスにおいて免疫性であることが示されている。更に、HSP70の一部または全部、ならびに他の免疫原性ペプチド、例えばインフルエンザウイルスもしくは免疫原性配列、またはHLAクラスIおよびクラスII分子へのアンカーモチーフを含有するペプチドも、該核酸構築物のスペーサー領域においてコードされうる。
更にもう1つの実施形態においては、核酸構築物の機能的リンカーは少なくとも1つのsiRNAまたはmiRNAコード配列を含みうる。siRNA（低分子干渉RNA）およびmiRNA（マイクロRNA）は配列特異的に内因性RNAを標的化して、分解をもたらす。したがって、本発明の核酸構築物内でコードされるsiRNAまたはmiRNAは、望ましくない遺伝子産物を標的化するように選択されうる。
もう1つの実施形態においては、機能的リンカーは少なくとも1つのポリリンカーまたはマルチクローニング部位（MCS）を含む。ポリリンカーおよびMCSは、制限酵素認識配列（すなわち、制限酵素が、平滑またはスタッガード（staggered）様態でDNAを切断して、核酸構築物内へのDNAの他の断片／配列のサブクローニングを容易にする部位）を含む一連のヌクレオチドである。ポリリンカー／MCSの認識配列は、典型的には、ユニーク（唯一）なものである。このことは、それらが核酸構築物の他のいずれの部位にも存在しないことを意味する。機能的リンカーは更に、リボソームからの新生ポリペプチドの遊離をシグナル伝達する1以上の停止または終止コドンを含みうる。機能的リンカーはまた、少なくとも1つのIRES（内部リボソーム侵入部位）および／または少なくとも1つのプロモーターを含みうる。IRESは、より大きなタンパク質合成過程の一部として、メッセンジャーRNA（mRNA）配列の中央部における翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。プロモーターは、遺伝子が転写されることを可能にするDNA配列である。後記に詳細に記載されているとおり、プロモーターはRNAポリメラーゼにより認識され、そしてそれが転写を開始させる。プロモーターは一方向性または双方向性でありうる。
好ましい実施形態においては、不変鎖と少なくとも1つの抗原との間の領域にわたる機能的リンカーは、少なくとも1つのポリリンカー、少なくとも1つのプロモーター、そしてまた、所望により、少なくとも1つのIRESを含む機能的リンカーである。これらの要素は任意の順序で配置されうる。もう1つの好ましい実施形態においては、不変鎖の終止コドンが欠失しており、ポリリンカーは、該ポリリンカー内に挿入される少なくとも1つの抗原のインフレーム読取りを可能にするようにオープンリーディングフレームを維持する様態でベクター内にクローニングされている。これは、1つの工程または複数のクローニング工程での同一構築物内への複数の抗原のサブクローニングを促進する、そして不変鎖と同じフレームでの複数の抗原の同時発現を可能にするという利点を有する。翻訳終結のために、ポリリンカーの後に終止コドンが挿入されうる。この実施形態は、前記ヘルパーエピトープのいずれか、mi/siRNAまたは本明細書に記載されている他の要素のいずれかと組合されうる。
好ましい実施形態においては、少なくとも1つの不変鎖と少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはそれらの断片との間に配置される機能的リンカーは、好ましくは、該構築物のオープンリーディングフレームの可読性を保証するものであり、したがって、抗原性ペプチドは少なくとも1つの機能的リンカーの後に配置され、該機能的リンカー自体は少なくとも1つの不変鎖またはその変異体の後に配置される。少なくとも１つの抗原性ペプチドをコードする配列は、好ましくは、不変鎖の末端部分に配置され、機能的リンカーはそれらの間に挿入される。該末端部分は不変鎖またはその断片の最初または最後の残基である。
幾つかの実施形態においては、不変鎖は1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結されており、該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片は少なくとも1つのさらなる抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結されており、ここで、該抗原体タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片は、本明細書に記載されているとおり、互いに機能的に連結されている。
組合せ
少なくとも1つの不変鎖および少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは該タンパク質もしくはペプチドの断片である複数の要素を核酸構築物がコードすることは本発明の範囲内である。したがって、互いにおよび複数の抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片にそれぞれが機能的に連結された複数の不変鎖を有することは本発明の範囲内に含まれ、ここで、これらも機能的に連結されている。したがって、核酸構築物の要素は互いに機能的に連結される必要がある。1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは該タンパク質もしくはペプチドの断片にそれぞれが機能的に連結されている幾つかの不変鎖系列（ここで、これらの系列は互いに機能的に連結されている）は本発明に含まれる。不変鎖のそれぞれは、前記のプロテアーゼ切断部位を含みうる。したがって、複数のプロテアーゼ切断部位を有する実施形態も本明細書に開示されている。
本発明の利点および非常に重要な態様は、任意のタイプの免疫応答、例えばT細胞媒介性応答および抗体媒介性応答が、共に、弱い抗原であることが知られているエピトープ、未知の抗原特性のポリペプチドおよび複数のエピトープ／抗原で同時に開始されうるということに関する。プロテアーゼ部位の挿入は単量体または三量体としての抗原の分泌をもたらし、これは免疫応答の改善をもたらす。
したがって、好ましい実施形態が、複数の抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドの断片（例えば、2、3、4、5、6、8、10、12個またはそれ以上の抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドの断片）に機能的に連結された少なくとも1つの不変鎖（ここで、該不変鎖はプロテアーゼ切断部位を含む）をコードする核酸構築物であることも、本発明の範囲内である。
核酸構築物は追加的な要素を含みうる。これらには以下のものが含まれる、それらに限定されるものではない：内部リボソーム侵入部位（IRES）、抗原提示に関連するタンパク質、例えばLAMP、カルレティキュリンおよびHsp70をコードする遺伝子、細胞内拡散に関連するタンパク質、例えばVP22、HIV Tat、Cx43または他のコネキシンおよび細胞間ギャップジャンクション構成要素をコードする遺伝子、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）活性化分子、例えばH60およびサイトカイン、ニワトリ卵白アルブミンまたは任意のヘルパーT細胞エピトープをコードする遺伝子。
1つの実施形態においては、核酸構築物は、抗原提示に関連するタンパク質、例えばLAMP、LIMP、カルレティキュリンまたはHsp70をコードする少なくとも1つの遺伝子を含む。
もう1つの実施形態においては、核酸構築物は、細胞内拡散に関連するタンパク質、例えばVP22、Cx43、HIV Tat、他のコネキシンまたは細胞間ギャップジャンクション構成要素をコードする少なくとも1つの遺伝子を含む。
プロモーター
本明細書においては、プロモーターなる語は、RNAポリメラーゼIIの開始部位の周囲にクラスター化された転写制御モジュールの一群を意味するものとして用いられる。プロモーターがどのように組織化されるかに関する知見の多くは、SV40初期転写単位およびHSVチミジンキナーゼ（tk）のウイルスプロモーターを含む幾つかのウイルスプロモーターの分析に由来する。これらの研究は、より最近の研究により補足されて、プロモーターが複数の異なる機能モジュールから構成され、該機能モジュールのぞれぞれが約7〜20 bpのDNAからなり、転写活性化タンパク質のための1以上の認識部位を含有することを示している。各プロモーターにおける少なくとも1つのモジュールは、RNA合成の開始部位を適切に配置するように機能する。この最もよく知られた例はTATAボックスであるが、TATAボックスを欠く幾つかのプロモーター、例えば哺乳類末端デオキシヌクレオドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターにおいては、該開始部位自体を覆う別個の要素が、開始部位を補正するのを補助する。
追加的なプロモーター要素が転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30〜110 bp上流の領域に位置するが、幾つかのプロモーターは開始部位の下流にも機能的要素を含有することが最近示されている。要素間の間隔は融通性に富み、したがって、要素が互いに対して反転または移動してもプロモーター機能は維持される。tkプロモーターにおいては、要素間の間隔は、活性が低下し始める前に、50 bpに増加されうる。プロモーターに応じて、個々の要素は、転写を活性化するために協調的または独立して機能しうるらしい。核酸構築物によりコードされる配列の転写開始を導きうる任意のプロモーターが本発明において使用されうる。
本発明の1つの態様は、少なくとも1つの機能的に連結された不変鎖および抗原性タンパク質またはペプチドをコードする配列が、構築物の発現を可能にするプロモーターの後に位置する（該配列の前に、構築物の発現を可能にするプロモーターがある）、核酸構築物を含む。
もう1つの態様においては、プロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、生物特異的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーターの群から選択される。
プロモーターの例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：構成的プロモーター、例えばシミアンウイルス40（SV40）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス長末端反復プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、ヒトアクチンプロモーター、ヒトミオシンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター、誘導性プロモーター、例えばメタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーター（tet-onまたはtet-off）、組織特異的プロモーター、例えばHER-2プロモーターおよびPSA関連プロモーター、ならびにプロモーターの両方向から転写を開始させうる双方向性プロモーター。
誘導性プロモーターを使用する利点は、随意に活性化されうる「休眠（dormant）」ワクチンを提供する選択肢を含む。これは、ワクチン接種が体内で全身的ではなく局所的でのみ誘導されるのが好ましい場合（例えば、癌を含む場合）、またはワクチンがワクチン接種時に被投与者の健康に有害である場合に有用でありうる。
好ましい実施形態においては、核酸構築物は、CMVプロモーター、SV40プロモーターおよびRSVプロモーターの群から選択されるプロモーターを含む。CMVプロモーターおよびSV40プロモーターが特に好ましい。
送達ビヒクル
1つの態様においては、本開示は、送達（運搬）ビヒクル内に含まれる前記のいずれかに記載されている核酸構築物に関する。送達ビヒクルは、ヌクレオチド配列またはポリペプチドまたはその両方を少なくとも1つの媒体から別の媒体へ輸送しうる物質である。送達ビヒクルは、一般に、核酸構築物内でコードされる配列の発現のために、および／または構築物もしくはそれにおいてコードされるポリペプチドの細胞内送達のために使用される。送達ビヒクルが、RNAに基づくビヒクル、DNAに基づくビヒクル／ベクター、脂質に基づくビヒクル、ウイルスに基づくビヒクルおよび細胞に基づくビヒクルの群から選択されるビヒクルであることは、本発明の範囲内である。そのような送達ビヒクルの例には、生分解性ポリマーミクロスフェア、脂質に基づく製剤、例えばリポソーム担体、コロイド金粒子上の構築物のコーティング、リポ多糖、ポリペプチド、多糖、およびウイルスビヒクルのペグ化（pegylated）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
好ましい実施形態は、機械的または電気的技術による、裸DNAとしての核酸構築物の送達（運搬）に関する。特に、金粒子上の核酸構築物のコーティングは、好ましい実施形態である。金粒子上の核酸構築物の送達は、遺伝子銃のような粒子衝撃装置を使用する弾道移動により行われる。
より好ましい実施形態は送達ビヒクルとしてのウイルスを含み、ここで、該ウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、フォーミーウイルス、サイトメガロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ポックスウイルス、MVAに基づくベクター、RNAウイルスベクターおよびDNAウイルスベクターの非網羅的群から選択される。そのようなウイルスベクターは当技術分野においてよく知られている。
ウイルスベクターは、しばしば、2つの成分、すなわち、修飾ウイルスゲノムとそれを囲むコート構造とから構成されるが、時には、ウイルスベクターは裸形態で導入され、またはウイルスタンパク質以外のタンパク質で被覆（コーティング）される。現在のほとんどのベクターは、野生型ウイルスに類似したコート構造を有する。この構造はウイルス核酸をパッケージングし保護し、標的細胞に結合し侵入する手段を提供する。
好ましくは、ウイルスベクターを野生型ウイルスゲノムから修飾して、標的細胞における該ウイルスの増殖を不可能にする一方で、感染性粒子を調製するために使用する宿主細胞（例えば、パッケージングまたはヘルパー細胞）において該ウイルスが増殖することを可能にする。ベクター核酸は、一般に、ヘルパー系における複製およびパッケージングのための不可欠なシス作用性ウイルス配列、ならびに標的細胞に送達されるポリヌクレオチドの発現を調節するための発現制御配列を含む。他のウイルス機能は、当該分野で公知の特定のパッケージングまたはヘルパー細胞系においてトランスで発現される。
アデノウイルス
より好ましい実施形態においては、本明細書に記載されている核酸構築物を含むビヒクルはアデノウイルスである。アデノウイルスゲノムは、ウイルス複製サイクルを完了するために必要な約30個を超える遺伝子を運ぶ約36 kbの線状二本鎖DNA分子からなる。初期遺伝子は、抗ウイルス宿主免疫応答を調節すると考えられているE3領域を除いて、ウイルス複製に不可欠な4つの領域（E1〜E4）に分けられる。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムの転写制御に関与するタンパク質をコードする。E2領域遺伝子（E2AおよびE2B）の発現は、ウイルス複製に必要なポリペプチドの合成をもたらす。E3領域によりコードされるタンパク質は細胞傷害性T細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防ぐ。E4領域によりコードされるタンパク質はDNA複製、後期遺伝子発現およびスプライシングならびに宿主細胞遮断に関与する。後期遺伝子は一般に、ウイルスキャプシドに寄与する構造タンパク質をコードする。また、アデノウイルスゲノムはシス作用性5'および3' ITR（逆方向末端反復）ならびにパッケージング配列（DNA複製に不可欠なもの）を含有する。ITRはDNA複製起点を含有し、一方、キャプシド形成領域は感染粒子内へのアデノウイルスDNAのパッケージングに必要である（例えば、US 2004/0157307を参照されたい）。
本発明の最も好ましい実施形態においては、本明細書に記載されている核酸構築物を含むビヒクルは複製欠損アデノウイルスまたは条件付き複製欠損アデノウイルスである。アデノウイルスベクターは、特定の細胞（例えば、増殖性細胞）における選択的複製のために条件付きで複製されるように設計されうる（CRAdベクター）。もう1つの態様においては、アデノウイルスベクターはE1機能に関して複製欠損型（例えば、E1の全体的または部分的な欠失または突然変異誘発による）である。ベクターのアデノウイルスバックボーンは追加的な修飾（1以上のウイルス遺伝子における欠失、挿入または突然変異）を含みうる。E2修飾の一例は、DBP（DNA結合タンパク質）をコードする遺伝子上に局在する温度感受性突然変異により例示される。アデノウイルス配列は、E4領域の全部または一部が欠失していることも可能である。非必須E3領域内の追加的な欠失は、送達されるポリヌクレオチドのサイズの増加を可能にしうる。しかし、免疫系または炎症反応からウイルスが逃れることを可能にするポリペプチド（例えば、gp19k）をコードするE3配列の全部または一部を保持することが有利でありうる。ITRおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残存合成を無効にする実質的な遺伝子修飾を含む第2世代ベクターも、導入細胞における発現遺伝子の長期的発現を改善するために使用されうる。細胞内に導入される核酸構築物は、シス作用性配列を除いて、ウイルスゲノムの任意の位置に挿入されうる（例えば、US 2004/0157307を参照されたい）。
アデノウイルスは、任意のヒトまたは動物、特にイヌ、鳥類、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサルに由来することが可能であり、あるいはハイブリッドウイルスでありうる。任意の血清型が使用されうる。しかし、ヒトアデノウイルスが好ましく、そのようなウイルスは例えばATCC（American Type Culture Collection）から入手可能である。
本発明の好ましい実施形態は、アデノウイルス、例えばヒツジアデノウイルス、イヌアデノウイルスII型、修飾ワクシニアアンカラ（MVA）またはMVA-BNを含む。
適切には、本発明における使用のためのアデノウイルスはヒトアデノウイルスに由来する。ヒト由来のアデノウイルスの例としては、Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Ad11、Ad19、Ad24、Ad34およびAd35が挙げられる。Ad5に基づくベクターは多数の遺伝子治療治験において広範に使用されているが、自然感染による一般集団の既存免疫ゆえに、Ad5および他のヒトC群アデノウイルスベクターの使用には制約があるかもしれない。Ad5および他のヒトC群メンバーは、最も血清学的に優勢な血清型の1つである傾向がある。また、既存ベクターに対する免疫は治療中のベクターへの曝露の結果として生じうる。血清学的に優勢なベクターに対するこれらのタイプの既存または生成免疫は遺伝子治療またはワクチン接種の取り組みの有効性を制限しうる。したがって、代替アデノウイルス血清型は、宿主免疫応答を回避しうる遺伝子送達系の追求における非常に重要な標的となる。
あるいは、本発明における使用のためのアデノウイルスベクターは非ヒト類人猿アデノウイルスに由来する。非ヒト類人猿、例えばチンパンジー、ボノボ、アカゲザルおよびゴリラから多数のアデノウイルスが分離されており、これらのアデノウイルスに由来するベクターは、これらのベクターによりコードされるトランスジーンに対する強力な免疫応答を誘導する（Collocaら, (2012) Sci. Transl. Med. 4:1-9; Royら, (2004) Virol.324: 361-372; Royら, (2010) J. of Gene Med. 13:17-25）。非ヒト類人猿アデノウイルスに基づくベクターの特定の利点には、標的集団におけるこれらのアデノウイルスに対する交差中和抗体の相対的な欠如が含まれる。例えば、既存の中和抗体応答との特定のチンパンジーアデノウイルスの交差反応は標的集団においては2%しか存在しないが、特定の候補ヒトアデノウイルスベクターの場合には35%存在する。
適切には、アデノウイルスは、チンパンジーアデノウイルス、例えばChAd3、ChAd63、ChAd83、ChAd155、Pan 5、Pan 6、Pan 7（C7とも称される）またはPan 9である非ヒト類人猿アデノウイルスに由来する。そのような株の例はWO03/000283、WO2005/071093、WO2010/086189およびGB1510357.5に記載されており、また、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209および他の供給源から入手可能である。あるいは、アデノウイルスは、ボノボから分離された非ヒト類人猿アデノウイルス、例えばPanAd1、PanAd2またはPanAd3に由来しうる。本明細書に記載されているそのようなベクターの例は、例えばWO2005/071093およびWO2010/086189において見出されうる。それらはまた、WO2013/52799、WO2013/52811およびWO2013/52832に記載されているとおり、ゴリラから分離されたアデノウイルスに由来しうる。
アデノウイルス粒子または空アデノウイルスキャプシドも、ウイルス媒介性コインターナリゼーション（co-internalization）過程により、核酸構築物または核酸に基づく送達ベクターを導入するために使用されうる。この過程は、1以上の脂質層を含む脂質小胞またはポリカルベンのようなカチオン剤の存在下で達成されうる。
アデノウイルス粒子は、ウイルス複製に必要な欠損ウイルス遺伝子をトランスで供給する相補細胞系またはヘルパーウイルスを使用して、当技術分野における任意の通常の技術に従い製造され、増殖されうる。アデノウイルス粒子は、培養上清からだけでなく、細胞溶解後の細胞からも回収可能であり、所望により、標準的な技術（例えば、クロマトグラフィーおよび超遠心分離）に従い更に精製されうる。
細胞型特異的標的化は、ウイルス表面タンパク質の修飾により、広範な宿主範囲を有するアデノウイルスに由来するベクターを使用して達成されうる。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面に存在する細胞受容体への付着により決定される。これに関しては、アデノウイルスカプシドの表面に存在するファイバーおよびペントンが細胞付着において重要な役割を果たす。したがって、アデノウイルスの細胞標的化は、特有の細胞表面受容体との特異的相互作用が可能な修飾ファイバーおよび／またはペントンを生成させるための、ファイバーおよび／またはペントンをコードするウイルス遺伝子の遺伝的修飾により行われる。
本発明の1つの態様は、MHC-I応答を刺激する少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドの断片と少なくとも1つの抗原とをコードするヌクレオチド構築物を含むアデノウイルスベクターに関する。
本発明のもう1つの態様は、ヌクレオチド構築物が、MHC-II応答を刺激する少なくとも1つのタンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドの断片をコードする、アデノウイルスベクターに関する。
好ましくは、アデノウイルスベクターは、少なくとも1つの抗原が少なくとも1つのMHC応答刺激性タンパク質もしくはペプチドまたはMHC応答刺激性タンパク質もしくはペプチドの断片に機能的に連結されている配列を含む。MHC刺激性タンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドの断片は、好ましくは、MHC関連タンパク質またはペプチドである。そのようなMHC関連ペプチドは、ER局在化ペプチド、ゴルジ局在化ペプチド、エンドソームペプチドローディング区画局在化ペプチド、リソソーム、MIIC、CIIV、メラノソーム、分泌顆粒およびビルベック（Birbeck）顆粒の群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
より好ましくは、アデノウイルスベクターはエンドソームペプチドローディング区画局在化ペプチドを含む。そのようなエンドソームペプチドローディング区画局在化ペプチドは、ソーティングシグナルペプチド、LAMP、LIMPおよび不変鎖の群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
最も好ましくは、アデノウイルスベクターは少なくとも1つのMHC応答刺激性タンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドの断片を含み、該MHC応答刺激性タンパク質もしくはペプチドまたはタンパク質もしくはペプチドの断片は不変鎖である。
アデノウイルスベクターは更に、ウイルスまたはその中に含まれる構築物の拡散を補助するタンパク質を含みうる。そのようなタンパク質には、コネキシン、ギャップジャンクション関連タンパク質およびポア形成タンパク質が含まれる。本発明の好ましい実施形態は、細胞間拡散に関連するタンパク質、すなわち、VP22、Cx43およびHIV Tatのいずれか1以上をコードする又は含むアデノウイルスベクターを含む。
組換え細胞
本発明の1つの態様は、前記のいずれかに記載されている核酸構築物を含む細胞に関する。そのような組換え細胞は、インビトロ研究の手段として、または核酸構築物のための送達ビヒクルとして、または遺伝子治療計画の一部として使用されうる。本発明の核酸構築物および核酸に基づくベクターは、当技術分野でよく知られた技術により細胞内に導入可能であり、そのような技術には、細胞の核内へのDNAの微量注入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション／リポソーム融合および粒子衝撃が含まれる。適切な細胞には、自己細胞および非自己細胞が含まれ、異種細胞が含まれうる。
好ましい実施形態においては、本発明の核酸構築物は抗原提示細胞（APC）内に含まれる。MHC分子と結合して表面に抗原を提示する任意の細胞が抗原提示細胞とみなされる。そのような細胞には、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、ハイブリッドAPC、および育成（foster）APCが含まれるが、これらに限定されるものではない。ハイブリッドAPCの製造方法は当技術分野でよく知られている。
より好ましい実施形態においては、APCはプロフェッショナル抗原提示細胞であり、最も好ましくは、APCはMHC-Iおよび／またはMHC-II発現細胞である。
前記のいずれかによるAPCは、患者から得られた幹細胞でありうる。本発明の核酸構築物を導入した後、患者の病態を治療するために、幹細胞を患者に再導入することが可能である。好ましくは、患者から単離された細胞は、抗原提示細胞に分化しうる幹細胞である。
更に、本発明の核酸構築物を含む抗原提示細胞が共刺激シグナルおよび抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは該タンパク質もしくはペプチドの抗原性断片を全く発現しないことが、本発明の範囲内に含まれる。
キメラタンパク質および抗体
本発明の1つの目的は、少なくとも1つの機能的に連結された不変鎖および少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは該抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片を含む、前記の核酸構築物によりコードされるキメラタンパク質であり、ここで、該不変鎖またはその変異体のC末端は該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、該不変鎖またはその変異体はプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置するTRIMドメインを含みうる。キメラタンパク質は、2以上の完全または部分的な遺伝子または一連の（非）ランダム核酸が共にスプライシングすることにより生成したヌクレオチド配列によりコードされる遺伝的に操作されたタンパク質であると理解される。
本発明の1つの態様は、前記のキメラタンパク質を認識しうる抗体に関する。抗体なる語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の活性部分と理解される。抗体は、例えば、完全免疫グロブリン分子またはそのフラグメントであって免疫学的活性を保有するものである。そのような抗体は、動物の受動免疫のために、または抗体が結合するタンパク質を検出するアッセイにおける用途に使用されうる。
ワクチン組成物
本発明の1つの態様は、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは該抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片に機能的に連結された少なくとも1つの不変鎖をコードする核酸配列を含む組成物であって、該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置するTRIMドメインを含みうる、組成物に関する。したがって、該ワクチンは、前記のいずれかに記載されている核酸構築物を含みうる。該ワクチンは更に、医薬品として使用されうる。
核酸構築物の組成物
本発明の1つの態様は、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは該抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片に機能的に連結された少なくとも1つの不変鎖またはその変異体をコードする核酸配列を含む組成物に関する。したがって、該組成物は、前記のいずれかに記載されている核酸構築物を含みうる。該組成物は更に、医薬品として使用されうる。
本発明の核酸構築物組成物は、公知方法に従い、例えば、賦形剤または安定剤としても公知の1以上の薬学的に許容される担体と活性物質を混合することにより製剤化されうる。これらの賦形剤は、用いられる投与量および濃度においてそれに曝露される細胞または個体に無毒性である場合、任意の個体／動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくはヒトへの投与に関して許容可能でありうる。しばしば、生理的に許容される担体はpH緩衝水溶液である。そのような賦形剤、担体および製剤化方法の例は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing Co, Easton, PA）において見出されうる。生理的に許容される担体の例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：バッファー、例えばホスファート、シトラートおよび他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、例えばEDTA；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（商標）、ポリエチレングリコール（PEG）およびPLURONICS（商標）。
有効な投与に適した薬学的に許容される組成物を製剤化（処方）するためには、そのような組成物は、本発明に従い、有効量の核酸構築物、送達ビヒクル内に含まれる核酸構築物または本明細書に記載されている核酸構築物内にコードされるキメラタンパク質を含む。しばしば、本発明の核酸構築物によりコードされるタンパク質またはポリペプチドで免疫応答を刺激する場合、担体を足場（スカフォールド）として用い、この場合、それに該タンパク質またはペプチドを結合させて、免疫応答の誘導を補助する。担体タンパク質は、免疫原性決定因子を提示するのに適した任意のタンパク質を含む任意の通常の担体でありうる。適切な担体は、典型的には、ゆっくりと代謝される大きな高分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。そのような担体は当業者によく知られている。また、これらの担体は免疫刺激物質（「アジュバント」）として機能しうる。動物の免疫化は、アジュバントおよび／または薬学的担体を使用して行われうる。通常の担体タンパク質には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えばトランスフェリン、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、免疫グロブリン、あるいはホルモン、例えばインスリンが含まれるが、これらに限定されるものではない。担体は、アジュバントと共に、またはそれから独立して存在しうる。
以下においては、核酸構築物組成物は、患者における免疫応答の刺激を含む予防的および治療的使用に有用な組成物を含むと意図される。更に、本発明の組成物は、いずれの全身性もしくは局所毒性反応をも、またはいずれの他の副作用をも誘発しないと想定される。
好ましい1つの実施形態においては、本明細書中で用いる「組成物」なる語は、免疫応答を刺激するための組成物を意味する。
好ましい実施形態においては、核酸構築物はパッケージングされる。核酸構築物のパッケージング手段には、RNAに基づく又はDNAに基づくベクター、脂質に基づく担体、ウイルス発現ベクター、ウイルス性送達ベクター、金コロイド粒子のコーティングおよび生分解性ポリマーミクロスフェアの群から選択される手段が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、前記の送達手段はいずれも、組成物における使用のためのパッケージング目的に使用されうる。
1つの実施形態においては、核酸構築物のパッケージング手段は、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびDNAウイルスベクター（これらに限定されるものではない）の群から選択されるウイルス発現ベクターである。該ウイルスベクターは複製欠損型または条件付き複製欠損型ウイルスベクターでありうる。
本発明の1つの態様は、少なくとも2つのベクターを含む組成物に関する。これは、記載されているいずれかの1つまたは2つの異なる核酸構築物が少なくとも2つのベクター内にパッケージングされうることを含み、これらのベクターは、前記のいずれかに記載されているタイプのものである。本発明は更に、3、4、5または6個のベクターを含む組成物に関する。この場合も、これらのベクターは互いに異なっていても異なっていなくてもよく、前記の同一の又は異なる核酸構築物を含有しうる。
本発明のもう1つの態様は、本明細書に記載されている核酸構築物のいずれかによりコードされる少なくとも1つのキメラタンパク質を含む組成物に関する。キメラタンパク質またはポリペプチドが免疫原として使用される場合、それは組換え細胞における前記の核酸構築物のいずれか1以上の発現により産生可能であり、または当技術分野で公知の方法による化学合成により製造可能である。前記のとおり、そのようなキメラタンパク質および／またはペプチドは、タンパク質／ペプチドに対する免疫学的応答を増強するために担体に結合されることが可能であり、アジュバントおよび／または賦形剤の存在下または非存在下で投与されうる。
1つの実施形態においては、本発明は、組成物の製造のための、本明細書に記載されている核酸構築物の使用に関する。
免疫応答の増強：伝統的なアジュバント
特異的免疫応答を増強するために、アジュバントを組成物中に含有させることが可能である。したがって、抗原／核酸構築物および／または送達ビヒクル（それらはいずれも免疫原性決定因子とも称されうる）と組合された場合に、強力な特異的免疫応答を誘導しうる組成物を与えるアジュバントを特定することが特に重要である。また、免疫原性決定因子は、免疫化前に、2以上の異なるアジュバントと混合されうる。本明細書においては、組成物は免疫原性組成物とも称される。
多数のアジュバントが記載されており、マウス、ラットおよびウサギのような実験動物における抗体の産生のために使用されている。そのような状況においては、副作用の許容度はかなり高い。なぜなら、主要目的は、強力な抗体反応を得ることであるからである。医薬品における使用および使用承認、特にヒトにおける使用のためには、アジュバントを含む組成物の成分が十分に特徴づけられている必要がある。更に、該組成物が、いずれかの有害反応、例えば肉芽腫、膿瘍または発熱の、最小のリスクを有することが必要である。
本発明の1つの実施形態は、アジュバントを含む組成物に関する。好ましい実施形態においては、該組成物は、哺乳動物、例えばヒトへの投与に適している。したがって、好ましいアジュバントは哺乳動物への投与に適しており、最も好ましくは、ヒトへの投与に適している。
もう1つの好ましい実施形態においては、該組成物は、鳥類または魚類、最も好ましくはニワトリ（Gallus gallus domesticus）への投与に適している。したがって、好ましいアジュバントは鳥類または魚類への投与に適している。
アジュバントの選択は更に、所望の免疫応答型、B細胞および／またはT細胞活性化を刺激するその能力により選択可能であり、該組成物は、関連リンパ組織への分布および提示を最適化するように製剤化されうる。
本発明に適したアジュバントは、それが鉱物、細菌、植物、合成物または宿主産物のいずれであっても、それらの起源に従い分類されうる。この分類における最初のグループは、ミネラルアジュバント、例えばアルミニウム化合物である。アルミニウム塩で沈殿した抗原または実施アルミニウム化合物に対して混合または吸着された抗原は、動物およびヒトにおける免疫応答を増強するために広く使用されている。アルミニウム粒子は免疫化の7日後のウサギの所属リンパ節において実証されており、もう1つの重要な機能は、リンパ節自体におけるT細胞含有領域に抗原を導くことである可能性がある。アジュバントの効力は排出リンパ節の刺激と相関することが示されている。多数の研究は、アルミニウム塩と共に投与された抗原が体液性免疫の増強をもたらすことを証明しているが、細胞性免疫は、遅延型過敏により測定された場合、僅かしか増強しないようである。水酸化アルミニウムは補体経路を活性化することも記載されている。このメカニズムは局所炎症応答ならびに免疫グロブリン産生およびB細胞記憶において何らかの役割を果たしている可能性がある。更に、水酸化アルミニウムは抗原を急速な異化から保護しうる。アルミニウム化合物は、主にその安全性の優れた成果ゆえに、現在、ヒトにおいて使用される唯一のアジュバントである。
アジュバントのもう1つの大きなグループは細菌由来のものである。細菌由来のアジュバントは精製され合成されることが可能であり（例えば、ムラミルジペプチド、リピドA）、宿主メディエーターがクローニングされている（インターロイキン1および2）。過去10年間は以下の細菌由来の有効成分のアジュバントの幾つかの化学的精製における大きな進歩をもたらした：百日咳菌、結核菌、リポ多糖、フロイント完全アジュバント（FCA）およびフロイント不完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Mich.）およびMerck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）。本発明による追加的な適切なアジュバントとしては、例えば、Titermax Classicalアジュバント（SIGMA-ALDRICH）、ISCOMS、Quil A、ALUN（US 58767および5,554,372を参照されたい）、リピドA誘導体、コレラ毒素誘導体、HSP誘導体、LPS誘導体、合成ペプチドマトリックス、GMDPなど、および免疫刺激物質と組合されたもの（US 5,876,735）が挙げられる。百日咳菌は本発明の場合におけるアジュバントとして興味深い。なぜなら、それはTリンパ球集団に対する作用により細胞性免疫を調節しうるからである。リポ多糖およびフロイント完全アジュバントに関しては、構造-機能関係の研究を可能にするアジュバント活性部分が特定され合成されている。これらも本発明の免疫原性組成物に含まれるとみなされる。
リポ多糖（LPS）、およびその種々の誘導体、例えばリピドAは、リポソームまたは他の脂質エマルジョンと組合された強力なアジュバントであることが判明している。ヒトにおける一般的使用に十分に低い毒性を有する誘導体が製造可能かどうかは未だ明らかでない。フロイント完全アジュバントはほとんどの実験的研究における標準物である。
急速な異化から抗原を保護するために、免疫原性組成物に鉱油が添加されうる。
多数の他のタイプの物質が本発明の免疫原性組成物におけるアジュバントとして使用されうる。それらには、サポニンのような植物産物、キチンのような動物産物、および多数の合成化学物質が含まれる。
本発明によるアジュバントは、提示されたそれらの作用メカニズムによっても分類されうる。ほとんどのアジュバントは複数のメカニズムにより機能するようであるため、このタイプの分類は必然的にやや恣意的である。アジュバントは、抗原の局在化および送達により、またはマクロファージおよびリンパ球のような免疫系を構成する細胞に対する直接的な影響により作用しうる。本発明によるアジュバントが免疫応答を増強する別のメカニズムは抗原デポーの生成によるものである。これはアルミニウム化合物、油エマルジョン、リポソームおよび合成ポリマーのアジュバント活性に寄与するらしい。リポ多糖およびムラミルジペプチドのアジュバント活性は主にマクロファージの活性化によりもたらされるようであり、一方、百日咳菌はマクロファージおよびリンパ球の両方に影響を及ぼす。本発明の免疫原性組成物に配合された場合に有用でありうるアジュバントの更なる例はUS 5,554,372に記載されている。
したがって、本発明の組成物に有用なアジュバントは以下のものでありうる：無機塩、例えば水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムゲル、油エマルジョンおよび界面活性剤に基づく製剤、例えばMF59（水中油型マイクロフルイダイズ化（microfluidized）界面活性剤安定化油）、QS21（精製サポニン）、AS02（SBAS2、水中油型エマルジョン + モノホスホリルリピドA（MPL）+ QS21）、Montanide ISA 51およびISA-720（安定化油中水型エマルジョン）、アジュバント65（ラッカセイ油、マンニドモノオレアートおよびモノステアリン酸アルミニウムを含有する）、RIBI ImmunoChem Research Inc., Hmilton, Utah）、微粒子アジュバント、例えばビロソーム（インフルエンザ血球凝集素を含む単層リポソーム細胞）、AS04（MPLとのAl塩）、ISCOMS（サポニンと脂質（例えば、コレステロール）との構造化複合体）、ポリアクチド コ-グリコリド（PLG）、微生物誘導体（天然物および合成物）、例えばモノホスホリルリピドA（MPL）、デトックス（MPL + M. Phlei細胞壁骨格）、AGP（RC-529（合成アシル化単糖））、DC chol（リポソームへと自己組織化しうるリポイド免疫刺激剤）、OM-174（リピドA誘導体）、CpGモチーフ（免疫刺激性CpGモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド）、修飾細菌毒素、LTおよびCT（無毒性アジュバント効果を有するもの）、内因性ヒト免疫調節物質、例えば、hGM-CSFまたはhIL-12またはイムダプチン（C3dタンデムアレイ）、不活性ビヒクル、例えば金粒子。
アジュバントの追加的な例には以下のものが含まれる：免疫刺激性油エマルジョン、例えば油中水型、水中油型、水中油中水型、例えばフロイント不完全アジュバント、例えばMontainde（登録商標）、Specol、無機塩、例えばAl(OH)3、AlPO4、微生物産物、サポニン、例えばQual A、合成産物、ならびにアジュバント製剤、および免疫刺激複合体（ISCOM）およびサイトカイン、熱不活性化細菌／成分、ナノビーズ、LPS、LTA。他の一般的に使用されるアジュバントの一覧はWO 2003/089471の6〜8ページに開示されており、その一覧を参照により本明細書に組み入れることとする。
本発明の免疫原性組成物は、希釈剤、例えばバッファー、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、低分子量（約10残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、例えばグルコース、スクロースまたはデキストリン、キレート剤、例えばEDTA、グルタチオンならびに他の安定剤および賦形剤をも含有しうる。中性緩衝生理食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は典型的な適切な希釈剤である。
アジュバントは一般に、製造業者の指示に従った量で免疫原性組成物中に含まれる。
免疫応答の増強：非伝統的なアジュバント
サイトカイン調節
ワクチンが有効であるためには、それが、与えられた病原体に対して適切な免疫応答を誘導する必要がある。これは、発現される抗原の形態（すなわち、細胞内型であるか分泌型であるか）、送達の方法および経路、ならびに送達されるDNAの用量を変更することにより達成されうる。しかし、それは、免疫調節分子、例えばサイトカイン、リンホカインまたは共刺激分子をコードするプラスミドDNA（pDNA）の同時投与によっても達成されうる。これらの「遺伝的アジュバント」は、本明細書中で概説されている「伝統的なアジュバント」または「他の免疫刺激性アジュバント」のいずれかと共に、以下の幾つかの方法で投与されうる：
・2つの別々のプラスミド（一方は免疫原をコードし、他方はサイトカインをコードする）の混合物として；
・スペーサー領域により区切られた単一のバイシストロンまたはポリシストロン性ベクターとして；あるいは
・プラスミドによりコードされたキメラ、または融合タンパク質として；あるいは
・その天然形態、すなわち、タンパク質またはヌクレオチドとして。
一般に、炎症促進性物質（例えば、種々のインターロイキン、腫瘍壊死因子およびGM-CSF）とTH2誘導性サイトカインとの同時投与は抗体応答を増強し、一方、炎症促進性物質およびTH1誘導性サイトカインは体液性応答を低下させ、細胞毒性応答（これは、例えばウイルス保護において、より重要である）を増強する。B7-1、B7-2およびCD40Lのような共刺激性分子も使用されることがある。
この概念は、IL-10をコードするpDNAの局所投与に成功裏に適用されている。プラスミドコード化B7-1（APC上のリガンド）は抗腫瘍モデルにおける免疫応答を成功裏に増強し、GM-CSFをコードするプラスミドとP. yoeliiのスポロゾイト周囲タンパク質（PyCSP）をコードするプラスミドとの混合は後続のチャレンジに対する防御を増強した（一方、プラスミドコード化PyCSP単独体はそれを引き起こさなかった）。GM-CSFは、抗原を樹状細胞がより効率的に提示することをもたらすことが可能であり、IL-2産生およびTH細胞活性化を促進して、免疫応答の増強を導きうる。これは、まず、pPyCSPとpGM-CSFとの混合物で初回刺激（プライミング）すること、およびついで、PyCSPを発現する組換えポックスウイルスで追加刺激（ブースト）することにより、更に増強されうる。しかし、P. chabaudiメロゾイト表面タンパク質1（C末端）-B型肝炎ウイルス表面タンパク質の融合タンパク質（PcMSP1-HBs）およびGM-CSF（またはIFN-γまたはIL-2）をコードするプラスミドの同時注入は、pPcMSP1-HBsのみの送達により得られた防御と比較して、チャレンジに対する防御を実際に阻止した。
他の免疫刺激性アジュバント
1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物または組成物に対する免疫刺激性アジュバントとして、以下のいずれかが使用されうる：
LPS（リポ多糖）、Poly-IC（ポリイノシトールシトシン）または二本鎖RNAに類似した任意の他のアジュバント、LL37、RIG-1ヘリカーゼ、IL-12、IL-18、CCL-1、CCL-5、CCL-19、CCL-21、GM-CSF、CX3CL、CD86、PD-1、分泌型PD-1、IL10-R、分泌型IL10-R、IL21、ICOSL、41BBL、CD40Lおよび免疫応答を刺激する任意の他のタンパク質もしくは核酸配列。
1つの実施形態において、免疫刺激性アジュバントはアデノウイルスファイバータンパク質に融合される。例えば、CX3CLはアデノウイルスファイバータンパク質に融合されうる。
免疫刺激性CpGモチーフ
プラスミドDNA自体が免疫系に対するアジュバント効果を有するようである。細菌由来のプラスミドDNAは自然免疫防御メカニズム、樹状細胞の活性化およびTH1サイトカインの産生を誘発することが判明している。これは、免疫刺激性である特定のCpGジヌクレオチド配列の認識によるものである。CpG刺激性（CpG-S）配列は、細菌由来のDNAにおいては、真核生物におけるよりも20倍頻繁に存在する。これは、真核生物が「CpG抑制」を示すからである。すなわち、CpGジヌクレオチドのペアは、予想されるより遥かに低い頻度で存在する。また、CpG-S配列は低メチル化されている。これは細菌DNAにおいて頻繁に生じ、一方、真核生物に存在するCpGモチーフはシトシンヌクレオチドにおいて全てメチル化されている。これとは対照的に、免疫応答（中和性CpGまたはCpG-Nと称される）の活性化を阻害するヌクレオチド配列は真核生物ゲノムにおいて過剰発現されている。最適な免疫刺激性配列は、2つの5'プリンおよび2つの3'ピリミジンに隣接する非メチル化CpGジヌクレオチドであることが判明している。また、この免疫刺激性ヘキサマーの外側の隣接領域は、場合によっては、標的細胞への結合および取り込みを保証するために、グアニンに富む。
自然免疫系は適応免疫系と相乗的に作用して、DNAコード化タンパク質に対する応答を開始させる。CpG-S配列はポリクローナルB細胞の活性化ならびにサイトカインの発現および分泌のアップレギュレーションを誘導する。刺激されたマクロファージはIL-12、IL-18、TNF-α、IFN-α、IFN-βおよびIFN-γを分泌し、一方、刺激されたB細胞はIL-6および一部のIL-12を分泌する。DNAワクチンのプラスミドバックボーンにおけるCpG-SおよびCpG-N配列の操作はコード化抗原に対する免疫応答の成功を保証し、免疫応答をTH1表現型へと導きうる。これは、病原体が防御のためにTH応答を要する場合に有用である。CpG-S配列はDNAおよび組換えタンパク質の両方のワクチン接種のための外部アジュバントとしても使用されており、様々な成功率が得られている。低メチル化CpGモチーフを有する他の生物もポリクローナルB細胞増殖の刺激を示している。しかし、この背後のメカニズムは単純メチル化より複雑かもしれない。低メチル化マウスDNAは免疫応答を開始することが見出されていない。
DNAの製剤
DNA免疫化の効率は、分解に対してDNAを安定化すること、および抗原提示細胞内へのDNA送達の効率を増加させることにより改善されうる。これは、生分解性カチオン性微粒子（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドと共に製剤化されたポリ(ラクチド-コ-グリコリド)）をDNAでコーティングすることにより達成されうる。そのようなDNAコート化微粒子は、特にミョウバンと混合された場合、組換えワクシニアウイルスと同じくらい有効にCTLを上昇させうる。直径300nmの粒子が抗原提示細胞による取り込みに最も有効であるらしい。
投与
本発明の核酸構築物および組成物は治療有効量で個体に投与されうる。有効量は個体の状態、体重、性別および年齢のような種々の要因によって異なりうる。他の要因には投与方法が含まれる。
1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物はDNA、RNA、LNA、PNA、INA、TINA、HNA、ANA、CNA、CeNA、GNA、TNA、Gap-mers、Mix-mers、モルホリノ（Morpholinos）またはそれらの任意の組合せの形態で対象に送達されうる。
1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物はDNAの形態で対象に送達されうる。
もう1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物はRNAの形態で対象に送達されうる。したがって、核酸構築物は投与前にRNAに転写されうる。
更にもう1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物はタンパク質の形態で対象に送達されうる。したがって、核酸構築物は投与前にタンパク質に翻訳されうる。
本発明の核酸構築物がタンパク質の形態で対象に送達される実施形態においては、該タンパク質は、安定性を増強するために、および／または細胞内への送達を最適化するために修飾されていてもよい。該タンパク質は、ジスルフィド結合の存在（例えば、US 5,102,985は過酸化水素で還元型のタンパク質の溶液を処理して、分子内ジスルフィド架橋を有するタンパク質を90〜96%の収率で得た）、極性残基の増加、表面電荷の最適化、表面塩橋、カプセル化（例えば、メソ多孔性シリカートを使用）により、増強した安定性を有しうる。あるいは、該タンパク質は熱ショックタンパク質（例えば、Hsp-60、Hsp-70、Hsp-90、Hsp-20、Hsp-27、Hsp-84など）、HIV tatトランスロケーションドメイン、アデノウイルスファイバータンパク質または任意の他のタンパク質もしくはドメインに連結されうる。
医薬組成物または獣医用組成物は皮下（scまたはs.c.）、腹腔内（i.p.）、局所、経口および筋肉内（imまたはi.m.）のような種々の経路により個体に投与されうる。医薬組成物の投与は経口的または非経口的に達成される。非経口送達の方法には、局所、動脈内（組織へ直接的に）、筋肉内、脳内（icまたはi.c.）、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内（ivまたはi.v.）、腹腔内または鼻腔内投与が含まれる。本発明は、該組成物で免疫応答を刺激する方法における使用のための適切な局所、経口、全身および非経口医薬製剤を提供する目的をも有する。
例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出製剤および徐放性製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、エアロゾル剤、シロップ剤および乳剤（エマルジョン）のような経口剤形で、または注射により投与されうる。同様に、それらは、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴う若しくは伴わない局所、または筋肉内形態で投与可能であり、全ては、薬学分野の当業者によく知られた形態を用いる。本明細書に記載されている化合物のいずれかを含む、該組成物の有効かつ無毒性の量が使用されうる。また、通常の薬学的に許容される担体、希釈剤、保存剤、アジュバント、バッファー成分などを、必要に応じて含有する凍結乾燥形態および溶液、懸濁液またはエマルジョン形態のような、注射可能な免疫原性ペプチド組成物を製剤化（処方）するのに適切であることが当技術分野で公知であるあらゆる通常の剤形が含まれる。
1つの実施形態においては、初回刺激（プライミング）のための組成物および／または後続の追加刺激（ブースター）ワクチンは徐放または持続放出製剤として投与される。
本発明の核酸構築物または組成物の好ましい投与方法には、全身投与、例えば静脈内または皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、経口投与、直腸投与、膣投与、肺投与および概ね任意の形態の粘膜投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。更に、本明細書に記載されている投与形態のいずれの手段も本発明に含まれることは、本発明の範囲内である。
本発明の核酸構築物または組成物は1回または2、3、4もしくは5回のような任意の回数投与されうる。
好ましい実施形態においては、核酸構築物または組成物を1回投与し、ついで適切なワクチンを投与する。
もう1つの好ましい実施形態においては、核酸構築物または組成物は、ワクチンの投与の前に、一連の投与として投与される。そのような一連の投与は、核酸構築物または組成物を毎日、2日ごと、3日ごと、4日ごと、5日ごと、6日ごと、毎週、隔週または3週間ごとに合計1、2、3、4または5回投与することを含みうる。
1つの実施形態においては、最初に免疫系を初回刺激するために該核酸構築物または組成物を投与し、次に追加刺激のためにワクチンを投与する間の期間は少なくとも1日間隔、例えば少なくとも2日間隔、例えば3日間隔、例えば少なくとも4日間隔、例えば5日間隔、例えば少なくとも6日間隔、例えば7日間隔、例えば少なくとも8日間隔、例えば9日間隔、例えば少なくとも10日間隔、例えば15日間隔、例えば少なくとも20日間隔、例えば25日間隔である。
したがって、核酸構築物または組成物での初回刺激は、ワクチンを投与することにより更に増強されることが意図される。投与は、前投与とは異なる又は前投与に類似した形態または身体部分におけるものでありうる。
追加接種は同種または異種の追加接種である。同種追加接種は、最初の投与および後続の投与が同一構築物、より詳細には同一送達ビヒクルを含むものである。異種追加接種は、異なるベクター内に同一構築物が含まれるものである。
本発明の組成物の好ましい投与形態は、所定の感染の受容部位である可能性が最も高い身体領域（身体内部または外部）に該組成物を投与することである。感染の受容部位は、感染を受けた身体領域であり、例えばインフルエンザに関しては、感染の受容部位は肺である。
本発明の核酸構築物または組成物は、それが有益でありうる任意の生物、特に任意の動物、例えば脊椎動物に投与されうる。該組成物の投与の手段および方法が被投与者に適合されることは本発明の範囲内に含まれる。
該組成物の好ましい被投与者は哺乳動物であり、哺乳動物は、本発明のより好ましい実施形態においては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、フェレットおよびヒトの群から選択される。最も好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
該組成物のもう1つの好ましい被投与者は、鳥綱（鳥類）からの任意の脊椎動物、例えばGallus gallus domesticus（ニワトリ）である。
本発明の1つの実施形態は、第2の有効成分を更に含む組成物を含む。第2の有効成分は、アジュバント、抗生物質、化学療法薬、抗アレルギー薬、サイトカイン、補体因子および免疫系の共刺激性分子の群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
本発明のもう1つの実施形態はパーツキット（kit in parts）を含み、ここで、該キットは前記のいずれかの少なくとも1つの核酸構築物または組成物、該核酸構築物または組成物を投与するための手段、およびその実施方法の説明を含む。同じ組成物または幾つかの異なる組成物の複数投与量を含むことは本発明の範囲内である。好ましい実施形態においては、該パーツキットは第2の有効成分を更に含む。より好ましい実施形態においては、前記の第2の有効成分は適切なワクチン、すなわち、前記免疫応答の事前の免疫刺激により惹起された免疫応答を増強しうるワクチンである。
本発明は、前記のいずれかの核酸構築物または組成物を動物に投与し、ついで、適切なワクチンを投与し、それにより、対象の免疫系を初回刺激および追加刺激することを含む、動物における免疫応答を増強する方法を更に含む。
免疫応答は、以下のタイプの応答（それらに限定されるものではない）のいずれかでありうる：MHC-I依存性応答、MHC-Iおよび／またはMHC-II依存性応答、T細胞依存性応答、CD4+ T細胞依存性応答、CD4+ T細胞非依存性応答、CD8+ T細胞依存性応答およびB細胞依存性免疫応答。適切なワクチンは、本発明の核酸構築物または組成物での免疫系の初回刺激の後、免疫系を追加刺激しうるものである。
もう1つの実施形態においては、本発明は、治療を要する個体の治療方法であって、該個体における臨床状態を治療するために、前記の組成物を投与することを含む、方法に関する。
ワクチンの効力の増強
本発明の1つの実施形態は、少なくとも1つの不変鎖またはその変異体と、前記のとおりに機能的に連結された少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片とをコードする核酸構築物に関する。幾つかの実施形態においては、少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたは抗原性タンパク質もしくはペプチドの断片はウイルス、細菌または寄生生物に由来する。
不変鎖またはその変異体を含む核酸構築物を使用して初回刺激-追加刺激レジメンを開発することは常に簡単なわけではない。
幾つかの実施形態においては、免疫応答を初回刺激するための、前記のとおりの少なくとも1つの不変鎖とウイルス、細菌もしくは寄生生物抗原またはその断片とをコードする核酸構築物を提供し、ここで、初回刺激の後、ワクチンでの後続の追加ワクチン接種を行う。不変鎖の該変異体は、不変鎖を含む本明細書において特定されている任意の変異体であることが可能であり、ここで、幾つかのドメインは、例えば、アミノ酸または領域の欠失または置換により改変されている。
1つの実施形態においては、本発明は、ワクチンの効力を増強するための、または免疫応答を初回刺激するための核酸構築物の使用に関する。
1つの実施形態においては、本発明は、
a．本明細書に記載されている不変鎖またはその変異体と抗原性ペプチドまたはその断片とを含む核酸構築物を準備する工程、
b．工程a）の核酸構築物を投与し、それにより、対象における免疫応答を刺激することにより、対象の免疫系を初回刺激（プライミング）する工程、および
c．適切なワクチンを投与することにより、工程b）の免疫応答を増強（ブースティング）する工程
を含む、ワクチンの効力を増強するための、または免疫応答を初回刺激するための方法を開示する。
1つの実施形態においては、本発明は、
a．本明細書に記載されている不変鎖の変異体と抗原性ペプチドまたはその断片とを含む核酸構築物を準備する工程、
b．工程a）の核酸構築物を投与し、それにより、対象における免疫応答を刺激することにより、対象の免疫系を初回刺激する工程、および
c．適切なワクチンを投与することにより、工程b）の免疫応答を増強する工程
を含む、ワクチンの効力を増強するための、または免疫応答を初回刺激するための方法であって、
不変鎖の該変異体が例えば欠失または置換によるTRIM領域の改変を含む、方法を開示する。
1つの実施形態においては、本発明は、
a．本明細書に記載されている不変鎖の変異体と抗原性ペプチドまたはその断片とを含む核酸構築物を準備する工程、
b．工程a）の核酸構築物を投与し、それにより、対象における免疫応答を刺激することにより、対象の免疫系を初回刺激する工程、および
c．適切なワクチンを投与することにより、工程b）の免疫応答を増強する工程
を含む、ワクチンの効力を増強するための、または免疫応答を初回刺激するための方法であって、
不変鎖の該変異体が例えば欠失または置換によるエンドソームソーティングシグナルの改変を含む、方法を開示する。
1つの実施形態においては、本発明は、
a．本明細書に記載されている不変鎖の変異体と抗原性ペプチドまたはその断片とを含む核酸構築物を準備する工程、
b．工程a）の核酸構築物を投与し、それにより、対象における免疫応答を刺激することにより、対象の免疫系を初回刺激する工程、および
c．適切なワクチンを投与することにより、工程b）の免疫応答を増強する工程
を含む、ワクチンの効力を増強するための、または免疫応答を初回刺激するための方法であって、
不変鎖の該変異体が例えば欠失または置換によるシグナルペプチドの改変を含む、方法を開示する。
1つの実施形態においては、本発明は、
a．本明細書に記載されている不変鎖の変異体と抗原性ペプチドまたはその断片とを含む核酸構築物を準備する工程、
b．工程a）の核酸構築物を投与し、それにより、対象における免疫応答を刺激することにより、対象の免疫系を初回刺激する工程、および
c．適切なワクチンを投与することにより、工程b）の免疫応答を増強する工程
を含む、ワクチンの効力を増強するための、または免疫応答を初回刺激するための方法であって、
不変鎖の該変異体が配列番号1〜8のいずれか1つの変異体であり、最初の17アミノ酸を含まない、方法を開示する。
効力が増強されるワクチンは、前記の疾患または障害に対するワクチンでありうる。幾つかの実施形態においては、ワクチンは癌ワクチンである。他の実施形態においては、ワクチンは異常な生理学的応答に対するものである。
ワクチンのタイプ
本発明の1つの態様は、前記のli結合抗原を含む核酸構築物を投与することによる対象における免疫応答の初回刺激（プライミング）、およびそれに続く、適切なワクチンを同じ対象に投与することにより達成される追加刺激（ブースター）に関する。
本発明による適切なワクチンは、好ましくは、免疫応答の初回刺激に使用される核酸構築物と共通する少なくとも1つの同一の特徴を有する。前記の同一の特徴は、不変鎖の一部または全部、抗原性ペプチドの一部または全部、バックボーン構造の一部または全部、例えばプロモーター領域の一部または全部、エンハンサーの一部または全部、ターミネーターの一部または全部、ポリAテールの一部または全部、リンカーの一部または全部、ポリリンカーの一部または全部、機能的リンカーの一部または全部、マルチクローニング部位（MCS）の一部または全部、マーカーの一部または全部、終止コドンの一部または全部、内部リボソーム侵入部位（IRES）の一部または全部、ならびに組込みのための宿主相同配列または他の定められた要素の一部または全部に含まれうる。
好ましい実施形態においては、同一の特徴は抗原性ペプチドまたは遍在性ヘルパーT細胞エピトープの一部または全部である。最も好ましい実施形態においては、同一の特徴は抗原ペプチドの一部または全部である。
もう1つの好ましい実施形態においては、同一の特徴は不変鎖の一部または全部である。
ワクチンは伝統的または革新的とみなされうる。本明細書において挙げられているタイプのワクチンはいずれも、本発明による後続の追加刺激工程において使用されうる。
伝統的なワクチン、すなわち第1世代ワクチンは、生物全体、すなわち、死滅した病原性株または弱毒化された病原性を有する株に基づく。
病原生物からの個々の抗原性タンパク質に基づく新規ワクチン、すなわち第2世代ワクチンを開発するためには、分子生物学的技術が用いられている。概念的には、生物全体ではなく抗原性ペプチドを使用すると、病原性が回避される一方で、最も免疫原性である抗原を含有するワクチンが得られる。これらには、よく知られている不活化毒性化合物に基づくトキソイドに基づくワクチン、および不活化または弱毒化病原性株の断片に基づくサブユニットワクチンが含まれる。
結合型ワクチン：ある細菌は、免疫原性の低い多糖外皮を有する。これらの外皮をタンパク質（例えば、毒素）に連結することにより、多糖をタンパク質抗原であるかのように免疫系が認識することがもたらされうる。
組換えベクターワクチン：一方の微生物の生理機能と他方の微生物のDNAとを組合せることにより、複雑な感染プロセスを有する疾患に対する免疫が得られうる。
合成ワクチンは、主に又は全体的に、合成ペプチド、炭水化物または抗原から構成される。
DNA（または遺伝的）ワクチン、すなわち第3世代ワクチンは、予防用ワクチンおよび治療用ワクチンの両方の開発のための新しく有望な候補である。DNAワクチンは、微生物からの1以上の抗原を産生するように遺伝的に操作された小さな環状DNA断片（プラスミド）から構成される。ワクチンDNAは身体の細胞内に注入され、そこにおいて宿主細胞の「内部機構」がDNAを「読取り」、それを病原性タンパク質に変換する。これらのタンパク質は異物として認識されるため、それらは宿主細胞により処理（プロセシング）され、それらの表面上に提示されて免疫系に警告を発し、ついで免疫系は一連の免疫応答を引き起こす。続いて生じる免疫応答の強度はベクター（すなわち、裸DNA、ウイルスベクター、生弱毒化ウイルスなど）の効力、抗原の発現レベルおよび組換え抗原自体（すなわち、高い又は低いアフィニティのMHC結合体、多少なりとも限定されたTまたはB細胞レパートリーに関して選択される構造的決定因子など）の組合せにより決定される。一般に、免疫記憶の効率的な誘導は、免疫記憶の効果の多数をもたらすCD8+（細胞傷害性）T細胞およびB細胞とのCD4+（ヘルパー細胞）T細胞の相互作用を要し、または該相互作用から利益を得ることは間違いないと考えられている。
本発明の1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物での免疫応答の初回刺激（プライミング）の後、該免疫応答を増強するために第1世代または伝統的ワクチンの後続投与を行う。
本発明の1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物での免疫応答の初回刺激の後、該免疫応答を増強するために第2世代ワクチンの後続投与を行う。
本発明の1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物での免疫応答の初回刺激の後、該免疫応答を増強するために第3世代またはDNAワクチンの後続投与を行う。
免疫原性を増強するためのDNAワクチン構築物における不変鎖の使用は当技術分野でよく知られている。本発明の1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物での免疫応答の初回刺激の後、該免疫応答を増強するために、不変鎖またはその変異体を含むDNAワクチンの後続投与を行う。
本発明の1つの実施形態においては、本発明の核酸構築物での免疫応答の初回刺激の後、該免疫応答を増強するためにアデノウイルスワクチンの後続投与を行う。
ワクチンは更に、1価（一価とも称される）または多価（ポリバレントとも称される）でありうる。1価ワクチンは、単一の抗原または単一の微生物に対して免疫化するように設計される。多価またはポリバレント・ワクチンは、同じ微生物の2以上の株に対して、または2以上の微生物に対して免疫化するように設計される。
もう1つの実施形態においては、ワクチン組成物にバッファーを添加する。液体製剤のpHは、組成物の成分および対象への投与に必要な適合性を考慮して調節される。適切には、液体混合物のpHは、少なくとも4、少なくとも4、少なくとも5.5、少なくとも5.8、少なくとも6である。液体混合物のpHは、9未満、8未満、7.5未満またはそれ未満であり得る。他の実施形態では、液体混合物のpHは4〜9、5〜8、例えば5.5〜8である。したがって、pHは、適切には、6〜9、例えば6.5〜8.5である。特に好ましい実施形態においては、pHは5.8〜6.4である。
適切なバッファーは酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩およびTRISから選択されうる。1つの実施形態においては、バッファーは、リン酸バッファー、例えばNa/Na2PO4、Na/K2PO4またはK/K2PO4である。バッファーは少なくとも6mM、少なくとも10mMまたは少なくとも40mMの量で液体混合物中に存在しうる。バッファーは100 mM未満、60 mM未満または40 mM未満の量で液体混合物中に存在しうる。
非経口投与の場合、細胞の変形または細胞溶解を回避するために、溶液は、薬学的に許容される浸透圧を有するべきであることが、よく知られている。薬学的に許容される浸透圧は、一般に、溶液が、ほぼ等張または僅かに高張である浸透圧を有することを意味する。適切には、本発明の組成物は、再構成（還元）された場合、250〜750 mOsm/kgの範囲の浸透圧を有し、例えば、浸透圧は、280〜550 mOsm/kgの範囲、例えば、280〜500 mOsm/kgの範囲でありうる。特に好ましい実施形態においては、浸透圧は280〜310 mOsm/kgの範囲でありうる。浸透圧は、当技術分野で公地の技術に従い、例えば、商業的に入手可能な浸透圧計、例えば、Advanced Instruments Inc. (USA)から入手可能なAdvanced（登録商標）Model 2020を使用して測定されうる。「等張化剤」は、製剤と接触している細胞膜を通過する水の正味の流れを防ぐために製剤に適切な張度を付与する、生理的に許容された化合物である。幾つかの実施形態においては、該組成物に使用される等張化剤は塩（または塩の混合物）であり、簡便には、塩は塩化ナトリウムであり、適切には、約150nMの濃度のものである。しかし、他の実施形態においては、組成物は非イオン性等張化剤を含み、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は100 mM未満、例えば80 mM未満、例えば50 mM未満、例えば40 mM未満、30 mM未満、特に20 mM未満である。組成物中のイオン強度は100 mM未満、例えば80 mM未満、例えば50 mM未満、例えば40 mM未満または30 mM未満でありうる。特定の実施形態においては、非イオン性等張化剤は、ポリオール、例えばスクロースおよび／またはソルビトールである。ソルビトールの濃度は、例えば約3%〜約15%（w/v）、例えば約4%〜約10%（w/v）でありうる。等張化剤が塩またはポリオールである、免疫学的に活性なサポニン画分およびTLR4アゴニストを含むアジュバントは、WO2012/080369に記載されている。
適切には、0.05ml〜1ml、例えば0.1〜0.5mlの、ヒトのための投与量、特に、約0.5mlまたは0.7mlの投与量が用いられる。用いる組成物の量は送達経路および部位に左右され、皮内経路による場合は、より少量が投与される。単位用量容器は、単位用量の投与中に物質の適切な操作を可能にするために過剰量を含有しうる。
特に非経口投与の場合、組成物は無菌性であるべきである。滅菌は種々の方法により行われうるが、滅菌等級フィルターによる濾過によって簡便に行われる。「滅菌等級フィルター」は、1×107 /cm2の有効濾過面積以上のチャレンジレベルで微生物によりチャレンジされた後、滅菌流出液を生成するフィルターを意味する。滅菌等級のフィルターは、本発明の目的に関して、本発明の当業者によく知られており、滅菌等級のフィルターは0.15〜0.25μm、適切には0.18〜0.22μm、例えば0.2または0.22μmの孔径を有する。
パーツキット
1つの態様においては、本明細書に開示されている核酸構築物を含む組成物、該組成物を投与するための医学的装置または他の手段、および使用説明を含むパーツキット（kit of parts）に関する。
（実施例）
材料および方法
ワクチン設計
マラリア抗原IT4var19（配列番号68；本明細書においては「CIDR1.1-IT4var19」または単に「19」とも称される）およびPFCLINvar30（配列番号69；本明細書においてはCIDR1.1-PFCLINvar30または単に「30」とも称される）を、li-fur（配列番号5）またはli（アイソフォーム2、p31、配列番号9）またはSP-alb（配列番号7）をコードする配列を含有するCMVベースのシャトルベクター内にクローニングした。種々のアデノウイルス構築物を、複製欠損E1欠失ヒトアデノウイルス5型（Ad5；hAd5とも称される）に基づいて設計した。不変鎖を、完全長タンパク質（li）として、またはESSドメインの欠失体（Δ17-li）として挿入した。フューリンの認識部位を三量体化ドメインの前（li-fur）または後（li-Cterm-fur）に挿入した。不変鎖を有さないが、アルブミンシグナルペプチド（SP-alb）を使用して抗原の分泌のために操作された1つの構築物を作製した。抗原提示研究のために、種々のアデノウイルス構築物にOVAを挿入した。免疫原性研究のために、同じ構築物をIT4var19（「19」）およびPFCLInvar30（「30」）で操作し、GSリンカーで連結し、不変鎖のC末端またはアルブミンのシグナルペプチド（SP-alb）に融合させた（図14の上部を参照されたい）。これらの構築物のために、huAd5ベクターをBJ5183細胞における相同組換えにより作製した。挿入されたアジュバント-抗原にはCMVプロモーター（huCMV）およびシミアンウイルス40（SV40）ポリアデニル化シグナルが隣接していた。コード化抗原のインビトロ発現はテトラサイクリンオペレーターの制御下にあった。増幅後、Beckerら, 1994に記載されているとおりに塩化セシウム勾配を使用してアデノウイルスウイルスを精製した。全てのウイルスを配列決定し、力価測定した。
MHC-I OVAおよびMHCII-OVA提示の分析
MHCI抗原提示のために、OVAが挿入された種々のAd5構築物の250MOI/細胞をJAWSII細胞に感染させた（図21A）。翌日、細胞を洗浄し、MHC提示OVA断片SIINFEKL（配列番号66）に結合した抗マウスH2kbで染色した。フィコエリトリン（PE）蛍光をFACS Caliburにより分析し、flowjoを使用してデータを解釈した。MHCII抗原提示のために、OVAが挿入された種々のAd5構築物の250MOI/細胞を105 JAWS細胞に感染させた（図21Aを参照されたい）。翌日、細胞を洗浄し、4×104 BO-97.10（OVAに結合したMHCIIを特異的に認識する細胞系（Hugoら, 1993））と共にインキュベートした。96時間の共培養の後、上清を回収し、IL-2レベルをELISA（IL-2 Ready Set and Goアッセイ（ebioscience、88-7024-86）を使用）により測定した。
T細胞応答の分析
T細胞応答を、まず、右後肢におけるワクチン接種の後、Balb/cマウスにおける足蹠腫脹測定により評価した。Ad5-li-fur-IT4var19-PFCLINvar30（n = 5）、Ad5-SP-Alb- IT4var19-PFCLINvar30（n = 5）およびAd5-li-IT4var19-PFCLINvar30（n = 5）をマウスに接種した。足蹠腫脹をノギス（キャリパー）で毎日測定し、ワクチン接種していない足と比較した場合の増大をプロットして、異なるワクチン接種群を比較した。ワクチン接種後、免疫応答を誘発するために抗原が導入された部位に細胞およびサイトカインがリクルートされる。足蹠の後ろの緩い組織における免疫化により、ベクターおよびワクチン抗原に対する免疫応答は、ノギスにより測定されうる腫脹を引き起こす。定量は、細胞性免疫応答の強度の指標として解釈される。
上清および細胞サイトゾル中のタンパク質の検出
IT4var19およびPFCLINvar30が挿入された種々のAd5構築物をCOS7細胞に10 IFU/細胞で、そしてVERO細胞に50 IFU/細胞で一晩感染させることにより、抗原の分泌を調べた。その際、24時間後に培地を無血清培地と交換した。感染の48時間後に上清および細胞を回収し、細胞をNP40およびプロテアーゼインヒビターカクテルで細胞溶解した。ビバスピンカラムを使用して上清を濃縮した。上清をSDS-PAGE上で泳動させ、免疫ラット血清により認識させた。一次抗体を抗ラットアルカリホスファターゼ抗体で認識させ、これはBCIP/NBT錠剤で示された。上清および細胞ライセートにおけるIT4var19およびPFCLINvar30のフォールディングを、それらの天然リガンドEPCRへの結合を試験することにより調べた。ヌンク・マキシソープ（Nunc maxisorp）プレートを3μg/mLのEPCR外部ドメインでコーティングし、上清および細胞ライセートをウェルに加えた。それらの2つのタンパク質の相互作用は免疫化ラット血清でのIT4var19またはPFLCINvar30の認識により示された。ラット抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ポリクローナルウサギ抗ラットで認識された。ELISAプレートリーダー（VersaMax Molecular Devices）を使用して、450 nmで光学密度を測定した。
抗体応答の評価のためのマウスにおけるワクチン接種
Balb/c、または幾つかの場合にはC57BL/6マウスに、種々のCIDR構築物（群当たりN = 5）の2×109個の粒子を第0日に筋肉内にワクチン接種し、8週間後に同種ブーストで追加刺激した（2×109個の粒子を筋肉内に）。最初のワクチン接種の2週間後、6週間後および10週間後に血液サンプルを採取した。
抗体応答の分析：認識ELISA：
血清を血液サンプルから単離し、抗体応答はELISAにより分析した。ヌンク・マキシソープ（Nunc Maxisorp）プレートを5μg/mlのIT4var19またはPFCLINvar30タンパク質でコーティングした。血清をウェルに加え、必要な読み取りに応じて希釈した。IT4var19およびPFCLINvar30を特異的に認識する抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ポリクローナルウサギ抗マウスIg（P260 DAKO, Denmark）で検出した。TMB plus（Kem-En-Tec Diagnostics, 4395A）を使用してウェルを現像した。ELISAプレートリーダー（VersaMax Molecular Devices）を使用して、450 nmで光学密度を測定した。
抗体応答の分析：阻害ELISA：
血清を血液サンプルから単離し、抗体応答はELISAにより分析した。ヌンク・マキシソープ（Nunc Maxisorp）プレートを3μg/mlのECPRでコーティングした。血清とIT4var19またはPFclinvar30タンパク質とを混合し、ついで、EPCRへの結合を該抗体が妨げる能力を試験した。IT4var19またはPFclinvar30とEPCRとの間の結合はHRP Ig抗hisタグにより確認された。TMB plus（Kem-En-Tec Diagnostics, 4395A）を使用してウェルを現像した。ELISAプレートリーダー（VersaMax Molecular Devices）を使用して、450 nmで光学密度を測定した。
ルミネックス（Luminex）による交差反応性抗体の分析：
ワクチン接種の10週間後のBalb/cマウスの血清において交差応答性抗体をマルチプレックス（multiplex）により検出した。1/50希釈血清を、種々のCIDRタンパク質でコーティングされたビーズと共にインキュベートし、Chamら, 2008に記載されているとおりに、該ビーズへの結合を発光により検出した。
インビボにおける腫瘍進行の測定：
Ad5-li-フューリン-p15E(N=5)またはAd5-li-p15E(N=5)のいずれかの2×107 IFUでC57BL/6マウスを足蹠において免疫化した。第155日に2×105個のB16F10gp細胞（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）の糖タンパク質（GP）の免疫優性エピトープを発現するマウスメラノーマ細胞系）でマウスを静脈内（iv.）にチャレンジした。チャレンジの14日後、肺を摘出し、PBS中の2% PFAの溶液中で一晩固定した。肺の表面上の黒色結節として転移を計数した。
抗p15E抗体応答の評価
メラノーマ関連レトロウイルス（MelARV）p15Eタンパク質のペプチド（配列：CFYADHTGLVRDSMAKLRERLSQRQKLFESQQGWFEGLFNKSP（配列番号67）；BSAに結合）をSchafer-N（Copenhagen, Denmark）から購入した。ヌンク・マキシソープ（Nunc MaxiSorp）ELISAプレートをウェル当たり2μg/mL μLのペプチド溶液（PBS中）で一晩コーティングし、ついで0.5% BSA溶液で37℃で2時間ブロッキングした。血清を1:25に希釈し、2倍希釈でウェルに加え、37℃で3時間インキュベートした。特異的抗体を、HRP結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Dako, P0447）を使用して検出し、TMBプラス（Kem-En-Tec Diagnostics, 4395A）で現像した。ELISAプレートリーダー（VersaMax Molecular Devices）を使用して、450 nmで光学密度を測定した。
統計分析
異なるグループ間で分析抗体応答を比較するために、ノンパラメトリック・マンホイットニー（Mann-Whitney）検定を行った。第10週からの血清（認識用）を2倍希釈し、非線形回帰曲線で分析し、曲線下面積（AUC）を計算し、比較のためにプロットした。グラフ・パッド・プリズム（Graph Pad Prism）を使用して統計分析を行った。0.05未満のp値を有意とみなした。足蹠腫脹を一元配置分散分析およびそれに続くニューマン・クールス（Newman-Keuls）検定により分析した。
実施例1A：MHCI-OVA提示
「材料および方法」の節において説明したとおり、JAWSII細胞を培養し、感染させ、固定し、染色し、フローサイトメトリーにより分析した。結果を図1に示す。図1は、li-fur-Ag複合体がMHC-I提示に影響を及ぼさないことを示している。しかし、エンドソームソーティング経路が通常はMHCIソーティング経路と重複しておらず、MHCIIと重複している場合であっても、d17-li-fur-OVA挿入Ad5はOVA構築物の提示の低下を示した。
実施例1B：T細胞応答
ワクチン接種後、免疫応答を誘発するために抗原が導入された部位に細胞およびサイトカインがリクルートされる。足蹠の後ろの緩い組織における免疫化により、ベクターおよびワクチン抗原に対する免疫応答は、ノギスにより測定されうる腫脹を引き起こす。定量は、細胞性免疫応答の強度の指標として解釈される。
ワクチン接種後、liおよびli-fur構築物でワクチン接種されたマウスの足蹠は、SPalb構築物でワクチン接種されたマウスよりも腫脹した（図2）。このことは、liおよびli-fur構築物の場合には、SPalb構築物の場合よりも免疫応答が強力であったことを示している。li-およびli-fur構築物でのワクチン接種は、非常に類似したT細胞応答を示す非常に類似したレベルの腫脹をもたらした。
実施例2：MHCII-OVA提示
li-fur構築物はDC様細胞の表面上のOVAのMHCII提示の増強を示した。しかし、li-fur複合体の分泌はエンドソームによる再取り込みを低下させ、したがってMHCII提示を低下させるため、提示はli-構築物より低くかった（図3）。
実施例3：コード化タンパク質の発現
図4Aは、フューリン認識部位およびアルブミンシグナルペプチドを介して分泌されるように設計された結合抗原が感染細胞の上清において検出可能であり、li-Cterm-furが最も有効であったことを示している。
図4Bは、非変性条件においては、li-furおよびd17-li-furで三量体が検出可能であったことを示している。これは、三量体化ドメインがliに存在し、したがって、コード化抗原が三量体として分泌されるからである（図18〜20も参照されたい）。
実施例4：コード化タンパク質の発現
コード化抗原IT4var19とPFCLINvar30の両方を使用した場合のEPCRへの結合が上清および細胞ライセートにおいて検出されたことが、図5から認められうる。li-fur-CIDR構築物は、SNにおいては、SPの場合より高いレベルの分泌抗原を誘導した。一方、li-CIDRは最小レベルで分泌されたが、細胞内で高レベルで保持された。これらの知見は、該抗原のコンホメーションが維持され、EPCR結合性エピトープの接近可能性が、不変鎖により誘導される三量体化によっては妨げられないことをも証明した。
実施例5：抗体応答のタイムライン
li-furアジュバントによりもたらされる応答の増強は、早くもワクチン接種の2週間後に検出され、この場合、抗体応答は単量体分泌（SP-alb）および膜三量体（li）と比較して増強した（図6）。これは、li-furアジュバントが免疫応答の加速および増強を引き起こすことを示している。ワクチン接種の10週間後および同種追加刺激の2週間後、抗体応答は、各コード化抗原に関するそのような2つの他の構築物と比較して有意に増強された。
実施例6：抗体応答の増強
図7は、li-fur構築物を突然変異構築物と比較した場合、各配列の欠失が免疫応答の低下につながることが認められうるため、三量体化およびESSの存在の両方が抗体応答に対する最適なアジュバント効果をもたらすことを示している。
実施例7：抑制応答の増強
図8において認められうるとおり、ワクチン接種後に生成された抗体は、天然リガンド（EPCR）にIT4var19およびPFCLINvar30が結合するのを妨げることが可能であった。このことは、liおよびli-fur構築物を使用した場合に、抗体応答が増強しただけでなく、より効率的であったことを示している。したがって、li-furアジュバントは、li単独またはSP-alb含有分泌抗原と比較して、より速い抗体産生およびより高いレベルの抗体を誘導しただけでなく、改善した機能性を有する抗体をも誘導したと結論付けられうる。
実施例8：増強した抗体応答の交差反応性
誘導された交差反応性の強度は、li-furアジュバントを含有する構築物でマウスにワクチン接種した場合、その他の構築物と比較して、特にCIDR1.1との交差反応性に関して高いことが判明した（図9）。遺伝的に更に遠い「var」遺伝子（CIDR1.4、1.7および1.8から）の認識も、このアジュバントを使用した場合、li単独または該抗原の分泌型と比較して増強した。したがって、該抗原へのli-furの連結はより高い且つより機能的な抗体応答を誘発しただけでなく、誘導抗体の、より一貫した交差反応性をも可能にする。この場合もまた、三量体化ドメインおよびESSドメインの両方が最適なアジュバント効果をもたらすことが示されている。
実施例9および10：C57BL/6において誘導された抗体応答
これらの図は、Balb/Cマウスで得られた及び前記で示された全ての抗体結果（認識および阻害データ）を示し、これらは、マウスの異なる系統、ここではC57BL/6マウスにおいて再現可能であった（図10および11）。
実施例11：異なる抗原（MelARVにおけるp15E）に対するli-furのアジュバント効果の分析
li-fur構築物でワクチン接種されたマウスは、Ad5-li群と比較して腫瘍転移の有意な低減を示した（図12）。残念ながら、Ad5免疫化の12週間後、検出が非常に低かったため、2つのグループ間の抗体レベルの差を検出することができなかった。
実施例12：不変鎖OVA連結構築物からの細胞上清におけるELISA
COS7細胞を６ウェルプレートにプレート当たり50万細胞で播き、翌日、リポフェクタミンを使用して2μgの各プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、上清を回収し、ELISAによりOVA含有量に関して試験した。使用したプラスミドは以下のとおりである：（1）内部フューリン認識部位を有する抗原（li/fur/int）；（2）C末端フューリン認識部位を有する抗原（li/fur/C）；（3）内部TACE融合プロテアーゼ認識部位を有する抗原（li/tace/int）；（4）C末端TACE認識部位を有する抗原（li/tace/C）；天然liChOVAは非切断対照（liChOVA）として機能し、pGKおよび未トランスフェクト化細胞（未トランスフェクト）は陰性対照として機能した。種々の希釈度（10倍、100倍および1000倍）の吸光度が示されている。フューリン認識部位はOVA抗原の分泌をもたらすが、TACE認識部位はOVA抗原の分泌を効率的にはもたらさないことが認められうる（図17）。
参考文献
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Claims (80)

  1. a．少なくとも1つの不変鎖またはその変異体、およびこれに機能的に連結された
    b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
    をコードする配列を含む核酸構築物であって、
    該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
    該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、核酸構築物。
  2. 該プロテアーゼ切断部位がMHC-II相互作用ペプチド（CLIP）ドメインのN末端またはCLIPドメインのC末端に位置する、請求項1に記載の核酸構築物。
  3. 該プロテアーゼ切断部位がCLIPドメインのC末端に位置する、請求項2に記載の核酸構築物。
  4. 該プロテアーゼ切断部位が小胞体プロテアーゼまたはトランス-ゴルジ・ネトッワーク・プロテアーゼの切断部位である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  5. 該プロテアーゼ切断部位が、フューリンおよびサブチリシン様プロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼの切断部位である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  6. コードされている少なくとも1つの不変鎖が生物特異的である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  7. コードされている少なくとも1つの不変鎖が配列番号1〜50のいずれか1つに対して少なくとも90%の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  8. コードされている少なくとも1つの不変鎖が配列番号1〜8のいずれか1つに対して少なくとも90%の同一性を有する、請求項7に記載の核酸構築物。
  9. コードされている少なくとも1つの不変鎖が配列番号1〜50のいずれか1つと同一である、請求項7に記載の核酸構築物。
  10. コードされている少なくとも1つの不変鎖が配列番号1〜8のいずれか1つと同一である、請求項9に記載の核酸構築物。
  11. 不変鎖のコード化変異体が少なくとも40アミノ酸の配列番号3の断片であり、配列番号3の同一断片に対して少なくとも85%の相同性を有する、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  12. コードされている少なくとも1つの不変鎖が、膜貫通ドメインをコードする領域を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  13. 少なくとも1つの不変鎖の少なくとも1つの領域、ペプチドまたはドメインが少なくとも1つの不変鎖の領域、ペプチドまたはドメインに対して付加、除去または置換されており、前記の少なくとも1つの領域、ペプチドまたはドメインが少なくとも1つの不変鎖に由来し、または別のタンパク質に由来し、または合成物である、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  14. 少なくとも1つのTRIMドメインが少なくとも1つの不変鎖のTRIMドメインに対して付加、除去または置換されており、前記の少なくとも1つのTRIMドメインが少なくとも1つの不変鎖に由来し、または別のタンパク質に由来し、または合成物である、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  15. 少なくとも1つのシグナルペプチドが少なくとも1つの不変鎖のシグナルペプチドに対して付加、除去または置換されており、前記の少なくとも1つのシグナルペプチドが少なくとも1つの不変鎖に由来し、または別のタンパク質に由来し、または合成物である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  16. 少なくとも1つのCLIPドメインが少なくとも1つの不変鎖のCLIPドメインに対して付加、除去または置換されており、前記の少なくとも1つのCLIPドメインが少なくとも1つの不変鎖に由来し、または別のタンパク質に由来し、または合成物である、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  17. 少なくとも1つのエンドソーム・ソーティング・シグナルが少なくとも1つの不変鎖のエンドソーム・ソーティング・シグナルに対して付加、除去または置換されており、前記の少なくとも1つのエンドソーム・ソーティング・シグナルが少なくとも1つの不変鎖に由来し、または別のタンパク質に由来し、または合成物である、請求項１〜１６のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  18. 該核酸構築物が少なくとも1つのミリストイル化部位を更に含み、該ミリストイル化部位が少なくとも1つの不変鎖に由来し、または別のタンパク質に由来し、または合成物である、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  19. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、ウイルス、細菌、原生動物および多細胞寄生生物からなる群から選択される病原体に由来する、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  20. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が細菌に由来する、請求項19に記載の核酸構築物。
  21. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、レトロウイルス、フラビウイルス科ウイルス、オルトミクソウイルス、ヘルペスウイルス科、アレナウイルス、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、パポバウイルス科の群から選択されるウイルスに由来する、請求項19に記載の核酸構築物。
  22. レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（HIV）である、請求項21に記載の核酸構築物。
  23. フラビウイルス科ウイルスが、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルスおよび黄熱病ウイルスからなる群から選択される、請求項21に記載の核酸構築物。
  24. オルトミクソウイルスが、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスBおよびインフルエンザウイルスCから選択される、請求項21に記載の核酸構築物。
  25. ヘルペスウイルス科ウイルスが、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタインバーウイルスからなる群から選択される、請求項21に記載の核酸構築物。
  26. アレナウイルスが、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、ルホウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルスおよびホワイトウォーターアロヨウイルスからなる群から選択される、請求項21に記載の核酸構築物。
  27. フィロウイルス科ウイルスが、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスからなる群から選択される、請求項21に記載の核酸構築物。
  28. ポックスウイルス科ウイルスが天然痘ウイルスである、請求項21に記載の核酸構築物。
  29. パポバウイルス科ウイルスがパピローマウイルスである、請求項21に記載の核酸構築物。
  30. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis、結核菌）、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis、炭疽菌）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属種およびビブリオ（Vibrio）属種の群から選択される細菌に由来する、請求項20に記載の核酸構築物。
  31. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、プラスモジウム（Plasmodium）属種、例えばプラスモジウム・ファルシパルム（P. falciparum、熱帯熱マラリア原虫）、プラスモジウム・ビバックス（P. vivax、三日熱マラリア原虫）、プラスモジウム・ノウレシ（P. knowlesi、二日熱マラリア原虫）またはプラスモジウム・マラリエ（P. malariae、四日熱マラリア原虫）、リーシュマニア（Leishmania）属種、およびトリパノソーマ（Trypanosoma）属種、例えばトリパノソーマ・ブルセイ（T. brucei）、トリパノソーマ・クルージ（T. cruzi）、トリパノソーマ・ローデシエンス（T. rhodesiense）、トリパノソーマ・ビバックス（T. vivax）またはトリパノソーマ・コンゴレンス（T. congolense）の群から選択される寄生生物に由来する、請求項20に記載の核酸構築物。
  32. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、請求項21〜31のいずれか1項に記載の抗原のいずれかに対して少なくとも85%同一である抗原性ペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜３１のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  33. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が癌特異的ポリペプチドに由来する、請求項１〜３２のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  34. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、p53、テロメラーゼ、メラノーマ抗原、HPV由来ウイルス癌遺伝子E5、E6、E7およびL1、サバイビン（Survivin）、Bcl-XL、MCL-1ならびにRho-Cの群から選択される癌特異的ポリペプチドに由来する、請求項33に記載の核酸構築物。
  35. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、異常な生理学的応答に関連するポリペプチドに由来する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  36. 少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、異常な生理学的応答に関連するポリペプチドに由来し、異常な生理学的応答が自己免疫疾患、アレルギー反応、癌または先天性疾患である、請求項35に記載の核酸構築物。
  37. 不変鎖と抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその断片とが、直接的な連結、またはスペーサー領域を介した連結により連結されている、請求項１〜３６のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  38. 不変鎖と抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその断片とがスペーサー領域により連結されている、請求項37に記載の核酸構築物。
  39. スペーサー領域がクラスII MHC分子に関する少なくとも1つのヘルパーエピトープをコードする、請求項38に記載の核酸構築物。
  40. スペーサー領域が少なくとも1つの他のプロテアーゼ切断部位をコードする、請求項38に記載の核酸構築物。
  41. 少なくとも1つの不変鎖が少なくとも2つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結されている、請求項１〜４０のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  42. 抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片の個数が3、4、5、6、8または10以上である、請求項41に記載の核酸構築物。
  43. 各不変鎖要素および各抗原性要素が、請求項37〜40のいずれか1項に記載のとおりに互いに機能的に連結されている、請求項41または42に記載の核酸構築物。
  44. 1つの不変鎖が1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結されており、該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が少なくとも1つのさらなる抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片に機能的に連結されており、前記の抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片が、請求項37〜40のいずれか1項に記載のとおりに互いに機能的に連結されている、請求項41または42に記載の核酸構築物。
  45. 少なくとも1つの機能的に連結されている不変鎖と少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片とをコードする配列が、該構築物の発現を可能にするプロモーターの後に位置する、請求項１〜４４のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  46. プロモーターが構成的プロモーター、誘導性プロモーター、生物特異的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび細胞型特異的プロモーター、CMVプロモーター、SV40プロモーターおよびRSVプロモーターの群から選択される、請求項45に記載の核酸構築物。
  47. 抗原提示および／または細胞間拡散に関連する遺伝子を含む、請求項１〜４６のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  48. 免疫応答の刺激における使用のための、請求項1〜47のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  49. 免疫応答の刺激により後続投与ワクチンまたは同時投与ワクチンの効力を増強するためのプライマーとしての使用のための、請求項1〜47のいずれか1項に記載の核酸構築物。
  50. a．不変鎖またはその変異体のC末端の少なくとも一部、
    b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
    を含むキメラタンパク質であって、
    該不変鎖またはその変異体のC末端の部分が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
    該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、キメラタンパク質。
  51. 請求項1〜47のいずれか1項に記載の核酸構築物によりコードされる、請求項50に記載のキメラタンパク質。
  52. キメラタンパク質が多量体、例えば二量体であり、好ましくは、キメラタンパク質が三量体である、請求項50〜51のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
  53. 請求項1〜47のいずれか1項に記載の核酸構築物を含む送達ビヒクル。
  54. ビヒクルが、RNAに基づくビヒクル、DNAに基づくビヒクル／ベクター、脂質に基づくビヒクル、ポリマーに基づくビヒクルおよびウイルスに由来するDNAまたはRNAビヒクルの群から選択される、請求項53に記載の送達ビヒクル。
  55. 送達ビヒクルがウイルスである、請求項53に記載の送達ビヒクル。
  56. 送達ビヒクルがアデノウイルスである、請求項55に記載の送達ビヒクル。
  57. 送達ビヒクルが複製欠損型アデノウイルスである、請求項56に記載の送達ビヒクル。
  58. 送達ビヒクルがペグ化ビヒクルである、請求項53に記載の送達ビヒクル。
  59. 脂質に基づくビヒクルがリポソームである、請求項53または54に記載の送達ビヒクル。
  60. ポリマーに基づくビヒクルが、ポリエチレンイミン（PEI）、ポリアミドアミンおよびポリプロピレンアミンデンドリマー、ポリアリルアミン、カチオン性デキストラン、キトサン、カチオン性タンパク質（ポリリジン、プロタミンおよびヒストン）、カチオン性ペプチド、ポリペプチド、リポ多糖および多糖からなる群から選択されるカチオン性ポリマーDNA担体から構成される、請求項54に記載の送達ビヒクル。
  61. 送達ビヒクルが生分解性ポリマーミクロスフェアである、請求項53〜60のいずれか1項に記載の送達ビヒクル。
  62. 送達ビヒクルが、核酸構築物をコロイド金粒子上にコーティングすることを含む、請求項53〜61のいずれか1項に記載の送達ビヒクル。
  63. プロテアーゼ切断部位がCLIP領域と不変鎖のC末端との間に位置する、請求項１〜６２のいずれか1項に記載の核酸構築物、キメラタンパク質または送達ビヒクル。
  64. プロテアーゼ切断部位がフューリン切断部位である、請求項１〜６３のいずれか1項に記載の核酸構築物、キメラタンパク質または送達ビヒクル。
  65. フューリン切断部位が配列RXR/KR（ここで、Xは任意のアミノ酸、好ましくは、天然の20種のアミノ酸のいずれかである）を含む、または好ましくは該配列からなる、請求項64に記載の核酸構築物、キメラタンパク質または送達ビヒクル。
  66. フューリン切断部位が配列番号57を含む、または好ましくは配列番号57からなる、請求項65に記載の核酸構築物、キメラタンパク質または送達ビヒクル。
  67. 請求項1〜66のいずれか1項に記載の核酸構築物を含む細胞。
  68. 請求項50〜66のいずれか1項に記載のキメラタンパク質を認識しうる抗体。
  69. a．少なくとも1つの不変鎖またはその変異体、
    b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
    をコードする核酸配列を含む組成物であって、
    該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
    該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、組成物。
  70. 請求項1〜66のいずれか1項に記載の核酸構築物を含む、請求項69に記載の組成物。
  71. 医薬としての使用のための、
    a．少なくとも1つの不変鎖またはその変異体、
    b．少なくとも1つの抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片
    をコードする核酸配列を含む組成物であって、
    該不変鎖またはその変異体のC末端が該抗原性タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原性断片のN末端に機能的に連結されており、
    該不変鎖またはその変異体がプロテアーゼ切断部位を含み、そして所望により、該プロテアーゼ切断部位のC末端に位置する三量体化（TRIM）ドメインを含みうる、組成物。
  72. 請求項1〜66のいずれか1項に記載の核酸構築物を含む、請求項71に記載の使用のための組成物。
  73. 医薬としての使用のための、請求項53〜66のいずれか1項に記載の送達ビヒクルを含むワクチン組成物。
  74. 筋肉内、腹腔内、静脈内または皮下投与のための手段を更に含む、請求項73に記載の使用のためのワクチン組成物。
  75. 抗生物質、化学療法薬、抗アレルギー薬、サイトカインおよび免疫系の共刺激性分子からなる群から選択される第2の有効成分を更に含む、請求項73〜74のいずれか1項に記載の使用のためのワクチン組成物。
  76. 送達ビヒクルがアデノウイルスベクターである、請求項73〜75のいずれか1項に記載の使用のためのワクチン組成物。
  77. ワクチンの製造における使用のための、請求項53〜66のいずれか1項に記載の送達ビヒクル。
  78. 請求項73〜76のいずれか1項に記載のワクチン組成物を動物に投与することを含む、動物における免疫応答を誘導するための方法。
  79. a．請求項1〜66のいずれか1項に記載の核酸構築物、または請求項69〜76のいずれか1項に記載の組成物を準備する工程、
    b．工程a）の核酸構築物または組成物を個体に投与し、それにより、個体における免疫応答を刺激することにより、個体の免疫系を初回刺激（プライミング）する工程
    を含む、ワクチンの効力を増強するための方法。
  80. 適切なワクチンを投与することにより工程b）の免疫応答を増強する工程を更に含む、請求項79に記載の方法。
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