CN110592125A - 一种食品级降解乙醇枯草杆菌重组菌的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌的构建方法，属于生物技术领域。乙醇经乙醇脱氢和乙醛脱氢酶的作用下可以转化为对人体相对无毒的乙酸。本发明公开的重组枯草杆菌的构建方法，通过双交换同源重组的方法将两个酶基因的表达盒整合至枯草杆菌的基因组上，实现了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的胞内共表达，且满足食品级重组微生物的要求。该重组枯草杆菌可以在低pH条件下降解乙醇，可作为口服制剂“帮助”人体代谢部分酒精，起到解酒护肝的作用，在解酒保健品领域具有广阔的应用前景。

Description

一种食品级降解乙醇枯草杆菌重组菌的构建方法
一、技术领域
本发明涉及一种食品级降解乙醇枯草杆菌重组菌的构建方法，属于生物技术领域。
二、背景技术
过量饮酒会导致一系列健康及社会问题，是造成200多种疾病和伤害的原因之一，2012年全球约有330万人因为酗酒而死亡。酒精在引起全球疾病和残疾的主要因素中排名第三，是60多种主要疾病的致病因素。其中，酒精性肝病是酒精引起的发病率和死亡率的主要原因之一，其治疗方法主要依靠戒酒、营养支持、生活方式的改变，以及一些药物和抗氧化剂，但在临床上效果不佳。
研究表明，外援补充乙醇的降解酶，如乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，可以“帮助”人体代谢酒精，增加酒精的首过代谢，减少进入血液和肝脏的酒精，从而减轻酒精给机体带来的危害。乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶37℃条件下能够保持较高的活性，满足在胃内降解乙醇的要求；但是这两个酶的最适pH都在碱性环境(pH9.0)，在酸性条件下失活；而胃内的pH很低，无法直接用于胃内的酒精降解。因此，将乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶在细胞内表达，微生物细胞就可以作为“反应器”降解乙醇。微生物细胞壁可以保护细胞内的酶免受潜在的有害环境影响，使得胞内的酶能够在较为恶劣的反应条件下发挥作用。同时，全细胞生物催化避免了细胞裂解和酶纯化，大大降低了生产成本。
为了便于基因工程改造，质粒载体上会带有抗生素抗性筛选标记，具有适用性广、筛选效率高等优点。但同时也带来了一系列的问题：为了维持筛选压力，在培养过程中需要持续补充相应的抗生素，增加生产成本；质粒在菌株传代时不会均等分配，使得重组菌株产量不稳定；质粒上的抗性基因可能会基因漂移，引起耐药性菌株泛滥。为了符合食品或医药安全的标准，食品级重组微生物必须符合两个规范：
(1)食品级重组微生物必须采用特性清楚、稳定且安全的食品级微生物。美国食品药物管理局和中国农业部等部门都将枯草杆菌认定为食品级安全菌株。
(2)用于构建食品级重组微生物的载体和筛选标记必须是食品级的，即采用的基因须来源于食品级微生物，不含有非食品级菌种来源的基因，抗生素抗性蛋白质编码基因是不允许出现的。
枯草杆菌培养简单快速，且有良好的发酵基础和生产技术，是目前原核表达系统中表达外源蛋白的理想宿主。此外，枯草杆菌没有致病性，是安全微生物(GenerallyRecognized as Safe，GRAS)，具有开发为食品级宿主的潜力。本发明采用同源重组的方法将目的基因的表达盒整合到枯草杆菌的基因组中，实现乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的胞内共表达，没有在重组菌株中引入抗生素抗性基因，符合食品级重组微生物的要求，重组枯草杆菌具有作为解酒制剂来减轻酒精性肝损伤的潜力。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的在于运用基因工程技术手段，构建一株食品级可降解乙醇的枯草杆菌重组菌。
技术方案
一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌构建方法,其特征在于，是一种食品级可降解乙醇的胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌的构建方法，包含以下构建步骤：
(1)整合型乙醛脱氢酶胞内表达载体的构建，包括扩增上下游同源臂、启动子和目的基因，回收扩增产物，采用重叠延伸PCR的方法将基因片段连接，再与整合型质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选得到乙醛脱氢酶整合型胞内表达载体；其中整合型乙醛脱氢酶胞内表达载体的构建中所述整合型质粒是含有启动子、乙醛脱氢酶基因和整合位点细胞壁相关蛋白酶wprA同源序列的整合型质粒。
(2)整合型乙醇脱氢酶胞内表达载体的构建；包括扩增上下游同源臂、启动子和目的基因，回收扩增产物，采用重叠延伸PCR的方法将基因片段连接，再与整合型质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选得到乙醇脱氢酶整合型胞内表达载体，其中整合型乙醇脱氢酶胞内表达载体的构建中所述整合型质粒是含有启动子、乙醇脱氢酶基因和整合位点蔗糖水解酶sacA同源序列的整合型质粒。
(3)胞内表达乙醛脱氢酶的枯草杆菌的构建：
1)重组质粒的转化：将测序验证正确的乙醛脱氢酶整合型胞内表达载体转化枯草杆菌168化学感受态细胞，涂布红霉素抗性平板，37℃过夜培养，PCR检测验证转化子，能检测到istALDH片段1578bp即为阳性克隆；
2)重组菌株的筛选：pCBS质粒是大肠杆菌和枯草杆菌的温敏型穿梭质粒，含有革兰氏阳性菌的温度敏感型复制起始位点——在37℃条件下，可在宿主菌中进行自主复制，当温度升高至42℃时，则无法进行自主复制。
将含有istALDH片段的阳性克隆在42℃，180rpm培养24小时后涂布LB平板，42℃培养得到单菌落，诱导第一次重组，第一次重组在wprA-up位置发生，得到的单菌落基因组出现wprA up-PaprE-istALDH-wprA down-质粒上的序列和wprA up-基因组序列-wprA down的结果。
将单菌落转接到新鲜的LB中37℃，180rpm培养48小时诱导发生第二次重组，整个质粒从基因组上掉下来，涂布LB平板并在42℃培养，消除掉下来的质粒，筛选在红霉素抗性的LB平板上不生长，但在无抗性的LB平板能够生长的克隆。
第二次重组在wprA-down位置发生，得到的菌株则为目的基因插入的重组型，通过PCR的方法可以检测istALDH基因，基因组出现wprA up-PaprE-istALDH-wprA down的结果,能检测到istALDH片段(1578bp)即为阳性克隆，验证正确的菌株即为胞内表达乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌，命名为BS-1，基因istALDH片段大小1578bp；
(4)胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的枯草杆菌的构建：
1)重组质粒的转化：将测序验证正确的乙醇脱氢酶整合型胞内表达载体转化至BS-1化学感受态细胞，涂布红霉素抗性平板，37℃过夜培养，PCR检测验证转化子，检测到scADH片段1047bp即为阳性克隆；
2)重组菌株的筛选：将含有scADH片段的阳性克隆在42℃，180rpm培养24小时后涂布LB平板，42℃培养得到单菌落，诱导第一次重组，第一次重组在sacA-up发生，得到的单菌落基因组出现sacA up-PaprE-scADH-sacAdown-质粒上的序列和sacA up-基因组序列-sacAdown的结果。
将单菌落转接到新鲜的LB中37℃，180rpm培养24小时后诱导第二次重组，第二次重组在sacA-down位置发生，通过PCR的方法可以检测scADH基因，基因组出现sacA up-PaprE-scADH-sacA down的结果，能检测到scADH片段1047bp即为阳性克隆，验证正确的菌株即为胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌，命名为BS-2，基因scADH片段大小1047bp。
所述整合型质粒是包括任何能够在枯草杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到枯草杆菌基因组上的质粒。可以为pDG364，pSG1729，pMLK83，pDG1661，pDG1662，pDG1728，pDG1730，pSG1170，pMAD，pDG1664，pAX01，pCBS或pCBS595中的任意一种。
所述一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌构建方法构建的食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌可以在乙醇降解中应用。
用所述的食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌可以制备冷冻干燥菌粉。所述冷冻干燥菌粉的制备方法为，将重组枯草杆菌发酵48小时后离心收集菌体，用生理盐水洗涤并重悬菌体，将加入冷冻干燥保护剂，混匀后先-80℃预冻12小时后真空冷冻干燥24小时，得到活性重组枯草杆菌冷冻干燥菌粉。所述冷冻干燥保护剂配方为1％甘露醇、6％谷氨酸钠、6％海藻糖、6％山梨醇和6％蔗糖。
有益效果
1.本发明采用双交换同源重组的方法将目的基因的表达盒整合到枯草杆菌的基因组中，实现了其在枯草杆菌中的高效表达，在制备解酒护肝口服制剂方面有巨大的应用前景。使用同类的质粒、引物和基因可以获得同样的重组菌。
2.将乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶插入枯草杆菌的基因组中，构建了食品级胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的基因工程菌株，得到的重组菌株是食品级重组微生物。该共表达重组枯草杆菌具有降解乙醇的能力，在实验条件下能有效降解反应液中的乙醇浓度，具有开发解酒制剂的潜力。
3.制备了活性重组枯草杆菌冷冻干燥菌粉，并通过优化冷冻干燥保护剂成分提高冷冻干燥粉中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，为进一步生产应用降低成本。
4.该共表达重组枯草杆菌(新鲜菌悬液或冷冻干燥菌粉)能够保护小鼠肝组织免受乙醇诱导的损伤。本发明所述的共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌在乙醇降解中的应用，共表达重组枯草杆菌具有降解乙醇的能力。
4.本发明通过单因素和正交试验，优化后的冷冻干燥保护剂配方为1％甘露醇、6％谷氨酸钠、6％海藻糖、6％山梨醇和6％蔗糖，在此条件下，乙醇脱氢酶存活率为55％，活力为1763U/g冷冻干燥粉；乙醛脱氢酶存活率为60％，活力为3071U/g冷冻干燥粉。
5.本发明所述的共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌在动物实验中的应用，重组枯草杆菌制剂能够保护小鼠肝组织免受乙醇诱导的损伤。
附图说明
图1 pBE-scADHistALDH质粒图谱
图2 pCBS-wprA/istALDH质粒图谱
图3 pCBS-sacA/scADH质粒图谱
图4胞内表达乙醛脱氢酶的枯草杆菌PCR验证电泳图
M:DNA Marker：1kb；1-3：乙醛脱氢酶基因片段
图5胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的枯草杆菌PCR验证电泳图
M:DNA Marker：DS 2000；1-3：乙醇脱氢酶基因片段
图6重组枯草杆菌对小鼠血清和肝脏指标的影响
*小鼠灌胃生理盐水(NC组)，酒精(AL组)或酒精和共表达乙醇脱氢酶/乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌(BS组)。
*AST：谷草转氨酶，ALT：谷丙转氨酶，AKP：碱性磷酸酶，MDA：丙二醛，SOD：超氧化物歧化酶，T-AOC：总抗氧化能力。
*数据表示为平均值±SD(n＝10)。不同的字母表明Duncan试验组间有显着差异(p<0.05)。
四、具体实施方式
实施例1：整合型乙醛脱氢酶胞内表达载体pCBS-wprA/istALDH的构建(整合位点：细胞壁相关蛋白酶wprA)
(1)根据NCBI数据库上的乙醛脱氢酶istALDH基因序列(GI:257782115)和pBE载体上的PaprE基因序列(pBE购自Takara公司，Cat#3380)设计引物，以质粒pBE-scADH/istALDH为模板(图1，pBE-scADH/istALDH质粒来源Lu,J.,Lyu,Y.,Li,M.,Sun,J.,Huang,Z.,Lu,F.,Lu,Z.,2018.Alleviating acute alcoholic liver injury in mice with Bacillussubtilis co-expressing alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase.JFunct Foods 49,342-350.)，用引物1和2进行PCR扩增得到PaprE-istALDH片段(PaprE 191bp，istALDH 1578bp，共1769bp)。
以枯草杆菌168基因组DNA为模板(购自上海古朵生物科技有限公司)，用引物3和4进行PCR扩增得到上游同源臂wprA-up片段(GenBank:CP041757.1，1152612到1153383，共772bp)，用引物5和6进行PCR扩增得到下游同源臂wprA-down片段(GenBank:CP041757.1，1154243到1154984，共742bp)。
(2)以wprA-up片段和PaprE-istALDH片段为模板，用引物2和3进行PCR扩增得到(wprA-up)-(PaprE-istALDH)片段(2541bp)。然后以(wprA-up)-(PaprE-istALDH)片段和wprA-down片段为模板，用引物3和6进行PCR扩增得到(wprA-up)-(PaprE-istALDH)-(wprA-down)(3283bp)片段。
(3)用Bgl II和Kpn I对整合质粒pCBS进行双酶切(pCBS质粒来源Meng,Fanqiang,et al.Enhanced expression of pullulanase in Bacillus subtilis by new strongpromoters mined from transcriptome data,both alone and incombination.Frontiers in Microbiology 2018(9):2635.)，采用一步克隆试剂盒将(wprA-up)-(PaprE-istALDH)-(wprA-down)片段与线性化的pCBS载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，获得阳性转化子，测序正确的质粒命名为pCBS-wprA/istALDH(图2)。
实施例2：整合型乙醇脱氢酶胞内表达载体pCBS-sacA/scADH的构建(整合位点：蔗糖水解酶，sacA)
(1)根据NCBI数据库上的乙醇脱氢酶scADH基因序列(GI:296147424)和pBE载体上的PaprE基因序列(pBE购自Takara公司，Cat#3380)设计引物，以质粒pBE-scADH/istALDH为模板(图1，pBE-scADH/istALDH质粒来源Lu,J.,Lyu,Y.,Li,M.,Sun,J.,Huang,Z.,Lu,F.,Lu,Z.,2018.Alleviating acute alcoholic liver injury in mice with Bacillussubtilis co-expressing alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase.JFunct Foods 49,342-350.)。用引物7和8进行PCR扩增得到PaprE-scADH片段(PaprE 191bp，scADH 1047bp，共1238bp)。
以枯草杆菌168的基因组DNA为模板，用引物9和10进行PCR扩增得到上游同源臂sacA-up片段(GenBank:CP041757.1，3902838到3903837，1000bp)，用引物11和12进行PCR扩增得到下游同源臂sacA-down片段(GenBank:CP041757.1，3901038到3902037，1000bp)。
(2)以sacA-up片段和PaprE-scADH片段为模板，用引物8和9进行PCR扩增得到(sacA-up)-(PaprE-scADH)片段(3238bp)。然后以(sacA-up)-(PaprE-scADH)和sacA-down片段为模板，用引物9和12进行PCR扩增并得到(sacA-up)-(PaprE-scADH)-(sacA-down)片段(4238bp)。
(3)用Bgl II和Kpn I对整合质粒pCBS(pCBS质粒来源Meng,Fanqiang,etal.Enhanced expression of pullulanase in Bacillus subtilis by new strongpromoters mined from transcriptome data,both alone and incombination.Frontiers in Microbiology 2018(9):2635.)双酶切，采用一步克隆试剂盒将(sacA-up)-(PaprE-scADH)-(sacA-down)片段与线性化的pCBS载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到阳性转化子，测序正确的质粒命名为pCBS-sacA/scADH(图3)。
表1 PCR引物序列
实施例3：胞内表达乙醛脱氢酶的枯草杆菌的构建
重组质粒的转化：将测序验证正确的质粒pCBS-wprA/istALDH转化枯草杆菌168化学感受态细胞，涂布红霉素(5μg/mL)抗性平板，37℃过夜培养，PCR检测验证转化子，能检测到istALDH片段(1578bp)即为阳性克隆。
重组菌株的筛选：pCBS质粒是大肠杆菌和枯草杆菌的温敏型穿梭质粒，含有革兰氏阳性菌的温度敏感型复制起始位点——在37℃条件下，可在宿主菌中进行自主复制，当温度升高至42℃时，则无法进行自主复制。
将含有重组质粒的阳性克隆在42℃，180rpm培养24小时后涂布LB平板，42℃培养得到单菌落，诱导第一次重组。由于枯草杆菌基因组和质粒pCBS-wprA/istALDH都含有相同的wprA-up片段，菌株会在培养过程中在基因组的wprA-up位置发生重组，得到的菌株基因组出现wprA up-PaprE-istALDH-wprA down-质粒上的序列和wprA up-基因组序列-wprAdown的序列。
将单菌落转接到新鲜的LB中37℃，180rpm培养48小时诱导发生第二次重组。涂布LB平板并在42℃培养，筛选在红霉素抗性的LB平板上不生长，但在无抗性的LB平板能够生长的克隆。第二次重组在wprA-down位置发生，得到的菌株则为目的基因插入的重组型。通过PCR的方法可以检测istALDH基因(基因组出现wprA up-PaprE-istALDH-wprA down的结果),能检测到istALDH片段(1578bp)即为阳性克隆。PCR验证正确的菌株即为胞内表达乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌，命名为BS-1(图4，istALDH片段大小1578bp)。
实施例4：胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的枯草杆菌的构建及发酵验证
重组质粒的转化：将测序验证正确的重组质粒pCBS-sacA/scADH转化枯草杆菌BS-1化学感受态细胞，涂布红霉素(5μg/mL)抗性平板，37℃过夜培养，PCR检测验证转化子，能检测到scADH片段(1047bp)即为阳性克隆。
重组菌株的筛选：诱导第一次重组。将含有重组质粒的阳性克隆在42℃，180rpm培养24小时后涂布LB平板，42℃培养得到单菌落。
由于枯草杆菌基因组和重组质粒pCBS-sacA/scADH都含有相同的sacA-up片段，菌株会在培养过程中在基因组的sacA-up位置发生重组，得到的菌株基因组出现sacA up-PaprE-scADH-sacA down-质粒上的序列和sacA up-基因组序列-sacA down的结果。
将单菌落转接到新鲜的LB中37℃，180rpm培养24小时后诱导第二次重组，筛选在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长的克隆。第二次重组在sacA-down位置发生，得到的菌株则为目的基因插入的重组型，通过PCR的方法可以检测scADH基因(基因组出现sacA up-PaprE-scADH-sacA down的结果)，能检测到scADH片段(1047bp)即为阳性克隆(图5，scADH片段大小1047bp)。验证正确的菌株即为胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌，命名为BS-2。
发酵验证：将验证正确的共表达重组枯草杆菌BS-2在平板上划线，过夜培养。挑取单菌落接种于种子培养基，37℃，180rpm过夜培养。次日将种子液接种于新鲜发酵培养基，37℃，180rpm培养。发酵结束后离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤并悬浮菌体。将菌体置于冰水浴中，用超声细胞破碎仪破碎菌体，离心收集上清液，获得粗酶液。检测粗酶液中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活力。结果表明，发酵48小时产量达到最高，乙醇脱氢酶活力为57U/mL，乙醛脱氢酶活力为81U/mL。
实施例6：共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢的菌株在体外乙醇降解中的应用
在37℃水浴条件下进行反应，反应结束后吸取反应液并用滤膜(0.22μm)过滤，用气相色谱检测乙醇含量。反应体系如下：
在重组枯草杆菌浓度为109cfu/mL和1％乙醇的条件下，半小时内反应体系中的乙醇浓度可降低43％左右；在重组枯草杆菌浓度为109cfu/mL和10％乙醇的条件下，半小时内反应体系中的乙醇浓度可降低22％左右，说明共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌在低pH条件下具有降解乙醇的能力。
实施例7：活性重组枯草杆菌冷冻干燥菌粉的制备及贮存实验
冷冻干燥粉菌的制备：活化共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌，将重组菌株发酵48小时后离心收集菌体，用生理盐水洗涤并重悬菌体，将加入冷冻干燥保护剂，混匀后先-80℃预冻12小时后真空冷冻干燥24小时，得到活性重组枯草杆菌冷冻干燥菌粉。
冷冻干燥保护剂的优化：以6％的谷氨酸钠和1％甘露醇作为基础配方，复配海藻糖，山梨醇和蔗糖以进一步提高冷冻干燥菌粉中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活力，设计三因素三水平的正交实验来优化保护剂配方，具体因素的水平设置见表2。通过正交试验，优化后的冷冻干燥保护剂配方为1％甘露醇、6％谷氨酸钠、6％海藻糖、6％山梨醇和6％蔗糖。在此条件下，乙醇脱氢酶存活率为55％，活力为1763U/g冷冻干燥菌粉；乙醛脱氢酶存活率为60％，活力为3071U/g冷冻干燥菌粉。
表2正交试验因素与水平
实施例8：动物实验
适应性培养之后，雄性ICR小鼠随机分为3组(6周龄，每组10只)——空白对照组(NC)，酒精组(AL)，重组枯草杆菌处理组(BS)。在酒精组中，以5.6g酒精/kg体重/天的剂量灌胃小鼠；在空白对照组组中，以相同体积的生理盐水灌胃小鼠；在重组枯草杆菌处理组中，除了灌胃相同剂量的酒精之外，重组菌的灌胃剂量为2000U/kg体重/天的乙醇脱氢酶和3000U/kg体重/天的乙醛脱氢酶。连续灌胃8天；每次灌胃1小时后从小鼠尾静脉取血并检测血液中的酒精含量。实验结束后，将小鼠禁食16小时后处死，记录小鼠体重和肝脏重量，取血液和肝脏用于生化分析。
连续灌胃8天后，各实验组在小鼠体重上没有显著差异，表明酒精和重组枯草杆菌都对小鼠体重没有影响(表2)。然而，灌胃酒精使小鼠的肝脏指数显著增加(15.87％)，表明小鼠肝脏受到损伤；而重组枯草杆菌处理组小鼠的肝脏指数比酒精组显著降低(8.26％)，说明重组枯草杆菌可以减少酒精引起的肝脏指数增加；但仍比空白对照组增加6.30％，没有恢复到正常水平。此外，饮酒后小鼠血液中的酒精含量会大幅增加。与空白对照组相比，酒精组小鼠的血液乙醇含量增加了12倍(表2)；重组枯草杆菌处理组与酒精处理的小鼠相比，重组枯草杆菌组能够显著降酒精引起的血液乙醇含量的升高，酒精浓度降低40％左右。这些数据表明，共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌可以显著减少酒精引起的肝脏指数和血液酒精含量的增加。
此外，血液中的转氨酶以及肝脏脂质过氧化和氧化应激水平是评价肝损伤的常用指标。连续灌胃8天之后，如图6a-c所示，酒精组与空白对照组组相比，小鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(AKP)活性显著增加，分别增加184.83％，74.52％和73.35％；重组枯草杆菌组与酒精组相比，能显著降低小鼠血清中的谷丙转氨酶，谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性，分别降低51.56％，22.86％和36.55％。此外，如图6d-f所示，与空白对照组相比，酒精组小鼠肝脏中的丙二醛(MDA)浓度显著增加(63.42％)，而肝脏总能抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)水平显著降低(分别降低21.57％和15.77％)。然而，重组枯草杆菌组的小鼠肝脏丙二醛和超氧化物歧化酶水平指标恢复到了正常水平；与酒精组小鼠相比，丙二醛含量减少了26.86％，超氧化物歧化酶水平增加了20.89％。与酒精组相比，重组枯草杆菌处理组的总能抗氧化能力显著升高(14.55％)，但与空白对照组相比仍存在显著差异。这些数据表明，共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌可以减少酒精引起的血液转氨酶水平的升高，减轻肝脏脂质过氧化和氧化应激水平，缓解酒精对肝脏造成的损伤。
表2酒精和重组枯草杆菌对小鼠体重，肝脏指数和血液中酒精含量的影响
*肝脏指数＝肝脏重量/小鼠体重。小鼠灌胃生理盐水(NC组)，酒精(AL组)或酒精和共表达乙醇脱氢酶/乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌(BS组)。
*数据表示为平均值±SD(n＝10)。不同的字母表明Duncan试验组间有显着差异(p<0.05)。对于血液乙醇含量，不同的小写和大写字母分别表示不同的天和组之间的显著差异。
序列表
<110> 南京农业大学，南京福斯弗瑞生物科技有限公司
<120> 一种食品级降解乙醇枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法
<141> 2019-09-30
<160> 12
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<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
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Claims (8)

1.一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌构建方法,其特征在于，是一种食品级可降解乙醇的胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌的构建方法，包含以下构建步骤：
(1)整合型乙醛脱氢酶胞内表达载体的构建，包括扩增上下游同源臂、启动子和目的基因，回收扩增产物，采用重叠延伸PCR的方法将基因片段连接，再与整合型质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选得到乙醛脱氢酶整合型胞内表达载体，所述整合型质粒是含有启动子、乙醛脱氢酶基因和整合位点细胞壁相关蛋白酶wprA同源序列的整合型质粒；
(2)整合型乙醇脱氢酶胞内表达载体的构建，包括扩增上下游同源臂、启动子和目的基因，回收扩增产物，采用重叠延伸PCR的方法将基因片段连接，再与整合型质粒连接，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选得到乙醇脱氢酶整合型胞内表达载体，所述整合型质粒是含有启动子、乙醇脱氢酶基因和整合位点蔗糖水解酶sacA同源序列的整合型质粒；
(3)胞内表达乙醛脱氢酶的枯草杆菌的构建：
1)重组质粒的转化：将测序验证正确的乙醛脱氢酶整合型胞内表达载体转化枯草杆菌168化学感受态细胞，涂布红霉素抗性平板，37℃过夜培养，PCR检测验证转化子，能检测到istALDH片段1578bp即为阳性克隆；
2)重组菌株的筛选：pCBS质粒是大肠杆菌和枯草杆菌的温敏型穿梭质粒，含有革兰氏阳性菌的温度敏感型复制起始位点——在37℃条件下，可在宿主菌中进行自主复制，当温度升高至42℃时，则无法进行自主复制。
将含有istALDH片段的阳性克隆在42℃，180rpm培养24小时后涂布LB平板，42℃培养得到单菌落，诱导第一次重组，第一次重组在wprA-up位置发生，得到的单菌落基因组出现wprA up-PaprE-istALDH-wprA down-质粒上的序列和wprA up-基因组序列-wprA down的序列。
将单菌落转接到新鲜的LB中37℃，180rpm培养48小时诱导发生第二次重组，涂布LB平板并在42℃培养，消除掉下来的质粒，筛选在红霉素抗性的LB平板上不长，但在无抗性的LB平板能够生长的克隆。第二次重组在wprA-down位置发生，得到的菌株则为目的基因插入的重组型。通过PCR的方法可以检测istALDH基因，基因组出现wprA up-PaprE-istALDH-wprAdown的结果,能检测到istALDH片段1578bp即为阳性克隆，验证正确的菌株即为胞内表达乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌，命名为BS-1，含istALDH片段大小1578bp；
(4)胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的枯草杆菌的构建：
1)重组质粒的转化：将测序验证正确的乙醇脱氢酶整合型胞内表达载体转化胞内表达乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌BS-1化学感受态细胞，涂布红霉素抗性平板，37℃过夜培养，PCR检测验证转化子，检测到scADH片段1047bp即为阳性克隆；
2)重组菌株的筛选：将含有scADH片段的阳性克隆在42℃，180rpm培养24小时后涂布LB平板，42℃培养得到单菌落，诱导第一次重组，第一次重组在sacA-up发生，得到的单菌落基因组出现sacA up-PaprE-scADH-sacA down-质粒上的序列和sacA up-基因组序列-sacAdown的序列。
将单菌落转接到新鲜的LB中37℃，180rpm培养24小时后诱导第二次重组，第二次重组在sacA-down位置发生，通过PCR的方法可以检测scADH基因，基因组出现sacA up-PaprE-scADH-sacA down的结果，能检测到scADH片段1047bp即为阳性克隆，验证正确的菌株即为胞内共表达乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的重组枯草杆菌，命名为BS-2，基因scADH片段大小1047bp。
2.根据权利要求1所述一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌构建方法,其特征在于，所述整合型质粒包括任何能够在枯草杆菌和大肠杆菌中复制的并且能够通过同源重组的方法整合到枯草杆菌基因组上的质粒。
3.根据权利要求1或2所述一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌构建方法,其特征在于，所述整合型质粒为pDG364，pSG1729，pMLK83，pDG1661，pDG1662，pDG1728，pDG1730，pSG1170，pMAD，pDG1664，pAX01，pCBS或pCBS595中的任意一种。
4.用权利要求1-3之一所述一种食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌构建方法构建的食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌。
5.权利要求4所述的食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌在乙醇降解中的应用。
6.用权利要求4所述的食品级降解乙醇的枯草杆菌重组菌制备的冷冻干燥菌粉。
7.权利要求6所述冷冻干燥菌粉的制备方法，其特征在于：将重组枯草杆菌发酵48小时后离心收集菌体，用生理盐水洗涤并重悬菌体，将加入冷冻干燥保护剂，混匀后先-80℃预冻12小时后真空冷冻干燥24小时，得到活性重组枯草杆菌冷冻干燥菌粉。
8.根据权利要求7所述冷冻干燥菌粉制备方法，所述冷冻干燥保护剂配方为1％甘露醇、6％谷氨酸钠、6％海藻糖、6％山梨醇和6％蔗糖。
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