CN109385389A - 一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST‑Ⅲ及其制备方法。该缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST‑Ⅲ是为了进一步改良植物乳杆菌ST‑Ⅲ的发酵性能，本发明是以植物乳杆菌ST‑Ⅲ为研究对象，采用Cre‑loxP同源重组的方法对该菌株进行遗传改造，构建合成能产生高比例L‑乳酸的植物乳杆菌ST‑Ⅲ，使植物乳杆菌ST‑Ⅲ合成L‑乳酸比例是原来合成L‑乳酸比例近3倍，有效的降低了人体吸收乳酸时的负担，为改良乳酸菌的遗传性能奠定基础。

Description

一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品产品领域，具体涉及一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ以及所述植物乳杆菌的制备方法。

背景技术

乳酸菌是一类在自然界中广泛存在的微生物，是人和动物肠道内重要的生理菌群。乳酸菌及其发酵制品具有特殊和重要的生理功能，包括改善人体肠道菌群、调节机体免疫力、抑肿瘤、降低血清胆固醇、调节血压等^[72]，因而，乳酸菌的重要性受到越来越多的关注，对于其分子机制和遗传特性的研究也越来越多。前期研究通过对植物乳杆菌ST-Ⅲ进行摇瓶发酵，结果显示其合成DL-乳酸，其中D-/L-乳酸的比例为4:3。

众所周知，人体仅含有L-乳酸脱氢酶，而过多的摄入D-乳酸会对身体产生较大的代谢负荷，而D-乳酸和L-乳酸分别由D-乳酸脱氢酶(D-LDH,EC 1.1.1.28)和L-乳酸脱氢酶(L-LDH,EC 1.1.1.27)催化而成。因此为进一步改良植物乳杆菌ST-Ⅲ的发酵性能，本发明旨在以植物乳杆菌ST-Ⅲ为研究对象，采用Cre-loxP同源重组的方法对该菌株进行遗传改造，构建合成高比例L-乳酸的植物乳杆菌ST-Ⅲ，为改良乳酸菌的遗传性能奠定基础。

本发明在植物乳杆菌的研究领域中引进一种利用Cre-loxP介导的同源重组的基因敲除的方法。本发明利用Cre-loxP介导的同源重组技术，以植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组为模板，PCR扩增目的基因上下游同源臂基因片段，以pNZ5319为质粒，分别构建含有ldhA基因上下游同源臂片段的敲除质粒，构建缺失ldhA基因的植物乳杆菌。摇瓶发酵实验显示该基因工程菌具有合成高比例L-乳酸的能力，本专利为提高其L-乳酸的合成比例提供方法和依据。

发明内容

本发明的目的提供一种可以提高L-乳酸产量的缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ及其制备方法。

7、本发明解决上述技术问题方案之一：所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ，是植物乳杆菌ST-Ⅲ中的ldhA基因上游基因片段被敲除质粒携带的ldhA基因上游同源臂基因替换，植物乳杆菌ST-Ⅲ中的ldhA基因下游基因片段被敲除质粒携带的ldhA基因下游同源臂基因替换，ldhA基因上游同源臂基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO:1、ldhA基因下游同源臂基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO:2。所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌经过摇瓶发酵后合成L-乳酸的比例是植物乳杆菌ST-Ⅲ合成L-乳酸比例的2.7倍。研究发现同源重组的效率与同源臂的长短有关，一定范围内同源臂长重组效率好，但是如果同源臂过长就会减小敲除质粒在电转化的过程中穿过细胞壁孔洞而进入细胞的概率，本实验发现敲除质粒连接的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂为1500bp、下游同源臂为1000bp时，重组效果最好。

敲除质粒包括质粒pNZ5319、ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因，质粒pNZ5319同时连接ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因。所述敲除质粒用于构建缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ，以现有技术相比，质粒pNZ5319含有氯霉素抗性基因和红霉素抗性基因，因此在试验中可以省略加入抗性基因这一实验步骤，简化实验操作。

解决上述技术问题方案之二：一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，包括以下步骤：

S1、以植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组DNA为模板，分别PCR扩增ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因；

S2、用限制性内切酶同时酶切质粒pNZ5319和S1步骤中PCR扩增后的ldhA基因上游同源臂基因，并将酶切后获得的产物在连接酶的作用下进行重新连接，得到包含上游同源臂的重组质粒；

S3、用限制性内切酶同时酶切S2步骤中的重组质粒和S1步骤中PCR扩增后的ldhA基因下游同源臂基因，酶切后获得的产物在连接酶的作用下重新进行连接，连接后得到包含上下游同源臂的重组质粒即为敲除质粒；

S4、将敲除质粒电转化至植物乳杆菌ST-Ⅲ感受态细胞中；

S5、对转化后获得的植物乳杆菌ST-Ⅲ进行抗性验证。

所述步骤S1的PCR扩增体系中以植物乳杆菌ST-Ⅲ为模板设计引物对，该引物对分别为ldhA基因上游同源臂引物对和ldhA基因下游同源臂引物对，ldhA基因上游同源臂引物对其碱基序列为序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，ldhA基因下游同源臂引物对其碱基序列为序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

步骤S1还包括对PCR扩增后的ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因分别进行测序验证。

步骤S2中用限制性内切酶做酶切处理是用PmeI、XhoI同时进行双酶切处理，步骤S3中的用限制性内切酶做酶切处理是用Ecl136 Ⅱ、Bgl Ⅱ同时进行双酶切处理。

步骤S3中的用限制性内切酶做酶切处理，还可以用Eco53kI、Bgl Ⅱ同时进行双酶切处理。Eco53kI和Ecl136 Ⅱ属于同序同裂酶，即序列及识别位点相同，酶切效果相似。

步骤S2和步骤S3提高了酶切的效率缩短了反应时间。

步骤S3还包括对所得到的敲除质粒进行电泳检测。

步骤S4中将敲除质粒电转化至植物乳杆菌ST-Ⅲ感受态细胞中，电转化参数为：电压2.0-2.5kv,电击时间3-7ms。用此参数进行电转化，效率更高、成功率也高于其他参数下的电转化，且提高了重组效率。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：通过同源重组的方法对植物乳杆菌的乳酸合成途径进行代谢改造，和现有的植物乳杆菌ST-Ⅲ相比本方法制备的缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ所述获得的突变株具有合成高比例L-乳酸的能力，改变丙酮酸到乳酸的代谢流的方向，明显的降低了D-乳酸的产量，L-乳酸的产量比例是原来产量比例的2.7倍，减轻了人体过多的摄入D-乳酸对身体产生的胃肠道很大代谢负荷，且变相的增加了乳酸菌及其发酵制品的吸收，从而改善人体肠道菌群、调节机体免疫力、抑肿瘤、降低血清胆固醇、调节血压等。

和现有技术相比本制备方法构建方法简单，制备方法简单，且阳性率高，制备的缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ稳定且未引入任何多余的序列，避免基因敲除后在染色体上留下残留痕迹，有利于菌株的基因组的稳定，且更方便于后续的改造工作。本发明方法针对植物乳杆菌ST-Ⅲ合成较高比例D-乳酸的问题，结合Cre-loxP介导的同源重组技术，改变丙酮酸到乳酸的代谢流的方向，提高L-乳酸的合成，可以为新型乳酸菌的开发提供方法和依据。本发明方法将为乳酸菌的遗传性能改良提供了新的研究思路，并奠定较好的研究基础。本发明利用Cre-loxP同源重组技术，可以使植物乳杆菌ST-Ⅲ发酵后D-乳酸/L-乳酸的比例从4:3增加至1:2，使得L-乳酸产量的比例上升了原来的近3倍。

综上所述，现有技术并没有利用基因敲除技术，提高植物乳杆菌ST-Ⅲ的L-乳酸比例的相关报道，本发明成功扩增出植物乳杆菌ST-Ⅲ的ldhA基因上下游同源臂基因，再分别利用2组限制性内切酶：Xho I、Pme I和Ecl136 Ⅱ、Bgl Ⅱ对重组质粒酶切，纯化回收目的片段，先后插入到质粒pNZ5319中，成功构建出敲除质粒pNZ5319ΔldhA。利用敲除质粒电转化植物乳杆菌ST-Ⅲ，经氯霉素抗性平板筛选、PCR鉴定和测序鉴定，成功完成植物乳杆菌ST-Ⅲ的ldhA基因的敲除。

附图说明

图1梯度PCR扩增ldhA上游同源臂片段电泳图(从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250bp)；

图2ldhA下游同源臂基因的PCR产物电泳图(从上到下分子量依次为：2000、1000bp)；

图3包含ldhA上游同源臂重组质粒的验证电泳图(lane1-3:1-3#clones；lane4:pNZ5319)；

图4包含ldhA下游同源臂重组质粒的验证电泳图(lane1-10:1-10#clones；lane11:pNZ5319；lane12:pNZ3519upldhA,从上到下分子量依次为：5000、3000、2000、1500、1000bp)；

图5pNZ5319质粒图谱，上游同源臂基因插入到XhoI和PmeI酶切位点，下游同源臂插入到Ecl136 Ⅱ和Bgl Ⅱ位点中。

图6敲除质粒验证电泳图(M:Marker；lane1-5:1-5#clones；lane6:pNZ5319upldhA；lane7:pNZ3519downldhA,从上从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250bp)；

图7敲除菌单克隆验证电泳图(M:Marker；lane1-10:1-10#clones；lane11:植物杆菌ST-Ⅲ,从上从上到下分子量依次为：2000、1000、750、500、250bp)；

图8氯霉素抗性MRS平板筛选图；

图9红霉素抗性MRS平板筛选图；

具体实施方式

下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的保护范围。

1.仪器与试药

主要仪器PCR仪5424R(Eppendorf)，核酸电泳仪EPS-100(上海天能科技有限公司)，XhoI、PmeI、Bgl Ⅱ、Ecl136 Ⅱ限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购买于Takara宝生物工程(大连)有限公司，胶回收试剂盒、红霉素和氯霉素抗生素购买于上海生工生物工程有限公司，质粒抽提试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司

2.实验方法

(1)实施例1PCR扩增D-乳酸脱氢酶基因上下游同源臂基因

使用天根基因组提取试剂盒抽提L.plantarum ST-Ⅲ基因组DNA，作为PCR反应模板。根据NCBI数据库公布的L.plantarum ST-Ⅲ D-乳酸脱氢酶基因(GenBank:ADN98863.1)的上游同源臂1500bp、下游同源臂1000bp设计引物，如附表1所示。PCR体系为50μL：模板DNA2μL，上下游引物(10μmol/L)各2μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，10×PCR buffer 5μL，0.5μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，ddH₂O补足50μL。PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。结果如附图1和2所示。

上游同源臂具体基因序列如下

下游同源臂具体基因序列如下

将已纯化的PCR产物与pMD18-T载体以5:1的摩尔比混合，在T4连接酶的作用下，室温连接6h；取5μL连接产物，加入100μL大肠杆菌JM109感受态，冰浴30min；42℃热激90s；冰上放置5min后，加入900μL LB培养基，37℃摇床复苏60min；3000r/min离心，去除上清后加入100μL新鲜LB液体培养基重悬，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37培养12h；挑取单菌落至3mL LB液体培养基，37℃培养12h后，采用天根质粒试剂盒提取质粒；将所抽得的质粒用相应的限制性内切酶进行双酶切，37℃酶切2h；经琼脂糖凝胶电泳检测后，酶切条带大小正确的质粒送测序鉴定。将测序结果与NCBI中序列进行比对，显示所测基因与植物乳杆菌ST-Ⅲ上下游基因测序同源性为100％，表明所挑选单克隆均为阳性。研究发现同源重组的效率与同源臂的长短有关，一定范围内同源臂长重组效率好，但是如果同源臂过长就会减小敲除质粒在电转化的过程中穿过细胞壁孔洞而进入细胞的概率，本实验发现敲除质粒连接的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂为1500bp、下游同源臂为1000bp时，重组效果最好。

(2)实施例2包含上游同源臂的重组质粒的构建

将扩增后的ldhA基因上游同源臂和质粒的pNZ5319分别进行PmeI、XhoI双酶切，37℃酶切4h左右，采用上海生工DNA片段胶回收试剂盒对酶切产物进行回收和纯化。将酶切后质粒和DNA片段按照1:3的比例进行连接，16℃连接过夜后热激转化E.coli JM109感受态细胞，37℃培养后挑选平板上的单克隆，质粒抽提双重验证。以空质粒pNZ5319作对照，结果如附图3所示。所挑选的3株单菌落菌株的重组质粒，结合菌落PCR验证结果表明所挑选的单菌落均为阳性克隆，包含ldhA基因上游同源臂基因的重组质粒pNZ5319upldhA构建成功。

结合菌落PCR验证结果表明所挑选的单菌落均为阳性克隆，包含ldhA基因上游同源臂基因的重组质粒pNZ5319upldhA构建成功。由于质粒pNZ5319含有氯霉素抗性基因和红霉素抗性基因，因此在试验中可以省略验证抗性基因这一实验步骤，简化实验操作。

(3)实施例3包含下游同源臂的重组质粒的构建

将扩增后的ldhA基因下游同源臂和质粒的pNZ5319分别进行Ecl136 ⅡBgl Ⅱ双酶切，37℃酶切4h左右，并将酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工DNA片段胶回收试剂盒对酶切产物进行回收和纯化。将酶切后质粒和DNA片段按照1:3的比例进行连接，16℃连接过夜后热激转化E.coli JM109感受态细胞，37℃培养后挑选平板上的单克隆，抽质粒抽提双重验证，以空质粒pNZ5319作对照，结果如附图4所示。所挑选的10株单菌落菌株的重组质粒大小与pNZ5319upldhA一致，大于质粒pNZ5319。结合菌落PCR验证结果表明所挑选的单菌落均为阳性克隆，包含ldhA基因下游同源臂基因的重组质粒pNZ5319downldhA构建成功。

(4)实施例4包含下游同源臂的重组质粒的构建

将扩增后的ldhA基因下游同源臂和质粒的pNZ5319分别进行Eco53kIBgl Ⅱ双酶切，37℃酶切4h左右，并将酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工DNA片段胶回收试剂盒对酶切产物进行回收和纯化。将酶切后质粒和DNA片段按照1:3的比例进行连接，16℃连接过夜后热激转化E.coli JM109感受态细胞，37℃培养后挑选平板上的单克隆，抽质粒抽提双重验证，以空质粒pNZ5319作对照，结果如附图4所示。所挑选的10株单菌落菌株的重组质粒大小与pNZ5319upldhA一致，大于质粒pNZ5319。结合菌落PCR验证结果表明所挑选的单菌落均为阳性克隆，包含ldhA基因下游同源臂基因的重组质粒pNZ5319downldhA构建成功。

(5)实施例5敲除质粒pNZ5319ΔldhA的构建

将构建好的包含ldhA基因上游同源臂基因的重组质粒pNZ5319upldhA和扩增后的ldhA基因下游同源臂，分别进行Eco53kI、Bgl Ⅱ双酶切，37℃酶切4h左右，采用上海生工DNA片段胶回收试剂盒对酶切产物进行回收和纯化。将酶切后质粒和DNA片段按照1:3的比例进行连接，16℃连接12小时。

或将构建好的包含ldhA基因下游同源臂基因的重组质粒pNZ5319downldhA和扩增后的ldhA基因上游同源臂，分别进行PmeI、XhoI双酶切，37℃酶切4h左右，采用上海生工DNA片段胶回收试剂盒对酶切产物进行回收和纯化。将酶切后质粒和DNA片段按照1:3的比例进行连接，16℃连接12小时。

按照上述方法构建同时包含上下游同源臂基因的敲除质粒pNZ5319ΔldhA，挑选单克隆，进行PCR验证，结果如附图6所示。从中我们可以看出，以pZN5319upldhA和pZN5319downldhA作对照，所挑选的五株单克隆菌株的重组质粒均显示出正确大小的条带，表明这五株菌均为阳性克隆，敲除质粒pNZ5319ΔldhA构建成功。

(6)实施例6敲除质粒pNZ5319ΔldhA的构建

将构建好的包含ldhA基因上游同源臂基因的重组质粒pNZ5319upldhA和扩增后的ldhA基因下游同源臂，分别进行Ecl136 Ⅱ、Bgl Ⅱ双酶切，37℃酶切4h左右，采用上海生工DNA片段胶回收试剂盒对酶切产物进行回收和纯化。将酶切后质粒和DNA片段按照1:3的比例进行连接，16℃连接12小时。

或将构建好的包含ldhA基因下游同源臂基因的重组质粒pNZ5319downldhA和扩增后的ldhA基因上游同源臂，分别进行PmeI、XhoI双酶切，37℃酶切4h左右，采用上海生工DNA片段胶回收试剂盒对酶切产物进行回收和纯化。将酶切后质粒和DNA片段按照1:3的比例进行连接，16℃连接12小时。

按照上述方法构建同时包含上下游同源臂基因的敲除质粒pNZ5319ΔldhA如附图5所示。挑选单克隆，进行PCR验证，结果如附图6所示。从中我们可以看出，以pZN5319upldhA和pZN5319downldhA作对照，所挑选的五株单克隆菌株的重组质粒均显示出正确大小的条带，表明这五株菌均为阳性克隆，敲除质粒pNZ5319ΔldhA构建成功。

(7)实施例7植物乳杆菌ST-Ⅲ D-乳酸脱氢酶基因缺失的突变株的构建

将敲除质粒电转化ST-Ⅲ感受态细胞，质粒添加量为50～300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL氯霉素抗性的MRS平板，37℃厌氧培养48h，挑选单克隆若干。抽提基因组，采用F:CAAAGGGGCTAAATATACGCGGGTCAGA；R:AATATGTGTACAGGCTGAGCTTAGTCCTTAGC为鉴定引物(分别为ldhA上游同源臂250bp位置设计上游引物，下游同源臂250bp位置设计下游同源臂)，进行PCR验证，PCR产物电泳图如附图7所示。与对照菌株ST-Ⅲ相比，所挑选的单克隆中1、5、7～10#菌株在1800bp左右的位置显示特异的条带(由于引物对设计分别为ldhA上游同源臂250bp位置设计上游引物，下游同源臂250bp位置设计下游同源臂，所以会在1800bp左右显示特异的条带)，且与预期大小一致,测序结果表明为正确的阳性克隆。试验中的参数电压2.5kV，电击试剂5ms是对电转化参数的进一步优化，在此参数下电转化的效率更高、成功率也高于其他参数下的电转化，且重组效率最好。

测序验证序列

CAAAGGGGCTAAATATACGCGGGTCAGATCACGGCGGCCTTTGCAATTAATTTATCATGAAACTTTCACTGACAAATCAAGTGCGTTAAAGGCTGAATATGCCTTCAAACACCAATCGCGAGCTGCCAAGCTAAAATACTTGTCAGCTCACGATGTGAAAATTTAGCGAAGTTTTCACAATTTATGATTCTATTTCTCGCATTTACTGTTATAATATTTACTGTATCAATATATAGGAGGAATTTTTGTAACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACAATGTCTTAGGCGTTAAGGTCGTTTTAGCCGATGGTCGCGAAGTTAAGTAAGGTACCATGCAGTTTAAATTCGGTCCTCGGGATATGATAAGAATGGCTTAATAAAGCGGTTACTTTGGATTTTTGTGAGCTTGGACTAGAAAAAAACTTCACAAAATGCTATACTAGGTAGATAAAAATTTAGGAGGCATATCAAATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACAATTGGAAGAGAAAAGAGATATTTAATCATTATTTGAACCAACAAACGACTTTTAGTATAACCACAGAAATTGATATTAGTGTTTTATACCGAAACATAAAACAAGAAGGATATAAATTTTACCCTGCATTTATTTTCTTAGTGACAAGGGTGATAAACTCAAATACAGCTTTTAGAACTGGTTACAATAGCGACGGAGAGTTAGGTTATTGGGATAAGTTAGAGCCACTTTATACAATTTTTGATGGTGTATCTAAAACATTCTCTGGTATTTGGACTCCTGTAAAGAATGACTTCAAAGAGTTTTATGATTTATACCTTTCTGATGTAGAGAAATATAATGGTTCGGGGAAATTGTTTCCCAAAACACCTATACCTGAAAATGCTTTTTCTCTTTCTATTATTCCATGGACTTCATTTACTGGGTTTAACTTAAATATCAATAATAATAGTAATTACCTTCTACCCATTATTACAGCAGGAAAATTCATTAATAAAGGTAATTCAATATATTTACCGCTATCTTTACAGGTACATCATTCTGTTTGTGATGGTTATCATGCAGGATTGTTTATGAACTCTATTCAGGAATTGTCAGATAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAATATGAGATAATGCCGACTGTACTTTCGGATCCTAAACGCAATTGATGATTGGTTCGGAAGGCACGTTAGGAATCATTACCGAAGTAATCGTTAAACTGTTGCCGATTCCGCTAGGGACCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTACAGCCCGGGCATGAGCTCCGATCGCTACGAGAAGACGCACTATCGACCATACCTAATAATTTATCTACATTCCCTTTAGTAACGTGAAGAAGATCTCTAAAGCTGACGGGGTAAACTATATAAAATCCAAATAAATTTCTAAAAATAAAAAAGTCTGTCGATGAACAGACTTTTTTATTATAGTTTAAAGCAAACTTTTAAATATAATAAAAAGAGTTAGTTGAAATTTTCTACTAACTCTTTTTTATTTTTAGTTCTCGATTATCACTGAAAATGGCGTCACTCATCTGAGTGACGCCATTTTTTATACTTTCATCTAATGGGGCCTTTTTGAAGCGTTAACCCCAAGCGTACTTTCAATGCTGTTATTATCCATAACAAAAAGCCCACAATCGAGCTGGTTGCACGACTGTGGGCTTCACAAGTAAGCGATTTTGTTAGCGATAACACAATTAAGTGTTGCTAGGTAAAGGTCTTGCTAGCACGTACTTACCGTGGTTGTTAC

(8)实施例8敲除菌株的抗性验证

将PCR验证正确的敲除菌株1、5、7～10#菌株进行抗性验证，即将活化后单菌落分别对应划线接种于含有终浓度为10μg/mL红霉素或氯霉素的MRS平板，最终挑选具有氯霉素抗性而对红霉素抗性敏感的菌株即为阳性敲除菌株。单菌落划线平板图如附图8和9所示。经反复验证后确定5#菌株具有氯霉素抗性，而对红霉素抗性敏感，这表明同源臂片段已经成功插入到ST-Ⅲ基因组中，因此5#菌株为正确的阳性敲除菌株。最终本发明成功扩增出植物乳杆菌ST-Ⅲ的ldhA基因上下游同源臂基因，再分别利用2组限制性内切酶：Xho I、Pme I和Ecl136 Ⅱ、Bgl Ⅱ对重组质粒酶切，纯化回收目的片段，先后插入到质粒pNZ5319中，成功构建出敲除质粒pNZ5319ΔldhA。利用敲除质粒电转化植物乳杆菌ST-Ⅲ，经氯霉素抗性平板筛选、PCR鉴定和测序鉴定，成功完成植物乳杆菌ST-Ⅲ的ldhA基因的敲除。

(9)实施例9植物乳杆菌ST-Ⅲ合成L-乳酸摇瓶发酵实验

取200μL甘油管保存的突变株接种于5mL MRS培养基中，37℃厌氧培养48h，12000r/min离心10min，取上清，并采用D-/L-乳酸测定试剂盒进行乳酸的测定对该突变株进行摇瓶发酵实验，测定结果图附表2所示。L.plantarum ST-Ⅲ在发酵48h D-乳酸和L-乳酸的含量分别为5.33和4.10g/L，DL-乳酸浓度为9.43g/L，二者的比例为4:3；突变株ST-ⅢΔldhA D-乳酸和L-乳酸的含量分别为3.29和6.34g/L，DL-乳酸浓度为9.63g/L，其中D-乳酸和L-乳酸的比例为1:2。由于ldhA基因的敲除，使得更多的碳流向L-乳酸合成的方向，减少了D-乳酸的积累。通过同源重组的方法对植物乳杆菌的乳酸合成途径进行代谢改造，和现有的植物乳杆菌ST-Ⅲ相比本方法制备的缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ所述获得的突变株具有合成高比例L-乳酸的能力，明显的降低了D-乳酸的产量，L-乳酸的产量比例是原来产量比例的2.7倍，减轻了人体过多的摄入D-乳酸对身体产生的胃肠道很大代谢负荷，且变相的增加了乳酸菌及其发酵制品的吸收，从而改善人体肠道菌群、调节机体免疫力、抑肿瘤、降低血清胆固醇、调节血压等。

综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

附表1是基因扩增的引物

表1用于基因扩增的引物

附表2是ST-Ⅲ及其突变株D-乳酸和L-乳酸的合成

表2ST-Ⅲ和突变株ST-ⅢΔldhA D-乳酸和L-乳酸的合成

SEQUENCE LISTING

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ及其制备方法

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgattgacag gaaaggcgtt cgcatgaacg agaatgaacc gcagaacggg attcttaaat 60

agttcttcct tggccataaa gctaaatttc attggactgc cagccagtgc atagtacaac 120

gggtcaaacc acgtgcggtg tggcccaact aagatatagg ccccctctgg taggttttcc 180

cgtccttgat agcggggccg accgttaata atggtgatga ttagccggac tagtccgcgc 240

ataaatgaat aaaacatcac gatcttcctt tcgtttaata actgctcaca gtatgacgaa 300

atttggcaaa ttctgcaagt taattgtatg atagctgtgc gacgaattga atggagaggt 360

ggccgaatat ggcagacgtc acgttacacg ccgatgagcg tattgatcaa ttatatagtc 420

aagatattca aatcattcaa agttcccaag tctttgcgtt ctcactggac gcggttttat 480

tgggtgactt tgcccaggtt gcgaagggtg ctaagagcca gattgtggat ctctgtgctg 540

gcactggcgc agtaggtcta ttcgccagtg ccaaaactca aggtcatatt acggcggtcg 600

aaatccagcc ccggttggct gagatggccc aacgcagtgt tattttgaac gatttaaccc 660

agcaaatgac agttctgaac gaagacttat tggcaattac gcaccaatta ccgaaggatt 720

cggtggatac cgtcttgtgt aacccgccgt attttaaaga tcaaccgcag agtgtcaaaa 780

atccaaatcc tcatttggcg attgcccgcc atgaattgtc cgctaattta gatcagattc 840

tagcggtaac tagtgatttg ttgaaaatga atggtaaagc ctattttgtg caccgtcctg 900

aacgtttgga tgatttattc agtgcgatgg cggccaatcg gttggcaccc aaacggatgc 960

ggttcgtcca cccgaaagca caacgggaag cgaacatggt tctaatcgaa atgatcaagg 1020

acgggaaacg caacggtgtt cgaatcatgc cgccgcttgt cgtttatcgt gatgatggtg 1080

aatacgggga agaggtgcac acgttactct atggcaagca caagtaagcc ggctgcgtcc 1140

acgacggcaa tcaaaaaata ttatttttat gtactattat gtgctgatca aacgttgtat 1200

ggtggtttta cggataactt gcagcgacga ttagcaacgc acaatgcggg caaaggggct 1260

aaatatacgc gggtcagatc acggcggcct ttgcaattaa tttatcatga aactttcact 1320

gacaaatcaa gtgcgttaaa ggctgaatat gccttcaaac accaatcgcg agctgccaag 1380

ctaaaatact tgtcagctca cgatgtgaaa atttagcgaa gttttcacaa tttatgattc 1440

tatttctcgc atttactgtt ataatattta ctgtatcaat atataggagg aatttttgta 1500

<210> 2

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctcgattat cactgaaaat ggcgtcactc atctgagtga cgccattttt tatactttca 60

tctaatgggg cctttttgaa gcgttaaccc caagcgtact ttcaatgctg ttattatcca 120

taacaaaaag cccacaatcg agctggttgc acgactgtgg gcttcacaag taagcgattt 180

tgttagcgat aacacaatta agtgttgcta ggtaaaggtc ttgctagcac gtacttaccg 240

tggttgttac cagcataagt tgctcgtagc tttaacgcca gtatgcgtct atgaagcgct 300

ggcggcttga agaagtgcta gcaatagttc atttagttcc gctggactct ggatgatttg 360

atcaggaatt acgctcggtg tcacctggtc attgcgccgg tgattaaacc aaaaagtttg 420

ccacccagcg tgtttggcac tggtcatgtc gagtgctgca ttgtcaccaa cgtaaacggc 480

ttcgttggcc ttgatgccaa cctgatgggc ccacgtcgtg aaaatcgatg ggtcgggttt 540

agcaataccc aattcttctg agataaagat gttatccgga tgcacgaaat gttcaatttg 600

taattgatgt aacttttgat gctgaatcgg cgctggcccg ttggtaatga taccaatttt 660

aaatgcgtga ctgagcttgg tcagcgtcgc actcagccca tcgaaaaggc aaatctgatt 720

tagttcctgc tgataggcca tttcaaattg gatagcccga tcagtgctga tgtggacttt 780

gctgggtgct aacgcgtgtc gaatacgggc ggtttgccac gcttccagcg tcatagttgt 840

atcagtgacc tggttaaagg tacggtcatt aaaatcatgg aaccggttaa aaatttgtgc 900

caattcagtg ctgctcaaag cctggttaaa agttttagtt aaggcagcag tgaacggtga 960

tttttgatca tacaacgtat cgtcaaggtc aaaaatgatg 1000

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtctcgagt tcgcatgaac gagaatgaac 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggccgtttaa accattacaa aaattcctcc 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgggagctcg gcaagttaag tttgactaa 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcagatctt caactaatca tggcactctc 30

Claims (8)

1.一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ，其特征在于，植物乳杆菌ST-Ⅲ中的ldhA基因上游基因片段被敲除质粒携带的ldhA基因上游同源臂基因替换，植物乳杆菌ST-Ⅲ中的ldhA基因下游基因片段被敲除质粒携带的ldhA基因下游同源臂基因替换，ldhA基因上游同源臂基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO:1、ldhA基因下游同源臂基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO:2。

2.根据权利要求1所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ，其特征在于，敲除质粒包括质粒pNZ5319、ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因，质粒pNZ5319同时连接ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因。

3.一种缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、以植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组DNA为模板，分别PCR扩增ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因；

S2、用限制性内切酶同时酶切质粒pNZ5319和S1步骤中PCR扩增后的ldhA基因上游同源臂基因，并将酶切后获得的产物在连接酶的作用下进行重新连接，得到包含上游同源臂的重组质粒；

S3、用限制性内切酶同时酶切S2步骤中的重组质粒和S1步骤中PCR扩增后的ldhA基因下游同源臂基因，酶切后获得的产物在连接酶的作用下重新进行连接，连接后得到包含上下游同源臂的重组质粒即为敲除质粒；

S4、将S3步骤中的敲除质粒电转化至植物乳杆菌ST-Ⅲ感受态细胞中；

S5、对转化后获得的植物乳杆菌ST-Ⅲ进行抗性验证。

4.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的PCR扩增体系中以植物乳杆菌ST-Ⅲ为模板设计引物对，该引物对分别为ldhA基因上游同源臂引物对和ldhA基因下游同源臂引物对，ldhA基因上游同源臂引物对的碱基序列为序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，ldhA基因下游同源臂引物对的碱基序列为序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

5.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S1还包括对PCR扩增后的ldhA基因上游同源臂基因和ldhA基因下游同源臂基因分别进行测序验证。

6.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S2中的用限制性内切酶做酶切处理是用PmeI、XhoI同时进行双酶切处理，步骤S3中的用限制性内切酶做酶切处理是用Ecl136Ⅱ、BglⅡ同时进行双酶切处理。

7.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S3还包括对所得到的敲除质粒进行电泳检测。

8.根据权利要求3所述缺失ldhA基因的植物乳杆菌ST-Ⅲ的制备方法，其特征在于，步骤S4中将敲除质粒电转化至植物乳杆菌ST-Ⅲ感受态细胞中，电转化参数为：电压2.0-2.5kv,电击时间3-7ms。