CN102994604B - 两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法，属于生物技术领域。本发明在水溶液状态下，能在7α-HSDH和7β-HSDH存在下转化底物结合态鹅去氧胆酸为结合态熊去氧胆酸，而且中间步骤不需要分离，非常简单，而且转化率非常高。特别是作为混合物状态的鸡胆汁，鸭胆汁或鹅胆汁，不需要将结合态鹅去氧胆酸分离纯化就能发生反应，该制备工艺简单，易行，为结合态熊去氧胆酸原料提供了新的简便的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH）联用，两步法催化结合态鹅去氧胆酸转化为结合态熊去氧胆酸的方法。
背景技术
熊胆是名贵的中药材，用于治疗胆结石疾病以及各种急性、慢性肝病，具有良好的治疗效果。牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）是中药材熊胆的主要有效成份之一。然而，中药熊胆粉主要的获取方式为“活熊引流取胆”，这有违野生动物保护法，并且被认为是非常不“人道”的获取方式。不过禽畜胆汁中存在众多胆酸类物质，尤其是鸡鸭鹅胆汁中含有丰富的牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）。TCDCA与TUDCA的差别不仅在于7位羟基的差向异构，而且它们的生物活性也相差甚远。目前TUDCA除可以从熊胆中提取外，其制备的方法还有化学合成法和生物转化法。
化学合成牛磺熊去氧胆酸，国内外报道主要有三种化学半合成法：①用熊去氧胆酸（UDCA）与氯甲酸乙酯或特戊酰氯反应形成混合酸酐，在碱性条件下与牛磺酸反应，再经离子交换柱纯化制得TUDCA，总收率约62%[Arosio R,Rossetti V.US 5565587.1995-10-15.(CA1994,122:265776);Dayal B,et al.Bioorg Med Chem,1996,4]；②UDCA和牛磺酸在碱性条件下分别在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉（EEDQ,N-ethoxy-carbonyl-ethoxy-1,2-dihydroquinoline）或氰基磷酸二乙酯（DEPC，diethyl phosphorocyanidate）作用下直接缩合得TUDCA，收率分别为67%和90%，此法试剂价格昂贵[Momose T,et al.Lipids,1997,32]；③UDCA和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后，与对羟基苯丙酮缩合，得熊去氧胆酸的活性酚酯，再与牛磺酸反应制得TUDCA，总收率约64%，此法反应步骤较多[Bonaldi A and Molinari E.US,5362891.1994-11]。比较三种合成方法，后两种需用有机试剂EEDQ和DEPC，价格昂贵，制备也较烦琐。
上述合成中的原料UDCA，也主要是通过化学合成的方法得到。比如，工业上生产UDCA的7步合成法，以牛、羊胆酸（CA）为原料，经胆酸甲酯化，二乙酰化，12位羟基CrO3-HOAc氧化，黄鸣龙还原合成鹅去氧胆酸（CDCA），再将CDCA氧化成7-羰基石胆酸（7-KLCA），然后在正丙醇中用金属钠还原得UDCA。另外，以鹅去氧胆酸（CDCA）为原料，CDCA甲酯化，3位羟基选择性保护后用Jones试剂或NBS氧化7位羟基，然后在叔丁醇中用金属钠、二氯化镍还原得UDCA[庄治平,等.有机化学,1986,(4):281]。
上述描述的化学合成法制备牛磺熊去氧胆酸的过程复杂，要使用大量有机溶剂，存在有机溶剂残留等缺点。这些化学合成法的最大缺点是只能在有机溶剂中进行，且所用的底物是单体纯物质，无法对混合状态存在的胆汁酸（如禽畜胆汁中的TCDCA或CDCA）进行原位转化而不影响其他成分。
生物转化也分微生物转化和酶催化法。熊安明和法幼华采用泡木贼镰刀菌将石胆酸转化为UDCA[熊安明和法幼华.微生物学报,1995,35:204-208]。刘光泽等利用不和谐梭菌（C.absonum）将水解鸡胆汁（不含结合态胆汁酸TCDCA）中的CDCA转化成为UDCA[刘光泽等,中国兽医学报,1998,18:74-76]，但微生物本身的代谢会产生多种物质，也给水解鸡胆汁引入了很多杂质，使产物的纯化更加困难，且操作复杂，效率较低。
Ferrandi EE等采用来自撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense，ATCC27555）的7α-羟基类固醇脱氢酶能催化CDCA转化成7-羰基石胆酸（7-KLCA），另外发现7β-羟基类固醇脱氢酶能催化7-KLCA转化成UDCA[Ferrandi EE,et al.Appl Microbiol Biotechnol 2012,95(5):1221-1233]，但没有报道以纯CDCA作为底物，在这两个酶的作用下连续催化直接转化成UDCA。Pedrini P等采用来自嗜麦芽窄食单胞菌（Xanthomonas maltophilia,CBS 897.97）的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶能将CDCA转化成UDCA[Pedrini P et al.Steroids,2006,71:189–198].Tanaka N等采用来自大肠杆菌（Escherichia coli）的7α-羟基类固醇脱氢酶能将甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）催化成7-羰基-甘氨鹅去氧胆酸（7-oxo-GCDCA）[Tanaka N,et al.Biochemistry 1996,35:7715-7730]。
上述生物转化法主要是将游离态的CDCA催化转化为游离态的UDCA，没有提到将TCDCA（或GCDCA）转化为TUDCA（或GUDCA）。而且游离态的CDCA和UDCA的水溶性差，不利于生物转化在水溶液中进行，而且第一步反应完成后需要处理，再进行第二步反应，反应比较麻烦，后处理多。
综上所述，TUDCA主要是以UDCA、CA或CDCA为原料通过化学合成法来制备。目前为止还没有文献报道在动物体外采用生物转化方法将结合态鹅去氧胆酸（TCDCA和GCDCA）转化成结合态熊去氧胆酸（TUDCA和GUDCA）。另外将禽畜胆汁中的TCDCA原位转化为TUDCA的方法也未见报道。这是因为动物体内的TCDCA转化成TUDCA的过程相当复杂，体外很难模拟。
在动物体内TCDCA转化成TUDCA要依赖于体内的胆汁酸肝肠循环过程，主要包括以下5个步骤（见下式）：
(1)结合型胆汁酸如牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）在肠道中被胆汁酸盐水解酶（BSH）水解，变成游离型胆汁酸如鹅去氧胆酸（CDCA）；
(2)CDCA在7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）的作用下被氧化成7-酮石胆酸（7-KLCA）；
(3)7-KLCA在7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）的作用下被还原成熊去氧胆酸（UDCA）；
(4)在肝脏中，UDCA在胆汁酸CoA连接酶（BAL）的作用下，末端羰基与CoA-SH硫键共轭生成中间产物胆汁酸CoA硫酯；
(5)胆汁酸CoA硫酯在胆汁酸N-脂肪酰转移酶（BAT）催化下，脱去CoA-SH，并再次通过末端羰基与氨基乙烷磺酸轭合生成牛磺轭合物即TUDCA。
所以TUDCA在体内合成是一个相当复杂的过程，共涉及到5个酶，所以要在体外模拟这个过程也非常困难。
为了简化这个复杂过程，我们建立了一种新颖的两步酶促法制备结合态UDCA的方法。该方法只需要通过两步（两个酶7α-HSDH和7β-HSDH）就能将TCDCA原位转化为TUDCA。令人惊奇的是，如果TCDCA是混合物中的一种成分，比如禽畜胆汁中的TCDCA，我们采用该技术在不破坏其他成分的前提下，能选择性地将TCDCA原位转化成TUDCA，该过程完全在水溶液中进行，不需要其他任何有机溶剂，产品不用分离纯化。
发明内容
本发明是基于动物体内胆汁酸合成的肝肠循环过程，并将体内的五步反应缩减为两步反应，在体外以结合态鹅去氧胆酸为底物如牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）和甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA），采用两步酶促法（7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶）制备结合态熊去氧胆酸如牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）和甘氨熊去氧胆酸（GUDCA）的方法。而目前化学合成法以TCDCA为原料制备TUDCA的过程，要经过TCDCA水解，CDCA氧化，7-KLCA还原，UDCA酸酐化，最后与牛磺酸反应等至少5个步骤，过程复杂，收率较低，而且反应过程要使用大量有机溶剂。而且原料TCDCA还必须从胆汁中先分离出来才能使用。
鉴于此，本发明的目在于提供一种制备结合态熊去氧胆酸（包括TUDCA和GUDCA）的方法。即联合使用7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH），通过两步酶促法将结合态鹅去氧胆酸（TCDCA和GCDCA）原位转化为结合态熊去氧胆酸（TUDCA和GUDCA）。
两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤：（1）在7α-羟基类固醇脱氢酶和氧化型辅酶I或Ⅱ（NAD+或NADP+）存在的条件下将溶于水溶液中的底物结合态鹅去氧胆酸的7位α-羟基氧化成羰基，形成中间产物结合态7-羰基-石胆酸；（2）在步骤（1）反应后的混合物中，加入7β-羟基类固醇脱氢酶和还原型辅酶I或Ⅱ（NADH或NADPH）将中间产物7位羰基还原成β-羟基得到结合态熊去氧胆酸。
所述的水溶液的pH值为7-9。
所述的水溶液为pH8.5磷酸盐缓冲液。
本发明公开了7α-HSDH和7β-HSDH联用通过两步酶促反应转化TCDCA得到TUDCA的过程。相关反应式如下：
所述的结合态鹅去氧胆酸包括牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）见式（1）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）见式（2）；结合态熊去氧胆酸包括牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）见式（3）、甘氨熊去氧胆酸（GUDCA）见式（4）。
所述的7α-HSDH和7β-HSDH转化的底物除以单体形式存在以外还包括以（天然）混合物状态存在的。
所述的混合物状态包括禽畜胆汁，如鸡、鸭、鹅、牛、狗、兔、羊的胆汁。
所述的7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH）来自于微生物，如撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense ATCC27555），脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilisATCC25825），产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)。
所述的7α-HSDH和7β-HSDH在非致病微生物中的表达，尤其是在大肠杆菌中的表达。一般定义：
（1）如果没有特别说明，术语“7α-HSDH”表示7α-羟基类固醇脱氢酶。该酶能催化胆酸及其衍生物的7位α羟基氧化为酮基，同时使用一定化学计量的辅酶NAD+或NADP+。本发明所述的7α-HSDH可以是天然或重组产生的酶。
（2）如果没有特别说明，术语“7β-HSDH”表示7β-羟基类固醇脱氢酶。该酶能催化胆酸及其衍生物的7位酮基还原为7β-羟基，同时使用一定化学计量的辅酶NADH或NADPH。本发明所述的7β-HSDH可以是天然或重组产生的酶。
（3）本发明所述的“原位转化”是指将混合物（比如禽畜胆汁）中的TCDCA能转化为TUDCA，且不需要将TCDCA事先从混合物中分离出来，整个反应过程只转化TCDCA，而不改变混合物中的其它成分的存在形式。
本发明在水溶液状态下，特别是在PBS溶液中，能在7α-HSDH和7β-HSDH存在下转化底物结合态鹅去氧胆酸为结合态熊去氧胆酸，而且中间步骤不需要分离，非常简单，而且转化率非常高。特别是作为混合物状态的鸡胆汁，鸭胆汁或鹅胆汁，不需要将结合态鹅去氧胆酸进行分离纯化就能发生反应，该制备工艺简单，易行，为结合态熊去氧胆酸原料提供了新的简便的制备方法。
附图说明
图1为本发明所用鸡胆粉主要成分的高效液相色谱图，
图2为本发明所用鸭胆粉主要成分的高效液相色谱图，
图3为本发明所用鹅胆粉主要成分的高效液相色谱图，
图4为来自撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）7α-HSDH和7β-HSDH联合转化鸡胆粉中TCDCA后产物的高效液相色谱图，
图5为来自脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis,ATCC25825）7α-HSDH和来自产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)的7β-HSDH联合转化鸡胆粉中TCDCA后产物的高效液相色谱图，
图6为来自撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）7α-HSDH和7β-HSDH联合转化鹅胆粉中TCDCA后产物的高效液相色谱图，
图7为来自脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis,ATCC25825）7α-HSDH和来自产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens,ATCC25986)的7β-HSDH联合转化鹅胆粉中TCDCA后产物的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。
实施案例1：鸡、鸭、鹅胆粉的制备
鸡胆、鸭胆、鹅胆从屠宰场购买得到。首先确定胆的数量和重量。用75%酒精分别对鸡胆、鸭胆、鹅胆局部进行消毒，然后分别剖取胆汁。将取出的胆汁分别盛入不同的不锈钢圆盆内。将盛有胆汁的圆盘放入-40°C冰箱冷冻24h，最后放入冷冻干燥器内干燥48h，分别得到鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉。
实施案例2：鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉中TCDCA和TUDCA的含量分析
取鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉各约0.16g，分别置于不同的量瓶（50mL）中，加入甲醇适量，超声（功率300W，频率25kHz）10min使之溶解，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得。取上述溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，检测器采用蒸发光散射检测器。记录色谱图（图1，图2，图3）。分别计算TCDCA和TUDCA的百分比含量（表1）。对照品TCDCA和TUDCA来自于中国药品生物制品检定所。
表1 HPLC法检测的鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉中TCDCA和TUDCA的含量（%）
| 鸡胆粉 | 鸭胆粉 | 鹅胆粉 | |
| TCDCA | 42.2±5.1 | 34.6±4.5 | 58.2±5.9 |
| TUDCA | 2.3±0.2 | 1.8±0.1 | 2.4±0.2 |
实施案例3：全基因合成7α-HSDH和7β-HSDH
基因序列优化后的来自于撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）的7α-HSDH基因序列如SEQ ID No 1所示；基因序列优化后的来自于撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）的7β-HSDH基因序列如SEQ ID No 2所示；基因序列优化后的来自于脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis ATCC25825）的7α-HSDH基因序列如SEQ ID No 3所示；基因序列优化后的来自于产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)的7β-HSDH基因序列如SEQID No 4所示。上述密码子优化后的基因序列由生工生物(上海)股份有限公司进行全基因合成，酶切位点均为BamH I和Not I。
实施案例4：7α-HSDH和7β-HSDH的表达
实施案例3中的基因进行全基因合成后均与表达载体pGEX-6p-1连接，并进转化。在大肠杆菌BL21中表达，将转化成功的大肠杆菌重组菌株按5%的添加量加入LB液体培养基中，220rpm、37℃培养。待OD600为0.5时，16℃IPTG诱导12小时，使大肠杆菌产生GST融合蛋白。将诱导完成的大肠杆菌10000rpm离心3min收集菌体，300W超声破壁菌液5min至澄清；4℃14000rpm离心15min收集上清液；上清液与谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（GlutathioneSepharose 4B medium，购自GE healthcare公司）4℃结合2h使GST融合蛋白结合于谷胱甘肽琼脂糖凝胶中，再利用预冷的五倍体积0.25%吐温20PBS（100mM）溶液冲洗三次，利用预冷的五倍体积PBS（100mM）冲洗三次。利用PreScission Protease酶4℃酶切12h，离心得到目的蛋白。并按GE公司的GST Gene Fusion System Handbook步骤进行纯化。
实施案例5：来自撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）7α-HSDH和7β-HSDH联合转化鸡胆粉中的TCDCA
取试管，各加入10ml pH8.5磷酸盐缓冲液（PBS）；加入200μl 50mg/ml鸡胆粉水溶液，混匀；各加入50μl 0.1M NADP+溶液；加入7α-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时，反应完的体系置于沸水中，沸水浴5min灭活7α-HSDH；将反应体系室温冷却。向反应体系中加入0.1M NADPH 50μl；加入7β-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时。
实施案例6：来自脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis ATCC25825）7α-HSDH和来自产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)的7β-HSDH联合转化鸡胆粉中的TCDCA
取试管，各加入10ml pH8.5磷酸盐缓冲液（PBS）；加入200μl 50mg/ml鸡胆粉水溶液，混匀；各加入50μl 0.1M NADP+溶液；加入7α-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时，反应完的体系置于沸水中，沸水浴5min灭活7α-HSDH；将反应体系室温冷却。向反应体系中加入0.1M NADPH 50μl；加入7β-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时。
实施案例7：来自撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）7α-HSDH和7β-HSDH联合转化鹅胆粉中的TCDCA
取试管，各加入10ml pH8.5磷酸盐缓冲液（PBS）；加入200μl 50mg/ml鹅胆粉水溶液，混匀；各加入50μl 0.1M NADP+溶液；加入7α-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时，反应完的体系置于沸水中，沸水浴5min灭活7α-HSDH；将反应体系室温冷却。向反应体系中加入0.1M NADPH 50μl；加入7β-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时。
实施案例8：来自脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis ATCC25825）7α-HSDH和来自产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)的7β-HSDH联合转化鹅胆粉中的TCDCA
取试管，各加入10ml pH8.5磷酸盐缓冲液（PBS）；加入200μl 50mg/ml鹅胆粉水溶液，混匀；各加入50μl 0.1M NADP+溶液；加入7α-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时，反应完的体系置于沸水中，沸水浴5min灭活7α-HSDH；将反应体系室温冷却。向反应体系中加入0.1M NADPH 50μl；加入7β-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时。
实施案例9：高效液相色谱蒸发光散射检测前的样品处理
对于实施案例5-8反应完毕的产物进行处理，先依次向反应体系中加入10ml、5ml、15ml、26.6ml无水乙醇，每次加入无水乙醇后均充分超声处理；14000rpm离心15min除去沉淀；旋转蒸发仪除去溶剂；加25%甲醇水溶液定容至25ml。
实施案例10：高效液相色谱蒸发光散射（HPLC-ELSD）检测样品的方法
取实施案例9所处理的溶液各10μL，注入高效液相色谱仪进行分析，检测器采用蒸发光散射检测器（雾化器温度80℃；N2流量3.0ml/min）。色谱柱：C18。色谱条件：柱温40℃；流速1.0ml/min；流动相A：0.05%三氟乙酸，流动相B：乙腈。线性梯度洗脱：0.01min，60%A+40%B；15min，10%A+90%B；15.01min，60%A+40%B；25min，60%A+40%B。记录色谱曲线图，如图4-图7。计算结果分析见表2.
表2两步酶促法将鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉中TCDCA转化成TUDCA的转化率
实施案例11：来自撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）7α-HSDH和7β-HSDH联合转化GCDCA
取试管，各加入10ml pH8.5磷酸盐缓冲液（PBS）；加入200μl 20mg/ml甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）溶液，混匀；各加入50μl 0.1M NADP+溶液；加入7α-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时，反应完的体系置于沸水中，沸水浴5min灭活7α-HSDH；将反应体系室温冷却。向反应体系中加入0.1M NADPH 50μl；加入7β-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时。按实施案例9处理产物，按实施案例10分析产物中GCDCA和GUDCA的含量，计算转化率，结果见表3。
实施案例12：来自脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis ATCC25825）7α-HSDH和来自产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)的7β-HSDH联合转化GCDCA
取试管，各加入10ml pH8.5磷酸盐缓冲液（PBS）；加入200μl 20mg/ml甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）溶液，混匀；各加入50μl 0.1M NADP+溶液；加入7α-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时，反应完的体系置于沸水中，沸水浴5min灭活7α-HSDH；将反应体系室温冷却。向反应体系中加入0.1M NADPH 50μl；加入7β-HSDH（酶总量为100μg）；30℃反应2小时。按实施案例9处理产物，按实施案例10分析产物中GCDCA和GUDCA的含量，计算转化率，结果见表3。
表3两步酶促法将GCDCA转化成GUDCA的转化率
上述实施例说明通过7α-HSDH、7β-HSDH联合两步酶促法转化后鸡胆粉的成分发生了变化，尤其是TUDCA所占的比例显著提高。这说明双酶联用的转化作用可以催化鸡鸭鹅胆粉中的TCDCA原位转化为TUDCA。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110>上海凯宝药业股份有限公司
<120>两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法
<130>P123731CN-CN-CQD-CQ
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>789
<212>DNA
<213>优化后的来自于撒丁岛梭菌（Clostridium sardiniense,ATCC27555）的7α-HSDH基因序列
<400>1
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aaactgctgc atcattatat tggtgaattc aaagaacgtg atcgtggtgc attcattacc 420
attggctctc tgagcggctg gaccagcctg ccgttctgcg cagaatatgc agcagaaaaa 480
gcttatatga tgaccgtgac cgaaggcgtt gcttacgaat gcgcaaatac taatgttgac 540
gtgatgctgc tgagcgcggg tagcaccatc accccgactt ggctgaaaaa taaaccgagc 600
gatccgaaag cggttgcagc agcaatgtat ccggaagatg ttattaaaga tggctttgaa 660
cagctgggca aaaaatttac ttatctggct ggcgagctga atcgtgaaaa aatgaaagaa 720
aataatgcaa tggatcgtaa tgatctgatt gcaaaactgg gcaaaatgtt tgatcatatg 780
gcataa 786
<210>3
<211>780
<212>DNA
<213>优化后的来自于脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis ATCC25825）的7α-HSDH基因序列
<400>3
atgaacagat ttgaaaataa gataatcatt atcacgggag ctgccggtgg aatcggcgca 60
tcaaccacac gccgcattgt atctgaaggc ggcaaagtag ttattgctga ctattcaaga 120
gaaaaagcag accaatttgc tgccgagctt agtaattcgg gagcagatgt acgtccggtt 180
tatttttctg ctacagaatt gaaaagctgc aaagaactaa tcacctttac aatgaaggaa 240
tacggacaga tcgatgtact ggtaaacaat gtaggaggta caaatcccag acgggacaca 300
aacatcgaaa ctctggatat ggattatttt gacgaagcct ttcatctgaa tttatcttgt 360
accatgtatt tgtcccaact ggttatcccc attatgagca cacaaggtgg tggaaatatt 420
gtaaacgtag cctcaataag tggaatcacg gccgattcga atggtactct ttatggagcc 480
agcaaagcag gagtcatcaa tctgaccaaa tacattgcca cccaaacggg aaagaaaaac 540
atccgttgca atgcagtagc accaggattg atcctgaccc cggccgcact gaataatctt 600
aatgaagagg tacgcaaaat atttctcggg caatgtgcga caccctattt aggtgaaccg 660
caagacgttg ccgcgaccat cgctttttta gcctccgaag atgcacgtta cattaccgga 720
cagaccatag tagtagatgg cggattgaca atacacaatc cgacaataaa cttagtataa 780
<210>4
<211>792
<212>DNA
<213>优化后的来自于产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)的7β-HSDH基因序列
<400>4
atgaacctga gggagaagta cggtgagtgg ggcctgatcc tgggcgcgac cgagggcgtc 60
ggcaaggcgt tctgcgagaa gatcgccgcc ggcggcatga acgtcgtcat ggtcggccgt 120
cgcgaggaga agctgaacgt gctcgcaggc gagatccgcg agacctacgg cgtggagacc 180
aaggtcgtgc gcgccgactt tagccagccc ggcgctgccg agaccgtctt cgccgcgacc 240
gagggcctgg acatgggctt catgagctac gtggcctgcc tgcacagctt cggtaagatc 300
caggacaccc cctgggagaa gcacgaggcc atgatcaacg tcaacgtcgt gaccttcctc 360
aagtgcttcc accactacat gcggatcttt gccgcccagg accgcggcgc cgtgatcaac 420
gtctcgtcga tgaccggcat cagctccagc ccctggaacg gccagtacgg cgcgggcaag 480
gccttcatcc tcaagatgac cgaggccgtg gcctgcgagt gcgagggcac cggcgtcgac 540
gtcgaggtca tcaccctcgg caccacccta acccccagcc tgctgtccaa cctccccggc 600
ggcccgcagg gcgaggccgt catgaagatc gccctcaccc ccgaggagtg cgttgacgag 660
gcctttgaga agctgggtaa ggagctctcc gtcatcgccg gccagcgcaa caaggactcc 720
gtccacgact ggaaggcaaa ccacaccgag gacgagtaca tccgctacat ggggtcgttc 780
taccgcgact ag 792
Claims (3)
1.两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤：(1)在7α-羟基类固醇脱氢酶和氧化型辅酶NAD+或NADP+存在的条件下将溶于水溶液中的底物结合态鹅去氧胆酸的7位α-羟基氧化成羰基，形成中间产物结合态7-羰基-石胆酸；(2)在步骤(1)反应后的混合物中，向混合物中加入7β-羟基类固醇脱氢酶和还原型辅酶NADH或NADPH，将中间产物7位羰基还原成β-羟基得到结合态熊去氧胆酸，所述的水溶液为pH8.5磷酸盐缓冲液；
所述的结合态鹅去氧胆酸为如式(1)所示的牛磺鹅去氧胆酸；结合态熊去氧胆酸为如式(3)所示的牛磺熊去氧胆酸；
所述的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶转化的底物是以天然混合物状态存在；
所述的天然混合物状态为禽畜胆汁；禽畜胆汁为鸡、鸭、鹅的胆汁；
所述步骤(1)、(2)的反应温度为30℃，反应时间为1-3小时；
所述7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的基因序列分别如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，或者SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶是在非致病微生物中的表达产物。
3.根据权利要求2所述的方法，所述非致病微生物为大肠杆菌。
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