CN108379295A - 鸡胆转化物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及鸡胆转化物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。本发明采用二甲基亚硝胺的肝纤维化大鼠模型，给予鸡胆转化物治疗后，能减轻肝脏胶原沉积程度、改善肝脏炎性和纤维化病理变化，具有抗肝纤维化病变的作用，可用于制备抗肝纤维化药物。鸡胆转化物作为抗肝纤维化药物中抑制和/或逆转肝纤维化活性成分，其质量百分比为10％～95％，通过改善肝细胞炎症、和/或增强肝细胞修复、和/或抑制肝纤维化病变、抑制和/或逆转肝纤维化，医疗应用前景广阔。

Description

鸡胆转化物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及鸡胆转化物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。

背景技术

肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的共同病理基础，其实质是肝内细胞外基质合成与降解失衡，导致细胞外基质尤其是胶原在肝脏大量沉积。肝纤维化持续发展导致相应器官功能障碍与衰竭，严重危害生命健康。减缓、阻止甚至逆转肝纤维化，对减少严重并发症的发生、改善病人生活质量及提高生存率具有重大意义。因此，研制抗肝纤维化的药物，具有明显的应用价值。

中药治疗慢性肝病具有悠久的历史，熊胆具有保肝作用，但由于天然熊胆和人工熊胆的产出壁垒，给熊胆的生产和相关产业的发展带来了前所未有的阻力。鸡胆为胆汁类天然产物，将鸡胆进行生物转化生成鸡胆转化物，研究其抗肝纤维化作用，可取代熊胆用于肝病治疗，减少对熊胆的需求，降低产业发展成本，应用前景广阔。

发明内容

本发明旨在提供鸡胆转化物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物方面的应用，鸡胆转化物具有显著的抗肝纤维化病变活性，作为抑制和/或逆转肝纤维化活性成分，用于制备预防和或治疗肝纤维化的药物，应用前景广阔。

具体地，鸡胆转化物可抑制炎细胞浸润、降低血清谷丙转氨酶和/或谷草转氨酶、提高血清白蛋白，改善肝细胞炎症，增强肝细胞修复，逆转肝细胞坏死和/或变性；鸡胆转化物还可降低肝脏羟脯氨酸，抑制成纤维细胞生成，抑制胶原蛋白和/或胶原纤维的生成和/或降解，进而抑制肝脏假小叶生成和/或胶原纤维沉积，从而抑制和/或逆转肝纤维化。

由此，本发明提供鸡胆转化物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用，所述鸡胆转化物作为抑制和/或逆转肝纤维化活性成分。

所述鸡胆转化物作为改善肝细胞炎症、和/或增强肝细胞修复、和/或抑制肝纤维化、和/或逆转肝纤维化的活性成分。

所述鸡胆转化物用作逆转肝细胞坏死和/或变性、和/或降低血清谷丙转氨酶、和/或降低血清谷草转氨酶、和/或提高血清白蛋白的活性成分，改善肝细胞炎症、和/或增强肝细胞修复。

所述鸡胆转化物用作抑制炎细胞浸润的活性成分，逆转肝细胞坏死和/或变性。

所述鸡胆转化物用作抑制肝脏假小叶形成和/或胶原纤维沉积的活性成分，抑制肝纤维化、和/或逆转肝纤维化。

所述鸡胆转化物用作抑制胶原纤维生成的活性成分，抑制肝脏假小叶形成和/或胶原纤维沉积。

所述鸡胆转化物作为抑制胶原蛋白生成、和/或降低肝脏羟脯氨酸的活性成分，抑制胶原纤维生成。

所述鸡胆转化物作为抑制成纤维细胞生成的活性成分，抑制胶原蛋白生成。

所述鸡胆转化物包括总胆酸，总胆酸包括牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸和牛磺熊胆酸；以鸡胆转化物质量计，总胆酸的含量为16％～85％，牛磺熊去氧胆酸的含量为10％～50％，牛磺鹅去氧胆酸的含量为5％～40％，牛磺胆酸的含量为0.1％～10％，牛磺熊胆酸的含量为0.1％～10％。优选地，总胆酸的含量为40％～65％，牛磺熊去氧胆酸的含量为22％～30％，牛磺鹅去氧胆酸的含量为12％～26％，牛磺胆酸的含量为2％～5％，牛磺熊胆酸的含量为2～5％；进一步优选地，牛磺熊去氧胆酸的含量为29.4％，牛磺鹅去氧胆酸的含量为25.4％，牛磺胆酸的含量为4％，牛磺熊胆酸的含量为4％。鸡胆转化物还含有氨基酸、微量元素、水分、胆色素、维生素、胆固醇或者脂肪酸等成分。

所述鸡胆转化物的制备方法为：a)鸡胆粉用pH＝7～9缓冲液溶解后，离心并取上清液过滤3～5次，得到滤渣和滤液，所述滤渣冷冻干燥保存；

b)将滤液与辅酶I或辅酶II加入固化有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的壳聚糖微球层析柱中反应2～8小时得反应液；

c)反应液冷冻干燥后与a)步骤滤渣混合，得鸡胆转化物。

a)步骤中，鸡胆粉主要由以下质量百分比的成分组成：总胆酸40％～93％，氨基酸4％～9％，微量元素0.5％～1％；总胆酸中牛磺鹅去氧胆酸占鸡胆粉的质量百分比为40％～74％。鸡胆粉中还含有水、胆色素、维生素、胆固醇或者脂肪酸等。

a)步骤中，pH＝7～9缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

a)步骤中，鸡胆粉与pH＝7～9缓冲液的用量比为7～7.5g鸡胆粉/L。

b)步骤中，辅酶I或辅酶II与滤液中牛磺鹅去氧胆酸的摩尔比为1:2～4。

本发明还提供一种预防和/或治疗肝纤维化的药物制剂，以鸡胆转化物为活性成分。

所述药物制剂还包括一种或者多种药学上可接受的辅料，所述药学上可接受的辅料有载体、崩解剂、赋形剂、调味剂、润滑剂、粘合剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、表面活性剂等。

所述药物制剂还包括以下辅助活性成分中的至少一种：辅助预防和/或治疗肝纤维化的活性成分、辅助增强肝修复的活性成分、辅助预防和/或治疗肝脏炎症的活性成分、辅助预防和/或治疗肝细胞坏死和/或变性的活性成分、辅助预防和/或治疗胶原沉的积活性成分、辅助预防和/或治疗肝脏假小叶生成的活性成分、保肝活性成分、养肝活性成分或者护肝活性成分。

所述药物制剂，根据需要可以制备成具有预防或者治疗作用的药学上可接受的任意剂型。药学上可接受的剂型有液体制剂、固体制剂、半固体制剂或者气体制剂等。固体制剂包括但不限于丸剂、散剂、丹剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉剂等；液体制剂包括但不限于口服液、注射液、混悬液、冲剂等；气体制剂包括但不限于气雾剂、喷雾等。片剂包括但不限于糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、含片等；胶囊剂包括但不限于硬胶囊剂和软胶囊剂。

所述药物制剂中，作为活性成分的鸡胆转化物的质量百分比为10％～95％。

本发明采用鸡胆转化物0.065g/kg、0.26g/kg灌胃给药，治疗二甲基亚硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)诱导的肝纤维化大鼠模型，结果表明，本发明鸡胆转化物对DMN肝纤维化模型具有减轻肝脏胶原沉积程度，改善肝脏炎性和纤维化病理变化，抗肝纤维化病变的作用，揭示了鸡胆转化物在制备抗肝纤维化药物中的用途前景。

本发明的有益效果在于，鸡胆转化物的抗肝纤维化作用，可取代熊胆或者熊胆汁用于制备预防和/或治疗肝病的药物，鸡胆来源丰富，生产成本低，促进肝病医疗产业和肝病治疗药物产业的发展。

附图说明

图1是本发明正常组、DMN模型组、鸡胆转化物低剂量组和鸡胆转化物高剂量组的肝组织病理染色图(HE染色×100倍)。图1中，a(左上)为正常组，b(右上)为DMN模型组，c(左下)为鸡胆转化物低剂量组，d(右下)为鸡胆转化物高剂量组。

图2是本发明正常组、DMN模型组、鸡胆转化物低剂量组和鸡胆转化物高剂量组的肝脏组织天狼星红染色图(天狼星红胶原染色×100倍)。图2中，a(左上)为正常组，b(右上)为DMN模型组，c(左下)为鸡胆转化物低剂量组，d(右下)为鸡胆转化物高剂量组。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。

实施例1鸡胆转化物的制备

本发明鸡胆转化物的制备参照公告号为CN104382941B的一种人工熊胆粉及其制备方法。

1、鸡胆粉的制备

鸡胆从屠宰场购买得到。首先确定胆的数量和重量。用75％酒精对鸡胆局部进行消毒，然后分别剖取胆汁。将取出的胆汁冷冻干燥48h，得到鸡胆粉，放置干燥器中保存备用。

鸡胆粉主要由以下质量百分比的成分组成：总胆酸40％～93％，氨基酸4％～9％，微量元素0.5％～1％；其中，总胆酸中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)占鸡胆粉的质量百分比为40％～74％。除上述主要成分外，鸡胆粉中还有以下成分：水分、胆色素、维生素、胆固醇或者脂肪酸等。

2、鸡胆转化物的制备

(1)鸡胆粉的处理

配制20L pH7.0～9.0缓冲液超声溶解140～150g鸡胆粉得鸡胆粉溶液，将鸡胆粉溶液在11000g条件下离心10min后所得上清液再过滤3～5次，所得滤液作为鸡胆粉处理液在4℃保存，备用；滤渣冷冻干燥，保存备用。

pH7.0～9.0缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(Gly-NaOH)。

(2)固定化酶的制备

向1％壳聚糖(水溶性)溶液中加入适量醋酸，磁力搅拌30min制得壳聚糖醋酸溶液。将壳聚糖醋酸溶液用高压注射泵注入到100mL3％(w/v)的三聚磷酸钠溶液中固化1～2h，得到粒度均匀、形状规则的白色壳聚糖球，然后过滤，用去离子水洗涤多次，得壳聚糖微球。将壳聚糖球放入盛有0.125％戊二醛水溶液的烧杯中，并置于37℃、170g条件下的摇床中，活化2～4h，即得活化壳聚糖微球。

称取10g活化好的壳聚糖微球，装入小型层析柱，加入适量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶液，采用垂直混合方式结合4～6h，固定完毕，放出酶液，并用PBS缓冲液冲洗固定化酶柱3～5次。结果检测表明7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的固定率大于90％。

7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)来自于微生物，如撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis ATCC25825)或产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciensATCC25986)。

(3)生物催化转化

在固定化酶柱中加入第(1)步制备的鸡胆粉处理液作为反应底物溶液，加入辅酶I或辅酶II，使辅酶I(或辅酶II):TCDCA(牛磺鹅去氧胆酸)＝1:2～4(摩尔比)，在20℃～30℃下，反应2～6h。

(4)反应液的处理

将第(3)步反应完毕后的反应液冷冻干燥48h，得固体反应产物。将该固体反应产物与第(1)步滤渣混合均匀，即得鸡胆转化物。

鸡胆转化物包括总胆酸，总胆酸包括牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸和牛磺熊胆酸；以鸡胆转化物质量计，总胆酸的含量为16％～85％，牛磺熊去氧胆酸的含量为10％～50％，牛磺鹅去氧胆酸的含量为5％～40％，牛磺胆酸的含量为0.1％～10％，牛磺熊胆酸的含量为0.1％～10％。优选地，总胆酸的含量为40％～65％，牛磺熊去氧胆酸的含量为22％～30％，牛磺鹅去氧胆酸的含量为12％～26％，牛磺胆酸的含量为2％～5％，牛磺熊胆酸的含量为2～5％；进一步优选地，牛磺熊去氧胆酸的含量为29.4％，牛磺鹅去氧胆酸的含量为25.4％，牛磺胆酸的含量为4％，牛磺熊胆酸的含量为4％。

鸡胆转化物除上述主要成分外，还含有氨基酸、微量元素、水分、胆色素、维生素、胆固醇或者脂肪酸等。

实施例2鸡胆转化物抗肝纤维化实验

动物：健康Wistar大鼠，雌雄各半，体重160～180g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

实验方法：

DMN(二甲基亚硝胺)造模：腹腔注射0.5％DMN溶液，注射剂量为2mL/kg体重，每天1次，每周连续3天，共8周；其中第1周注射2/3量。

正常组：腹腔注射等量生理盐水，每天1次，共8周。

动物分组：经2周腹腔注射DMN造模后，大鼠随机分为DMN模型组(不给药)、鸡胆转化物低剂量组、鸡胆转化物高剂量组，各组继续按照DMN造模的腹腔注射方法注射0.5％DMN溶液至第8周结束。

给药：鸡胆转化物低剂量为0.065g/kg体重灌胃、鸡胆转化物高剂量组为0.26g/kg体重灌胃，DMN模型组和正常组灌胃等容积生理盐水，从第3周开始，每日1次，共6周。

最后一天给药前一晚所有动物禁食不禁水12h，末次给药后1小时采集血清测定肝脏功能，结果如表1所示；摘取肝脏测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)水平，结果如表2所示；肝组织病理染色结果如图1所示，肝脏组织天狼星红染色检查结果如图2所示。

表1鸡胆转化物对DMN诱导肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALB水平的影响

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

表2鸡胆转化物对DMN诱导肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量比较

注：*P<0.05，**P<0.01Vs模型组

各组血清生化指标如表1所示，与正常组相比，DMN模型组血清ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)显著升高(P<0.01)，ALB(白蛋白)显著降低(P<0.01)；与DMN模型组相比，鸡胆转化物低剂量和高剂量组ALT、AST显著降低，ALB显著回升。说明本申请鸡胆转化物可显著修复肝损伤，改善肝脏炎症。

各组肝脏羟脯氨酸含量如表2所示，与正常组相比，DMN模型组肝脏羟脯氨酸含量显著升高(P<0.01)；与DMN模型组相比，鸡胆转化物低剂量和高剂量组肝脏羟脯氨酸含量都显著降低(P<0.01)。说明本申请鸡胆转化物可显著降低肝脏内胶原蛋白合成和降解的速度，减少胶原纤维的生成，抑制肝脏纤维化进程。

由图1的HE染色结果可知，正常组(a)：大鼠肝细胞排列整齐，汇管区未见炎症及充血肿胀；DMN模型组(b)：大鼠肝脏汇管区有大量炎性细胞浸润，成纤维细胞大量增生，肝细胞广泛变性呈片状坏死。鸡胆转化物低剂量组(c)和鸡胆转化物高剂量组(d)：大鼠肝脏汇管区炎性细胞浸润明显减轻，成纤维细胞少量增生，少量肝细胞变性坏死，高剂量组改善尤其明显。说明本申请鸡胆转化物抑制炎细胞浸润和成纤维细胞生成，逆转肝细胞变性和/或坏死，改善肝细胞炎症，增强肝细胞修复，抑制或逆转肝细胞纤维化进程。

由图2的天狼星红胶原染色结果可知，正常组(a)：肝脏肝小叶结构清晰，未见肝纤维化及假小叶成形；DMN模型组(b)：汇管区可见较多假小叶形成，肝小叶间隔明显增宽和大量胶原纤维沉积；鸡胆转化物低剂量组(c)和鸡胆转化物高剂量组(d)：汇管区未见明显假小叶形成，肝小叶间隔增宽和少量胶原纤维沉积。说明本申请鸡胆转化物可明显抑制肝脏假小叶形成和胶原纤维沉积，具有抗肝纤维化作用。

综上，本申请鸡胆转化物可抑制炎细胞浸润、降低血清谷丙转氨酶和/或谷草转氨及提高血清白蛋白，逆转肝细胞坏死和/或变性，改善肝细胞炎症，增强肝细胞修复；还可抑制成纤维细胞、胶原蛋白和胶原纤维的生成，抑制肝脏假小叶形成和胶原纤维沉积，从而抑制和/或逆转肝脏纤维化；也就是说，本发明的鸡胆转化物具有改善肝脏炎症、提高肝脏修复和抗肝纤维化病变的作用，并最终抑制和/或逆转肝脏纤维化进程，可用于制备预防和/或治疗肝纤维化药物。

Claims (10)

1.鸡胆转化物在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用，其特征在于，所述鸡胆转化物作为抑制和/或逆转肝纤维化活性成分。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡胆转化物作为改善肝细胞炎症、和/或增强肝细胞修复、和/或抑制肝纤维化、和/或逆转肝纤维化的活性成分。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鸡胆转化物用作逆转肝细胞坏死和/或变性、和/或降低血清谷丙转氨酶、和/或降低血清谷草转氨酶、和/或提高血清白蛋白的活性成分，改善肝细胞炎症、和/或增强肝细胞修复；所述鸡胆转化物用作抑制肝脏假小叶形成和/或胶原纤维沉积的活性成分，抑制肝纤维化、和/或逆转肝纤维化。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鸡胆转化物用作抑制炎细胞浸润的活性成分，逆转肝细胞坏死和/或变性；所述鸡胆转化物用作抑制胶原纤维生成的活性成分，抑制肝脏假小叶形成和/或胶原纤维沉积；所述鸡胆转化物用作抑制胶原蛋白生成、和/或降低肝脏羟脯氨酸的活性成分，抑制胶原纤维生成；所述鸡胆转化物用作抑制成纤维细胞生成的活性成分，抑制胶原蛋白生成。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，鸡胆转化物包括总胆酸，总胆酸包括牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸和牛磺熊胆酸；以鸡胆转化物质量计，总胆酸的含量为16％～85％，牛磺熊去氧胆酸的含量为10％～50％，牛磺鹅去氧胆酸的含量为5％～40％，牛磺胆酸的含量为0.1％～10％，牛磺熊胆酸的含量为0.1％～10％。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鸡胆转化物的制备方法为：

a)鸡胆粉用pH＝7～9缓冲液溶解后，离心并取上清液过滤3～5次，得到滤渣和滤液，所述滤渣冷冻干燥保存；

b)将滤液与辅酶I或辅酶II加入固化有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的壳聚糖微球层析柱中反应2～8小时得反应液；

c)反应液冷冻干燥后与a)步骤滤渣混合，得鸡胆转化物。

7.一种预防和/或治疗肝纤维化的药物制剂，其特征在于，以鸡胆转化物为活性成分。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂还包括以下辅助活性成分中的至少一种：辅助预防和/或治疗肝纤维化的活性成分、辅助增强肝修复的活性成分、辅助预防和/或治疗肝脏炎症的活性成分、辅助预防和/或治疗肝细胞坏死和/或变性的活性成分、辅助预防和/或治疗胶原沉积的活性成分、辅助预防和/或治疗肝脏假小叶形成的活性成分、保肝活性成分、养肝活性成分或者护肝活性成分。

9.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，作为活性成分的鸡胆转化物的质量百分比为10％～95％。