CN109554384A - 一种基因工程菌及其在催化二腈选择性水解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基因工程菌及其在催化二腈选择性水解中的应用。本发明公开的基因工程菌携带含有两段腈水解酶nh基因的重组表达载体，能够实现腈水解酶的双表达，催化二腈水解活力和选择性高，转化率可达99%以上。由于实现了腈水解酶的双表达，导致酶的生产成本低，并且该制备条件温和、无需添加大量有机溶剂，有利于进一步的工业化生产，在抗癫痫药物加巴喷丁的生产中具有很好的工业开发前景。

Description

一种基因工程菌及其在催化二腈选择性水解中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够实现腈水解酶双表达的基因工程菌，该重组基因工程菌的培养方法，和该重组菌作为催化剂在选择性水解二腈以制备加巴喷丁中间体中的应用。
背景技术
加巴喷丁(Gabapentin),化学名为1-氨甲基-1-环己烷乙酸，CAS号为60142-96-3。它是美国Warner-Lambert公司首先开发的抗癫痛药(商品名为Neurotin)，于1993年首次在英国上市，之后，相继在美国、加拿大、法国、德国、意大利、日本等世界上多数国家上市。随着临床应用上的拓展，加巴喷丁的销售迅速增长，1997年的销售额为3.74亿美元，1999年的销售额为9.1亿美元，2002年为22.7亿美元，2005年达到近30亿美元，在全球80亿美元的抗癫痫药市场中占有很大份额。2005年，加巴喷丁进入世界畅销药物100强的行列。被医疗界列为畅销药物中的“重磅炸弹”。已成为世界上最常用的抗癫痛药之一。随着加巴喷丁治疗适应症的不断扩大，其原料药的需求也在逐年增加。
通过二腈底物(1)区域选择性水解合成1-氰基环己乙酸(2)，进而催化加氢还原其为最终产物加巴喷丁(3)是一条绿色的制备途径(图3所示)。但是，催化二腈(1)区域选择性水解的催化剂不多，大部分化学催化剂存在区域选择性差，产物1-氰基环己乙酸中有一定量的二酸存在，增加了后续产物分离的难度和成本。此外，还存在反应条件苛刻、环保性差等问题。
生物催化具有反应条件温和、高活性和高选择性等优势，广泛用于实验室研究和医药化学制造领域。腈水解酶是研究较早的一类生物催化剂，能够催化腈类底物水解生成羧酸类产物，在工业生产中有一定的应用。瑞士龙沙公司就发现一种新的菌株，可用于5-羟基-吡嗪-2-甲酸及5-羟基-毗啶-2-甲酸的生产，两者均是药物的关键中间体，转化率几乎是100％[Stepanek F,ChemEngSci,1999,54:1493-1498]。杜邦公司利用Acidovoraxfacilis 72W催化2-甲基戊二腈生成4-氰基戊酸，后者是生产1,5-二甲基-2-哌啶酮的重要中间体[Cooling FB,J MolCatal.B:Enzym,2001,11:295-306]。薛建萍等人筛选乳酪短杆菌(Brevibacteriumcasei CGMCC No.0887)，通过长期的诱变育种，使得这种乳酪短杆菌每毫升发酵液中腈酶活力单位可以达到10万之多，羟基乙酸的年产量达到150t[薛建萍,生物催化生产羟基乙酸,中国专利,1772912A.2006.05.17.]。
腈水解酶催化反应的高度化学、区域和立体选择性也被广为报道[Rey P.,J.Agric.Food Chem.2004,52:8155-8162；Chauhan S.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2003,61:118-122]。区域选择性的腈水解酶能够选择性水解二腈中的一个氰基，将其转化成单氰基羧酸，这是化学方法难以实现的。1988年，日本科学家首次对来自于Rhodococcus rhodochrous J1中的腈酶的区域选择性进行报道，以1,3-二氰基苯和1,4-二氰基苯作为底物时，该酶只作用于一个氰基，生成相应的单氰基羧酸[Kobayashi M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.1988,29:231-233；Kobayashi M,J BiolChem.1992,267:20746-20751]。后续又有来自于RhodococcusrhodochrousLL100-21，Rhodococcus.sp等菌株的腈水解酶被报道具有区域选择性。
将区域选择性腈水解酶用于1-氰基环己乙酸的制备，对其大规模工业化生产具有重要意义。目前已有报道，来自于Bradyrhizobiumjaponicum USDA110的腈水解酶对一系列二腈表现出较好的催化作用，并且有一定的选择性，可用于1-氰基环己基乙酸的生产(Dunming Zhu,Adv.Synth.Catal.2007,349,1667-1670)。但是较低的底物耐受性和活性限制了其在大规模工业生产中的应用。此外，浙江工业大学公开了来自于敏捷食酸菌的经分子改造的腈水解酶，其突变体可催化1M氰基环己基乙腈选择性水解，产物1-氰基环己基乙酸得率达到90％，但在反应体系中添加了高达100g/L的湿菌体量。[郑裕国，重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用，中国专利,104212784A.2014.12.17.]。本课题组在前期的工作中利用Acidovoraxsp.来源的腈水解酶构建基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-nh用于氰基环己基乙腈选择性水解，但是存在产酶量少导致酶的生产成本较高，工业应用价值低。
发明内容
本发明目的在于提供一种可以实现腈水解酶双表达的重组工程菌，所述重组工程菌的制备方法、上述腈水解酶及工程菌在其在二腈选择性水解中的应用。通过构建高效表达重组腈水解酶的基因工程菌株，用于二腈底物的选择性水解反应，从而降低1-氰基环己基乙酸制备过程中生物催化剂的成本，使腈水解酶催化的1-氰基环己基乙酸生产途径更具有经济性。该工程菌具有较强的腈水解酶生产能力，腈水解酶的生产成本较低。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案之一是：
一种重组表达载体，其特征在于，含有两段腈水解酶nh基因。
进一步地，所述的腈水解酶基因的序列为SEQ ID NO:1。
进一步地，所述的两段腈水解酶nh基因分别连接于pRSFDuet-1质粒的两个多克隆酶切位点上。
本发明选择具有两个多克隆酶切位点的pRSFDuet-1质粒构建重组菌。由于申请人在前期的工作中，已经构建产腈水解酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET21a-nh，目标腈水解酶表达质粒为pET21a，pET21a和pRSFDuet-1多克隆位点2(MCS2)有相同的酶切位点Ndel和Xho1，直接将含有腈水解酶基因重组表达载体pET21a-nh和载体pRSFDuet分别用限制性内切酶Ndel和Xho1进行双酶切后，形成互补的粘性末端，再用T4DNA连接酶进行连接，形成含有一段腈水解酶NH的基因的重组表达质粒pRSFDuet-1-nh。连接液转化大肠杆菌E.coliDH5α，挑选阳性克隆子，经质粒提取获得大量重组质粒pRSFDuet-1-nh。
进一步，根据目的基因序列设计一对特异性引物(F:5’-AAAACTGCAGCTTTGCTGGGACCGGTTCTT-3’；R:5’-GACATGCCATGGTTTCGTATAACAGCAAGTT-3’)，以pET21a-nh为模板进行PCR扩增，将扩增产物和载体pRSFDuet-1-nh分别用限制性内切酶Pst1和Nco1进行双酶切后，形成互补的粘性末端，再用T4DNA连接酶进行连接，形成含有两段腈水解酶nh的基因的重组表达质粒pRSFDuet-1-nh-nh。
本发明采取的技术方案之二是：
一种重组表达转化体，其特征在于，包含宿主微生物，所述的宿主微生物携带上述的重组表达载体。
一种基因工程菌，其特征在于，为携带上述的重组表达载体的大肠埃希氏菌BL21(DE3)。
其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将如上所述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的腈水解酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠埃希氏菌(E.coli)，更佳地为大肠埃希氏菌BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pRSFDuet-1-nh-nh转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-nh-nh。所述转化方法为本领域常规转化方法，包括化学转化法，热激法或电转法。
本发明采取的技术方案之三是：上述的重组表达转化体或基因工程菌的培养方法，其特征在于，包括：将如上所述的重组表达转化体或基因工程菌接种到培养基中进行培养，从培养物中获得腈水解酶细胞。
所述培养基含有可溶性淀粉20g/L，酵母粉15g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，卡纳霉素50μg/mL，培养基的初始pH为7.0-7.5。
所述的培养方法较佳地包括：将上述重组大肠埃希氏菌接种至上述培养基中，30℃，180rpm培养，培养4h，加入0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在25-35℃进行诱导表达。
更优选地，所述的培养方法较佳地包括：将上述重组大肠埃希氏菌接种至上述培养基中，30℃，180rpm培养，培养4h，加入0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，在30℃进行诱导表达。
本发明采取的技术方案之四是：上述的重组表达转化体或基因工程菌作为催化剂在选择性水解1-氰基环己基乙腈中的应用。
其中所述的应用较佳地为：在pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中，加入本发明所述重组表达转化体、基因工程菌、或其经超声破碎后的酶液以及底物1-氰基环己基乙腈，进行位点选择性水解反应，形成1-氰基环己基乙酸。反应过程用碳酸钠或氨水调节反应pH在7.0～7.5之间。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的基因工程菌能够实现腈水解酶的双表达，酶的产量大大提高，催化二腈水解活力和选择性高，转化率可达99％以上。由于实现了腈水解酶的双表达，导致酶的生产成本低，并且该制备条件温和、无需添加大量有机溶剂，有利于进一步的工业化生产，在抗癫痫药物加巴喷丁的生产中具有很好的工业开发前景。
附图说明
图1.pRSFDuet-1-nh-nh重组质粒图谱。
图2.腈水解酶催化1-氰基环己基乙腈选择性水解反应进程。
图3为化学-酶法合成加巴喷丁工艺路线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术内容做进一步描述，但不限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件，或按照商品说明书选择。
下列实施例中的材料来源为：
基因工程菌株E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α和质粒pET-21a、pRSFDuet-1均可以从商业途径购买获得。
质粒提取均采用商业化质粒抽提试剂盒，按说明书提取步骤进行提取。
重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-nh，该基因工程菌为发明人实验室前期构建。设计一对特异性引物(上游引物:5’-GGGTTTCATATGCTTTGCTGGGACCGGTTCTT-3’(SEQIDNO：2)；下游引物:5’-CCGCTCGAGTTTCGTATAACAGCAAGTT-3’(SEQIDNO：3))，进行PCR扩增。PCR体系为：2×PrimeSTAR Max Premix10μl，上游引物和下游引物各0.5μl(0.25μmol/L)，DNA模板0.5μl(约0.08μgAcidovoraxsp.基因组DNA)和ddH2O 8.5μl。PCR反应过程：95℃模板预变性5min；95℃模板变性，30s，56℃退火，30s，72℃引物延伸90s，该过程共循环30次；72℃引物沿模板继续延伸10min。
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化、回收后，连接到通用pGM-Simple-T载体上，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，进行菌落PCR筛选，挑选含有目的腈水解酶基因的单菌落，经培养后，采用商业化质粒抽提试剂盒，按说明书步骤提取质粒，然后利用Ndel和Xho1进行双酶切30min。同时，用相同的限制性内切酶对pET-21a质粒进行双酶切。利用T4DNA连接酶对回收后的酶切产物进行连接，连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子，经质粒提取获得大量重组表达载体质粒pET-21a-nh。
将重组质粒pET-21a-nh转化大肠杆菌E.coli BL21(DE 3)感受态细胞，挑阳性克隆，得到重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET-21a-nh。
本发明各实施例中所用的试剂皆为分析纯或者HPLC纯规格。
实施例1重组质粒及重组工程菌的构建
从重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-21a-nh中采用商业化质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，产品编号DP103)，按说明书提取步骤提取重组表达载体pET21a-nh。由于pET21a和pRSFDuet-1多克隆位点2(MCS2)有相同的酶切位点Ndel和Xho1，直接将含有腈水解酶基因重组表达载体pET21a-nh和载体pRSFDuet-1分别用限制性内切酶Ndel和Xho1进行双酶切30min后，形成互补的粘性末端，再用T4DNA连接酶进行连接，形成含有一段腈水解酶nh基因的重组表达质粒pRSFDuet-1-nh。连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子，经培养、质粒提取获得大量重组质粒pRSFDuet-1-nh。
在载体上连接一段目的基因之后，在MCS1上寻找另一对酶切位点，根据MCS1的限制性内切酶酶切位点及目的基因nh的序列分析，选择常用的Pst1和Nco1作为酶切位点。设计一对特异性引物(上游引物:5’-AAAACTGCAGCTTTGCTGGGACCGGTTCTT-3’(SEQIDNO：2)；下游引物:5’-GACATGCCATGGTTTCGTATAACAGCAAGTT-3’(SEQIDNO：3))，进行PCR扩增。PCR体系为：2×PrimeSTAR Max Premix10μl，上游引物和下游引物各0.5μl(0.25μmol/L)，DNA模板0.5μl(约0.05μg质粒pET21a-nh)和ddH2O8.5μl。PCR反应过程：95℃模板预变性3min；95℃模板变性，30s，56℃退火，30s，72℃引物延伸90s，该过程共循环30次；72℃引物沿模板继续延伸10min。
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化、回收后，连接到通用pGM-Simple-T载体上，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，进行菌落PCR筛选，挑选含有目的腈水解酶基因的单菌落，经培养后，提取质粒，然后利用Pst1和Nco1进行双酶切30min。同时，用相同的限制性内切酶对MCS1上含目的基因的pRSFDuet-1-nh进行双酶切。利用T4DNA连接酶对回收后的酶切产物进行连接，连接液转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆子，经质粒提取获得大量重组表达载体质粒pRSFDuet-1-nh-nh，如图1所示，其含有两段腈水解酶nh基因，所述的腈水解酶基因的序列为SEQ ID NO:1。
将重组质粒pRSFDuet-1-nh-nh转化大肠杆菌E.coli BL21(DE 3)感受态细胞，挑阳性克隆，得到重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-nh-nh，用于后续诱导表达。所述的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-nh-nh为为携带上述的重组表达载体pRSFDuet-1-nh-nh的大肠埃希氏菌BL21(DE3)。
实施例2工程菌在25℃培养及活力测定
种子液培养：自转化后的平板上挑取单菌落接种至含有5mL种子液培养基(含有卡纳霉素，50μg/ml)的试管中，30℃，180rpm条件下培养12h。
所述的种子液培养基配方为种子液培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉10，NaCl 5，pH7.0。
摇瓶发酵：将培养好的种子液按4％的接种量接种至含有卡纳霉素(50μg/ml)的发酵培养基中，30℃，180rpm培养4h后，加入终浓度为0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续在25℃培养8h进行诱导表达，测定最终的OD600。并将培养液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿菌体。
所述的发酵培养基中基本组分为(g/L)：可溶性淀粉20，酵母粉15，NaCl 5，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0。
酶活力测定：称取50mg湿菌体，重悬于950μl磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7)中。加入50μl溶解于DMSO的底物1-氰基环己基乙腈母液，底物母液浓度为1M，反应体系中底物的最终浓度为50mM，助溶剂DMSO浓度为5％(v/v)，在漩涡振荡器上进行位点选择性水解反应15min，形成1-氰基环己基乙酸。反应条件为1000rpm，30℃。用微孔滤膜过滤后，用HPLC分析。
一个单位酶的活力被定义为在标准测定条件下每分钟催化生成1μmol 1氰基环己基乙酸所需要的酶量。
HPLC分析条件：流动相为0.01M磷酸盐缓冲液(pH 2.0)和乙腈，体积比76：24，流速为1.0mL/min，检测波长为215nm，ODS柱(5μm)。
经测定，发酵所得湿菌体的比活为82U/g。
实施例3工程菌在30℃培养及活力测定
种子液培养：自转化后的平板上挑取单菌落接种至含有5mL种子液培养基(含有卡纳霉素，50μg/ml)的试管中，30℃，180rpm条件下培养12h。
所述的种子液培养基配方为种子液培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉10，NaCl 5，pH7.0。
摇瓶发酵：将培养好的种子液按4％的接种量接种至含有卡纳霉素(50μg/ml)的发酵培养基中，30℃，180rpm培养4h后，加入终浓度为0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续在30℃培养8h进行诱导表达，测定最终的OD600。并将培养液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿菌体。
所述的发酵培养基中基本组分为(g/L)：可溶性淀粉20，酵母粉15，NaCl 5，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0。
按照实施例2所述的测活及分析方法，对发酵所得细胞进行活力分析，发酵所得湿菌体的比活为90U/g。
实施例4工程菌在35℃培养及活力测定
种子液培养：自转化后的平板上挑取单菌落接种至含有5mL种子液培养基(含有卡纳霉素，50μg/ml)的试管中，30℃，180rpm条件下培养12h。
所述的种子液培养基配方为种子液培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉10，NaCl 5，pH7.0。
摇瓶发酵：将培养好的种子液按4％的接种量接种至含有卡纳霉素(50μg/ml)的发酵培养基中，30℃，180rpm培养4h后，加入终浓度为0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续在30℃培养8h进行诱导表达，测定最终的OD600。并将培养液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿菌体。
所述的发酵培养基中基本组分为(g/L)：可溶性淀粉20，酵母粉15，NaCl 5，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0。
按照实施例2所述的测活及分析方法，对发酵所得细胞进行活力分析，发酵所得湿菌体的比活为86U/g。
实施例5重组工程菌催化1mol/L的1-氰基-环己基乙腈选择性水解
1-氰基环己基乙腈选择性水解反应：将按实施例3培养所得的湿菌体0.5g重悬于9ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7)，加入1ml的DMSO，称取适量底物加入，底物终浓度为1M，水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌进行位点选择性水解反应，形成1-氰基环己基乙酸，反应过程用1mol/L碳酸钠滴定生成的产物酸，控制反应pH在7.0，反应不同时间取样，测定转化率。结果如图2所示，底物在反应6h后几乎完全被转化，转化率达到97.2％。
实施例6重组工程菌催化1.0mol/L的1-氰基-环己基乙腈选择性水解
1-氰基环己基乙腈选择性水解反应：将按实施例3培养所得的湿菌体0.5g重悬于9ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7)，加入1ml的DMSO，称取适量底物加入，底物终浓度为1.5mol/L，水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌进行位点选择性水解反应，形成1-氰基环己基乙酸，反应过程用1mol/L氨水滴定生成的产物酸，控制反应pH在7.0，反应不同时间取样，测定转化率。底物在反应6h后转化率达到99.2％。
实施例7重组工程菌催化1.5mol/L的1-氰基-环己基乙腈选择性水解
1-氰基环己基乙腈选择性水解反应：将按实施例3培养所得的湿菌体0.5g重悬于9ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7)，加入1ml的DMSO，称取适量底物加入，底物终浓度为1.5mol/L，水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌进行位点选择性水解反应，形成1-氰基环己基乙酸，反应过程用1mol/L氨水滴定生成的产物酸，控制反应pH在7.0，反应不同时间取样，测定转化率。底物在反应8h后转化率达到96.3％。
综上所述，本发明提供的一种能够实现腈水解酶双表达的基因工程菌，利用其作为生物催化剂催化1-氰基环己基乙腈进行区域选择性水解反应制备1氰基环己基乙酸的方法。该方法具有转化率高、位点选择性高，反应条件温和等优点。最终所得的1-氰基环己基乙酸的得率最高可达99％。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海应用技术大学
<120> 一种基因工程菌及其在催化二腈选择性水解中的应用
<130> 11
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1110
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atggtgtcat ataatagtaa atttctggca gctaccgtgc aggccgaacc agtgtggctg 60
gatgccgatg cgacaatcga taaaagtatc ggcatcattg aagaagcagc acagaaaggc 120
gcaagtctga ttgcctttcc ggaagtgttt attccgggct atccatattg ggcttggtta 180
ggcgatgtta aatattcact gagctttacc tcacgctatc atgaaaattc tttagaatta 240
ggcgatgatc gcatgcgtcg cttacagtta gccgcccgcc gtaataaaat tgccctggtt 300
atgggctata gtgaacgcga agcgggctct cgttatctga gtcaggtgtt tattgatgaa 360
cgcggcgaaa tcgttgctaa tcgtcgcaaa ctgaaaccta cacatgtgga acgtacgatc 420
tatggtgaag gtaatggcac ggattttctg acacatgatt ttgcgtttgg tcgcgtgggt 480
ggcctgaatt gttgggaaca ttttcagcca ctgtctaaat ttatgatgta tagcttaggt 540
gaacaggttc atgttgcatc ttggccggca atgtctccat tacagccaga tgtgtttcag 600
ttaagtatcg aagccaatgc gaccgtgaca cgttcgtacg ccattgaagg ccagaccttt 660
gtgctgtgta gtacccaggt gatcggtcct agcgcaatcg aaaccttttg cttaaatgat 720
gaacagcgcg ccttactgcc tcagggttgc ggttgggcac gcatctatgg tccagatggc 780
tcagaattag ctaaaccatt agccgaagat gcagaaggta tcctgtatgc ggaaatcgat 840
ttagaacaga ttctgctggc caaagcgggc gccgatccag tgggtcatta tagtcgtccg 900
gatgtgctga gcgtgcagtt tgatcctcgt aatcatacac ctgtgcatcg catcggtatt 960
gatggtcgtc tggatgttaa tacccgctct cgcgtggaaa attttcgctt acgtcaggct 1020
gccgaacagg aacgtcaggc gagcaaacgc ctgggaacca aactgtttga acagagtctg 1080
ctggcggaag aaccggttcc ggccaaataa 1110
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
aaaactgcag ctttgctggg accggttctt 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gacatgccat ggtttcgtat aacagcaagt t 31

Claims (10)

1.一种重组表达载体，其特征在于，含有两段腈水解酶nh基因。
2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述的腈水解酶基因的序列为SEQID NO:1。
3.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述的两段腈水解酶nh基因分别连接于pRSFDuet-1质粒的两个多克隆酶切位点上。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含宿主微生物，所述的宿主微生物携带权利要求1-3中任一项所述的重组表达载体。
5.一种基因工程菌，其特征在于，为携带权利要求1-3中任一项所述的重组表达载体的大肠埃希氏菌BL21(DE3)。
6.权利要求4所述的重组表达转化体或权利要求5所述的基因工程菌的培养方法，其特征在于，包括：将权利要求4所述的重组表达转化体或权利要求5所述的基因工程菌接种到培养基中进行培养，从培养物中获得腈水解酶细胞。
7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述培养基含有可溶性淀粉20g/L，酵母粉15g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，卡纳霉素50μg/mL，培养基的初始pH为7.0。
8.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，包括：将上述重组大肠埃希氏菌接种至培养基中，30℃，180rpm培养，培养4h，加入0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，在25-35℃进行诱导表达。
9.权利要求4所述的重组表达转化体或权利要求5所述的基因工程菌作为催化剂在选择性水解1-氰基环己基乙腈中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：在pH为7.0～7.5的磷酸盐缓冲液中，加入权利要求4所述的重组表达转化体或其经超声破碎后的酶液、或者权利要求5所述的基因工程菌或其经超声破碎后的酶液，以及底物1-氰基环己基乙腈，进行位点选择性水解反应，形成1-氰基环己基乙酸。反应过程用碳酸钠或氨水调节反应pH在7.0～7.5之间。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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S. CHAUHAN等: "Purification， cloning， sequencing and over-expression in Escherichia coli of a regioselective aliphatic nitrilase from Acidovorax facilis 72W", 《AMB》 *
邱静雯: "来源于敏捷食酸菌72W重组腈水解酶的发酵优化研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

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