CN107058205B

CN107058205B - 一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN107058205B
Application number: CN201710414186.9A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 吴丹; 王淼淼; 张康
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-05
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2037-06-05
Also published as: CN107058205A

Abstract

本发明公开了一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过人工合成SPase基因、设计引物、PCR获得Bifidobacterium adolescentis来源蔗糖磷酸化酶目的基因，构建重组质粒pBSMuL3‑SP，并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(CCTCC M2016536)，得到重组枯草芽孢杆菌。以此枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产SPase。将重组蔗糖磷酸化酶应用于制备曲二糖具有比较好的效果。本发明以食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达蔗糖磷酸化酶，产酶水平高，便于分离纯化，且发酵原料来源广泛，生产成本较低。

Description

一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，Sucrose Phosphorylase,SPase)，是GH13家族中的一员，是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。主要催化2种类型的反应：一是将1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体；二是将蔗糖中的葡萄糖基转移至受体，受体包括无机磷酸、水、含酚羟基、醇羟基及羧基的物质。如以氢醌为受体可生成美白添加剂熊果苷，消除了氢醌作为美白添加剂的毒性作用，以葡萄糖为受体可生成麦芽糖和曲二糖。曲二糖以及曲二糖衍生的低聚糖不易被消化，可以预防龋齿，在肠道系统有很好的耐受性，是双歧杆菌，乳酸菌，真杆菌属的增殖因子，因而是一种很好的益生元成分；同时它也是一种低热量甜味剂，因此可以替代普通的碳水化合物糖类，为肥胖以及糖尿病患者提供一种新的功能性保健甜味剂；曲二糖还能够特异性抑制不同组织器官内α-葡糖苷酶Ⅰ活性，具有抗毒性的活性，促进了新药特别是抗HIV-Ⅰ新药的产生。蔗糖磷酸化酶还可催化合成某些不稳定物质的衍生物，提高其稳定性。因此，蔗糖磷酸化酶在食品、化妆品及医药方面有广泛的应用价值。

蔗糖磷酸化酶属胞内酶，酶的基因主要来源于肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)、长双歧杆菌(Bidifobacterium longum)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)B.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶在以蔗糖为糖基供体时，具有很高的活性且受体范围较广，合成曲二糖时具有产物特异性高，转化率高的特点。另一方面，其他菌株来源的蔗糖磷酸化酶不能以葡萄糖为受体合成曲二糖。目前B.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶只在大肠杆菌中获得异源表达，但是大肠杆菌容易产生内毒素，不适合应用于食品工业。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组表达B.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以保藏编号为CCTCC M2016536的枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pHYCGTd4或pBSMuL3为表达载体。

本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SEQ ID NO.2所示的编码蔗糖磷酸化酶的基因与表达载体连接，转入枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述SEQ ID NO.2所示的基因编码SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括保藏编号为CCTCC M2016536的枯草芽孢杆菌或Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis WB400，Bacillussubtilis WB600，Bacillus subtilis WB800。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pHYCGTd4或pBSMuL3；所述pHYCGTd4已于《High-level extracellular protein production in Bacillus subtilis usingan optimized dual-promoter expression system》的表2中公开；所述pBSMuL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法具体如下：

1)扩增SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶基因；

2)将克隆出的目的基因SEQ ID NO.1连接到pMD18T，构建成为重组载体pMD18T-sp，转化至E.coli JM109进一步克隆，酶切后将目的基因连接到表达载体pBSMuL3，命名为pBSMuL3-sp。

3)将重组质粒pBSMuL3-sp通过电转化进入枯草芽孢杆菌表达宿主，获得枯草芽孢杆菌蔗糖磷酸化酶基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供一种产蔗糖磷酸化酶的方法，所述方法是将所述重组芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于30～35℃，200～250rpm培养24～72h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB培养基。

本发明的第四个目的是提供一种产曲二糖的方法，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌的发酵液离心得到粗酶液。以0.5mol/L蔗糖和0.5mol/L葡萄糖为底物，加酶量为0.25U/mol底物，于50～55℃，pH7.0～7.2反应12～48h。

本发明的第五个目的是提供一种蔗糖磷酸化酶，，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蔗糖磷酸化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在食品、医药、化工领域的应用。

有益效果：本发明以食品准入的枯草芽孢杆菌为宿主构建了表达B.adolescentis来源的蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌，酶活达1.577U/mL，应用该重组菌生产曲二糖，反应36h时底物转化率达56％，为曲二糖的工业化制备奠定了基础。

附图说明

图1重组质粒pBSMuL3-sp的构建过程图；

图2 pMD18T-sp双酶切验证图；从左至右，泳道1为5000Marker，2-3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证

图3 pBSMuL3-sp重组质粒的双酶切验证图；从左至右，泳道1～3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证，泳道4为10000bp Marker。

图4 pBSMuL3-sp重组菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图，左侧12～24h为蔗糖磷酸化酶胞外上清；右侧12～24h黑色为破壁上清；

图5最高转化率的酶转化HPLC色谱图。

具体实施方式

酶活的测定方法：将1mL 5％的蔗糖溶液和0.9mL的50mmol/L，pH6.7的磷酸缓冲液充分混匀，在55℃预热10min,加入100ul的酶液，反应10min后加入3mLDNS，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

酶活定义：将每分钟水解蔗糖糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(U)。

产物的HPLC检测：最终反应体系中的蔗糖、葡萄糖、果糖、、乳糖以及单糖的量采用HPLC来确定。色谱条件为：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，色谱柱NH₂-504E(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦G1362A；流动相采用75％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8mL/min，柱温设定为35℃。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应低聚乳果糖的浓度。

转化率按公式计算：

实施例1青春双歧杆菌蔗糖磷酸化酶编码基因的克隆及表达载体的构建

按图1的流程进行表达载体的构建，根据合成的蔗糖磷酸化酶基因设计引物D-F、D-R：

D-F：5’-GCGAAGCTTAAGGAGGATATTATGAAAAACAAAGTTCAGCTGAT-3’

D-R：5’-GCGGGATCCTTAAGCAACAACTGGAGGATTGG-3’

所述限制性酶切位点加下划线的字母表示。PCR体系为：20μM引物DZm-F和DZm-R各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer 10μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5uL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL。PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min50s，30个循环。将PCR产物进行胶回收、加A纯化后与克隆载体pMD18T连接，酶切回收目的基因将其与表达载体pBSMuL3进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，涂布含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图3所示，酶切后有两条片段，大小分别为7000bp左右(表达载体pBSMuL3)和1512bp(蔗糖磷酸化酶)即连接成功。然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即pBSMuL3-sp。

实施例2重组质粒pBSMuL3-sp的转化

1)新鲜LB平板(LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5，NaCl 10g/L，0.2g/L琼脂粉)挑枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(保藏编号为CCTCC M 2016536)单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养10.5h。

2)取2.5mL转接入40mL加0.5M的山梨醇LB培养基，37℃，200rpm震荡培养四个半小时。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，4℃，离心5min收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液(山梨醇0.5M，甘露醇0.5M，葡萄糖10％)洗涤菌体，5000rpm，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次。

5)将洗涤后的菌体重悬于1mL电转培养基中，分装到1.5mL EP管中，每管装300ul感受态细胞。

6)将300μL感受态细胞中加入10μL重组质粒，冰浴孵育15min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次。电转仪设置：2.4kv，25uF，200Ω，电击1次。

7)电击完毕立即加入1mL复苏培养基RM(山梨醇0.5M，甘露醇0.38M，蛋白胨10g/L，酵母膏5，NaCl 10g/L)吹吸，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养，挑取菌落至LB卡那霉素培养基中，进行验证，酶切后表达载体和目的基因条带大小一一对应即验证正确，然后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至TB发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h，再移至33℃恒温培养48h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10g/L，酵母膏5，NaCl 10g/L

TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O 16.43，KH₂PO₄2.31。

对粗酶液中的酶活进行测定，结果显示，酶活力为1.577U/mL，蛋白含量蛋白含量2.15mg/mL。蛋白电泳结果显示在56kDa处有一条与理论分子量一致的条带(图4)。

实施例4酶转化法制备曲二糖

在初始反应温度55℃，以0.5M蔗糖和0.5M葡萄糖为底物，加酶量为0.25U/mol底物。设置水浴摇床温度为55℃、转速150r/min，从第24h开始每隔12h取样煮沸终止反应，直至反应达到平衡。产物用HPLC进行检测。当反应结束(反应36h)后转化率可达到56％，色谱峰图见图5。

实施例5

采用实施例1～3相同策略构建重组枯草芽孢杆菌，区别在于，将载体替换为pHYCGTd4(已于《High-level extracellular protein production in Bacillussubtilis using an optimized dual-promoter expression system》的表2中公开)，所示，经检测，酶活达1.438U/mL。

实施例6

采用实施例1～3相同策略构建重组枯草芽孢杆菌，区别在于，将宿主替换为枯草芽孢杆菌168，经检测，酶活达1.121U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp

1 5 10 15

Gly Thr Ile Lys Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly

20 25 30

Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly

35 40 45

Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg

50 55 60

Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile

65 70 75 80

Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe

85 90 95

Gln Asp Val Leu Ala Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe

100 105 110

Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu

115 120 125

Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys

130 135 140

Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln

145 150 155 160

Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Asp Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser

165 170 175

Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Ser Tyr Ile Arg Leu Asp

180 185 190

Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr

195 200 205

Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys

210 215 220

Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln

225 230 235 240

Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro

245 250 255

Pro Leu Leu Leu His Ala Leu Ser Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala

260 265 270

His Trp Thr Asp Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr

275 280 285

His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg

290 295 300

Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn

305 310 315 320

Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Gln Ala Ala Thr Gly Ala

325 330 335

Ala Ala Ser Asn Ile Asp Leu Tyr Ser Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser

340 345 350

Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln

355 360 365

Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala

370 375 380

Gly Lys Asn Asp Met Glu Leu Leu Arg Lys Thr Asn Asn Gly Arg Asp

385 390 395 400

Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Lys

405 410 415

Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu

420 425 430

Leu Asp Ala Phe Asp Gly Thr Phe Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Asp Thr

435 440 445

Ser Ile Ser Phe Thr Trp Arg Gly Glu Thr Ser Gln Ala Thr Leu Thr

450 455 460

Phe Glu Pro Lys Arg Gly Leu Gly Val Asp Asn Thr Thr Pro Val Ala

465 470 475 480

Met Leu Glu Trp Glu Asp Ser Ala Gly Asp His Arg Ser Asp Asp Leu

485 490 495

Ile Ala Asn Pro Pro Val Val Ala

500

<210> 2

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaaaaca aagttcagct gatcacttat gcggatcgtc tgggcgatgg cacaatcaaa 60

tcaatgacgg acattctgcg tacacgcttt gatggcgtgt atgatggtgt tcatatcctg 120

ccgttcttca ccccgtttga tggtgcagat gcgggctttg atcctatcga tcataccaaa 180

gtggatgaac gcttaggctc ttgggatgat gttgcggaac tgtccaagac ccataatatc 240

atggttgatg caattgtgaa tcacatgtct tgggaaagta aacagtttca ggatgtgctg 300

gccaaaggcg aagaaagcga atattatcct atgtttctga ccatgtcaag cgtgtttccg 360

aatggtgcga ccgaagagga cctggccggc atctatcgcc ctcgtccagg tctgccgttt 420

acacattaca agtttgcggg aaaaacacgc ttagtgtggg tgagctttac cccacagcag 480

gttgatattg atacagattc agataaaggt tgggaatatc taatgtctat ctttgatcag 540

atggccgcct cacatgtgag ctatattcgc ttagatgccg ttggttatgg cgccaaagaa 600

gcgggcacga gctgttttat gacacctaaa acctttaaac tgatctcacg cctccgcgaa 660

gaaggcgtta aacgcggctt agaaatctta atcgaagttc atagctatta taagaaacag 720

gtggaaattg catctaaagt ggatcgcgtg tatgattttg cactgcctcc tctgctgtta 780

catgcactgt ctacgggtca tgtggaacca gttgcgcatt ggacggatat tcgtccgaac 840

aatgccgtga cggttctgga tacacatgat ggcatcggcg ttatcgatat tggctcagat 900

cagttagatc gctcactgaa aggcctggtt ccggatgaag atgtggataa cctcgtgaat 960

accatccatg ctaatacgca cggcgaatct caggcagcca ccggtgcagc cgcaagcaat 1020

atcgatctgt atagcgttaa tagtacctat tatagtgctc tgggctgtaa tgatcagcat 1080

tatattgcag cccgcgcagt gcagtttttc ctgccaggtg ttccacaggt gtattatgtg 1140

ggcgccttag cgggcaaaaa tgatatggaa ctgctgcgca aaaccaataa cggtcgcgac 1200

attaatcgtc attattatag taccgcagaa atcgatgaaa atctgaaacg tccggttgtt 1260

aaagcactga atgccctggc caaatttcgc aatgagctgg atgcatttga tggaacgttt 1320

agctatacga ccgatgatga tacaagcatc tcttttactt ggcgcggcga aacgagtcag 1380

gccaccctga cctttgaacc taaacgcggc ctgggtgtgg ataatacgac accggttgct 1440

atgttagaat gggaagattc agccggcgat catcgtagcg atgatcttat tgccaatcct 1500

ccagttgttg cttaa 1515

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgaagctta aggaggatat tatgaaaaac aaagttcagc tgat 44

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgggatcct taagcaacaa ctggaggatt gg 32

<210> 5

<211> 5748

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcttctag attctcaaaa aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag 60

agcaaaaccc ccctttgctg aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt 120

aaaaaaaaga aaggtcttaa aggttttatg gttttggtcg gcactgccga cagcctcgca 180

gagcacacac tttatgaata taaagtatag tgtgttatac tttacttgga agtggttgcc 240

ggaaagagcg aaaatgcctc acatttgtgc cacctaaaaa ggagcgattt aggcggcgtt 300

ctgtttctgc ttcggtatgt gattgtgaag ctggcttaca gaagagcggt aaaagaagaa 360

ataaaaaaga aatcatcttt tttgtttgga aagcgaggga agcgttcaca gtttcgggca 420

gcttttttta taggaacatt gatttgtatt cactctgcca agttgttttg atagagtgat 480

tgtgataatt ttaaatgtaa gcgttaacaa aattctccag tcttcacatc ggtttgaaag 540

gaggaagcgg aagaatgaag taagagggat ttttgactcc gaagtaagtc ttcaaaaaat 600

caaataagga gtgtcaagaa agcttggtaa taaaaaaaca cctccaagct gagtgcgggt 660

atcagcttgg aggtgcgttt attttttcag ccgtatgaca aggtcggcat caggtgtgac 720

aaatacggta tgctggctgt cataggtgac aaatccgggt tttgcgccgt ttggcttttt 780

cacatgtctg atttttgtat aatcaacagg cacggagccg gaatctttcg ccttggaaaa 840

ataagcggcg atcgtagctg cttccaatat ggattgttca tcgggatcgc tgcttttaat 900

cacaacgtgg gagaattcct gttataaaaa aaggatcaat tttgaactct ctcccaaagt 960

tgatccctta acgatttaga aatccctttg agaatgttta tatacattca aggtaaccag 1020

ccaactaatg acaatgattc ctgaaaaaag taataacaaa ttactataca gataagttga 1080

ctgatcaact tccataggta acaacctttg atcaagtaag ggtatggata ataaaccacc 1140

tacaattgca atacctgttc cctctgataa aaagctggta aagttaagca aactcattcc 1200

agcaccagct tcctgctgtt tcaagctact tgaaacaatt gttgatataa ctgttttggt 1260

gaacgaaagc ccacctaaaa caaatacgat tataattgtc atgaaccatg atgttgtttc 1320

taaaagaaag gaagcagtta aaaagctaac agaaagaaat gtaactccga tgtttaacac 1380

gtataaagga cctcttctat caacaagtat cccaccaatg tagccgaaaa taatgacact 1440

cattgttcca gggaaaataa ttacacttcc gatttcggca gtacttagct ggtgaacatc 1500

tttcatcata taaggaacca tagagacaaa ccctgctact gttccaaata taattccccc 1560

acaaagaact ccaatcataa aaggtatatt tttccctaat ccgggatcaa caaaaggatc 1620

tgttactttc ctgatatgtt ttacaaatat caggaatgac agcacgctaa cgataagaaa 1680

agaaatgcta tatgatgttg taaacaacat aaaaaataca atgcctacag acattagtat 1740

aattcctttg atatcaaaat gaccttttat ccttacttct ttctttaata atttcataag 1800

aaacggaaca gtgataattg ttatcatagg aatgagtaga agataggacc aatgaatata 1860

atgggctatc attccaccaa tcgctggacc gactccttct cccatggcta ctatcgatcc 1920

aataagacca aatgctttac ccctattttc ctttggaata tagcgcgcaa ctacaaccat 1980

tacgagtgct ggaaatgcag ctgcaccagc cccttgaata aaacgagcca taataagtaa 2040

ggaaaagaaa gaatggccaa caaacccaat taccgacccg aaacaattta ttataattcc 2100

aaataggagt aaccttttga tgcctaattg atcagatagc tttccatata cagctgttcc 2160

aatggaaaag gttaacataa aggctgtgtt cacccagttt gtactcgcag gtggtttatt 2220

aaaatcattt gcaatatcag gtaatgagac gttcaaaacc atttcattta atacgctaaa 2280

aaaagataaa atgcaaagcc aaattaaaat ttggttgtgt cgtaaattcg attgtgaata 2340

ggatgtattc acatttcacc ctccaataat gagggcagac gtagtttata gggttaatga 2400

tacgcttccc tcttttaatt gaaccctgtt acattcatta ttcattacac ttcataatta 2460

attcctccta aacttgatta aaacatttta ccacatataa actaagtttt aaattcagta 2520

tttcatcact tatacaacaa tatggcccgt ttgttgaact actctttaat aaaataattt 2580

ttccgttccc aattccacat tgcaataata gaaaatccat cttcatcggc tttttcgtca 2640

tcatctgtat gaatcaaatc gccttcttct gtgtcatcaa ggtttaattt tttatgtatt 2700

tcttttaaca aaccaccata ggagattaac cttttacggt gtaaaccttc ctccaaatca 2760

gacaaacgtt tcaaattctt ttcttcatca tcggtcataa aatccgtatc ctttacagga 2820

tattttgcag tttcgtcaat tgccgattgt atatccgatt tatatttatt tttcggtcga 2880

atcatttgaa cttttacatt tggatcatag tctaatttca ttgccttttt ccaaaattga 2940

atccattgtt tttgattcac gtagttttct gtattcttaa aataagttgg ttccacacat 3000

accaatacat gcatgtgctg attataagaa ttatctttat tatttattgt cacttccgtt 3060

gcacgcataa aaccaacaag atttttatta atttttttat attgcatcat tcggcgaaat 3120

ccttgagcca tatctgacaa actcttattt aattcttcgc catcataaac atttttaact 3180

gttaatgtga gaaacaacca acgaactgtt ggcttttgtt taataacttc agcaacaacc 3240

ttttgtgact gaatgccatg tttcattgct ctcctccagt tgcacattgg acaaagcctg 3300

gatttacaaa accacactcg atacaacttt ctttcgcctg tttcacgatt ttgtttatac 3360

tctaatattt cagcacaatc ttttactctt tcagcctttt taaattcaag aatatgcaga 3420

agttcaaagt aatcaacatt agcgattttc ttttctctcc atggtctcac ttttccactt 3480

tttgtcttgt ccactaaaac ccttgatttt tcatctgaat aaatgctact attaggacac 3540

ataatattaa aagaaacccc catctattta gttatttgtt tggtcactta taactttaac 3600

agatggggtt tttctgtgca accaatttta agggttttcc aatactttaa aacacataca 3660

taccaacact tcaacgcacc tttcagcaac taaaataaaa atgacgttat ttctatatgt 3720

atcaagataa gaaagaacaa gttcaaaacc atcaaaaaaa gacacctttt caggtgcttt 3780

ttttatttta taaactcatt ccctgatctc gacttcgttc tttttttacc tctcggttat 3840

gagttagttc aaattcgttc tttttaggtt ctaaatcgtg tttttcttgg aattgtgctg 3900

ttttatcctt taccttgtct acaaacccct taaaaacgtt tttaaaggct tttaagcgtc 3960

tgtacgttcc ttaaggaatt attccttagt gctttctagg ttaatgtcat gataataatg 4020

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtcc gcggaacccc tatttgtatt 4080

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 4140

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 4200

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 4260

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 4320

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 4380

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 4440

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 4500

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 4560

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 4620

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 4680

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 4740

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 4800

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 4860

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 4920

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 4980

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 5040

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 5100

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 5160

gagcgtcaga ccccttaata agatgatctt cttgagatcg ttttggtctg cgcgtaatct 5220

cttgctctga aaacgaaaaa accgccttgc agggaggttt ttcgaaggtt ctctgagcta 5280

ccaactcttt gaaccgaggt aactggcttg caggagcgca gtcaccaaaa cttgtccttt 5340

cagtttagcc ttaaccggcg catgacttca agactaactc ctctaaatca attaccagtg 5400

gctgctgcca gtggtgcttt tgcatgtctt tccgggttgg actcaagacg atagttaccg 5460

gataaggcgc agcggtcgga ctgaacgggg ggttcgtgca tacagtccag cttggagcga 5520

actgcctacc cggaactgag tgtcaggcgt ggaatgagac aaacgcggcc ataacagcgg 5580

aatgacaccg gtaaaccgaa aggcaggaac aggagagcgc acgagggagc cgccaggggg 5640

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac cactgatttg agcgtcagat 5700

ttcgtgatgc ttgtcagggg gcggagccta tggaaaaacg ctttgccc 5748

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，以保藏编号为CCTCC M 2016536的枯草芽孢杆菌为宿主，以pHYCGTd4或pBSMuL3为表达载体，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶。

2.构建权利要求1所述的基因工程菌的方法，其特征在于，将SEQ ID NO.2所示的编码蔗糖磷酸化酶的基因与表达载体pHYCGTd4或pBSMuL3连接，转入保藏编号为CCTCC M2016536的枯草芽孢杆菌中。

3.一种产蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因工程菌接种至发酵培养基中，于30～35℃，200～250rpm培养24～72h。

4.一种产曲二糖的方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因工程菌培养24～48h后的发酵液离心得到粗酶液，以质量比为1:0.8～1.2的蔗糖和葡萄糖为底物，按0.2～0.5U/mol底物的添加量加入酶液，于50～55℃，pH7.0～7.2反应12～48h。

5.权利要求1所述的基因工程菌在制备曲二糖中的应用。