CN101671660A - 一种精制β-葡萄糖苷酶发酵液的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及β－葡萄糖苷酶发酵液精制的生产方法。本发明要克服现有技术存在的步骤复杂、成本较高和难以实现工业化生产的问题。一种精制β－葡萄糖苷酶发酵液的方法，本发明所述的制备原理以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为酶原产生菌，经摇瓶发酵得到含β－葡萄糖苷酶的发酵液，经过离心除去菌体和杂质，采用膜分离技术，在高压和常温条件下截留有效β－葡萄糖苷酶的成分，从而达到精制β－葡萄糖苷酶液的目的。该方法具有制备简单、制备成本低、性能稳定、安全性高、适用面广的优点，为工业化生产β－葡萄糖苷酶提供了一个新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及β-葡萄糖苷酶发酵液精制的生产方法。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)系统名称是β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(β-D-Glucoside glucohydrolase；EC3.2.1.21)，是纤维素酶系的-个组成部分，它广泛分布与动物、植物和微生物中，它能催化水解含有烷基和芳香基团的β-葡萄糖苷键以及水解二糖和低聚糖，被广泛应用于各类生物技术行业中。在工业上，β-葡萄糖苷酶被应用于分解木质纤维素生产燃料乙醇，随着环境和开发新型产品解决能源危机的问题受到日益重视，乙醇燃料无疑将成为替代能源产品的新的开发方向。在食品行业中，β-葡萄糖苷酶也是一种很重要的酶，它能将水果中糖苷酶前体的芳香族化合物释放变为具有浓郁香味的化合物，从而改善果汁的风味。在医药保健品行业中，β-葡萄糖苷酶通过生物转化功能，将无活性的化合物转化成有生物活性的化合物，如β-葡萄糖苷酶将大豆异黄酮糖苷转化成有生物活性的苷元时，才能发挥改善更年期综合症、预防骨质疏松、抗氧化等生物学功能。
目前，β-葡萄糖苷酶的制备通常采用的方法是：先用微生物发酵方法得到含β-葡萄糖苷酶的发酵液，该过程中采用霉菌作为目标菌，繁殖速度慢，发酵时间长；再对含β-葡萄糖苷酶的发酵液进行分离纯化，分离纯化过程沿用蛋白质纯化的经典步骤，如硫酸盐沉淀、离子交换及柱层析等方法。因步骤复杂且成本较高，因此大多数仅限于实验室研制开发阶段，国内外工业化生产β-葡萄糖苷酶制剂的企业相对较少。
复旦大学周珮等人发明用微晶纤维素作为亲和层析介质纯化β-葡萄糖苷酶[1]，是直接对β-葡萄糖苷酶原料进行纯化，纯化步骤简化，但由于微晶纤维素的成本较高，因此也限制了β-葡萄糖苷酶的工业化生产。如何高效经济地生产β-葡萄糖苷酶成为我们目前需要解决难题。
参考文献
[1]周珮，严钦，冯美卿等.“一种分离纯化β-葡萄糖苷酶的方法”[专利]专利号：200710043571.3
发明内容
本发明的目的是提供一种精制β-葡萄糖苷酶发酵液的生产方法，以克服现有技术存在的步骤复杂、成本较高和难以实现工业化生产的问题。
为克服现有技术存在的问题，本发明提出的技术方案是：
一种精制β-葡萄糖苷发酵液的生产方法，依次包括下述步骤：
一、制备含β-葡萄糖苷酶的发酵液：从纳豆中筛选菌株经生化试验及16SrRNA序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为酶原产生菌，采用黄豆粉培养基，经摇瓶发酵得到含β-葡萄糖苷酶的发酵液；
二、纯化：发酵液经过离心除去菌体，采用超滤膜技术，在高压和常温条件下截留有效β-葡萄糖苷酶的成分，脱除发酵液中的杂质和盐分，得到精制β-葡萄糖苷酶液。
上述步骤一中的发酵条件为：
1、发酵培养基采用黄豆粉培养基：黄豆粉10.0g，酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，NaCl5.0g，水1000ml，PH-7.2～7.4，121℃灭菌30min。
2、发酵菌株-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
3、发酵条件：温度35～37℃，往复式摇床(振幅135次/min)培养72小时。
4、发酵液酶活：150.3IU/ml
5、发酵液处理：将在摇床上培养完成的发酵液用低温离心机在10000～15000rad/min条件下离心15min，留上清液用0.45μm的微滤膜过滤后备用。
上述步骤二中所述的膜为中空纤维超滤膜组件，根据β-葡萄糖苷酶的分子量，选用切割分子量为超滤膜1(100KD)和超滤膜2(20KD)的超滤膜各一个，膜材料为聚醚砜(PES)，超滤方式为外压式；具体操作过程是将含有β-葡萄糖苷酶发酵液，于高速离心机上在4℃下以10000～15000rad/min离心15min，留取上清液，测定酶活(检测方法为DNS酶活测定法)应在150.0IU/ml以上方可用；将上清液在20～40℃温度，通过0.45μm的微滤膜过滤，在0.1～0.25MPa压力下依次经过超滤膜组件1和2，得到精制β-葡萄糖苷酶液。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1、步骤简单：本方法中纯化过程通过离心和膜技术分离的物理方法，除去发酵液中的菌体和其他杂质并截留有效的酶成分，使β-葡萄糖苷酶达到纯化与浓缩。
2、酶活高：我们的目标菌株为细菌，其繁殖速度快，发酵时间短；又采用物理的纯化过程，可最大限度的保护酶的活性不受损失，比通常用方法获得β-葡萄糖苷酶的酶活要高，可达到600IU/ml以上。
3、成本低：采用物理方法的分离设备(膜)，可以反复使用，因此可以大大降低分离成本。
4、可实现工业化生产：本发明的纯化过程是一种物理变化的过程，经过低温离心除去菌体，采用膜分离技术，通过确定酶分子量大小，选取合适孔径的超滤膜，在0.10MPa～0.25MPa的压力范围内设定不同的超滤压力以及设定不同的超滤操作温度(20-40℃)，使超滤能够连续进行，因此适用于连续的工业化生产。
5、产品适用范围广：本发明所用原料为培养微生物的食品级原料，安全、无毒，可适用于医药、食品等各个行业；同时本发明制得的产品是以液体形式存在，可作为酶制剂，适用于降解纤维素使其生成葡萄糖，这对人类将是一个很大的贡献，它可以让我们摆脱粮食的绝对依赖，缓和世界资源紧张；用于食品行业中增加果汁的香气；用于医药、保健品行业中，将无活性的黄酮糖苷类化合物转化成有活性的苷元。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做详细地说明。
本发明中所有原料和试剂均为食品级和试剂级，其来源及规格如下：
组分 规格 产地
黄豆粉 食品级 西安中西公司
酵母膏 BR(生化试剂) 北京博奥星生物技术有限责任公司
磷酸二氢钾 分析纯 西安化学试剂厂
NaCl 分析纯 西安化学试剂厂
水 城市自来水
3，5二硝基水杨酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
水杨苷 分析纯 上海化学试剂采购供应站
超滤膜的规格：
选用切割分子量分别为100KD和20KD的超滤膜1和超滤膜2，膜为中空纤维超滤膜，膜材料均为聚醚砜(PES)，超滤方式为外压式。
实施例1
在搅拌条件下将黄豆粉10克加入到1000ml水中，再顺序加入酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，NaCl5.0g，加热溶解，调整PH-7.3，平均分装于5个300ml的三角瓶中，灭菌锅121℃灭菌30min，备用；将经过活化的自筛菌种N1在无菌条件下接入装有培养基的三角瓶中，置于振幅为135次/min的往复式摇床上，在35-37℃温度下，培养72小时，得到含有β-葡萄糖苷酶发酵液；将含有β-葡萄糖苷酶发酵液，于高速离心机上在10000rad/min条件下离心15min，留取上清液920ml，再通过0.45μm的微滤膜过滤，测定酶活(检测方法为DNS酶活测定法)152.2IU/ml；将上清液在40℃温度，0.10MPa压力下经过超滤膜1和2，得到精制β-葡萄糖苷酶液220ml，测定酶活601.4IU/ml。
实施例2
在搅拌条件下将黄豆粉10克加入到1000ml水中，再顺序加入酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，NaCl5.0g，加热溶解，调整PH-7.3，平均分装于5个300ml的三角瓶中，灭菌锅121℃灭菌30min，备用；将经过活化的自筛菌种N1在无菌条件下接入装有培养基的三角瓶中，置于振幅为135次/min的往复式摇床上，在35-37℃温度下，培养72小时，得到含有β-葡萄糖苷酶发酵液；将含有β-葡萄糖苷酶发酵液，于高速离心机上在12000rad/min条件下离心15min，留取上清液900ml，再通过0.45μm的微滤膜过滤，测定酶活(检测方法为DNS酶活测定法)154.1IU/ml；将上清液在25℃温度，0.15MPa压力下经过超滤膜1和2，得到精制β-葡萄糖苷酶液180ml，测定酶活625.4IU/ml。
实施例3
在搅拌条件下将黄豆粉10克加入到1000ml水中，再顺序加入酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，NaCl5.0g，加热溶解，调整PH-7.3，平均分装于5个300ml的三角瓶中，灭菌锅121℃灭菌30min，备用；将经过活化的自筛菌种N1在无菌条件下接入装有培养基的三角瓶中，置于振幅为135次/min的往复式摇床上，在35-37℃温度下，培养72小时，得到含有β-葡萄糖苷酶发酵液；将含有β-葡萄糖苷酶发酵液，于高速离心机上在13000rad/min条件下离心15min，留取上清液925ml，再通过0.45μm的微滤膜过滤，测定酶活(检测方法为DNS酶活测定法)151.6IU/ml；将上清液在30℃温度，0.20MPa压力下经过经过超滤膜1和2，得到精制β-葡萄糖苷酶液200ml，测定酶活600.6IU/ml。
实施例4
在搅拌条件下将黄豆粉10克加入到1000ml水中，再顺序加入酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，NaCl5.0g，加热溶解，调整PH-7.3，平均分装于5个300ml的三角瓶中，灭菌锅121℃灭菌30min，备用；将经过活化的自筛菌种N1在无菌条件下接入装有培养基的三角瓶中，置于振幅为135次/min的往复式摇床上，在35-37℃温度下，培养72小时，得到含有β-葡萄糖苷酶发酵液；将含有β-葡萄糖苷酶发酵液，于高速离心机上在15000rad/min条件下离心15min，留取上清液920ml，再通过0.45μm的微滤膜过滤，测定酶活(检测方法为DNS酶活测定法)155.3IU/ml；将上清液在30℃温度，0.20MPa压力下经过超滤膜1和2，得到精制β-葡萄糖苷酶液200ml，测定酶活610.9IU/ml。
实施例5
在搅拌条件下将黄豆粉10克加入到1000ml水中，再顺序加入酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，NaCl5.0g，加热溶解，调整PH-7.3，平均分装于5个300ml的三角瓶中，灭菌锅121℃灭菌30min，备用；将经过活化的自筛菌种N1在无菌条件下接入装有培养基的三角瓶中，置于振幅为135次/min的往复式摇床上，在35-37℃温度下，培养72小时，得到含有β-葡萄糖苷酶发酵液；将含有β-葡萄糖苷酶发酵液，于高速离心机上在15000rad/min条件下离15min，留取上清液920ml，再通过0.45μm的微滤膜过滤，测定酶活(检测方法为DNS酶活测定法)154.6IU/ml；将上清液在35℃温度，0.25MPa压力下经过超滤膜1和2，得到精制β-葡萄糖苷酶液200ml，测定酶活620.8IU/ml。
Claims (8)
1、一种精制β-葡萄糖苷发酵液的生产方法，依次包括下述步骤：
一、制备含β-葡萄糖苷酶的发酵液：从纳豆中筛选菌株经生化试验及16SrRNA序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为酶原产生菌，采用黄豆粉培养基，经摇瓶发酵得到含β-葡萄糖苷酶的发酵液；
二、纯化：发酵液经过离心除去菌体，采用超滤膜技术，在高压和常温条件下截留有效β-葡萄糖苷酶的成分，脱除发酵液中的杂质和盐分，得到精制β-葡萄糖苷酶液。
2、如权利要求1所述的一种精制β-葡萄糖苷发酵液的生产方法，其特征在于：所述步骤一中的发酵条件为：
1、发酵培养基采用黄豆粉培养基：黄豆粉10.0g，酵母膏10.0g，磷酸二氢钾1.0g，NaC15.0g，水1000ml，PH-7.2～7.4，121℃灭菌30min。
2、发酵菌株-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
3、发酵条件：温度35～37℃，往复式摇床(振幅135次/min)培养72小时。
4、发酵液酶活：150.3IU/ml
5、发酵液处理：将在摇床上培养完成的发酵液用低温离心机在10000～15000rad/min条件下离心15min，留上清液用0.45μm的微滤膜过滤后备用。
3、如权利要求1所述的一种精制β-葡萄糖苷发酵液的生产方法，其特征在于：所述步骤二中的膜为中空纤维超滤膜组件，根据β-葡萄糖苷酶的分子量，选用切割分子量为超滤膜1(100KD)和超滤膜2(20KD)的超滤膜各一个，膜材料为聚醚砜(PES)，超滤方式为外压式；具体操作过程是将含有β-葡萄糖苷酶发酵液，于高速离心机上在4℃下以10000～15000rad/min离心15min，留取上清液，测定酶活(检测方法为DNS酶活测定法)应在150.0IU/m1以上方可用；将上清液在20～40℃温度，通过0.45μm的微滤膜过滤，在0.1～0.25MPa压力下依次经过超滤膜组件1和2，得到精制β-葡萄糖苷酶液。
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| CN104542804A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-04-29 | 南通双和食品有限公司 | 一种食品用酶制剂及其制备方法 |
| CN111411117A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-07-14 | 江南大学 | 一种耐热β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用 |
| CN107325955B (zh) * | 2017-08-09 | 2020-12-29 | 湖北工业大学 | 一种降低青梅醋中苦杏仁苷的前处理方法 |
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