BR112014002709A2 - célula de fermentação de açúcar pentose - Google Patents

Abstract

célula de fermentação de açúcar pentose a presente invenção refere-se a uma célula que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma xilose isomerase, em que a sequência de aminoácido da xilose isomerase tem pelo menos 75% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácido definida na seq id no: 2 e 10, em que a sequência de nucleotídeo é heteróloga ao hospedeiro. uma célula da invenção pode ser usada em um processo para a produção de um produto de fermentação, tal como etanol. tal processo pode compreender a fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula da invenção tal que a célula fermenta a xilose no produto de fermentação.

Description

CÉLULA DE FERMENTAÇÃO DE AÇÚCAR PENTOSE Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a uma célula que é capaz de isomerizar a xilose em xilulose. A invenção também 5 se refere a um processo no qual tais células são usadas para a produção de um produto de fermentação, tais como etanol. Antecedentes da Invenção

[002] O consumo em larga escala de combustíveis fósseis tradicionais (combustíveis derivados do petróleo), nas últimas décadas, tem contribuído para os altos níveis de poluição. Isto, junto com a consciência de que o estoque mundial de combustíveis fósseis não é limitado e com uma consciência ambiental crescente, tem estimulado novas iniciativas para investigar a viabilidade de combustíveis alternativos tais como etanol, que é uma fonte de combustível com queima livre de particulado que libera menos CO2 do que a gasolina sem chumbo em uma base por litro.

[003] Embora o etanol derivado de biomassa possa ser produzido pela fermentação de açúcares hexose, obtidos de muitas fontes diferentes, os substratos usados tipicamente para a produção em escala comercial de álcool combustível, tais como a cana de açúcar e amido de milho, são caros. O aumento na produção de combustível etanol, portanto, exigirá o uso de matérias-primas de baixo custo.

[004] Atualmente, apenas a matéria-prima lignocelulósica derivada da biomassa vegetal está disponível em quantidades suficientes para substituir as culturas atualmente usadas para a produção de etanol. Na maioria do material lignocelulósico, o segundo açúcar mais comum, após a glicose, é a xilose. Assim, para um processo de produção de combustível economicamente viável, ambos os açúcares hexose e pentose devem ser fermentados para formar 5 o etanol. A levedura Saccharomyces cerevisiae é robusta e bem-adaptada para a produção de etanol, mas ele é incapaz de produzir etanol usando a xilose como uma fonte de carbono. Da mesma forma, nenhum organismo de ocorrência natural é conhecido que possa fermentar a xilose em etanol com ambos um alto rendimento de etanol e uma alta produtividade de etanol.

[005] Há, portanto, uma necessidade de um organismo que possua estas propriedades de modo a permitir a produção comercialmente viável de etanol a partir de matérias-primas lignocelulósicas. Sumário da Invenção

[006] De acordo com a invenção, existe uma célula provida que é capaz de fermentação, tal como fermentação alcoólica e de utilizar xilose como uma fonte de carbono. Uma tal célula compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma xilose isomerase, em que a sequência de aminoácido da xilose isomerase apresenta pelo menos 75% de identidade de sequência para a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID Nº: 2 e em que a sequência de nucleotídeos é heteróloga ao hospedeiro. Uma tal célula produz uma maior quantidade de etanol quando utiliza xilose como uma fonte de carbono quando comparada aos fungos filamentosos do tipo selvagem.

[007] A invenção também provê:

- Um processo para produção de um produto de fermentação o qual processo compreende a fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula da invenção de modo que a célula fermenta a xilose para o 5 produto de fermentação; - Um processo para a produção de um produto de fermentação o qual processo compreende a fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de L-arabinose com uma célula conforme definida da invenção a qual também é capaz de utilizar L-arabinose de modo que a célula fermenta xilose e L-arabinose para o produto de fermentação; e - Um processo para a produção de um produto de fermentação o qual processo compreende a fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de L-arabinose com uma célula da invenção e uma célula capaz de utilizar L-arabinose, por meio da qual cada célula fermenta xilose e/ou arabinose para o produto de fermentação.

[008] Em uma modalidade, a célula compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase obtenível a partir de uma célula do gênero Clostridium, por exemplo, a partir de uma célula Clostridium beijerinckii. Em uma modalidade, o nucleotídeo pode ser do tipo selvagem ou otimizado por códon ou por par de códons.

[009] A invenção provê adicionalmente o uso de uma célula da invenção em um processo para a produção de um produto de fermentação. Breve Descrição dos Desenhos

[0010] A figura 1 estabelece o mapa de plasmídeo de p427-TEF que codifica a xilose isomerase a partir de Clostridium beijerinckii para a expressão em Saccharomyces cerevisiae. CpO denota otimizado por par de códons. 5 [0011] A figura 2 estabelece uma curva de crescimento de BIE104P1 transformado com pPWT215 sobre 2% de xilose como única fonte de carbono e da cepa de referência transformada com nenhum no DNA no plasmídeo (transformação na ausência de plasmídeo). Os números "1" e "2" indicam a transferência de uma alíquota da cultura para o meio fresco. Todas as culturas foram incubadas na presença de ar, exceto a última (após a segunda transferência).

[0012] A figura 3 estabelece curvas de crescimento de Cepa BIE292XI(C. beyerinckii) (linha preta) e uma cepa sem plasmídeo (linha cinza), a partir do exemplo 6. Breve descrição da Listagem de Sequência

[0013] SEQ ID NO: 1 estabelece a sequência de xilose isomerase otimizada por par de códons a partir de Clostridium beijerinckii.

[0014] SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de aminoácido de xilose isomerase a partir de Clostridium beijerinckii.

[0015] SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de iniciador direto (“forward primer”).

[0016] SEQ ID NO: 4 estabelece a sequência de iniciador reverso (“reverse primer”). Descrição Detalhada da Invenção

[0017] Através de todo o relatório descritivo e das reivindicações acompanhantes, as palavras "compreendem" e

"incluem" e variações tais como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" são para serem interpretadas de forma inclusive. Ou seja, estas palavras são pretendidas para transmitir a possível inclusão de 5 outros elementos ou números inteiros não especificamente recitados, onde o contexto permita.

[0018] A invenção refere-se a uma célula que compreende uma sequência de nucleotídeos que codificam uma xilose isomerase, em que a sequência de aminoácido da xilose isomerase apresenta pelo menos 75% de identidade para a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 2 e em que a sequência de nucleotídeos é heteróloga ao hospedeiro.

[0019] A presença da sequência de nucleotídeos que codificam uma xilose isomerase confere à célula a capacidade de isomerização de xilose para xilulose.

[0020] Uma "xilose isomerase" (EC 5.3.1.5) é aqui na presente invenção definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-xilose dentro de D-xilulose e/ou vice-versa. A enzima é também conhecida como uma a D-xilose cetoisomerase. Uma xilose isomerase aqui na presente invenção pode também ser capaz de catalisar a conversão entre D-glicose e D-frutose (e consequentemente pode, portanto, ser referida como uma glicose isomerase). Uma xilose isomerase aqui na presente invenção pode exigir um cátion bivalente, tal como magnésio, manganês ou cobalto como um cofator.

[0021] Consequentemente, uma célula da invenção é capaz de isomerização de xilose para xilulose. A capacidade de isomerização de xilose para xilulose é conferida á célula do hospedeiro através da transformação da célula do hospedeiro com um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase definida. Uma célula da invenção isomeriza xilose 5 dentro de xilulose pela isomerização direta de xilose para xilulose. Isto é entendido para significar que a xilose é isomerizada dentro de xilulose em uma reação única catalisada por uma xilose isomerase, em oposição a duas etapas de conversão de xilose dentro de xilulose via um intermediário xilitol como catalisado por xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente.

[0022] Uma unidade (U) de atividade da xilose isomerase pode ser aqui na presente invenção definida como a quantidade de enzima que produz 1 nmol de xilulose por minuto, sob as condições como descritas por Kuyper e outros. (2003, FEMS Yeast Res. 4: 69 a 78).

[0023] A célula da invenção é definida com referência a uma xilose isomerase que apresenta a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que apresenta pelo menos 74% de identidade de sequência à mesma. Da mesma forma, uma célula da invenção pode ser definida com referência a uma xilose isomerase sendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma tal sequência de aminoácidos.

[0024] A SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de aminoácidos de xilose isomerase a partir de Clostridium beijerinckii. Uma célula da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase que apresenta o aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou uma que apresenta pelo menos 74% de identidade de sequência à mesma.

[0025] Preferivelmente, uma célula de acordo com a presente invenção é uma célula que compreende uma sequência 5 de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase que apresenta uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 75%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2. Uma célula de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase apresentando uma sequência que apresenta pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico estabelecida na SEQ ID NO: 1.

[0026] A identidade de sequência (ou similaridade de sequência) é definida aqui na presente invenção como uma 5 relação entre duas ou mais sequências (polipeptídeo ou proteína) de aminoácidos ou duas ou mais sequências (polinucleotídeo) de ácido nucleico, conforme determinado através da comparação de sequências. Normalmente, as identidades ou similaridades de sequência são comparadas, tipicamente sobre todo o comprimento das sequências comparadas. Contudo, as sequências podem ser comparadas sobre janelas de menor comparação. Na técnica, "identidade" também significa o grau de associação da sequência entre aminoácido ou sequências de ácido nucleico, visto que o caso pode ser, conforme determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências.

[0027] Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para darem a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar identidade e similaridade entre duas sequências incluem, por exemplo, o BestFit, BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S. F. e outros, J. Mol. Biol. 215:403 a 410 (1990), publicamente disponível a partir de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., e outros, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Os parâmetros preferidos para comparação de sequências de aminoácidos utilizando BLASTP são abertura de vão 11.0, extensão de vão 1, matriz de

Blosum 62. Os parâmetros preferidos para comparação sequências de ácido nucleico utilizando BLASTP são abertura de vão 11.0, extensão de vão 1, matriz completa de DNA (matriz de identidade de DNA). 5 [0028] Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade de aminoácido, a pessoa versada na técnica pode também levar em conta as então chamadas substituições “conservadoras” de aminoácidos, visto que será mais claro para a pessoa versada na técnica.

[0029] As substituições conservantes de aminoácido referem-se à intervariabilidade de resíduos que apresentam cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que apresenta cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que apresenta cadeias laterais hidroxil alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos que apresenta cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que apresenta cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que apresenta cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina e um grupo de aminoácidos que apresenta cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina.

[0030] Os grupos de substituição conservadora de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina glutamina. As variantes substituintes da sequência de aminoácido descrita aqui na presente invenção são aquelas nas quais pelo menos um resíduo nas sequências descritas foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar.

Preferivelmente, a variação de aminoácido é conservadora. As substituições conservadoras preferidas para cada um dos aminoácidos que ocorre naturalmente são as seguintes: Ala para ser; Arg para lis; Asn para gln ou his; Asp para glu; 5 Cis para ser ou ala; GIn para asn; GIu para asp; Gli para pro; His para asn ou gln; He para leu ou val; Leu para ile ou val; Lis para arg; gln ou glu; Met para leu ou ile; Fe para met, leu ou tir; Ser para tr; Tr para ser; Trp para tir; Tir para trp ou fe e Val para ile ou leu.

[0031] Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima que catalisa a conversão de xilose para xilulose de acordo com a invenção pode também ser definida pela sua capacidade de hibridização com as sequências de nucleotídeos que codificam a enzima que apresenta a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que apresenta pelo menos 74% de identidade de sequência com a mesma, mediante condições moderadas ou preferivelmente mediante condições de hibridização rigorosas.

[0032] Formalmente, tais sequências de nucleotídeos se hibridizam com o complemento reverso das sequências de nucleotídeos e codificam a enzima que apresenta a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que apresenta pelo menos 74% de identidade de sequência com a mesma, por exemplo, sequências que se hibridizam com o complemento reverso de SEQ ID NOs: 1 ou 2.

[0033] As condições rigorosas de hibridização são definidas aqui na presente invenção como condições que permitem uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, para hibridizar a uma temperatura de cerca de 65°C em uma solução compreendendo cerca de 1M de sal, preferivelmente 6x SSC (cloreto de sódio, citrato de sódio) ou qualquer outra solução que apresenta uma resistência 5 iônica comparável e lavagem a 65°C em uma solução compreendendo cerca de 0,1M de sal ou menos, preferivelmente 0,2x SSC ou qualquer outra solução que apresenta uma resistência iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Estas condições normalmente permitirão a hibridização específica de sequências que apresentam cerca de 90% ou mais de identidade de sequência.

[0034] As condições moderadas são definidas aqui na presente invenção como condições que permitem as sequências de ácido nucleico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridizarem-se a uma temperatura de cerca de 45°C em uma solução compreendendo cerca de 1M de sal, preferivelmente 6x SSC ou qualquer outra solução que apresenta uma resistência iônica comparável e lavagem a temperatura ambiente em uma solução compreendendo cerca de 1M de sal, preferivelmente 6x SSC ou qualquer outra solução que apresenta uma resistência iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Estas condições normalmente permitirão a hibridização específica de sequências que apresentam mais de 50% de identidade de sequência. A pessoa versada na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização de modo a 5 identificar especificamente sequências que variam em identidade entre 50% e 90%.

[0035] Para aumentar a probabilidade que a enzima introduzida é expressa na forma ativa em uma célula da invenção, a sequência de nucleotídeo de codificação correspondente pode ser adaptada para otimizar seu uso de códon para aquele da célula de levedura escolhida. Vários métodos para otimização por códon são conhecidos na técnica. Um método preferido para otimizar o uso de códon das sequências de nucleotídeos para aquele da levedura é uma tecnologia de otimização por par de códons conforme descrito no documento WO 2006/077258 e/ou WO 2008/000632. O documento WO 2008/000632 fala sobre otimização por par de códons. A otimização por par de códons é um método em que as sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo são modificadas com relação ao seu uso de códon, em particular os pares de códons que são utilizados, para obter expressões melhoradas da sequência de nucleotídeo que codificam o polipeptídeo e/ou produção melhorada do polipeptídeo codificado. Os pares de códons são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação.

[0036] Como uma simples medida para expressão de gene e eficiência de tradução, aqui na presente invenção, o Índice de Adaptação de Códon (CAI), como descrito em Xuhua Xia, Evolutionary Bioinformatics 2007,: 3 53 a 58, é utilizado. O índice utilize uma referência estabelecida de genes altamente expressos a partir de uma espécie para avaliar os méritos relativos de cada códon e uma contagem para um gene é calculada a partir da frequência de uso de 5 todos os códons naquele gene. O índice avalia a extensão para a qual a seleção foi eficaz na moldagem do padrão de uso do códon. Naquela relação é útil para previsão do nível de expressão de um gene, para avaliação da adaptação de genes virais aos seus hospedeiros e para fazer comparações de uso de códon em diferentes organismos. O índice também pode dar uma indicação aproximada do sucesso provável de expressão de heterólogo. Nos genes otimizados por par de códons de acordo com a invenção, o CAI é 0,6 ou mais, 0,7 ou mais, 0.8 ou mais, 0,85 ou mais, 0,87 ou mais 0,90 ou mais, 0,95 ou mais ou cerca de 1,0.

[0037] Em uma célula da invenção, a xilose isomerase é tipicamente heteróloga à célula. Ou seja, a xilose isomerase apresenta uma sequência que não ocorre naturalmente na célula em questão como parte do organismo, célula, sequência de genoma de DNA ou RNA na qual está presente. Ou seja, a xilose isomerase é exógena à célula ou não ocorre naturalmente na célula. Consequentemente, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase é tipicamente expressa ou é capaz de ser expressa na forma ativa na célula de hospedeiro transformada.

[0038] Uma célula da invenção é, portanto, uma célula que compreende, isto é, foi transformada com um construto de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase conforme definida acima. O construto de ácido nucleico compreendendo a xilose isomerase que codifica a sequência preferivelmente é capaz de expressão da xilose isomerase na célula do hospedeiro.

[0039] Os métodos para expressão de uma sequência 5 de xilose isomerase heteróloga em uma célula são bem- conhecidos para aqueles versados na técnica.

[0040] Consequentemente, uma célula da invenção é uma célula recombinante. Ou seja, uma célula da invenção compreende ou é transformada com ou é geneticamente modificada com uma sequência de nucleotídeo que não ocorre naturalmente na célula em questão.

[0041] As técnicas para a expressão recombinante de xilose isomerase em uma célula, bem como para as modificações genéticas adicionais de uma célula da invenção são bem-conhecidas para aqueles versados na técnica. Tipicamente tais técnicas envolvem transformação de uma célula com construto de ácido nucleico compreendendo a sequência relevante. Tais métodos são, por exemplo, conhecidos a partir de manuais padrão, tais como Sambrook e Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press ou F. Ausubel e outros, edições, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing e Wiley Interscience, New York (1987). Os métodos para transformação e modificação genética de células hospedeiras de fungos são conhecidas a partir, por exemplo, dos documentos EPA 0635574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO 90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 e da patente norte-americana nº 6.265.186.

[0042] A maioria dos plasmídeos epissomais ou 2µ são relativamente instáveis, sendo perdidos em aproximadamente 10-2 ou mais células após cada geração. Mesmo sob condições de crescimento seletivo, apenas 60% a 5 95% das células retêm o plasmídeo epissomal. O número de cópias da maioria das faixas de plasmídeos epissomais de 10 a 40 por célula de hospedeiros cir+. Contudo, os plasmídeos não são igualmente distribuídos ao logo das células e existe uma alta variação no número de cópias por célula nas populações. As cepas transformadas com plasmídeos integrados são extremamente estáveis, mesmo na ausência de pressão seletiva. Contudo, a perda de plasmídeo pode ocorrer em frequência de aproximadamente 10-3 a 10-4 através de recombinação homóloga entre DNA repetido conjuntamente, levando à saída da sequência de vetor. Preferivelmente, o projeto de vetor no caso de integração estável é, portanto, aquele mediante perda dos genes marcadores de seleção (o qual também ocorre através de recombinação homóloga intramolecular) que sai do construto integrado não é mais possível. Preferivelmente, os genes são, portanto, integrados de forma estável. A integração estável é definida aqui na presente invenção como integração no interior do genoma, em que a saída do construto integrado não é mais possível. Preferivelmente, os marcadores de seleção estão ausentes.

[0043] Tipicamente, o construto de ácido nucleico pode ser um plasmídeo, por exemplo, um plasmídeo com poucas cópias ou um plasmídeo com muitas cópias. A célula de acordo com a presente invenção pode compreender Omã cópia única ou múltiplas cópias da sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase, por exemplo, através de múltiplas cópias de um construto de nucleotídeo ou através do uso de construto que apresenta múltiplas cópias da sequência de xilose isomerase. 5 [0044] O construto de ácido nucleico pode ser mantido na forma epissomal e, portanto, compreender uma sequência para replicação autônoma, tal como uma sequência de replicação autossômica. Um construto de ácido nucleico epissomal adequado pode, por exemplo, ser baseado na levedura 2µ ou plasmídeos de pKD1 (Gleer e outros, 1991, Biotechnology 9: 968 a 975) ou os plasmídeos de AMA (Fierro e outros, 1995, Curr Genet. 29:482 a 489). Alternativamente, cada construto de ácido nucleico pode ser integrado em uma ou mais cópias dentro do genoma da célula. A integração dentro do genoma da célula pode ocorrer de forma aleatória através de recombinação não homóloga, mas preferivelmente, o construto de ácido nucleico pode ser integrado dentro do genoma da célula através de recombinação homóloga como é bem-conhecida na técnica (vide, por exemplo, o documento WO 90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e a patente norte-americana 6.265.186).

[0045] Tipicamente, a xilose isomerase que codifica a sequência será operavelmente ligada a uma ou mais sequências de ácido nucleico, capaz de prover ou auxiliar na transcrição e/ou tradução da sequência de xilose isomerase.

[0046] O termo "ligado operavelmente” se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que os permite funcionar da sua maneira pretendida. Por exemplo, um promotor ou intensificador é ligado operavelmente a uma sequência de codificação, o dito promotor ou intensificador afeta a transcrição da sequência de codificação.

[0047] Como usado aqui, o termo "promotor" se 5 refere a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados a montante com relação à direção da transcrição do sítio de iniciação da transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, sítios de iniciação de transcrição e quaisquer outras sequências de DNA conhecidas por aquele versado na técnica. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e desenvolvimentais. Um promotor "induzível” é um promotor que é ativo sob a regulação ambiental ou desenvolvimental.

[0048] O promotor que poderia ser usado para alcançar a expressão de uma codificação da sequência de nucleotídeo para uma enzima, de acordo com a presente invenção, pode não ser nativo à codificação da sequência de nucleotídeo para a enzima a ser expressa, isto é, um promotor que é heterólogo à sequência de nucleotídeo (sequência de codificação) a qual ele é ligado operavelmente. O promotor pode, no entanto, ser homólogo, isto é, endógeno, à célula hospedeira.

[0049] Os promotores adequados neste contexto incluem ambos os promotores naturais constitutivos e induzíveis assim como os promotores construídos geneticamente, os quais são bem-conhecidos pela pessoa versada na técnica. Os promotores adequados nas células eucarióticas hospedeiras podem ser GAL7, GAL10 ou GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1 e AOX1. Outros promotores adequados incluem PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 e TDH3. 5 [0050] Em uma célula da invenção, a extremidade 3' da sequência de ácido nucleotídeo codificando a xilose isomerase preferivelmente está ligada operavelmente a uma sequência terminadora de transcrição. Preferivelmente, a sequência terminadora é operável em uma célula hospedeira de escolha, tal como, por exemplo, a espécie de levedura de escolha. Em qualquer caso, a escolha do terminador não é crítica; ela pode ser, por exemplo, de qualquer gene de levedura, embora os terminadores possam, algumas vezes, ser de um gene eucariótico não de levedura. Geralmente, uma sequência de nucleotídeo codificando a xilose isomerase compreende um terminador. Preferivelmente, tais terminadores são combinados com mutações que impedem a decomposição absurda do RNAm mediado na célula hospedeira da invenção (vide, por exemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).

[0051] A sequência de terminação de transcrição ainda compreende preferivelmente um sinal de poliadenilação.

[0052] Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente em um construto de ácido nucleico adequado para o uso na invenção. Como usado aqui, o termo "marcador" se refere a um gene codificando um traço ou um fenótipo que permite a seleção de, ou a triagem para, uma célula hospedeira contendo o marcador. O gene marcador pode ser um gene com resistência a antibiótico pelo que o antibiótico apropriado pode ser usado para selecionar células transformadas dentre as células que não são transformadas. Exemplos de marcadores com resistência a antibiótico adequados incluem, por exemplo, di-hidrofolato redutase, 5 higromicina-B-fosfotransferase, 3'-O-fosfotransferase II (resistência à canamicina, neomicina e G418). Embora os marcadores com resistência a antibiótico possam ser mais convenientes para a transformação de células hospedeiras poliploides, preferivelmente, no entanto, marcadores sem resistência a antibiótico são usados, tais como marcadores auxotróficos (URA3, TRPl, LEU2) ou o gene TPI S. pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130). Em uma modalidade preferida, as células hospedeiras transformadas com os construtos de ácido nucleico são livres de gene marcador. Os métodos para a construção de células hospedeiras microbianas livres de marcador de gene recombinante são descritos em EP-A-O 635 574 e são baseados no uso de marcadores bidirecionais tais como o gene A. nidulans amdS (acetamidase) ou os genes de levedura URA3 e LYS2. Alternativamente, um marcador passível de triagem tal como proteína fluorescente verde, lacL, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase, beta-glucuronidase pode ser incorporado nos construtos de ácido nucleico da invenção permitindo selecionar as células transformadas.

[0053] Outros elementos opcionais que podem estar presentes nos construtos de ácido nucleico adequados para o uso na invenção incluem, mas não são limitados a, uma ou mais sequências líder, intensificadores, fatores de integração e/ou genes repórter, sequências íntron, centrômeros, telômeros e/ou sequências de ligação à matriz

(MAR). Os construtos de ácido nucleico da invenção podem ainda compreender uma sequência para a replicação autônoma, tal como uma sequência ARS.

[0054] Preferivelmente, a xilose isomerase é 5 expressa no citosol. A expressão citosólica pode ser alcançada por deleção ou modificação de um sinal de direcionamento mitocondrial ou peroximal.

[0055] Uma célula da invenção pode ser qualquer célula adequada, tal como uma célula procariótica, tal como uma bactéria ou uma célula eucariótica. Tipicamente, a célula será uma célula eucariótica, por exemplo, uma levedura ou um fungo filamentoso.

[0056] As leveduras são aqui definidas como micro- organismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, In : Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc. , New York) que crescem predominantemente na forma unicelular.

[0057] As leveduras podem crescer pelo desenvolvimento de um talo unicelular ou podem crescer pela fissão do organismo. Uma levedura preferida como uma célula da invenção pode pertencer aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckem, Schwanniomyces ou Yarrowia. Preferivelmente, a levedura é uma capaz de fermentação anaeróbica, mais preferivelmente uma capaz de fermentação alcoólica anaeróbica.

[0058] Os fungos filamentosos são aqui definidos como micro-organismos eucarióticos que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo composto de quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos.

[0059] Os fungos filamentosos adequados para o uso como uma célula da presente invenção são morfologicamente, 5 fisiologicamente e geneticamente distintos das leveduras. As células fúngicas filamentosas podem ser vantajosamente usadas visto que a maioria dos fungos não exigem condições estéreis para a propagação e são insensíveis às infecções por bacteriófago. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos é por alongamento de hifa e o catabolismo do carbono da maioria dos fungos filamentosos é obrigatoriamente aeróbico. Os fungos filamentosos preferidos, como uma célula hospedeira da invenção, podem pertencer ao gênero Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium ou Penicillium. Mais preferivelmente, a célula fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, um Penicillium chrysogenum ou Rhizopus oryzae.

[0060] Ao longo dos anos sugestões têm sido feitas para a introdução de vários organismos para a produção de bioetanol de culturas de açúcar. Na prática, no entanto, todos os processos de produção de bioetanol principais têm continuado a usar as leveduras do gênero Saccharomyces como produtor de etanol. Isto é devido a muitas características atraentes das espécies Saccharomyces para os processos industriais, isto é, uma alta tolerância a ácido, etanol e osmotolerância, capacidade de crescimento anaeróbico e, com certeza, sua alta capacidade fermentativa alcoólica. As espécies de levedura preferidas como as células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus,

S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K fragilis.

[0061] Uma célula da invenção pode ser capaz de converter a biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, 5 pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose e glicerol, por exemplo, em açúcares fermentáveis. Consequentemente, uma célula da invenção pode expressar uma ou mais enzimas tais como uma celulase (uma endocelulase ou uma exocelulase), uma hemicelulase (uma endo- ou exo-xilanase ou arabinase) necessária para a conversão da celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, uma pectinase capaz de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou uma amilase para converter amido em monômeros de glicose.

[0062] A célula da invenção é preferivelmente um hospedeiro capaz de transporte ativo ou passivo da xilose para dentro da célula.

[0063] Preferivelmente, uma célula da invenção: é capaz de glicólise ativa e/ou; mostra fluxo através da via da pentose fosfato e/ou; exibe atividade de xilulose quinase de modo que a xilulose isomerizada da xilose possa ser metabolizada em piruvato.

[0064] A célula ainda compreende preferivelmente aquelas atividades enzimáticas, necessárias à conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado, tal como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina.

[0065] Uma célula da invenção preferida é uma 5 célula que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, preferivelmente, fermentação alcoólica anaeróbica. Uma célula da invenção tem, preferivelmente, uma alta tolerância a etanol, uma alta tolerância a baixo pH (isto é, capaz de crescimento em um pH menor do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2,5) e voltado aos ácidos orgânicos tipo ácido láctico, ácido acético ou ácido fórmico e/ou produtos de degradação do açúcar tais como furfural e hidroxi-metilfurfural e/ou uma alta tolerância a elevadas temperaturas.

[0066] Qualquer uma das características ou atividades acima de uma célula da invenção pode estar naturalmente presente na célula ou pode ser introduzida ou modificada pela modificação genética.

[0067] A sequência de nucleotídeo codificando uma xilose isomerase é tipicamente expressa ou é capaz de ser expressa na forma ativa na célula hospedeira transformada. Assim, a expressão da sequência de nucleotídeo na célula hospedeira produz uma xilose isomerase ativa, tipicamente com uma atividade específica de pelo menos cerca de 10 U de atividade de xilose isomerase por mg de proteína em cerca de 30oC, preferivelmente pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 750 ou pelo menos cerca de 1000 U por mg em cerca de 30oC. A atividade específica da xilose isomerase expressa na célula hospedeira transformada é aqui definida como a quantidade de unidades de atividade de xilose isomerase por mg de proteína de lisado livre de célula da 5 célula hospedeira, por exemplo, um lisado livre de célula de levedura. A determinação da atividade de xilose isomerase, a quantidade de proteína e a preparação do lisado livre de célula são como descrito aqui. Preferivelmente, a expressão da sequência de nucleotídeo codificando a xilose isomerase na célula hospedeira produz uma xilose isomerase com uma Km para a xilose que é menor do que 50, 40, 30 ou 25 mM, mais preferivelmente, a Km para a xilose é cerca de 20 mM ou menos.

[0068] Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via da pentose fosfato. Em particular, a(s) modificação(ões) genética(s) podem levar a um fluxo aumentado através da parte não oxidativa da via da pentose fosfato. Uma modificação genética que causa um fluxo aumentado da parte não oxidativa da via da pentose fosfato é aqui entendida como uma modificação que aumenta o fluxo por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20 quando comparado ao fluxo em uma cepa que é geneticamente idêntica exceto pela modificação genética que causa o fluxo aumentado. O fluxo da parte não oxidativa da via da pentose fosfato pode ser medido pelo crescimento do hospedeiro modificado na xilose como única fonte de carbono, determinando a taxa de consumo de xilose específica e subtraindo a taxa de produção de xilitol específica da taxa de consumo de xilose específica, se qualquer xilitol for produzido. No entanto, o fluxo da parte não oxidativa da via da pentose fosfato é proporcional com a taxa de crescimento na xilose como única fonte de carbono, preferivelmente com a taxa de crescimento 5 anaeróbica na xilose como única fonte de carbono. Há uma relação linear entre a taxa de crescimento em xilose como única fonte de carbono (µmax) e o fluxo da parte não oxidativa da via da pentose fosfato. A taxa de consumo de xilose específica (Qs) é igual à taxa de crescimento (µ) dividido pelo rendimento da biomassa no açúcar (Yxs) devido ao rendimento da biomassa no açúcar ser constante (sob um dado conjunto de condições: anaeróbico, meio de crescimento, pH, base genética da cepa, etc.; isto é, Qs = µ/Yxs). Portanto, o fluxo aumentado da parte não oxidativa da via da pentose fosfato pode ser deduzida do aumento na taxa de crescimento máxima sob estas condições salvo transporte (a absorção é limitada).

[0069] Uma ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via da pentose fosfato podem ser introduzidas na célula hospedeira de várias maneiras. Estas incluindo, por exemplo, a obtenção de níveis maiores de atividade com estado estacionário de xilulose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da parte não oxidativa da via da pentose fosfato e/ou um nível reduzido com estado estacionário de atividade da aldose redutase não específica. Estas mudanças nos níveis de atividade com estado estacionário podem ser efetuadas pela seleção de mutantes (espontâneos ou induzidos por produtos químicos ou radiação) e/ou por tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, por superexpressão ou inativação, respectivamente,

de genes codificando as enzimas ou fatores que regulam estes genes.

[0070] Em uma célula hospedeira preferida, a modificação genética compreende a superexpressão de pelo 5 menos uma enzima da (parte não oxidativa da) via da pentose fosfato. Preferivelmente, a enzima é selecionada do grupo consistindo nas enzimas codificando a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase. Várias combinações de enzimas da (parte não oxidativa da) via da pentose fosfato podem ser superexpressas. Por exemplo, as enzimas que são superexpressas podem ser pelo menos as enzimas ribulose-5- fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5- fosfato epimerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase. Em uma modalidade da invenção, cada uma das enzimas ribulose-5- fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase é superexpressa na célula hospedeira. Mais preferida é uma célula hospedeira na qual a modificação genética compreende pelo menos a superexpressão de ambas as enzimas transcetolase e transaldolase visto que tal célula hospedeira já é capaz de crescimento anaeróbico na xilose. De fato sob algumas 5 condições, as células hospedeiras que superexpressam apenas a transcetolase e a transaldolase já têm a mesma taxa de crescimento anaeróbica na xilose que a das células hospedeiras que superexpressam todas as quatro enzimas, isto é, a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase. Além disso, as células hospedeiras que superexpressam ambas as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase são preferidas sobre as células hospedeiras que superexpressam apenas a isomerase ou apenas a epimerase visto que a superexpressão de apenas uma destas enzimas pode produzir desequilíbrios metabólicos.

[0071] A enzima "ribulose 5-fosfato epimerase" (EC

5.1.3.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a epimerisação de D-xilulose 5-fosfato em D-ribulose 5- fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como fosforibulose epimerase; eritrose-4-fosfato isomerase; fosfocetopentose 3-epimerase; xilulose fosfato 3-epimerase; fosfocetopentose epimerase; ribulose 5-fosfato 3-epimerase; D-ribulose fosfato-3-epimerase; D-ribulose 5-fosfato epimerase; D-ribulose-5-P 3-epimerase; D-xilulose-5-fosfato 3-epimerase; pentose-5-fosfato 3-epimerase; ou D-ribulose- 5-fosfato 3-epimerase. Uma ribulose 5-fosfato epimerase pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácido. Da mesma forma, uma ribulose 5-fosfato epimerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeo codificando a enzima assim como por uma sequência de nucleotídeo hibridizando uma sequência de nucleotídeo de referência codificando uma ribulose 5-fosfato epimerase. A sequência de nucleotídeo codificando a ribulose 5-fosfato epimerase é 5 aqui designada RPE1.

[0072] A enzima "ribulose 5-fosfato isomerase" (EC

5.3.1.6) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-ribose 5-fosfato em D-ribulose 5- fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como fosfopentosisomerase; fosforiboisomerase; ribose fosfato isomerase; 5-fosforibose isomerase; D-ribose 5-fosfato isomerase; D-ribose-5-fosfato cetol-isomerase; ou D-ribose- 5-fosfato aldose-cetose-isomerase. A ribulose 5-fosfato isomerase pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácido. Da mesma forma, uma ribulose 5-fosfato isomerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeo codificando a enzima assim como por uma sequência de nucleotídeo hibridizando uma sequência de nucleotídeo de referência codificando uma ribulose 5- fosfato isomerase. A sequência de nucleotídeo codificando a ribulose 5-fosfato isomerase é aqui designada RPI1.

[0073] A enzima "transcetolase" (EC 2.2.1.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: D-ribose 5- fosfato + D-xilulose 5-fosfato <-> sedoheptulose 7- fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como glicolaldeidotransferase ou sedoheptulose-7-fosfato:D-gliceraldeído-3-fosfato glicolaldeídotransferase. Uma transcetolase pode ser ainda definida por seu aminoácido. Da mesma forma, uma transcetolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeo codificando a enzima assim como por uma sequência de nucleotídeo hibridizando a uma sequência de nucleotídeo de referência codificando uma transcetolase. A sequência de nucleotídeo codificando a transcetolase é aqui 5 designada TKL1.

[0074] A enzima "transaldolase" (EC 2.2.1.2) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: sedoheptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato <-> D- eritrose 4-fosfato + D-frutose 6-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como dihidroxiacetonatransferase; dihidroxiacetona sintase; formaldeído transcetolase; ou sedoheptulose-7-fosfato:D-gliceraldeído-3-fosfato gliceronatransferase. Uma transaldolase pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácido. Da mesma forma, uma transaldolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeo codificando a enzima assim como por uma sequência de nucleotídeo hibridizando a uma sequência de nucleotídeo de referência codificando uma transaldolase. A sequência de nucleotídeo codificando a transcetolase é aqui designada TAL1.

[0075] Vários meios são conhecidos por aqueles versados na técnica para a expressão e superexpressão de enzimas em uma célula da invenção. Em particular, uma enzima pode ser superexpressa pelo aumento do número de cópias do gene codificando a enzima na célula hospedeira, por exemplo, pela integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira, pela expressão do gene de um vetor de expressão de múltiplas cópias epissomal ou pela introdução de um vetor de expressão epissomal que compreende múltiplas cópias do gene.

[0076] Alternativamente, a superexpressão de enzimas nas células hospedeiras da invenção pode ser alcançada pelo uso de um promotor que é nativo em relação à sequência que codifica a enzima a ser superexpressa, isto 5 é, um promotor que é heterólogo à sequência de codificação a qual ele é operavelmente ligado.

Embora o promotor seja, preferivelmente, heterólogo à sequência de codificação a qual ele é operavelmente ligado, também é preferido que o promotor seja homólogo, isto é, endógeno à célula hospedeira.

Preferivelmente, o promotor heterólogo é capaz de produzir um nível maior com estado estacionário do transcrito compreendendo a sequência de codificação (ou é capaz de produzir mais moléculas de transcrito, isto é, moléculas de RNAm, por unidade de tempo) do que é o promotor que é nativo em relação à sequência de codificação, preferivelmente sob condições onde a xilose ou xilose e glicose estão disponíveis como fontes de carbono, mais preferivelmente como principais fontes de carbono (isto é, mais do que 50% da fonte de carbono disponível consiste em xilose ou xilose e glicose), mais preferivelmente como únicas fontes de carbono.

Os promotores adequados neste contexto incluem ambos os promotores constitutivos e naturais induzíveis assim como os promotores construídos geneticamente.

Um promotor preferido para o uso na presente invenção será, em adição, insensível à repressão do catabólito (glicose) e/ou não exigirá, preferivelmente, a xilose para a indução.

Os promotores tendo estas características são amplamente disponíveis e conhecidos por aqueles versados na técnica.

Os exemplos adequados de tais promotores incluem, por exemplo, os promotores de genes glicolíticos, tais como a fosfofrutoquinase (PFK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato quinase (PGK) 5 promotores de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes acerca de tais promotores de levedura podem ser encontrados em (WO 93/03159). Outros promotores úteis são a proteína ribossômica codificando os promotores de gene, o promotor de gene lactase (LAC4), promotores de álcool desidrogenase (ADHl, ADH4, e os similares) e o promotor de enolase (ENO). Outros promotores, ambos constitutivos e induzíveis e sequências intensificadoras ou com ativação a montante serão conhecidas por aqueles versados na técnica. Os promotores usados nas células hospedeiras da invenção podem ser modificados, se desejado, para afetar suas características de controle.

[0077] A sequência de codificação usada para a superexpressão das enzimas mencionadas acima pode ser, preferivelmente, homóloga à célula hospedeira da invenção. No entanto, as sequências de codificação que são heterólogas à célula hospedeira da invenção podem ser usadas.

[0078] A superexpressão de uma enzima, quando se referindo à produção da enzima em uma célula hospedeira geneticamente modificada, significa que a enzima é produzida em um nível maior de atividade enzimática específica quando comparada à célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. Geralmente, isto significa que a proteína enzimaticamente ativa (ou proteínas no caso de enzimas com múltiplas subunidades) é produzida em quantidades maiores ou preferivelmente em um nível maior com estado estacionário quando comparada à célula hospedeira não modificada sob condições idênticas.

Similarmente, isto geralmente significa que a codificação 5 do RNAm para a proteína enzimaticamente ativa é produzida em quantidades maiores ou novamente preferivelmente em um nível maior com estado estacionário quando comparada à célula hospedeira não modificada sob condições idênticas.

A superexpressão de uma enzima é, assim, preferivelmente determinada pela medição do nível da atividade específica da enzima na célula hospedeira usando os ensaios de enzima apropriados como descrito aqui.

Alternativamente, a superexpressão da enzima pode ser determinada indiretamente pela quantificação do nível no estado estacionário específico da proteína enzimática, por exemplo, usando os anticorpos específicos para a enzima ou pela quantificação do nível constante específico da codificação do RNAm para a enzima.

A última pode ser particularmente adequada para as enzimas da via da pentose fosfato para a qual os ensaios enzimáticos não são facilmente viáveis visto que os substratos para as enzimas não estão comercialmente disponíveis.

Preferivelmente em uma célula hospedeira da invenção, uma enzima a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20 quando comparado a uma cepa que é geneticamente idêntica exceto pela modificação genética que causa a superexpressão.

Deve-se entender que estes níveis de superexpressão podem ser aplicados ao nível no estado estacionário da atividade da enzima, ao nível no estado estacionário da proteína da enzima assim como ao nível no estado estacionário do transcrito que codifica a enzima.

[0079] Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam a atividade de 5 xilulose quinase específica. Preferivelmente, a modificação ou modificações genéticas causam a superexpressão de uma xilulose quinase, por exemplo, pela superexpressão de uma sequência de nucleotídeo codificando uma xilulose quinase. O gene codificando a xilulose quinase pode ser endógeno à célula hospedeira ou pode ser uma xilulose quinase que é heteróloga à célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeo usada para a superexpressão de xilulose quinase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo com atividade de xilulose quinase.

[0080] A enzima "xilulose quinase" (EC 2.7.1.17) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação ATP + D-xilulose = ADP + D-xilulose 5-fosfato. A enzima também é conhecida como a fosforilação de xiluloquinase, D- xyluloquinase ou ATP :D-xilulose 5-fosfotransferase. Uma xilulose quinase da invenção pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácido. Da mesma forma, uma xilulose quinase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeo codificando a enzima assim como por uma sequência de nucleotídeo hibridizando uma sequência de nucleotídeo de referência codificando uma xilulose quinase.

[0081] Em uma célula da invenção, uma modificação ou modificações genéticas que aumentam a atividade de xilulose quinase específica podem ser combinadas com qualquer uma das modificações que aumentam o fluxo da via da pentose fosfato como descrito acima. Isto, no entanto, não é essencial.

[0082] Assim, uma célula hospedeira da invenção pode compreender apenas uma modificação ou modificações 5 genéticas que aumentam a atividade de xilulose quinase específica. Os vários meios disponíveis na técnica para a obtenção e análise da superexpressão de uma xilulose quinase nas células hospedeiras da invenção são os mesmos que aqueles descritos acima para as enzimas da via da pentose fosfato. Preferivelmente nas células hospedeiras da invenção, uma xilulose quinase a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20 quando comparada a uma cepa que é geneticamente idêntica exceto pela modificação genética(s) que causa a superexpressão. Deve-se entender que estes níveis de superexpressão podem ser aplicados ao nível no estado estacionário da atividade da enzima, ao nível no estado estacionário da proteína da enzima assim como ao nível no estado estacionário do transcrito que codifica a enzima.

[0083] Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que reduzem a atividade da aldose redutase não específica na célula hospedeira. Preferivelmente, a atividade da aldose redutase não específica é reduzida na célula hospedeira por uma ou mais modificações genéticas que reduzem a expressão de ou inativam um gene codificando uma aldose redutase não específica. Preferivelmente, a(s) modificação(ões) genética(s) reduzem ou inativam a expressão de cada cópia de endógeno de um gene codificando uma aldose redutase não específica na célula hospedeira. As células hospedeiras podem compreender múltiplas cópias de genes codificando aldose redutases não específicas como um resultado de di-, 5 poli- ou aneuploidi e/ou a célula hospedeira pode conter várias (iso)enzimas diferentes com atividade da aldose redutase que diferem em sequência de aminoácido e que são, cada uma, codificadas por um gene diferente. Da mesma forma em tais casos preferivelmente, a expressão de cada gene que codifica uma aldose redutase não específica é reduzida ou inativada. Preferivelmente, o gene é inativado pela deleção de pelo menos parte do gene ou por rompimento do gene, pelo que neste contexto o termo gene também inclui qualquer sequência não de codificação a montante ou a jusante da sequência de codificação, cuja deleção (parcial) ou inativação resulta em uma redução da expressão de atividade da aldose redutase não específica na célula hospedeira.

[0084] Uma sequência de nucleotídeo codificando uma aldose redutase cuja atividade deve ser reduzida na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo com atividade da aldose redutase.

[0085] Nas células hospedeiras da invenção, a modificação genética que reduz a atividade da aldose redutase não específica na célula hospedeira pode ser combinada com qualquer uma das modificações aumentando o fluxo da via da pentose fosfato e/ou com qualquer uma das modificações aumentando a atividade de xilulose quinase específica nas células hospedeiras como descrito acima. Isto não é, no entanto, essencial.

[0086] Assim, uma célula hospedeira da invenção, compreendendo apenas uma modificação ou modificações genéticas que reduzem a atividade da aldose redutase não específica na célula hospedeira, é incluída especificamente 5 na invenção.

[0087] A enzima "aldose redutase" (EC 1.1.1.21) é aqui definida como qualquer enzima que seja capaz de reduzir a xilose ou xilulose em xilitol. No contexto da presente invenção, uma aldose redutase pode ser qualquer aldose redutase não específica que seja nativa (endógena) em uma célula hospedeira da invenção e que seja capaz de reduzir a xilose ou xilulose em xilitol. As aldose redutases não específicas catalisam a reação: aldose + NAD(P)H + H+ <-> alditol + NAD(P)+

[0088] A enzima tem uma ampla especificidade e também é conhecida como aldose redutase; poliol desidrogenase (NADP+); alditol:NADP oxidorredutase; alditol:NADP+ 1-oxidorredutase; NADPH-aldopentose redutase; ou NADPH-aldose redutase.

[0089] Um exemplo particular de tal aldose redutase não específica que é endógena a S. cerevisiae e que é codificada pelo gene GRE3 (Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74). Assim, uma aldose redutase da invenção pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácido. Da mesma forma, uma aldose redutase pode ser definida pela sequência de nucleotídeos codificando a enzima assim como por uma sequência de nucleotídeo hibridizando uma sequência de nucleotídeo de referência codificando uma aldose redutase.

[0090] Uma célula da invenção pode ser adaptada à utilização de xilose pela seleção de mutantes, seja espontânea ou induzida (por exemplo, pela radiação ou por produtos químicos), para o crescimento em xilose, 5 preferivelmente em xilose como única fonte de carbono e mais preferivelmente sob condições anaeróbicas. A seleção de mutantes pode ser realizada por técnicas incluindo a passagem serial de culturas como, por exemplo, descrito por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664) ou pelo cultivo sob pressão seletiva em uma cultura no quimiostato. Em uma célula hospedeira preferida da invenção, pelo menos uma das modificações genéticas, como descrito acima, incluindo as modificações obtidas pela seleção de mutantes, conferem à célula hospedeira a capacidade de crescer em xilose como fonte de carbono, preferivelmente como única fonte de carbono e, preferivelmente, sob condições anaeróbicas. Preferivelmente, a célula hospedeira modificada produz essencialmente nenhum xilitol, por exemplo, o xilitol produzido está abaixo do limite de detecção ou, por exemplo, menos do que cerca de 5, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,5 ou cerca de 0,3 % do carbono consumido em uma base molar.

[0091] Uma célula da invenção pode ter a capacidade de crescer em xilose como única fonte de carbono em uma taxa de pelo menos cerca de 0,05, cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,25 ou cerca de 0,3 h-1 sob condições aeróbicas ou, se aplicável, em uma taxa de pelo menos cerca de 0,03, cerca de 0,05, cerca de 0,07, cerca de 0,08, cerca de 0,09, cerca de 0,1, cerca de 0,12, cerca de 0,15 ou cerca de 0,2 h-1 sob condições anaeróbicas.

Preferivelmente, a célula hospedeira modificada tem a capacidade de crescer em uma mistura de glicose e xilose (em uma razão em peso de 1:1) como única fonte de carbono em uma taxa de pelo menos cerca de 0,05, cerca de 0,1, 5 cerca de 0,2, cerca de 0,25 ou cerca de 0,3 h-1 sob condições aeróbicas ou, se aplicável, em uma taxa de pelo menos cerca de 0,03, cerca de 0,05, cerca de 0,1, cerca de 0,12, cerca de 0,15, ou cerca de 0,2 h-1 sob condições anaeróbicas.

[0092] Uma célula da invenção pode ter uma taxa de consumo de xilose específica de pelo menos cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 346, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 750, ou cerca de 1000 mg de xilose/g de células/h. Uma célula da invenção pode ter um rendimento de produto de fermentação (tal como etanol) em xilose que é pelo menos cerca de 40, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 98 ou cerca de 99% do rendimento da célula hospedeira do produto de fermentação (tal como etanol) em glicose. Mais preferivelmente, o rendimento de um produto de fermentação (tal como etanol) de uma célula da invenção em xilose pode ser igual ao rendimento da célula do produto de fermentação (tal como etanol) em glicose. Da mesma forma, o rendimento da biomassa da célula em xilose pode ser pelo menos cerca de 40, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 98 ou cerca de 99% do rendimento da biomassa da célula hospedeira em glicose. Mais preferivelmente, o rendimento da biomassa da célula em xilose, pode ser igual ao rendimento da biomassa da célula hospedeira em glicose. Entende-se que na comparação de rendimentos em glicose e xilose, ambos os rendimentos são comparados sob condições aeróbicas ou ambos sob condições anaeróbicas. 5 [0093] Uma célula da invenção pode ser capaz de usar a arabinose. Uma célula da invenção pode, portanto,ser capaz de converter a L-arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, um dos mencionados aqui.

[0094] Os organismos, por exemplo, cepas de S. cerevisiae, capazes de produzir o etanol de L-arabinose podem ser produzidos pela modificação de uma célula que introduz os genes de araA (L-arabinose isomerase), araB (L- ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de uma fonte adequada. Tais genes podem ser introduzidos em uma célula da invenção a fim de ser capz de usar a arabinose. Tal abordagem é descrita em WO2003/095627.

[0095] Uma célula da invenção pode ser uma célula adequada para a produção de etanol. Uma célula da invenção pode, no entanto, ser adequada para a produção de produtos de fermentação outros que não o etanol. Tais produtos de fermentação não etanólicos incluem em princípio qualquer produto químico volumoso ou fino que seja produzível por um micro-organismo eucariótico tal como uma levedura ou um fungo filamentoso.

[0096] Tais produtos de fermentação podem ser, por exemplo, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno,

glicerol, antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina. Uma célula hospedeira modificada preferida da invenção para a produção de produtos de fermentação não etanólicos é uma célula hospedeira que contém uma modificação genética que 5 resulta em atividade diminuída de álcool desidrogenase.

[0097] Em um aspecto adicional, a invenção refere- se a processos de fermentação nos quais as células hospedeiras modificadas da invenção são usadas para a fermentação de uma fonte de carbono compreendendo uma fonte de xilose, tal como xilose. Em adição a uma fonte de xilose, a fonte de carbono no meio de fermentação também pode compreender uma fonte de glicose. A fonte de xilose ou glicose pode ser a xilose ou glicose como tal ou pode ser qualquer carboidrato oligo- ou polímero compreendendo unidades de xilose ou glicose, tais como, por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido e os similares. Para a liberação de unidades de xilose ou glicose de tais carboidratos, carbohidrases apropriadas (tais como as xilanases, glucanases, amilases e os similares) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser construída geneticamente para produzir e excretar tais carbohidrases. Uma vantagem adicional de usar as fontes de oligo ou poliméricas da glicose é que ela possibilita manter uma baixa (mais baixa) concentração de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, pelo uso de quantidades limitantes da taxa das carbohidrases. Isto, por sua vez, impedirá a repressão de sistemas necessaries ao metabolismo e transporte de açúcares não glicose tais como a xilose.

[0098] Em um processo preferido, a célula hospedeira modificada fermenta ambas a xilose e a glicose, preferivelmente simultaneamente em cujo caso preferivelmente uma célula hospedeira modificada é usada a 5 qual é insensível à repressão da glicose para impedir o crescimento diáuxico. Em adição a uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação compreenderá ainda o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula hospedeira modificada. As composições dos meios de fermentação para o crescimento de micro-organismos tais como leveduras são bem-conhecidos na técnica. O processo de fermentação é um processo para a produção de um produto de fermentação tal como, por exemplo, etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama, tais como Penicilina G ou Penicilina V e derivados fermentativos dos mesmos e uma cefalosporina.

[0099] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbica ou anaeróbica. Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos do que cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, mais preferivelmente 0 mmol/L/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem como ambos doador de elétrons e aceptor de elétrons. Na ausência de oxigênio, o

NADH produzido em glicólise e na formação da biomassa não pode ser oxidado pela fosforilação oxidativa. Para solucionar este problema, muitos micro-organismos usam o piruvato ou um de seus derivados como um aceptor de 5 elétrons e hidrogênio dessa forma regenerando NAD+.

[00100] Assim, em um processo de fermentação anaeróbica preferido, o piruvato é usado como um aceptor de elétrons (e hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação tais como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina.

[00101] O processo de fermentação é preferivelmente executado em uma temperatura que é ideal para a célula hospedeira modificada. Assim, para a maioria das leveduras ou células hospedeiras fúngicas, o processo de fermentação é realizado em uma temperatura que é menor do que cerca de 42oC, preferivelmente menor do que cerca de 38oC. Para a levedura ou células fúngicas filamentosas hospedeiras, o processo de fermentação é preferivelmente realizado em uma temperatura que é menor do que cerca de 35, cerca de 33, cerca de 30 ou cerca de 28oC e em uma temperatura que é maior do que cerca de 20, cerca de 22 ou cerca de 25oC.

[00102] Um processo preferido é um processo para a produção de um etanol, pelo que o processo compreende as etapas de: (a) fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula hospedeira modificada como definido acima, pelo que a célula hospedeira fermenta a xilose em etanol; e opcionalmente, (b) recuperação do etanol. O meio de fermentação também pode compreender uma fonte de glicose que também é fermentada em etanol. No processo, a produtividade volumétrica do etanol é preferivelmente pelo menos cerca de 0,5, cerca de 1,0, cerca de 1,5, cerca de 5 2,0, cerca de 2,5, cerca de 3,0, cerca de 5,0 ou cerca de 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento do etanol em xilose e/ou glicose no processo preferivelmente é de pelo menos cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95 ou cerca de 98%. O rendimento de etanol é aqui definido como uma porcentagem do rendimento máximo teórico.

[00103] A invenção também se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação, tal como um produto selecionado do grupo consistindo em butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3- propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina. O processo preferivelmente compreende a fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula hospedeira modificada como definido aqui acima, pelo que a célula hospedeira fermenta a xilose no produto de fermentação.

[00104] A invenção também provê um processo para a produção de um produto de fermentação, tal como um produto selecionado do grupo consistindo em etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3- propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina. O processo preferivelmente compreende a fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de L-arabinose com uma célula como definido acima que é capaz de usar ambas a xilose e a L- 5 arabinose tal que a célula fermenta a xilose e a L- arabinose no produto de fermentação.

[00105] A invenção também provê um processo para a produção de um produto de fermentação, tal como um produto selecionado do grupo consistindo em etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3- propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina. O processo preferivelmente compreende a fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de L-arabinose com uma célula como definido acima e uma célula capaz de usar a L-arabinose, pelo que cada célula fermenta a xilose e/ou arabinose no produto de fermentação.

[00106] Um processo da invenção também pode compreender a recuperação do produto de fermentação. O meio com o qual o processo é realizado também pode conter uma fonte de glicose.

[00107] O processo de acordo com a presente invenção pode ser executado sob condições aeróbicas e anaeróbicas. Preferivelmente, o processo é realizado sob condições microaerofílicas ou limitadas a oxigênio.

[00108] Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos do que cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, e em que moléculas orgânicas servem como ambos doador de elétrons e aceptores de elétrons. 5 [00109] Um processo de fermentação limitado a oxigênio é um processo no qual o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás que entra assim como as propriedades de transferência de massa/mistura atuais do equipamento de fermentação usado. Preferivelmente, em um processo sob condições limitadas a oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é pelo menos cerca de 5,5, mais preferivelmente pelo menos cerca de 6, tal como pelo menos 7 mmol/L/h.

[00110] Os exemplos a seguir ilustram a invenção:

EXEMPLOS Técnicas Gerais de Biologia Molecular

[00111] A menos que especificado o contrário, os métodos usados são técnicas bioquímicas padrão. Exemplos de manuais de metodologia geral adequados incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

[00112] Experimentos de crescimento foram realizados seja no meio Verduyn (Verduyn, 1992) ou no meio YEPh (10 g/l de extrato de levedura, 20 g/l de fitona), suplementado com açúcares como indicado nos exemplos. Para o meio sólido YEPh, 20 g/l de ágar foram adicionados ao meio líquido antes da esterilização.

Tranformação de células de levedura com DNA circular

[00113] A transformação de levedura foi feita de acordo com o método descrito por Chen et al (Current Genetics (1992), Volume 21, Number 1, 83-84) no caso do DNA 5 de plasmídeo. Tranformação de células de levedura com fragmentos de DNA linear por eletroporação

[00114] As células de levedura foram cultivadas pela inoculação de 25 ml de meio YEPh contendo 2% de glicose com uma colônia de levedura única. O frasco foi incubado durante a noite a 30°C, 280 rpm.

[00115] A densidade óptica a 600 nm foi determinada e a quantidade necessária para obter uma densidade óptica de 0,2 foi transferida para o meio YEPh de 100 ml com 2% de glicose. As células foram cultivadas por 4 a 5 horas a 30°C, 280 rpm, a fim de alcançar um densidade óptica de aproximadamente 1,2 a 1,3, o que corresponde a 2 a 3 gerações. As células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em 28 ml de TE (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5). 3 ml de uma solução a 1M de LiAC (ajustada em pH 7,5 com HAc diluído) foram adicionados. As células foram agitadas gentilmente emu ma incubadora giratória (150 rpm, 30°C) por 45 minutos. Após a adição de 500 µl de uma solução a 1M de DTT (ditiotreitol), as células foram incubadas uma vez mais sob estas condições por 15 minutos. O volume foi constituído até 100 ml com água gelada estéril milliQ. As células foram coletadas por centrifugação.

[00116] O sobrenadante foi descartado e as células peletizadas foram lavadas com 50 ml de água gelada estéril milliQ e coletadas por centrifugação. Um tratamento de lavagem subsequente foi feito com 30 ml de uma solução de sorbitol a 1M gelada. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pélete da célula foi ressuspenso em 4 ml de uma solução de sorbitol a 1M gelada. Após a 5 centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pélete da célula foi ressuspenso em 300 µl de uma solução de sorbitol a 1M gelada.

[00117] Para cada transformação, 40 µl da suspensão celular foram transferidos para dentro de tubos gelados Eppendorf. O DNA transformante e 5 µg de DNA de esperma de salmão (como DNA veículo) foram adicionados juntos em um volume máximo de 20 µl. O DNA deve ser dissolvido em TE. O tubo Eppendorf foi tapado cuidadosamente a fim de misturar o conteúdo gentilmente. Subsequentemente, o conteúdo foi transferido para uma cuba de eletroporação pré-resfriada (em gelo) com uma folga de 0,2 cm e um pulso (usando, por exemplo, um dispositivo de eletroporação BioRad) a 1,5 kV, 200 Ohm e 25µF foi aplicado. O tempo de pulso deve ser em torno de 5 ms.

[00118] As células foram transferidas imediatamente para 200 µl a 1M sorbitol. Subsequentemente, 4 ml de YEPh 2% de glicose foram adicionados e a suspensão celular foi incubada a 30°C por 1 hora. Após esta hora, as células foram coletadas por centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pélete ressuspenso em 4 ml de sorbitol a 1M. As células foram novamente coletadas por centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pélete ressuspenso em 300 µl de sorbitol a 1M. As células foram diluídas como apropriado e usadas nos meios seletivos. Produção de Etanol

[00119] Pré-culturas foram preparadas pela inoculação de 25 ml de meio Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) suplementado com 2% de glicose em um frasco de agitação de 100 ml com uma cultura de estoque 5 congelada ou uma colônia única de uma placa de ágar. Após a incubação a 30°C em uma agitador orbital (280 rpm) por aproximadamente 24 horas, esta cultura foi coletada e usada para a determinação de evolução de dióxido de carbono e experimentos de produção de etanol.

[00120] Os cultivos para a produção de etanol foram realizados a 30°C em 100 ml de meio de modelo sintético (meio Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) com 5% de glicose, 5% de xilose, 3,5% de arabinose, 1% de galactose e 0,5% de manose) no BAM (Biological Activity Monitor, Halotec, the Netherlands). O pH do meio foi ajustado a 4,2 com 2 M NaOH/H2SO4 antes da esterilização. O meio sintético para o cultivo anaeróbico foi suplementado com 0,01 g/l de ergosterol e 0,42 g/l de Tween 80 dissolvido em etanol (Andreasen e Stier. J. Célula Physiol. 41:23-36, 1953; e Andreasen and Stier. J. Cell Physiol. 43:271-281, 1954). O meio foi inoculado em uma OD600 inicial de aproximadamente 2. As culturas foram agitadas por um agaitador magnético. As condições anaeróbicas foram desenvolvidas rapidamente durante a fermentação à medida que as cultures não foram aeradas. A produção de dióxido de carbono foi monitorada constantemente. A conversão do açúcar e a formação do produto (etanol, glicerol) foram analisadas por NMR. O crescimento foi monitorado seguindo a densidade óptica da cultura a 600nm em espectrofotômetro LKB Ultrospec K.

Exemplo 1 Construção de vetor de expressão de xilose isomerase

[00121] Um gene xylA otimizado por par de códons 5 sintéticos foi projetado com base na sequência de aminoácido principal e sintetizado por GeneArt (Regensburg, Germany). A otimização por par de códons foi realizada como descrito anteriormente (WO2008000632). A sequência de nucleotídeo está incluída aqui como SEQ ID NO 1, a sequência de aminoácido correspondente como SEQ ID NO 2.

[00122] O quadro aberto de leitura foi clonado no vetor de transferência de levedura p427-TEF (figura 1; DualSystems Biotech, Schlieren, Switzerland) usando as enzimas de restrição Spel e Xmal.

[00123] O plasmídeo foi chamado de pPWT215. Exemplo 2 Tranformação de BIE104P1 com pPWT215

[00124] Uma cepa de S. cerevisiae, BIE104P1 (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2 GRE3::[TPI1p-TAL1_ADH1p- TKL1_PGI1p-RPE1_ENO1p-RKI1]) como descrito em WO2009109633, no qual o gene GRE3 foi substituído pelos genes da parte não oxidativa da via da pentose fosfato foi transfromada com o plasmídeo pPWT215, usando o método de transformação de levedura de uma etapa descrito por Chen et al (1992). Como um controle negativo, milliQ foi usado. O pélete final do procedimento de transformação foi ressuspenso em 1ml de YEPh 2% de glicose (vide acima). 50 µl desta mistura de transformação foram plaqueados em uma placa de ágar YEPh suplementado com 2% de glicose e 200 µg de G418/ml. Os 950 µl restantes foram transferidos para um frasco de agitação de 100 ml contendo 25 ml de meio Verduyn, suplementado com 2% de xilose, 10 µg de G418/ml e 250 µl de uma solução Pen- Strep (Gibco/Invitrogen). Os frascos inoculados (transformação na ausência de plasmídeo e transformação de 5 plasmídeo) foram incoculados em um agitador giratório a 30°C e 280 rpm. A densidade óptica foi seguida em tempo. Exemplo 3 Experimento de crescimento

[00125] A progressão do experimento de crescimento após a transformação é mostrada na figura 2.

[00126] Durante os primeiros dez dias do experimento de crescimento, a densidade óptica a 600 nm das culturas dificilmente aumentou. Após 20 dias (indicado com "1" na figura 2), a densidade óptica da cultura de célula transformada com plasmídeo alcançou um valor maior do que

20. Subsequentemente, uma quantidade da cultura foi transferida para uma alíquota fresca de 25 ml de meio Verduyn contendo 2% de xilose, 10 µg de G418/ml e 250µl de Pen-Strep. Como é claro da figura 2, 4 transferências foram feitas. O experimento de crescimento foi realizado na presença de ar, exceto pela última cultura, após a quarta transferência, que foi realizada em um frasco de agitação com um borbulhador (condições anaeróbicas).

[00127] Da figura 2 pode ser concluído que as células de levedura de cepa BIE104P1 transformada com pPWT215 ganharam a capacidade de utilizar a xilose como um único carbono e fonte de energia, enquanto as células de levedura da mesma cepa, transformadas na ausência de plasmídeos, não mostraram um aumento na densidade óptica, portanto, não puderam crescer em xilose. Exemplo 4

Construção de uma célula de fermentação de pentose

[00128] A cepa de S. cerevisae BIE292 é um derivado de cepa BIE201. A construção desta cepa foi descrita em PCT/EP2011/056242, exemplo 7. Este é o resultado de uma 5 retrocruzamento da cepa BIE201, uma cepa que é otimizada pela transformação e evolução adaptativa para a fermentação eficiente da arabinose e sua origem antes da evolução adaptativa, cepa BIE104A2P1a. A cepa BIE292 expressa os genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum e os genes da via não oxidativa da pentose fosfato TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 constitutivamente e o gene GRE3 codificando aldose redutase foi deletado. Além disso, o BIE292 tem uma amplificação deste cassete de arabinose no cromossoma VII e o SNP no gene GAL80 (mudança de nucleotídeo A436C, onde o A do códon de partida ATG é 1).

[00129] Subsequentemente, a cepa BIE292 foi transformada com fragmentos de PCR do gene xylA otimizado para o par de códon, incluindo o promotor e sequências terminadoras, flanqueados com 100 bp de regiões de sobreposição para sequências Ty1 no genoma. O cassete de expressão xylA foi amplificado por PCR usando pPWT215 como um padrão. A reação de PCR foi realizada com as sequências iniciadoras SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 usando a polimerase de DNA Phusion (Finnzymes) usando as instruções do fornecedor. O cassete de expressão amplificado foi etanol precipitado e armazenado a -20°C antes de usar.

[00130] O DNA precipitado foi coletado por centrifugação e o pélete de DNA foi lavado com 70% de etanol e subsequentemente seco a ar. O DNA foi dissolvido emu ma concentração de aproximadamente 1 µg de DNA/µl no tampão de TE.

[00131] A cepa de levedura BIE292 foi desenvolvida em meio YEPh contendo 2% de glicose. As células competentes 5 foram preparadas para a eletroporação, como descrito acima. As células eletrocompetentes foram transformadas com 20 µg de produto de PCR. Como um controle negativo, a água milliQ foi usada.

[00132] As misturas de transformação da transformação de xylA e na ausência de plasmídeo foram diretamente transferidas a 4 frascos de agitação diferentes cada uma contendo 25 ml de meio Verduyn suplementado com 2% de xilose e 250µl de pen/strep. Como nenhum marcador de seleção dominante é usado, a seleção de transformantes corretos na placa após a transformação não foi realizada.

[00133] Os oito frascos de agitação foram incubados em um agitador giratório a 30°C e 280 rpm. O crescimento foi monitorado pela medição da densidade óptica a 600 nm frequentemente. Exemplo 5 Seleção e caracterização de uma cepa de levedura de fermentação da pentose

[00134] Se a cultura descrita no exemplo 4 alcançar uma densidade óptica a 600 nm maior do que 15, uma alíquota de 250 µl é transferida para um frasco contendo meio Verduyn suplementado com 2% de xilose. A densidade óptica a 600 nm é monitorada frequentemente. A taxa de crescimento é determinada com o uso dos dados de densidade óptica.

[00135] Após vários ciclos de inoculação em meios contendo xilose, o meio Verduyn contendo 2% de arabinose como uma fonte de carbono está sendo usado, a fim de manter a pressão seletiva na utilização da arabinose. Da mesma forma, um frasco contendo meio Verduyn suplementado com uma mistura de hexoses (isto é, glicose, galactose e/ou manose) 5 e pentoses (isto é, arabinose e/ou xilose) é usado. Os experimentos de cultura são inicialmente realizados sob condições aeróbicas, mas são subsequentemente realizados sob condições anaeróbicas, por exemplo, quando a taxa de crescimento excede um valor de cerca de 0,07 por hora ou mais alto, am ambas arabinose e xilose.

[00136] Após vários ciclos de crescimento e reinoculação sob condições anaeróbicas, uma alíquota das culturas é diluída a cerca de 100 - 1000 de unidades de formação de colônia (CFU) por mililitro e subsequentemente alíquotas de 10 - 100 µl são plaqueadas em placas de ágar YEPh contendo 2% de glicose. As placas são incubadas por pelo menos 48 horas a 30°C ou até colônias únicas serem visíveis.

[00137] Os isolados de colônia única são testados no BAM (vide supra). Os isolados de colônia únicos são selecionados na base da capacidade de fermentar todos os cinco açúcares eficientemente, como é inferido do perfil de dióxido de carbono e os dados de NMR dos açúcares, etanol e subprodutos.

[00138] As melhores cepas são caracterizadas por técnicas de biologia molecular e genética conhecidas por aqueles versados na técnica, tal como PCR, Southern blot(s), FIGE e ressequenciamento. Exemplo 6

Seleção e caracterização de uma cepa de levedura de fermentação da pentose

[00139] Quando a cultura descrita no exemplo 4 alcançou uma densidade óptica a 600nm maior do que 10, uma 5 alíquota de 25 µl foi transferida para um frasco de agitação contendo meio Verduyn suplementado com 2% de xilose. A densidade óptica foi monitorada frequentemente e a taxa de crescimento foi determinada com o uso destes dados. Quando a cultura alcançou uma densidade óptica a 600 nm maior do que 15, a alíquota da cultura foi transferida para um frasco de agitação contendo o meio Verduyn suplementado com 2% de xilose e o frasco de agitação foi fechado com um borbulhador que permite a cultura anaeróbica. Deste ponto, as incubações foram realizadas em um agitador orbital a 30°C e 100 rpm. O crescimento da cultura foi monitorado pela medição da densidade óptica a 600 nm e a taxa de crescimento foi calculada com base nestes dados. Quando a densidade óptica a 600 nm da cultura alcançou um valor maior do que 3,75, uma alíquota da cultura foi transferida para um frasco de agitação contendo o meio Verduyn suplementado com 2% de arabinose. O frasco de agitação foi fechado com um borbulhador. No caso da cultura alcançar uma densidade óptica a 600 nm com um valor maior do que 5, uma alíquota da cultura foi novamente transferida para um frasco de agitação contendo meio Verduyn suplementado com 2% de xilose e este frasco de agitação foi fechado com um borbulhador. Um resultado típico deste experimento de crescimento é dado na figura 3.

[00140] Como é claro da figura 3, a tranformação de BIE292 com XylA de Clostridium beyerinckii possibilitou que a cepa obtivesse rapidamente um fenótipo com consumo de xilose, enquanto a transformação na ausência de plasmídeo não resultou nas células com consumo de xilose.

[00141] A tabela 1 apresenta as taxas de crescimento 5 de cepas de S. cerevisiae transformadas com genes de xilose isomerase de vários organismos. A cepa BIE292XI(C. beyerinckii) demonstrou a maior taxa de crescimento sob condições aeróbicas após o crescimento inicial em xilose como única fonte de carbono após a transformação. Em adição, BIE292XI(C. beyerinckii) foi a única cepa capaz de crescer em xilose sob condições anaeróbicas sem crescimento genético evolutivo extensivo. Tabela 1: Taxas de crescimento de BIE292XI(C. beyerinckii) e dados disponíveis publicamente de cepas de Saccharomyces cerevisiae transformadas com XI de Clostridium phytofermentans (ref. 1), Orpinomyces (ref. 2), Piromyces (RWB202) (ref. 3), e Thermus thermophilus (ref. 4), após o crescimento inicial em xilose. Xilose isomerase Aeróbico Anaeróbico C. beyerincki 0,061 h-1 0,056 h-1 C. phytofermentans 0,039 h-1 -- Orpinomyces 0,01 h-1 -- Piromyces 0,005 h-1 -- T. thermophilus -- --

[00142] Os dados apresentados na tabela acima são todos obtidos a partir de diferentes bases de célula. - indica não medido ou não testado. Para a cepa de S. cerevisiae abrigando XI de T. Thermophilus nota-se que o consumo de xilose foi observado, mas os níveis de consumo foram baixos demais para suportar o crescimento.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma xilose isomerase, em que a sequência de aminoácido da xilose 5 isomerase tem pelo menos 75% de identidade de sequência em relação à sequência de aminoácido definida na SEQ ID NO: 2 e em que a sequência de nucleotídeo é heteróloga ao hospedeiro.

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma célula de levedura.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeo codificando a xilose isomerase é obtenível da célula do gênero Clostridium.

4. Célula, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que é uma célula de levedura do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Klockera, Schwanniomyces ou Yarrowia.

5. Célula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura é da espécie S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis.

6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a célula compreende uma ou mais modificações genéticas resultando em: a. um aumento no transporte de xilose na célula; b. um aumento na atividade de xilulose quinase;

c. um aumento no fluxo através da via da pentose fosfato; d. uma diminuição na atividade da aldose redutase; e. uma diminuição na sensibilidade à repressão por 5 catabólito; f. um aumento na tolerância ao etanol, osmolaridade ou ácidos orgânicos ou; g. uma produção reduzida de subprodutos.

7. Célula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais modificações genéticas resultam na superexpressão de pelo menos um gene codificando uma enzima da parte não oxidativa da via da pentose fosfato.

8. Célula, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o gene é um gene codificando uma ribulose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase, uma transcetolase ou uma transaldolase.

9. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais modificações genéticas resultam na superexpressão de um gene codificando uma xilulose quinase.

10. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais modificações genéticas resultam em uma diminuição na atividade da aldose redutase não específica na célula.

11. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que tem a capacidade de usar L-arabinose, em que os genes TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 são superexpressos.

12. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizada pelo fato de que a região de codificação do gene GRE3 é inativada pela substituição da região de codificação com uma sequência de 5 nucleotídeo compreendendo os genes TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1.

13. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizada pelo fato de que os genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum são expressos.

14. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizada pelo fato de que uma ou mais genes constitutivamente expressos ou constitutivamente superexpressos são estavelmente integrados no genoma da célula.

15. Processo para a produção de um produto de fermentação, o processo caracterizada pelo fato de que compreende a fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, tal que a célula fermenta a xilose no produto de fermentação.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o produto de fermentação é etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o processo é anaeróbico.