BR112014012963A2

BR112014012963A2 - cepas de leveduras modificadas para produzir etanol a partir de ácido acético e glicerol

Info

Publication number: BR112014012963A2
Application number: BR112014012963-0A
Authority: BR
Inventors: Johannes Adrianus Maria De Bont; Aloysius Wihelmus Rudolphus Hubertus Teunissen; Paul Klaassen; Wouter Willem Antonius Hartman; Van Beusekon
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-11-26
Publication date: 2020-10-20
Also published as: WO2013081456A3; MX2014006446A; MY169074A; BR112014012963B8; EP3321368A2; WO2013081456A2; BR112014012963B1; CA2857247A1; US9988649B2; AU2012346662B2; CA2857247C; CN104126011B; CN107189954A; JP2015504309A; EA201491056A1; EA201491056A8; EP3321368A3; ES2648865T3; US20180251798A1; DK2785849T3

Abstract

cepas de leveduras modificadas para produzir etanol a partir de ácido acético e glicerol. a presente invenção refere-se a processos para a produção de etanol a partir de hidrolisados lignocelulósicos compreendendo hexoses, pentoses e ácido acético, em que são utilizadas células de levedura geneticamente modificadas que compreendem um gene exógeno que codifica um acetaldeído desidrogenase e um gene bacteriano que codifica uma enzima com atividade de glicerol desidrogenase ligada a nad+. o processo é ainda caracterizado pelo fato do glicerol estar presente ou ser alimentado ao meio de cultura no qual a célula de levedura modificada fermenta as hexoses, pentoses, ácido acético e glicerol em etanol. a invenção refere-se ainda a células de levedura para utilização em tais processos. as células de levedura vantajosamente compreendem modificações genéticas que melhoram a utilização de glicerol, tal como modificações que aumentam uma ou mais da atividade de dihidroxiacetona quinase e transporte de glicerol para dentro da célula. a célula de levedura, mais preferencialmente, compreende um gene exógeno funcional de xilose isomerase e/ou genes exógenos funcionais que conferem à célula a capacidade de converter l-arabinose em d-xilulose-5-fosfato e que podem compreender uma modificação genética que aumenta a atividade de acetil-coa sintetase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL, BEM COMO CÉLULA DE LEVEDURA E SEU USO”.

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se à engenharia metabólica em microrganismos, tais como leveduras. Em particular, a invenção refere-se a cepas de leveduras que tenham sido modificadas para produzir etanol a partir de ácido acético e de glicerol. Além do ácido acético e de glicerol, a cepa de levedura pode também consumir hexoses e pentoses para a produção de etanol. A invenção refere-se ainda aos processos em que as cepas modificadas da invenção produzem etanol a partir de ácido acético e de glicerol.

Antecedentes da invenção

[002] Bioetanol de segunda geração é produzido a partir de, por exemplo, frações lignocelulósicas de biomassa de plantas, que são hidrolisadas em açúcares monoméricos livres, como hexoses e pentoses, para a fermentação em etanol. Hidrolisados lignocelulósicos contêm grandes quantidades de ácido acético, que é um potente inibidor das capacidades de fermentação dos microrganismos utilizados para a produção de etanol, tais como leveduras.

[003] Sonderegger et al. (2004, Appl Environ Microbiol 70: 2892-2897) descrevem a expressão heteróloga de fosfotransacetilase e de acetaldeído desidrogenase na cepa de Saccharomyces cerevisiae fermentadora de xilose. Em combinação com a fosfoquetolase nativa, Sonderegger et al.

criaram assim uma via funcional de fosfoquetolase que é capaz de reoxidação completa do NADH gerado pela expressão heteróloga de uma xilose redutase e xilitol desidrogenase, que são utilizadas para a utilização de xilose na cepa.

[004] Guadalupe et al. (2009, Appl. Environ.

Microbiol. doi:10.1128/AEM.01772-09) descrevem uma cepa de Saccharomyces cerevisiae em que a produção do subproduto glicerol é eliminada por disrupção dos genes endógenos de glicerol-3-fosfato desidrogenase dependentes de NAD (GPD1 e GPD2). A expressão do gene E. coli mhpF, que codifica para a acetaldeído desidrogenase de acetilação dependente de NAD restaurou a capacidade da cepa com disrupção de GPD de crescer anaerobicamente por suplementação do meio com ácido acético.

[005] Yu et al. (2010, Bioresour. Technol.

101(11):4157-61. Epub 2010 Feb 9) divulgam cepas de Saccharomyces cerevisiae metabolicamente projetadas para uma melhor produção de etanol a partir de glicerol por superexpressão simultânea de glicerol desidrogenase (GCY), dihidroxiacetona quinase (DAK) e a proteína de transporte de glicerol (GUP1).

[006] Lee e Dasilva (2006, Metab Eng. 8(1):58-65) revelam a levedura Saccharomyces cerevisiae modificada para produzir 1,2-propanodiol a partir de glicerol pela introdução inter alia da expressão dos genes mgs e gldA de Escherichia coli.

[007] É um objeto da presente invenção proporcionar leveduras que são capazes de produzir etanol a partir de ácido acético e de glicerol (e hexoses e pentoses), bem como os processos em que estas cepas são utilizadas para a produção de etanol e/ou outros produtos de fermentação.

Descrição da invenção Definições

[008] A identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucleico (polinucleotídeo), tal como determinado por comparação das sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relacionamento das sequências entre as sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, conforme o caso, como determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências. "Semelhança" entre duas sequências de aminoácidos é determinada através da comparação da sequência de aminoácidos e dos seus substitutos de aminoácidos conservados de um polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo. "Identidade" e "semelhança" podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos. Os termos "identidade de sequência" ou "similaridade de sequência" significam que duas sequências de (poli)peptídeo ou de nucleotídeos, quando otimamente alinhadas, de preferência, ao longo de todo o comprimento (de pelo menos o da sequência mais curta em comparação) e maximizando o número de correspondências e minimizando o número de lacunas, como pelos programas ClustalW (1.83), GAP ou

BESTFIT usando parâmetros padrão, partilham pelo menos uma certa percentagem de identidade de sequência, tal como definido neste documento.

GAP usa o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências ao longo de toda sua extensão, maximizando o número de correspondências e minimizando o número de lacunas.

Geralmente, os parâmetros padrão GAP são usados,

com uma penalidade de criação de lacunas = 50

(nucleotídeos)/8 (proteínas) e penalidade de extensão de lacunas = 3 (nucleotídeos)/2 (proteínas). Para nucleotídeos a matriz de pontuação padrão usada é nwsgapdna e para as proteínas a matriz de pontuação padrão é Blosum62 (Henikoff

& Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Um programa de alinhamento múltiplo preferido para alinhar sequências de proteínas da invenção é o ClustalW (1.83), utilizando uma matriz Blosum e configurações padrão (penalidade de abertura de lacunas: 10; penalidade de extensão de lacunas:

0,05). É claro que, quando as sequências de RNA são referidas como sendo essencialmente semelhantes ou como tendo um certo grau de identidade de sequência com as sequências de DNA, a timina (T) na sequência de DNA é considerada igual a uracila (U) na sequência de RNA.

Alinhamentos de sequências e pontuações de identidade de sequência percentuais podem ser determinados utilizando programas de computador, como o GCG Wisconsin Package, versão 10.3, disponível a partir da Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EUA ou o software open-source Emboss para Windows (versão atual 2.7.1-07).

Alternativamente, percentagem de semelhança ou de identidade podem ser determinadas através da procura contra bases de dados, tais como FASTA, BLAST, etc.

[009] Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e semelhança estão codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade e semelhança entre duas sequências incluem por exemplo, o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol.

215:403-410 (1990). O programa BLAST X está disponível ao público a partir do NCBI e de outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;

Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O algoritmo bem conhecido de Smith Waterman pode também ser utilizado para determinar a identidade.

[010] Os parâmetros preferidos para a comparação de sequências de polipeptídeos incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: BLOSSUM62 de Hentikoff e Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10.915-10.919 (1992); Penalidade de lacuna: 12; e penalidade de extensão de lacuna: 4. Um programa útil com estes parâmetros está disponível ao público como o programa "Ogap" do Genetics Computer Group, localizado em Madison, WI. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros padrão para comparações de aminoácidos (junto com nenhuma penalidade para lacunas finais).

[011] Os parâmetros preferidos para a comparação de ácidos nucleicos incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: correspondências = +10, não-correspondências = 0; Penalidade de lacuna: 50; Penalidade de extensão de lacuna: 3. Disponível como o programa Gap do Genetics Computer Group, localizado em Madison, Wisconsin. São indicados acima os parâmetros padrão para comparações de ácidos nucleicos.

[012] Opcionalmente, para determinar o grau de semelhança de aminoácidos, o perito na técnica pode também ter em conta as chamadas substituições "conservativas" de aminoácidos, tal como será claro para a pessoa qualificada.

Substituições de aminoácidos conservativas referem-se à intermutabilidade de resíduos possuindo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas é o da glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas-hidroxilo é o da serina e treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo amida é o da asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas é o da fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas é o da lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre é o da cisteína e metionina. Grupos preferidos de substituição conservativa de aminoácidos são: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. As variantes de substituição da sequência de aminoácidos aqui divulgadas são aquelas em que pelo menos um resíduo nas sequências reveladas foi removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. De preferência, a alteração de aminoácidos é conservativa. As substituições conservativas preferidas para cada um dos aminoácidos que ocorrem naturalmente são as seguintes: Ala por ser; Arg por lis; Asn por gln ou his; Asp por glu; Cys por ser ou ala; Gln por asn; Glu por asp; Gli por pro; His por asn ou gln; Ile por leu ou val; Leu por ile ou val; Lis por arg; gln ou glu; Met por leu ou ile; Phe por met, leu ou tyr; Ser por thr; Thr por ser; Trp por tyr; Tyr por trp ou phe; e, Val por ile ou leu.

[013] As sequências de nucleotídeos da invenção também podem ser definidas pela sua capacidade de hibridizar com as partes de sequências de nucleotídeos específicas aqui descritas, respectivamente, sob condições de hibridação moderadas, ou de preferência sob condições de hibridação rigorosas. Condições de hibridação rigorosas são aqui definidas como as condições que permitem que uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, de preferência cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferencialmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize a uma temperatura de cerca de 65°C numa solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferencialmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável, e lavando a 65°C numa solução compreendendo cerca de 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. De preferência, a hibridação é realizada durante a noite, isto é, pelo menos durante 10 horas e de preferência a lavagem é realizada durante pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças de solução de lavagem.

Estas condições normalmente irão permitir a hibridação específica de sequências tendo cerca de 90% ou mais de identidade de sequência.

[014] Condições moderadas são aqui definidas como as condições que permitem a sequências de ácidos nucleicos de pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridizem a uma temperatura de cerca de 45°C numa solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferencialmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável, e lavando em temperatura ambiente numa solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma força iônica comparável. De preferência, a hibridação é realizada durante a noite, isto é, pelo menos durante 10 horas, e de preferência a lavagem é realizada durante pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças de solução de lavagem. Estas condições normalmente irão permitir a hibridação específica de sequências tendo até 50% de identidade de sequência. O perito na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização, de modo a identificar especificamente sequências variando em identidade entre 50% e 90%.

[015] A "construção de ácido nucleico" ou "vetor de ácido nucleico" é aqui entendido como significando uma molécula de ácido nucleico feita pelo homem, resultante do uso de tecnologia de DNA recombinante. O termo "construção de ácido nucleico", por conseguinte, não inclui moléculas de ácidos nucleicos que ocorram naturalmente, embora uma construção de ácido nucleico pode compreender (ou parte dela) moléculas de ácido nucleico que ocorram naturalmente.

Os termos "vetor de expressão" ou "construção de expressão" referem-se a sequências de nucleotídeos que são capazes de afetar a expressão de um gene em células hospedeiras ou organismos hospedeiros compatíveis com tais sequências.

Estes vetores de expressão incluem geralmente pelo menos sequências reguladoras da transcrição adequadas e, opcionalmente, sinais 3' de terminação da transcrição.

Fatores adicionais necessários ou úteis para efetuar a expressão podem também estar presentes, tais como elementos potenciadores de expressão. O vetor de expressão vai ser introduzido numa célula hospedeira adequada e ser capaz de efetuar a expressão da sequência de codificação numa cultura de células in vitro da célula hospedeira. O vetor de expressão será adequado para replicação na célula ou organismo hospedeiro da invenção.

[016] Tal como aqui utilizado, o termo "promotor" ou "sequência reguladora de transcrição" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de uma ou mais sequências de codificação, e está localizado a montante relativamente à direção de transcrição do local de iniciação da transcrição da sequência de codificação, e está estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação de RNA dependente de DNA polimerase, de sítios de iniciação de transcrição e de outras sequências de DNA, incluindo, mas não limitados a locais de ligação de fator de transcrição, locais de ligação de proteínas repressoras e ativadoras, e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidas para um perito na técnica para atuar diretamente ou indiretamente na regulação da quantidade de transcrição a partir do promotor. Um promotor "constitutivo" é um promotor que está ativo na maioria dos tecidos sob a maioria das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que é regulado fisiologicamente ou por desenvolvimento, por exemplo, pela aplicação de um indutor químico.

[017] O termo "marcador selecionável" é um termo familiar para um perito na técnica e é aqui usado para descrever qualquer entidade genética que, quando expressa, pode ser utilizada para selecionar uma célula ou células que contêm o marcador selecionável. O termo "repórter" pode ser utilizado indiferentemente com marcador, embora seja usado principalmente para se referir a marcadores visíveis, tais como a proteína fluorescente verde (GFP). Marcadores selecionáveis podem ser dominantes ou recessivos ou bidirecionais.

[018] Tal como aqui utilizado, o termo "operativamente ligado" refere-se a uma ligação de elementos polinucleotídicos numa relação funcional. Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, uma sequência reguladora da transcrição está operativamente ligada a uma sequência de codificação se afeta a transcrição da sequência de codificação.

Operacionalmente ligado significa que as sequências de DNA a serem ligadas estão tipicamente contíguas e, quando necessário para ligar duas regiões de codificação de proteínas, contíguas e em enquadramento de leitura.

[019] Os termos "proteína" ou "polipeptídeo" são utilizados de forma intercambiável e referem-se a moléculas formadas por uma cadeia de aminoácidos, sem referências a um modo de ação específico, dimensão, estrutura 3- dimensional ou origem.

[020] "Fungos" (fungo no singular) são aqui entendidos como microrganismos eucarióticos heterotróficos que digerem os alimentos externamente, absorvendo moléculas de nutrientes para dentro das suas células. Os fungos são um reino separado de organismos eucarióticos e incluem leveduras, bolores e cogumelos. Os termos fungos, fungo e fúngico, tal como aqui utilizados, inclui assim expressamente leveduras, bem como fungos filamentosos.

[021] O termo "gene" significa um fragmento de DNA compreendendo uma região (região transcrita), que é transcrita para uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) em uma célula, ligado operativamente a regiões reguladoras adequadas (por exemplo, um promotor). Um gene será normalmente constituído por diversos fragmentos operacionalmente ligados, tais como um promotor, uma sequência terminal 5', uma região codificadora e uma sequência 3' não traduzida (extremidade 3'), que compreende um local de poliadenilação. "Expressão de um gene" refere- se ao processo pelo qual uma região de DNA que está ligada operativamente a regiões reguladoras apropriadas, particularmente um promotor, é transcrita em um RNA, que é biologicamente ativo, isto é, que seja capaz de ser traduzido numa proteína biologicamente ativa ou peptídeo.

[022] O termo "homólogo" quando usado para indicar a relação entre uma dada molécula (recombinante) de ácido nucleico ou de polipeptídeo e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, é entendido como significando que, na natureza a molécula de ácido nucleico ou de polipeptídeo é produzida por uma célula hospedeira ou organismos da mesma espécie, de preferência da mesma variedade ou cepa. Se homóloga a uma célula hospedeira, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, tipicamente (mas não necessariamente) será operativamente ligada a uma outra sequência (heteróloga) de promotor e, se for o caso, uma outra sequência (heteróloga) de sinal de secreção e/ou uma sequência de terminador do que no seu ambiente natural.

Entende-se que as sequências reguladoras, sequências de sinal, sequências de terminação, etc., podem também ser homólogas à célula hospedeira. Neste contexto, o uso de apenas elementos "homólogos" de sequência permite a construção de organismos geneticamente modificados "auto- clonados" (GMOs) (auto-clonagem é aqui definido como na Diretiva Europeia 98/81/CE Anexo II). Quando utilizado para indicar o grau de relacionamento entre duas sequências de ácidos nucleicos, o termo "homólogo" significa que uma sequência de cadeia simples de ácido nucleico pode hibridar com uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples complementar. O grau de hibridização pode depender de um número de fatores, incluindo a quantidade de identidade entre as sequências e as condições de hibridização, como temperatura e concentração de sal, como discutido mais adiante.

[023] Os termos "heterólogo" e "exógeno", quando utilizados com respeito a um ácido nucleico (DNA ou RNA) ou proteína referem-se a um ácido nucleico ou proteína que não ocorre naturalmente, como parte do organismo, de células,

ou do genoma ou na sequência de DNA ou RNA em que está presente, ou que se encontra em uma célula ou um local ou locais no genoma, ou sequência de DNA ou RNA que difere daquela a qual é encontrada na natureza.

Os ácidos nucleicos ou proteínas heterólogas e exógenas não são endógenos à célula na qual são introduzidos, mas foram obtidos a partir de outra célula ou produzido sinteticamente ou de forma recombinante.

Geralmente, embora não necessariamente, estes ácidos nucleicos codificam para proteínas, ou seja, as proteínas exógenas, que normalmente não são produzidas pela célula em que o DNA é transcrito e expresso.

Similarmente RNA exógeno codifica para proteínas não normalmente expressas na célula em que o RNA exógeno estiver presente.

Os ácidos nucleicos heterólogos/exógenos e proteínas também podem ser referidos como ácidos nucleicos ou proteínas estrangeiras.

Qualquer ácido nucleico ou proteína que um perito na técnica reconhecerá como estranhos à célula na qual se expressa é aqui englobado pelo termo ácido nucleico ou proteína heteróloga ou exógena.

Os termos heterólogos e exógeno, também se aplicam a combinações não naturais de ácido nucleico ou sequências de aminoácidos, isto é, combinações onde pelo menos duas das sequências combinadas são estranhas com respeito uma à outra.

[024] A "atividade específica" de uma enzima é aqui entendida como a quantidade de atividade de uma enzima particular por quantidade de proteína total da célula hospedeira, geralmente expressa em unidades de atividade da enzima por mg de proteína da célula hospedeira total. No contexto da presente invenção, a atividade específica de uma enzima particular pode ser aumentada ou diminuída, em comparação com a atividade específica da enzima em uma (outra forma idêntica) da célula hospedeira de tipo selvagem.

[025] "Condições anaeróbicas" ou um processo de fermentação anaeróbio é aqui definido como as condições ou um processo de fermentação realizado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/ h, mais preferencialmente, 0 mmol/L/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem como dador de elétrons e aceitadores de elétrons.

Descrição detalhada da invenção

[026] A expressão de uma desidrogenase acetaldeído exógena na levedura permite que a levedura converta o ácido acético, que pode estar presente em quantidades elevadas em hidrolisados lignocelulósicos, em etanol. A redução dependente de NADH de ácido acético em etanol tem sido proposta como um substituto para a formação de glicerol como um dissipador de redox em culturas de S. cerevisiae cultivadas em glucose anaeróbia, permitindo assim uma base estequiométrica para a eliminação da produção de glicerol (como subproduto) durante produção industrial de etanol e, consequentemente, um maior rendimento de etanol (Guadalupe et al. supra). No entanto, a estequiometria destas reações é tal que a redução de uma molécula de ácido acético em etanol exigiria duas moléculas de glicerol não fossem produzidas. Os presentes inventores descobriram no entanto, que, na prática, a quantidade de ácido acético que normalmente está presente em hidrolisados lignocelulósicos industriais é tal que a quantidade de NADH necessária para que possa ser reduzido a etanol excede a quantidade de NADH que se tornam disponível a partir de se impedir a produção de glicerol em leveduras cultivadas sob condições anaeróbias. Os presentes inventores verificaram agora surpreendentemente que quantidades muito mais elevadas de ácido acético pode ser reduzido para etanol por consumo simultâneo do glicerol pela levedura, em vez de prevenir a sua produção.

[027] Grandes quantidades de glicerol são geradas como um subproduto da produção de biodiesel a partir de reações de transesterificação usando óleos vegetais ou de gorduras animais e de um álcool. Prevê-se então que a disponibilidade de glicerol em bruto deverá portanto aumentar nos próximos anos, como resultado do crescimento da produção de biodiesel em todo o mundo. Consequentemente grandes quantidades de glicerol estarão disponíveis a baixo custo. A presente invenção proporciona meios e métodos para a valorização de glicerol obtido, por exemplo, como subproduto da produção de biodiesel, convertendo-o em etanol que pode ser utilizado como biocombustível. Ao mesmo tempo, a presente invenção soluciona o problema de grandes quantidades de ácido acético que estão presentes em hidrolisados de lignocelulose e que inibem a capacidade de fermentação das leveduras produtoras de etanol a partir de tais hidrolisados. Uma outra vantagem da presente invenção é que, ao deixar a via de resposta de glicerol de alta osmolaridade intacta nas células de levedura da presente invenção (em oposição às cepas em que (todos) os genes de glicerolfosfato desidrogenase são inativados, como descrito por Guadalupe et al. supra), são obtidas cepas mais robustas de levedura que são mais capazes de lidar com o stress osmótico que pode ocorrer sob condições de fermentações industriais.

[028] Em uma primeira modalidade, a invenção refere-se a uma célula hospedeira fúngica que compreende um gene exógeno que codifica para uma enzima com a capacidade de reduzir a acetil-CoA em acetaldeído, gene que confere à célula a capacidade de converter o ácido acético em etanol.

Uma enzima com a capacidade de reduzir a acetil-CoA em acetaldeído é aqui entendido como uma enzima que catalisa a reação (ACDH; EC 1.2.1.10): acetaldeído + NAD+ + Coenzima A ↔ acetil-Coenzima A + NADH + H+

[029] Assim, a enzima catalisa a conversão de acetil- CoA em acetaldeído (e vice-versa) e é também referida como uma acetaldeído-desidrogenase (de acetilação dependente de NAD) ou de uma acetil-CoA redutase. A enzima pode ser uma enzima bifuncional que catalisa ainda a conversão de acetaldeído em etanol (e vice-versa; ver abaixo). Por conveniência, refere-se aqui a uma enzima que tem pelo menos a capacidade de reduzir a acetil-CoA em qualquer acetaldeído ou etanol como um "acetaldeído desidrogenase".

Entende-se ainda aqui que a célula hospedeira fúngica tem atividades de acetil-CoA sintetase e álcool desidrogenase endógenos que permitem a célula, sendo fornecidas com atividade acetaldeído desidrogenase, que complete a conversão do ácido acético em etanol.

[030] O gene exógeno pode codificar para uma enzima monofuncional que possui apenas atividade de acetaldeído desidrogenase (ou seja, uma enzima que tem unicamente a capacidade de reduzir a acetil-CoA em acetaldeído), tais como por exemplo, a acetaldeído desidrogenase codificada pelo gene mhpF de E. coli. Um gene exógeno adequado que codifica para uma enzima com atividade de acetaldeído desidrogenase compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% identidade de sequência de aminoácido com a SEQ ID NO: 1. Exemplos adequados de procariotas compreendendo enzimas monofuncionais com atividade de desidrogenase acetaldeído são fornecidos na Tabela 1. As sequências de aminoácidos destas enzimas monofuncionais estão disponíveis em bases de dados públicas e podem ser utilizadas pelo perito na técnica para a concepção de sequências de nucleotídeos otimizados para códons que codificam para a enzima monofuncional correspondente (ver por exemplo, SEQ ID NO: 2).

[031] Tabela 1: Enzimas com atividade de acetaldeído desidrogenase relacionadas com mhpF de E. coli Organismo Identidade de aminoácidos (%) Escherichia coli str. K12 substr. 100% MG1655 Shigella sonnei 100% Escherichia coli IAI39 99% Citrobacter youngae ATCC 29220 93% Citrobacter sp. 30_2 92% Klebsiella pneumoniae 342) 87% Klebsiella variicola 87% Pseudomonas putida 81% Ralstonia eutropha JMP134 82%

Burkholderia sp. H160 81% Azotobacter vinelandii DJ 79% Ralstonia metallidurans CH34 70% Xanthobacter autotrophicus Py2 67% Burkholderia cenocepacia J2315 68% Frankia sp. EAN1pec 67% Polaromonas sp. JS666 68% Burkholderia phytofirmans PsJN 70% Rhodococcus opacus B4 64%

[032] De preferência, a célula hospedeira compreende um gene que codifica para uma enzima exógena bifuncional com atividade de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase, gene que confere à célula a capacidade de converter o ácido acético em etanol. A vantagem de utilizar uma enzima bifuncional com atividade de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase, em oposição a enzimas separadas para cada uma das atividades de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase, é que permite a canalização direta do intermediário entre as enzimas que catalisam as reações consecutivas numa via oferecendo a possibilidade de um meio eficiente, exclusivo e protegido da entrega do metabólito. Canalização de substrato diminui portanto o tempo de trânsito de intermediários, impede a perda de intermediários por difusão, protege os intermediários instáveis dos solventes, e previne entrada de intermediários vias metabólicas competidoras. Por conseguinte, a enzima bifuncional permite uma conversão mais eficiente de ácido acético em etanol, em comparação com enzimas separadas de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase. Uma outra vantagem da utilização da enzima bifuncional é que pode também ser usada em células hospedeiras possuindo pouca ou nenhuma atividade de álcool desidrogenase sob a condição utilizada, tal como por exemplo, condições anaeróbias e/ou condições de repressão catabólica.

[033] Enzimas bifuncionais com atividade de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase são conhecidas na técnica em procariotas e os protozoários, incluindo, por exemplo as enzimas bifuncionais codificadas pelos genes adhE de Escherichia coli e ADH2 de Entamoeba histolytica (ver, por exemplo Bruchaus and Tannich, 1994, J. Biochem. 303: 743-748; Burdette and Zeikus, 1994, J.

Biochem. 302: 163-170; Koo et al., 2005, Biotechnol. Lett.

27: 505-510; Yong et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93: 6464-6469). Enzimas bifuncionais com atividade de acetaldeído desidrogenase e álcool desidrogenase são proteínas maiores que consistem de cerca de 900 aminoácidos e são bifuncionais na medida em que exibem tanto atividade de acetaldeído desidrogenase (ACDH; EC 1.2.1.10) quanto atividade de álcool desidrogenase (ADH; EC 1.1.1.1). O adhE de E. coli e o ADH2 de Entamoeba histolytica mostram uma identidade de aminoácidos de 45%. Portanto, numa forma de realização da invenção, um gene exógeno adequado que codifica para uma enzima bifuncional com atividade de acetaldeído desidrogenase e álcool desidrogenase compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência de aminoácidos com, pelo menos, uma das SEQ ID NO: 3 e 5.

Exemplos adequados de procariotas compreendendo enzimas bifuncionais com atividade de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase são apresentados nas Tabelas 2 e 3.

As sequências de aminoácidos destas enzimas bifuncionais estão disponíveis em bases de dados públicas e podem ser utilizadas pelo perito na técnica para concepção de sequências de nucleotídeos otimizados para códons que codificam para a enzima bifuncional correspondente (ver por exemplo, SEQ ID NO: 4 ou 6).

[034] Tabela 2: Enzimas bifuncionais com atividade de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase relacionadas com adhE de E. coli Organismo Identidade de aminoácidos (%) Escherichia coli str. K12 substr. MG1655 100% Shigella sonnei 100% Escherichia coli IAI39 99% Citrobacter youngae ATCC 29220 93% Citrobacter sp. 30_2 92% Klebsiella pneumoniae 342) 87% Klebsiella variicola 87% Pseudomonas putida 81% Ralstonia eutropha JMP134 82% Burkholderia sp. H160 81% Azotobacter vinelandii DJ 79% Ralstonia metallidurans CH34 70% Xanthobacter autotrophicus Py2 67%

Burkholderia cenocepacia J2315 68% Frankia sp. EAN1pec 67% Polaromonas sp. JS666 68% Burkholderia phytofirmans PsJN 70% Rhodococcus opacus B4 64%

[035] Tabela 3: Enzimas bifuncionais com atividade de acetaldeído desidrogenase e de álcool desidrogenase relacionadas com ADH2 de Entamoeba histolytica Organismo Identidade de aminoácidos (%) Entamoeba histolytica HM-1:IMSS 99% Entamoeba dispar SAW760 98% Mollicutes bacterium D7 65% Fusobacterium mortiferum ATCC 9817 64% Actinobacillus succinogenes 130Z 63% Pasteurella multocida Pm70 62% Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 61% Streptococcus sp. 2_1_36FAA] 61%

[036] A codificação do gene exógeno para a enzima bifuncional com atividade de acetaldeído desidrogenase e álcool desidrogenase, para uma enzima que possui atividade de acetaldeído desidrogenase, de preferência é uma construção de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para a enzima ligada operativamente a regiões/sequências expressão de regulação adequadas para garantir a expressão da enzima mediante transformação da construção de expressão na célula hospedeira da invenção. Assim, a construção de genes ou de expressão irá compreender, pelo menos, um promotor que é funcional na célula hospedeira operativamente ligado à sequência de codificação. O gene ou a construção pode compreender adicionalmente uma sequência terminal '5 a montante da região de codificação e uma sequência 3' não traduzida (extremidade 3') constituído por um local de poliadenilação e um local de terminação da transcrição a jusante da sequência de codificação.

[037] Num aspecto, a invenção refere-se a métodos para a preparação ou construção de células de levedura da invenção. Para este efeito, as técnicas de genética e biologia molecular convencionais que são utilizadas, são geralmente conhecidas na técnica e foram por exemplo descritas por Sambrook e Russell (2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press) e Ausubel et al. (1987, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York). Além disso, a construção de cepas mutadas de levedura hospedeira é levada a cabo por meio de cruzamentos genéticos, esporulação dos diplóides resultantes, tetra disseção dos esporos haplóides contendo os marcadores auxotróficos desejados, e purificação de colónias de tais leveduras hospedeiras haplóides no meio de seleção apropriado. Todos estes métodos são métodos genéticos padrão para levedura conhecidos para os peritos na técnica.

Veja-se, por exemplo, Sherman et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1978) e

Guthrie et al. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991).

[038] Os promotores adequados para a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica para a enzima com atividade de acetaldeído desidrogenase e opcionalmente atividade de álcool desidrogenase (bem como outras enzimas da presente invenção, ver abaixo) incluem os promotores que são preferencialmente insensíveis à repressão de catabólito (glicose), que são ativos sob condições anaeróbicas e/ou que, de preferência, não requerem xilose ou arabinose para a indução. Promotores que têm estas características estão amplamente disponíveis e são conhecidos do perito na técnica. Exemplos adequados de tais promotores incluem, por exemplo, os promotores dos genes glicolíticos, tais como a fosfofrutoquinase (PPK), triose fosfato isomerase (TPT), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GDP, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato quinase (PGK), promotores glicose-6-fosfato-isomerase (promotor PGI1) de leveduras. Mais detalhes sobre tais promotores de leveduras podem ser encontrados em (WO 93/03159). Outros promotores úteis são os promotores do gene que codifica a proteína ribossomal (TEF1), o promotor do gene da lactase (LAC4), promotores de álcool desidrogenase (ADH1, ADH4, e semelhantes), o promotor da enolase (ENO) e o promotor transportador de hexose (glucose) (HXT7). Alternativamente,

a sequência de nucleotídeos que codifica a enzima possuindo atividade de acetaldeído desidrogenase e, opcionalmente, álcool desidrogenase é superexpressa sob condições anaeróbias, utilizando um promotor anóxico, tais como por exemplo, o promotor ANB1 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 19).

Outros promotores, tanto constitutivos e induzíveis, potenciadores e ou sequências ativadoras a montante serão conhecidos dos peritos na técnica. De preferência, o promotor que está operativamente ligado à sequência de nucleotídeos como definida acima, é homólogo à da célula hospedeira. Sequências de terminação adequadas são por exemplo, obtidas a partir do gene de citocromo cl (CYC1) ou de um gene de álcool desidrogenase (ADH1, por exemplo).

[039] Para aumentar a probabilidade de que a enzima possuindo atividade de acetaldeído desidrogenase e opcionalmente álcool desidrogenase seja expressa em níveis suficientes e na forma ativa nas células hospedeiras transformadas da presente invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica para estas enzimas, assim como outras enzimas da invenção (ver abaixo), são de preferência adaptadas para otimizar a sua utilização de códons da célula hospedeira em questão. A adaptabilidade de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima para a utilização de códons da célula hospedeira pode ser expressa como o índice de adaptação de códons (CAI). O índice de adaptação de códons é aqui definido como uma medida da capacidade de adaptação em relação à utilização de códons de um gene para a utilização de códons de genes altamente expressos numa célula hospedeira particular, ou organismo.

A adaptabilidade relativa (w) de cada códon é a razão entre o uso de cada códon, para o do códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice de CAI é definido como a média geométrica destes valores relativos de adaptabilidade.

Códons não-sinônimos e códons de terminação (dependendo do código genético) são excluídos. Valores CAI variam de 0 a 1, com valores mais elevados indicando uma maior proporção dos códons mais abundantes (ver Sharp e Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; ver também: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51). Uma sequência de nucleotídeos adaptada de preferência tem um CAI de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9. As mais preferidas são as sequências que foram otimizadas para códons para expressão na célula hospedeira fúngica em questão, tais como por exemplo, as células de S.

cerevisiae.

[040] A sequência de nucleotídeos codifica uma enzima com atividade de acetaldeído desidrogenase e opcionalmente de álcool desidrogenase, que é de preferência expressa sob a forma ativa na célula hospedeira transformada. Assim, a expressão da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira produz uma desidrogenase acetaldeído com uma atividade específica de pelo menos 0,005, 0,010, 0,020, 0,050 ou 0,10 µmol min-1 (mg de proteína)-1, determinada como a taxa de redução de NADH dependente de acetil-CoA em extratos celulares da célula hospedeira transformada, a 30°C como descrito nos Exemplos aqui apresentados.

[041] A célula hospedeira a ser transformada com uma construção de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima com acetaldeído desidrogenase e, opcionalmente, álcool desidrogenase de preferência é uma célula hospedeira de levedura. De preferência, a célula hospedeira é uma célula de cultura. A célula hospedeira da invenção, de preferência, é um hospedeiro capaz de transporte de pentose ativa ou passiva (xilose e preferencialmente, também a arabinose) para dentro da célula. A célula hospedeira de preferência contém glicólise ativa. A célula hospedeira pode ainda, de preferência conter uma via de fosfato de pentose endógena e podem conter atividade da xilulose quinase endógena, de modo que xilulose isomerizada a partir de xilose pode ser metabolizada em piruvato. O hospedeiro mais preferencialmente contém enzimas para a conversão de uma pentose (de preferência através de piruvato) em um produto de fermentação desejado, tal como o etanol, o ácido láctico, o ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-

propano-diol, butanois (1-butanol, 2-butanol, iso-butanol) e produtos derivados de isoprenóides. Uma célula hospedeira particularmente preferida é uma célula de levedura que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, de preferência, fermentação alcoólica anaeróbia. A célula hospedeira de levedura ainda mais preferivelmente tem uma elevada tolerância ao etanol, uma alta tolerância a baixo pH (isto é, capaz de crescimento a um pH menor do que 5, 4, ou 3) e em ácidos orgânicos como o ácido láctico, o ácido acético ou ácido fórmico e produtos da degradação do açúcar tais como o furfural e hidroxi-metilfurfural, e uma alta tolerância a temperaturas elevadas. Qualquer uma dessas características ou atividades da célula hospedeira pode ser naturalmente presente na célula hospedeira, ou pode ser introduzida ou modificada por modificação genética, de preferência, por auto clonagem ou pelos métodos da invenção descritos abaixo. Uma célula adequada é uma célula de cultura, uma célula que pode ser cultivada no processo de fermentação, por exemplo, em fermentação submersa ou estado sólido. Particularmente adequadas são células de microrganismos eucarióticos, como por exemplo fungos, no entanto, o mais apropriado para o uso nas presentes invenções são leveduras.

[042] As leveduras são aqui definidas como microrganismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Yeasts: characteristics and identification, J.A.

Barnett, R.W.

Payne, D.

Yarrow, 2000,

3rd ed., Cambridge University Press, Cambridge UK; e, The yeasts, a taxonomic study, C.P.

Kurtzman and J.W.

Fell

(eds) 1998, 4th ed., Elsevier Science Publ.

B.V.,

Amsterdam, The Netherlands) que predominantemente crescem na forma unicelular.

As leveduras podem crescer ou brotar de um talo unicelular ou podem crescer por fissão do organismo.

Células de leveduras preferidas para uso na presente invenção pertencem aos gêneros Saccharomyces,

Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces,

Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, e Yarrowia.

De preferência, a levedura é capaz de fermentação anaeróbia,

de preferência fermentação alcoólica anaeróbia.

Ao longo dos anos foram feitas sugestões para a introdução de vários organismos para a produção do bioetanol a partir de açúcares de colheitas agrícolas.

Na prática, no entanto,

todos os principais processos de produção de bioetanol têm continuado a usar as leveduras do gênero Saccharomyces,

como produtor de etanol.

Isto é devido às muitas características atraentes de espécies Saccharomyces para processos industriais, ou seja, uma alta tolerância ao ácido, ao etanol e uma alta osmo-tolerância, capacidade de crescimento anaeróbico, e, claro, sua alta capacidade fermentativa alcoólica.

Espécies de leveduras preferidas como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus e Schizosaccharomyces pombe.

[043] Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira da presente invenção compreende ainda uma modificação genética que introduz atividade de glicerol desidrogenase ligada a NAD+ na célula. A glicerol desidrogenase codificada pelo gene de levedura GCY1 endógeno parece ser específica para o cofator NADP+ (CE

1.1.1.72), em oposição a NAD+ (CE 1.1.1.6). As leveduras como S. cerevisiae parecem carecer de atividade de glicerol desidrogenase dependente de NAD+ (EC 1.1.1.6) (ver por exemplo a via KEGG 00561). Uma glicerol desidrogenase ligada a NAD+ é aqui entendida como uma enzima que catalisa a reação química (CE 1.1.1.6): glicerol + NAD+ ↔ glicerona + NADH + H+

[044] Outros nomes de uso comum incluem glicerina desidrogenase e glicerol:NAD+ 2-oxidorredutase.

[045] De preferência, a modificação genética que introduz a atividade de glicerol desidrogenase ligada a NAD+ na célula hospedeira é a expressão de uma glicerol desidrogenase ligada a NAD+ que é heteróloga para a célula hospedeira. Mais preferencialmente, a sequência de nucleotídeos para a expressão de uma glicerol desidrogenase heteróloga nas células da invenção é uma sequência que codifica uma glicerol desidrogenase bacteriana que utilizam NAD+ como cofator (CE 1.1.1.6). Um exemplo adequado de uma glicerol desidrogenase bacteriana ligada a NAD+ para a expressão em uma célula hospedeira da invenção é por exemplo o gene gldA a partir de E. coli descrito por Truniger e Boos (1994, J Bacteriol. 176(6): 1796-1800), cuja expressão em levedura já foi relatada (Lee e Dasilva, 2006, Metab Eng. 8(l):58-65). De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica uma glicerol desidrogenase heteróloga compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, a sequência de aminoácidos de 99% identidade com a SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma sequência de aminoácidos que possuem uma ou várias substituições, inserções e/ou deleções, em comparação com a SEQ ID NO: 7.

Numa forma de realização preferida, uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons (ver acima) que codifica a glicerol desidrogenase heteróloga é superexpressa, tal como por exemplo, uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons que codifica a sequência de aminoácidos da glicerol desidrogenase da SEQ ID NO: 7. Tal sequência de nucleotídeos otimizada para códons é por exemplo, proporcionada na SEQ ID NO: 21 (posições 10-1113; CAI = 0,976).

[046] Para a superexpressão da sequência de nucleotídeos que codifica a glicerol desidrogenase, a sequência de nucleotídeos (a ser superexpressa) é colocada numa construção de expressão na qual está operacionalmente ligada a regiões/sequências reguladoras de expressão adequadas para garantir a superexpressão da enzima de glicerol desidrogenase mediante a transformação da construção de expressão dentro da célula hospedeira da invenção (ver acima). Os promotores adequados para a (super) expressão da sequência de nucleotídeos que codifica para a enzima que possui atividade de glicerol desidrogenase incluem os promotores que são preferencialmente insensíveis à repressão de catabólito (glicose), que são ativos sob condições anaeróbias e/ou que, de preferência, não requerem xilose ou arabinose para indução. Exemplos de tais promotores são dados acima. A expressão da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira produz uma atividade específica de glicerol desidrogenase ligada a NAD+ a pelo menos 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, ou 5,0 U min-1 (mg de proteína)-1, determinada em extratos celulares das células hospedeiras transformadas, a 30°C como descrito nos Exemplos aqui apresentados.

[047] Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira da presente invenção compreende ainda uma modificação genética que aumenta a atividade específica de dihidroxiacetona quinase na célula. Dados de transcriptoma mostraram que a dihidroxiacetona quinase endógena DAK1 já é expressa em níveis elevados em S. cerevisiae. Um aumento da atividade da dihidroxiacetona quinase nas células da invenção pode, por conseguinte, não ser estritamente necessário. No entanto, numa forma de realização preferida, para taxas de conversão ótimas, a célula hospedeira da presente invenção compreende, assim, uma modificação genética que aumenta a atividade específica de dihidroxiacetona quinase na célula. A dihidroxiacetona quinase é aqui entendida como uma enzima que catalisa a reação química (CE 2.7.1.29): ATP + glicerona ↔ ADP + fosfato glicerona

[048] Outros nomes de uso comum incluem glicerona quinase, ATP:glicerona fosfotransferase e acetol quinase (de fosforilação). Entende-se que dihidroxiacetona e glicerona são a mesma molécula. De preferência, a modificação genética causa a superexpressão de uma dihidroxiacetona quinase, por exemplo, por superexpressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma dihidroxiacetona quinase. A sequência de nucleotídeos que codifica a dihidroxiacetona quinase pode ser endógena à célula ou pode ser uma dihidroxiacetona quinase que é heteróloga à célula. As sequências de nucleotídeos que podem ser usadas para a superexpressão de dihidroxiacetona quinase nas células da invenção são, por exemplo, os genes de dihidroxiacetona quinase de S. cerevisiae (DAK1) e (DAK2) como por exemplo descrito por Molin et al. (2003, J.

Biol. Chem. 278:1415-1423). De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a dihidroxiacetona quinase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência de aminoácidos com, pelo menos uma das SEQ ID Nos: 8 e 9. Numa forma de realização preferida uma sequência de nucleotídeos com otimizada para códons (ver acima) que codifica a dihidroxiacetona quinase é superexpressa, tal como por exemplo, uma sequência de nucleotídeos com otimizada para códons que codifica para a dihidroxiacetona quinase da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de nucleotídeos com otimizada para códons que codifica a dihidroxiacetona quinase da SEQ ID NO: 9. A sequência de nucleotídeos de preferência para a superexpressão de uma dihidroxiacetona quinase é uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma dihidroxiacetona quinase que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência de aminoácidos com, pelo menos uma das SEQ ID Nos: 8 (S. cerevisiae (DAK1) ou tendo uma ou várias substituições, inserções e/ou deleções, em comparação com a SEQ ID NO: 8.

[049] As sequências de nucleotídeos que podem ser usadas para a superexpressão de uma dihidroxiacetona quinase heteróloga nas células da invenção são por exemplo as sequências que codificam para uma dihidroxiacetona quinase bacteriana, tais como o gene Dhak de Citrobacter freundii por exemplo descrito por Daniel et al. (1995, J.

Bacteriol. 177:4392-4401). De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica para uma dihidroxiacetona quinase heteróloga compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma sequência de aminoácidos que possuem uma ou várias substituições, inserções e/ou deleções, em comparação com a SEQ ID NO. 25. Numa forma de realização preferida de uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons (ver acima) que codifica para a dihidroxiacetona quinase heteróloga é superexpressa, tal como por exemplo, sequência de nucleotídeos otimizada para códons que codifica a sequência de aminoácidos da dihidroxiacetona quinase da SEQ ID NO:

25. Tal sequência de nucleotídeos otimizada para códons é por exemplo proporcionada na SEQ ID NO: 26 (posições 10- 1668).

[050] Para a superexpressão da sequência de nucleotídeos que codifica a dihidroxiacetona quinase, a sequência de nucleotídeos (a ser superexpressa) é colocada numa construção de expressão na qual está operacionalmente ligado a regiões/sequências reguladoras de expressão adequadas para garantir a superexpressão da enzima dihidroxiacetona quinase mediante transformação da construção de expressão dentro da célula hospedeira da invenção (ver acima). Os promotores adequados para a

(sobre) expressão da sequência de nucleotídeos que codifica para a enzima que possui atividade de dihidroxiacetona quinase incluem os promotores que são preferencialmente insensíveis à repressão de catabólito (glicose), que são ativos sob condições anaeróbias e/ou que, de preferência,

não requerem xilose ou arabinose para indução.

Exemplos de tais promotores são dados acima.

Nas células da invenção,

uma dihidroxiacetona quinase a ser superexpressa é de preferência superexpressa a pelo menos um fator de 1,1,

1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética causando a superexpressão.

De preferência, a dihidroxiacetona quinase é superexpressa em condições anaeróbicas, a pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5,

10 ou 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética causando a superexpressão. É para ser entendido que estes níveis de superexpressão podem aplicar-se ao nível de estado estacionário de atividade da enzima (atividade específica na célula), ao nível de estado estacionário de proteína da enzima, bem como com ao nível de estado estacionário para a codificação da transcrição para a enzima na célula. A superexpressão da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira produz uma atividade de dihidroxiacetona quinase específica de, pelo menos, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ou 0,05 U min-1 (mg de proteína)-1, determinada em extratos celulares das células hospedeiras transformadas, a 30°C, como descrito nos Exemplos aqui apresentados.

[051] Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira da presente invenção compreende ainda uma modificação genética que aumenta o transporte de glicerina para dentro da célula. De preferência, a modificação genética que aumenta o transporte de glicerina para dentro da célula, de preferência é uma modificação genética que provoca a superexpressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma de uma proteína de transporte de glicerol e um canal de glicerol.

[052] Uma proteína de transporte de glicerol é aqui entendida como uma proteína transmembranar multipasso que pertence à superfamília onde se incluem as O- aciltransferases (MBOAT) ligadas à membrana, incluindo por exemplo, as proteínas de transporte de glicerol de S.

cerevisiae codificadas pelos genes GUP1 e GUP2. De preferência, a modificação genética causa a superexpressão de uma proteína de transporte de glicerol, por exemplo, por superexpressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma proteína de transporte de glicerol. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de transporte de glicerol pode ser endógena à célula ou pode ser uma proteína de transporte de glicerol que é heteróloga à célula. As sequências de nucleotídeos que podem ser usadas para a superexpressão da proteína de transporte de glicerol nas células da invenção são, por exemplo, os genes da proteína de transporte de glicerol de S. cerevisiae (GUP1) e (GUP2) e ortólogos destes como por exemplo descrito por Neves et al. (2004, FEMS Yeast Res. 5:51-62).

De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de transporte de glicerol compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência de aminoácidos com pelo menos uma das de SEQ ID Nos: 10 (Guplp) e 11 (Gup2p). Numa forma de realização preferida uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons (ver acima) que codifica para a proteína de transporte de glicerol é superexpressa, tal como por exemplo, uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons que codifica a proteína de transporte de glicerol SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons que codifica a proteína de transporte de glicerol da SEQ ID NO: 11. Embora a natureza exata da influência de GUP1 em no transporte de glicerol ainda não está claro, Yu et al. (2010, supra) demonstraram que a superexpressão de GUP1 em S. cerevisiae melhora a produção de etanol em células cultivadas em glicerol. Uma sequência de nucleotídeos preferida para a superexpressão de uma proteína de transporte de glicerol é, portanto, uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma proteína de transporte de glicerol que é capaz de resgatar um fenótipo de um mutante de S. cerevisiae gup1∆ associado ao stress por sal por complementação, como descrito por Neves et al. (2004, supra). Tais ortólogos complementares de S. cerevisiae GUP1 incluem sequências de nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 68, 72, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 10 e podem ser obtidos a partir de espécies de leveduras pertencentes ao gênero Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces e Yarrowia.

[053] Um canal de glicerol é aqui entendido como um membro da família de proteínas MIP de canal revistas por

Reizer et al. (1993, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28: 235-257), proteínas de canal que compreendem um domínio de transmembrana de 250-280 aminoácidos que consiste em seis domínios que atravessam a membrana e têm pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de aminoácidos, ou, pelo menos, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% de similaridade de aminoácidos com a sequência de aminoácido entre os aminoácidos 250 e 530 da SEQ ID NO: 12, a aquagliceroporina FPS1 de S. cerevisiae.

As sequências de nucleotídeos que podem ser usados para a superexpressão de um canal de glicerol nas células da invenção incluem sequências de nucleotídeos que codificam o gene de levedura aquagliceroporina FPS1 a partir de, por exemplo, S. cerevisiae (Van Aelst et al., 1991, EMBO J.

10:2095-2104) e seus ortólogos de outras leveduras, incluindo Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus e Zygosaccharomyces rouxii, como por exemplo, descrito por Neves et al. (2004, supra). No entanto, o uso de canais de glicerol bacterianos ou de plantas não é excluído, por exemplo, Luyten et al. (1995, EMBO J. 14: 1360-1371) mostraram que o facilitador de glicerol de E. coli, tendo apenas 30% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos entre os aminoácidos 250 e 530 da aquagliceroporina FPS1 de S. cerevisiae, pode complementar o transporte de glicerol num mutante fps1∆ de S.

cerevisiae. A sequência de nucleotídeos que codifica o canal de glicerol pode ser endógeno à célula ou pode ser um canal de glicerol que é heterólogo para a célula. Numa forma de realização preferida uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons (ver acima) que codifica o canal de glicerol é superexpressa, tal como por exemplo, uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons que codifica a aquagliceroporina da SEQ ID NO: 12.

[054] Para a superexpressão da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de transporte de glicerol e/ou a proteína do canal de glicerol, a sequência de nucleotídeos (a ser superexpressa) é colocada numa construção de expressão na qual está operacionalmente ligada a regiões/sequências de regulação de expressão adequadas para garantir a superexpressão da proteína de transporte de glicerol e/ou a proteína do canal de glicerol mediante a transformação da construção de expressão na célula hospedeira da invenção (ver acima). Os promotores adequados para a (sobre) expressão da sequência de nucleotídeos que codifica para a proteína de transporte de glicerol e/ou a proteína do canal de glicerol incluem os promotores que são preferencialmente insensíveis à repressão de catabólito (glicose), que são ativos sob condições anaeróbias e/ou que, de preferência não exigem xilose ou arabinose para a indução. Exemplos de tais promotores são dados acima. Nas células da invenção, uma proteína de transporte de glicerol e/ou de uma proteína do canal de glicerol a ser superexpressa, de preferência superexpressa em pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica exceto para a modificação genética que causa a superexpressão. De preferência, a proteína de transporte de glicerol e/ou a proteína do canal de glicerol são superexpressas em condições anaeróbicas em pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica exceto para a modificação genética que causa a superexpressão. É para ser entendido que estes níveis de superexpressão podem aplicar- se ao nível de estado estacionário de atividade de enzima (atividade específica na célula), ao nível de estado estacionário de proteína de enzima, bem como com o nível de estado estacionário para a codificação da transcrição para a enzima na célula.

[055] Numa forma de realização preferida da célula hospedeira da invenção, a expressão da proteína do canal de glicerol, tal como definido acima é reduzida ou inativada.

Uma modificação genética reduzindo ou inativando a expressão da proteína do canal de glicerol pode ser útil para reduzir ou evitar o transporte de glicerina para fora da célula. De preferência, a redução ou inativação da expressão da proteína do canal de glicerol é combinada com a superexpressão da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de transporte de glicerol, tal como definido acima.

[056] Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira da presente invenção compreende ainda uma modificação genética que aumenta a atividade específica da acetil-CoA sintetase na célula, de preferência, sob condições anaeróbicas, pois esta atividade tem ação limitada sob essas condições. Acetil-CoA sintetase ou acetato-CoA-ligase (EC 6.2.1.1) é aqui entendido como uma enzima que catalisa a formação de uma nova ligação química entre etil e coenzima A (CoA). De preferência, a modificação genética causa a superexpressão de uma acetil- CoA sintetase, por exemplo, por superexpressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma acetil-CoA sintetase. A sequência de nucleotídeos que codifica a acetil-CoA sintetase pode ser endógena à célula ou pode ser uma acetil-CoA sintetase que é heteróloga para a célula. As sequências de nucleotídeos que podem ser usadas para a superexpressão de acetil-CoA sintetase nas células da invenção são, por exemplo, os genes da acetil-CoA sintetase a partir de S. cerevisiae (ACS1 e ACS2) como por exemplo descrito por De Jong-Gubbels et al. (1998, FEMS Microbiol Lett. 165:. 15-20). De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a acetil-CoA sintetase compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidade de sequência de aminoácidos com pelo menos uma das SEQ ID Nos: 13 e 14.

[057] Numa forma de realização, a sequência de nucleotídeos que é superexpressa codifica uma acetil-CoA sintetase com uma elevada afinidade para o acetato.

Utilização de uma acetil-CoA sintetase com uma elevada afinidade para o acetato é preferida para condições em que existe uma concentração relativamente baixa de ácido acético no meio de cultura, por exemplo, não mais do que 2 g de ácido acético/L de meio de cultura. Uma acetil-CoA sintetase com uma elevada afinidade para o acetato é aqui definida como uma acetil-CoA sintetase com uma afinidade para o acetato maior do que a da acetil-CoA sintetase codificada pela ACS2 de S. cerevisiae. De preferência, uma acetil-CoA sintetase com uma elevada afinidade para o acetato tem um Km para o acetato de não mais do que 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2 ou 0,1 mM, como por exemplo a acetil-CoA sintetase codificada pelo gene ACS1 de S. cerevisiae. Mais de preferência, uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons (ver acima) que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 é superexpressa.

[058] Numa outra forma de realização, a sequência de nucleotídeos que é superexpressa codifica uma acetil-CoA sintetase com uma alta taxa máxima (vmax). Utilização de uma acetil-CoA sintetase com uma alta taxa máxima é preferido para as condições nas quais há uma concentração relativamente elevada de ácido acético no meio de cultura, por exemplo, pelo menos, 2, 3, 4 ou 5 g de ácido acético/L de meio de cultura. Uma acetil-CoA sintetase com uma alta taxa máxima é aqui definida como uma acetil-CoA sintetase com uma taxa máxima maior do que a acetil-CoA sintetase codificada pelo ACS1 de S. cerevisiae. De preferência, a acetil-CoA sintetase com uma alta taxa máxima é a acetil- CoA sintetase, codificada pelo gene ACS2 de S. cerevisiae.

Mais de preferência, uma sequência de nucleotídeos otimizada para códons (ver acima) que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 é superexpressa.

[059] Para a superexpressão da sequência de nucleotídeos que codifica a acetil-CoA sintetase (a ser superexpressa) é colocada numa construção de expressão na qual está operacionalmente ligada a regiões/sequências reguladoras de expressão adequadas para garantir a superexpressão da enzima de acetil-CoA sintetase com a transformação da construção de expressão dentro da célula hospedeira da invenção (ver acima). Os promotores adequados para a (sobre) expressão da sequência de nucleotídeos que codifica para a enzima que possui atividade de acetil-CoA sintetase incluem os promotores que são preferencialmente insensíveis à repressão de catabólito (glicose), que são ativos sob condições anaeróbias e/ou que de preferência não requerem xilose ou arabinose para indução. Exemplos de tais promotores são dados acima. Nas células da invenção, uma acetil-CoA sintetase a ser superexpressa é superexpressa a pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética causando a superexpressão. De preferência, a acetil-CoA sintetase é superexpressa em condições anaeróbicas em pelo menos um fator de 2, 5, 10, 20, 50, ou 100, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética causando a superexpressão. É para ser entendido que estes níveis de superexpressão podem aplicar- se ao nível de estado estacionário de atividade da enzima (atividade específica), ao nível de estado estacionário de proteína da enzima, bem como com ao nível de estado estacionário para a codificação da transcrição para a enzima.

[060] Em uma outra forma de realização, a célula hospedeira da presente invenção compreende ainda uma modificação genética que reduz a atividade específica de glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NAD+ na célula. Glicerol-3-fosfato desidrogenase ou glicerolfosfato desidrogenase (CE 1.1.1.8) catalisa a redução da dihidroxiacetona fosfato em sn-glicerol-3-fosfato, enquanto oxida NADH em NAD+ . Nas células da invenção, a atividade específica de glicerolfosfato desidrogenase é preferencialmente reduzida em pelo menos um fator de 0,8, 0,5, 0,3, 0,1, 0,05 ou 0,01 em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética causando a superexpressão, de preferência sob condições anaeróbias.

[061] De preferência, glicerolfosfato desidrogenase é reduzida na célula hospedeira através de uma ou mais modificações genéticas que diminuem a expressão ou inativam um gene que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase. De preferência, as modificações genéticas reduzem ou inativam a expressão de cada cópia endógena do gene que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase específica no genoma da célula. Uma dada célula pode compreender múltiplas cópias do gene que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase específica com uma e a mesma sequência de aminoácidos como resultado da di-, poli- ou aneu-ploidia. Em tais casos, de preferência a expressão de cada cópia do gene específico que codifica a glicerolfosfato desidrogenase é reduzida ou inativada. Em alternativa, uma célula pode conter várias diferentes (iso)enzimas com atividade de glicerolfosfato desidrogenase que diferem na sequência de aminoácidos e que são cada uma delas codificada por um gene diferente. Em tais casos, em algumas formas de realização da invenção, prefere-se que apenas certos tipos de isoenzimas sejam reduzidas ou inativadas, enquanto outros tipos de permaneçam inalteradas (ver abaixo). De preferência, o gene é inativado por deleção de pelo menos uma parte do gene ou por disrupção do gene, em que, neste contexto, o termo gene inclui também qualquer sequência não codificante a montante ou a jusante da sequência de codificação, a deleção (parcial) ou inativação que resulta numa redução da expressão da atividade de glicerolfosfato desidrogenase na célula hospedeira.

[062] Um gene preferido que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase cuja atividade seja para ser reduzida ou inativada nas células da invenção é o gene GPD2 de S. cerevisiae como descrito por Eriksson et al. (1995, Mol. Microbiol 17:95-107), que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e seus ortólogos em outras espécies. Por conseguinte, um gene que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase cuja atividade seja para ser reduzida ou inativada nas células da invenção, de preferência, é um gene que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15.

[063] Numa forma de realização preferida da invenção, a célula hospedeira da presente invenção compreende uma via de resposta de glicerol de alta osmolaridade funcional. De preferência, por conseguinte, apenas a atividade do(s) gene(s) que codifica(m) uma glicerolfosfato desidrogenase tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15 são reduzidos ou inativados, enquanto que pelo menos um gene endógeno que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16 é funcional. SEQ ID NO: 16 ilustra a sequência de aminoácidos codificada pelo gene GPD1 de S. cerevisiae, tal como descrito por Albertyn et al. (1994, Mol. Cell. Biol.

14:4135-4144), que tem 69% de identidade de aminoácidos com a glicerolfosfato desidrogenase de GPD2 de S. cerevisiae. O gene GPD1 de S. cerevisiae é a glicerolfosfato desidrogenase induzida pelo stress de S. cerevisiae, que é importante para o crescimento sob stress osmótico, como pode ocorrer em condições de fermentações industriais. A sua expressão é regulada nomeadamente pela via de resposta de glicerol de alta osmolaridade. Por conseguinte, é vantajoso que uma célula hospedeira da invenção tenha, pelo menos, uma cópia funcional de um gene endógeno que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16.

[064] Não obstante o anterior, os inventores verificaram agora, surpreendentemente, que a inativação da glicerolfosfato desidrogenase de GPD1 de S. cerevisiae tem um efeito mais vantajoso na redução da produção de glicerol e no aumento de consumo de glicerol e de acetato em comparação com a inativação da glicerolfosfato desidrogenase de GPD2 de S. cerevisiae. Portanto, numa forma de realização mais preferida, a célula hospedeira da invenção compreende uma modificação genética que reduz ou inativa a expressão de, pelo menos, o(s) gene(s) que codifica(m) uma glicerolfosfato desidrogenase tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16 (GPD1).

[065] Numa outra modalidade, a atividade de todos os genes na célula hospedeira que codificam uma glicerolfosfato desidrogenase é reduzida ou inativada. Em tais células, de preferência todas as cópias de genes endógenos que codificam para uma glicerolfosfato desidrogenase tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15 ou 16 estão inativadas, ou pelo menos reduzidas em expressão.

[066] Numa outra forma de realização da invenção, a célula hospedeira não é uma célula de levedura que compreende uma codificação do gene exógeno para uma enzima com a capacidade de converter piruvato e coenzima-A em formato e acetil-CoA. De preferência, a célula hospedeira não é uma célula de levedura compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma piruvato formato liase.

[067] Em ainda outra forma de realização da invenção, a célula hospedeira é uma célula hospedeira em que a atividade de formato desidrogenase específica é de pelo menos 81, 85, 90, 95 ou 100% da atividade da formato desidrogenase específica em uma cepa da célula hospedeira que é geneticamente idêntica, exceto por uma alteração genética selecionada a partir do grupo que consiste em: a) (a introdução de) um gene exógeno que codifica para uma enzima com atividade de acetaldeído desidrogenase, gene que confere à célula a capacidade de converter o ácido acético em etanol; b) (a introdução de) um gene bacteriano que codifica uma enzima para a atividade da glicerol desidrogenase ligada com NAD+; e c) qualquer das outras modificações genéticas aqui descritas acima. Assim, uma célula hospedeira preferida da invenção não é uma célula de levedura compreendendo uma modificação genética que reduz a atividade específica de formato desidrogenase dependente de NAD+ na célula.

[068] Em uma outra forma de realização preferida, a célula hospedeira da presente invenção tem, pelo menos, um dos seguintes: a) a capacidade de isomerização de xilose em xilulose; e b) a capacidade para converter L-arabinose em D-xilulose 5-fosfato. Para a) a célula tem de preferência um gene funcional de xilose isomerase exógeno, gene que confere à célula a capacidade de isomerizar a xilose em xilulose. Para b) a célula tem de preferência genes exógenos funcionais que codificam para uma L-arabinose isomerase, uma L-ribuloquinase e uma L-ribulose-5-fosfato- 4-epimerase, genes que juntos conferem à célula a capacidade de isomerizar converter L-arabinose em D- xilulose 5-fosfato.

[069] As células hospedeiras de fungos que possuem a capacidade de isomerização de xilose em xilulose, por exemplo, descritas em WO 03/0624430 e em WO 06/009434. A capacidade de isomerização de xilose em xilulose é de preferência conferida à célula através de transformação com uma construção de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase. De preferência, a célula adquire assim a capacidade de isomerizar a xilose em xilulose diretamente.

Mais de preferência, a célula adquire assim a capacidade de crescer em condições aeróbias e/ou anaeróbias com xilose como fonte única de energia e/ou de carbono, através da isomerização direta de xilose em xilulose (e metabolismo adicional em xilulose). É aqui entendido que a isomerização direta de xilose em xilulose ocorre numa única reação catalisada por uma xilose isomerase, em oposição aos dois passos de conversão de xilose em xilulose por meio de um intermediário como xilitol catalisada por xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente.

[070] Vários xilose isomerases (e os seus aminoácidos e sequências de codificação de nucleotídeos), que podem ser usados com sucesso para conferir à célula da invenção a capacidade de isomerizar a xilose em xilulose diretamente têm sido descritos na técnica. Estes incluem as xilose isomerases de Piromyces sp. e de outros fungos anaeróbios que pertencem às famílias Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces ou Ruminomyces (WO 03/0624430), Cyllamyces aberensis (EUA 20060234364), Orpinomyces (Madhavan et al., 2008, DOI 10.1007/s00253-008-1794-6), a xilose isomerase bacteriana do gênero Bacteroides, incluindo, por exemplo B.

thetaiotaomicron (WO 06/009434), B. fragilis e B. uniformis (WO 09/109633), a xilose isomerase da bactéria anaeróbica Clostridium phytofermentans (Brat et al., 2009, Appl.

Environ. Microbiol. 75:2304-2311) e as xiloses isomerases de Clostridium difficile, Ciona intestinales e Fusobacterium mortiferum.

[071] As células hospedeiras de fungos tendo a capacidade de converter a L-arabinose em D-xilulose 5- fosfato por exemplo, como descrito em Wisselink et al.

(2007, AEM Accepts, publicado online antes da impressão em 1 de Junho de 2007; Appl. Environ. Microbiol.

doi:10.1128/AEM.00177-07) e em EP 1499708. A capacidade de converter a L-arabinose em D-xilulose 5-fosfato é de preferência conferida à célula através de transformação com construção(ões) de ácido nucleico que compreendem as sequências de nucleotídeos que codificam a) uma arabinose isomerase; b) uma ribuloquinase, de preferência uma L- ribuloquinase uma xilose isomerase; e c) uma ribulose-5-P 4-epimerase, preferivelmente a L-ribulose-5-P-4-epimerase.

De preferência, nas células da invenção, a capacidade de converter a L-arabinose em D-xilulose 5-fosfato é a capacidade de converter a L-arabinose em D-xilulose 5- fosfato por meio de reações subsequentes de 1) isomerização de arabinose em ribulose; 2) fosforilação de ribulose em ribulose 5-fosfato; e, 3) epimerização de ribulose 5- fosfato em D-xilulose 5-fosfato. Sequências de nucleotídeos adequadas que codificam arabinose isomerases, ribuloquinases e ribulose-5-P-4-epimerases podem ser obtidas a partir de Bacillus subtilis, Escherichia coli (ver, por exemplo EP 1499 08), Lactobacillus, por exemplo, Lactobacillus plantarum (ver, por exemplo Wisselink et al.

supra), ou espécies de Clavibacter, Arthrobacter e Gramella, das quais de preferência Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens e Gramella forsetii (ver WO2009/011591).

[072] A célula hospedeira transformada da invenção ainda compreende preferencialmente a atividade da xilulose quinase de modo a que xilulose isomerizada a partir de xilose pode ser metabolizada em piruvato. De preferência, a célula contém a atividade de xilulose quinase endógena.

Mais preferivelmente, uma célula da invenção compreende uma modificação genética que aumenta a atividade específica de xilulose quinase. De preferência, a modificação genética causa a superexpressão de uma xilulose quinase, por exemplo, por superexpressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma xilulose quinase. O gene que codifica a xilulose quinase pode ser endógeno à célula ou pode ser uma xilulose quinase que é heteróloga à célula.

Uma sequência de nucleotídeos que pode ser usada para a superexpressão da xilulose quinase nas células da invenção é por exemplo o gene da xilulose quinase de S. cerevisiae (XKS1) tal como descrito por Deng e Ho (1990, Appl.

Biochem. Biotechnol. 24-25:193-199). Outra xilulose quinase preferida é uma xilose quinase que está relacionada com a xilulose quinase de Piromyces (xylB, ver WO 03/0624430).

Esta xilulose quinase de Piromyces está na verdade mais relacionada com quinase procariótica do que com todas as quinases eucarióticas conhecidas, tais como a quinase de levedura. As xilulose quinases eucarióticas têm sido indicadas como quinases de açúcar não específicas, que têm uma ampla gama de substratos que inclui xilulose. Em contraste, as xilulose quinases procariotas, com as quais a quinase de Piromyces é mais estreitamente relacionada, têm sido indicadas como sendo quinases mais específicas para xilulose, ou seja, possuindo uma gama de substrato mais estreita. Nas células da invenção, uma xilulose quinase superexpressa é superexpressa a pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética que causa a superexpressão. É para ser entendido que estes níveis de superexpressão podem aplicar-se ao nível de estado estacionário da atividade da enzima, o nível de estado estacionário de proteína da enzima, bem como com o nível de estado estacionário para a codificação da transcrição para a enzima.

[073] Uma célula da invenção mais preferivelmente compreende uma modificação genética que aumenta o fluxo da via das pentoses fosfato, tal como descrito em WO 06/009434. Em particular, a modificação genética provoca um aumento do fluxo da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato. A modificação genética que causa um aumento do fluxo da parte não-oxidativa da via das pentoses fosfato é aqui entendida como significando uma alteração que aumenta o fluxo a pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20, em comparação com o fluxo em uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética que causa o aumento do fluxo. O fluxo da parte não- oxidativa da via das pentoses fosfato pode ser medida como descrito em WO 06/009434.

[074] Modificações genéticas que aumentam o fluxo da via das pentoses fosfato podem ser introduzidas nas células da invenção de várias formas. Estes incluem, por exemplo, alcançar maiores níveis estacionários de xilulose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da parte não-oxidativa da via das pentoses fosfato e/ou um nível estacionário reduzido da atividade da aldose redutase inespecífica. Estas alterações nos níveis estacionários de atividade podem ser efetuadas por seleção de mutantes (espontâneos ou induzidos por produtos químicos ou radiação) e/ou por tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, por superexpressão ou inativação, respectivamente, dos genes que codificam as enzimas ou fatores que regulam estes genes.

[075] Numa célula preferida da invenção, a modificação genética compreende a superexpressão de pelo menos uma enzima (da parte não-oxidativa) da via das pentoses fosfato. De preferência, a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em enzimas que codificam para ribulose-

5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato 3-epimerase,

transcetolase e transaldolase.

Várias combinações de enzimas da (parte não-oxidativa) da via das pentoses fosfato podem ser superexpressas.

Por exemplo, as enzimas que são superexpressas podem ser, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato 3-

epimerase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato 3-epimerase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-

fosfato 3-epimerase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato 3-epimerase e transaldolase; ou,

pelo menos, as enzimas transcetolase e transaldolase; ou,

pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato 3-epimerase, e transcetolase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transcetolase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-

fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato 3-epimerase, e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-

fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato 3-epimerase, e transcetolase.

Em uma forma de realização da invenção, cada uma das enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-

fosfato 3-epimerase, transcetolase e transaldolase são superexpressas na célula da invenção. É preferida uma célula em que a modificação genética compreende, pelo menos, a superexpressão da enzima transaldolase. Mais preferida é uma célula em que a modificação genética compreende, pelo menos, a superexpressão de ambas as enzimas transcetolase e transaldolase como tal, uma célula hospedeira já é capaz de um crescimento anaeróbio em xilose. Na verdade, em algumas condições, descobrimos que as células que superexpressam apenas a transcetolase e a transaldolase já têm a mesma taxa de crescimento anaeróbio em xilose do que as células que superexpressam todas as quatro enzimas, isto é, a ribulose-5-fosfato isomerase, a ribulose-5-fosfato 3-epimerase, transcetolase e transaldolase. Além disso, as células da invenção que superexpressam tanto as enzimas isomerase ribulose-5- fosfato como ribulose-5-fosfato 3-epimerase são preferidas em relação às células que superexpressam apenas a isomerase ou a 3-epimerase como a superexpressão de apenas uma destas enzimas podem produzir desequilíbrios metabólicos.

[076] Existem vários meios disponíveis na técnica para a superexpressão de enzimas nas células da invenção. Em particular, uma enzima pode ser superexpressa pelo aumento do número de cópias do gene que codifica para a enzima na célula, por exemplo, através da integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula, através da expressão do gene a partir de um vetor de expressão multicópia epissomal ou por introdução de um vetor de expressão multicópia epissomal que compreende múltiplas cópias do gene. A sequência de codificação para a superexpressão das enzimas de preferência é homóloga à da célula hospedeira da invenção. No entanto, as sequências de codificação que são heterólogas para a célula hospedeira da presente invenção podem também ser aplicadas.

[077] Alternativamente, a superexpressão das enzimas nas células da invenção pode ser alcançada através da utilização de um promotor que não é nativo para a sequência de codificação da enzima a ser superexpressa, isto é, um promotor que é heterólogo em relação à sequência de codificação para o qual está operativamente ligado. Embora o promotor de preferência é heterólogo à sequência de codificação para o qual está operativamente ligado, é também preferido que o promotor seja homólogo, isto é endógeno à célula da invenção. De preferência, o promotor heterólogo é capaz de produzir um maior nível de estado estacionário de transcrição que compreende a sequência de codificação (ou seja, capaz de produzir mais moléculas de transcrição, ou seja, moléculas de mRNA, por unidade de tempo) do que o promotor que é nativo para a sequência de codificação, de preferência, sob condições em que a xilose ou glicose e xilose são disponíveis como fontes de carbono,

mais preferencialmente como fontes principais de carbono (ou seja, mais de 50% da fonte de carbono disponível consiste em xilose ou xilose e glucose), mais preferencialmente como únicas fontes de carbono.

[078] Uma outra célula preferida da invenção compreende uma modificação genética que reduz a atividade da aldose-redutase inespecífica na célula. De preferência, a atividade da aldose-redutase inespecífica é reduzida na célula hospedeira através de uma ou mais modificações genéticas que diminuem a expressão ou inativam um gene que codifica uma aldose redutase inespecífica. De preferência, as modificações genéticas reduzem ou inativam a expressão de cada cópia endógena de um gene que codifica uma aldose redutase inespecífica que é capaz de reduzir uma aldopentose, incluindo, xilose, xilulose e arabinose, no genoma da célula. Uma determinada célula pode compreender múltiplas cópias de genes que codificam a aldose redutase inespecífica como resultado da di-, poli- ou aneu-ploidia, e/ou uma célula pode conter várias diferentes (iso)enzimas com atividade de aldose redutase, que diferem na sequência de aminoácidos e que são cada uma delas codificada por um gene diferente. Além disso, nestes casos, de preferência a expressão de cada gene que codifica uma aldose redutase não específica é reduzido ou inativado. De preferência, o gene é inativado por deleção de pelo menos uma parte do gene ou por disrupção do gene, em que, neste contexto, o termo gene inclui também qualquer sequência não codificante a montante ou a jusante da sequência de codificação, a deleção (parcial) ou inativação que resulta numa redução da expressão da atividade da aldose redutase inespecífica na célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma aldose redutase, cuja atividade é reduzida na célula da invenção e as sequências de aminoácidos dessas aldose redutases são descritas em WO 06/009434 e incluem por exemplo os genes (inespecíficos) de aldose redutase do gene GRE3 de S. cerevisiae (Träff et al., 2001, Appl. Environm. Microbiol. 67: 5668-5674) e seus ortólogos em outras espécies.

[079] Uma célula hospedeira transformada ainda mais preferida de acordo com a invenção pode compreender ainda modificações genéticas que resultam em uma ou mais das características selecionadas de entre o grupo constituído por (a) transporte aumentado de xilose e/ou arabinose para dentro da célula; (b) diminuição da sensibilidade à repressão catabólica; (c) aumento da tolerância ao etanol, osmolaridade ou ácidos orgânicos; e, (d) redução da produção de subprodutos. Subprodutos, entende-se que sejam moléculas contendo carbono que não são as do produto de fermentação desejado e incluem, por exemplo, xilitol, arabinitol, glicerol e/ou ácido acético. Qualquer modificação genética aqui descrita pode ser introduzida por mutagênese clássica e rastreio e/ou seleção para o mutante desejado, ou simplesmente por rastreio e/ou seleção de mutantes espontâneos com as características desejadas.

Alternativamente, as modificações genéticas podem consistir de superexpressão de genes endógenos, e/ou a inativação de genes endógenos. Genes cuja superexpressão é desejada para o aumento do transporte de arabinose e/ou xilose para dentro da célula são preferencialmente escolhidos de genes codificando um transportador de hexose ou pentose. Em S.

cerevisiae e outras leveduras esses genes incluem HXT1, HXT2, HXT4, HXT5, HXT7 e GAL2, dos quais HXT7, HXT5 e GAL2 são mais preferidos (ver Sedlack e Ho, Yeast 2004; 21: 671- 684). Outro transportador preferido para a expressão em leveduras é o transportador de glicose codificado pelo gene SUT1 de P. stipitis (Katahira et al., 2008, Enzyme Microb.

Technol. 43:115-119). Similarmente, ortólogos destes genes transportadores de outras espécies podem ser superexpressos. Outros genes que podem ser superexpressos em células da invenção incluem genes que codificam para enzimas glicolíticas e/ou enzimas etanologênicas tais como álcool desidrogenases. Genes endógenos preferidos para inativação incluem genes da hexose quinase, por exemplo, o gene Hxk2 de S. cerevisiae (ver Diderich et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1587-1593); genes MIG1 ou

MIG2 de S. cerevisiae ou; genes que codificam enzimas envolvidas no metabolismo de glicerol, tais como os genes de glicerolfosfato desidrogenase 1 e/ou 2 de S. cerevisiae; ou ortólogos (hibridizantes) destes genes em outras espécies. Outras modificações adicionais preferidas de células hospedeiras para a fermentação da xilose são descritos em van Maris et al. (2006, Antonie van Leeuwenhoek 90:391-418), WO2006/009434, WO2005/023998, WO2005/111214 e WO2005/091733. Qualquer das modificações genéticas das células da invenção tal como aqui descritas são, na medida do possível, de preferência introduzidas ou modificadas por modificação genética por auto clonagem.

[080] Uma célula hospedeira preferida de acordo com a invenção, tem a capacidade de crescer em pelo menos uma de xilose e arabinose como fonte de carbono/energia, de preferência, como única fonte de carbono/energia, e de preferência, sob condições anaeróbicas, isto é, as condições tal como definidas aqui a seguir para o processo de fermentação anaeróbia. De preferência, quando cultivada em xilose como fonte de carbono/energia a célula hospedeira produz essencialmente nenhum xilitol, por exemplo, o xilitol é produzido abaixo do limite de detecção, ou por exemplo, menos do que 5, 2, 1, 0,5, ou 0,3% do carbono consumido em uma base molar. De preferência, quando cultivada em arabinose como fonte de carbono/energia, a célula produz essencialmente nenhum arabinitol, por exemplo, o arabinitol produzido é inferior ao limite de detecção, ou por exemplo, menos do que 5, 2, 1, 0,5, ou 0,3% do carbono consumido em uma base molar.

[081] Uma célula hospedeira preferida da invenção tem a capacidade de crescer em uma combinação de: a) pelo menos uma de uma hexose e uma pentose; b) ácido acético; e c) glicerol, a uma velocidade de pelo menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 h-1, sob condições aeróbicas, ou, mais preferencialmente, a uma velocidade de, pelo menos, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ou 0,2 h-1, sob condições anaeróbicas. Portanto, de preferência a célula hospedeira tem a capacidade de crescer em pelo menos uma de xilose e arabinose como única fonte de carbono/energia a uma velocidade de pelo menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 h-1 sob condições aeróbicas, ou, mais preferivelmente, a uma velocidade de pelo menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ou 0,2 h-1, sob condições anaeróbicas. Mais de preferência, a célula hospedeira tem a capacidade de crescer em uma mistura de uma hexose (por exemplo, glicose) e pelo menos uma de xilose e de arabinose (numa de proporção 1:1 em peso) como única fonte de carbono/energia a uma velocidade de pelo menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 h-1, sob condições aeróbicas, ou, mais preferencialmente, a uma velocidade de pelo menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ou 0,2 h-1, sob condições anaeróbicas.

[082] Em um aspecto, a invenção relaciona-se com a utilização de uma célula de levedura de acordo com a invenção para a preparação de um produto de fermentação selecionado a partir do grupo que consiste em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3- propano-diol, butanol e produtos derivados de isoprenóides.

[083] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a produção de um produto de fermentação selecionado a partir do grupo que consiste em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3- propano-diol, butanois (1-butanol, 2-butanol, iso-butanol) e produtos derivados de isoprenóides. O processo compreende de preferência o passo de: a) fermentação de um meio com uma célula de levedura, em que o meio contém ou é alimentado com: a) uma fonte de pelo menos uma de uma hexose e uma pentose; b) uma fonte de ácido acético; e c) uma fonte de glicerol e em que a célula de levedura fermenta o ácido acético, glicerol e pelo menos uma das hexoses e pentoses em etanol. A célula de levedura é de preferência uma célula (hospedeira) tal como aqui definido acima. O processo compreende, de preferência, um passo em que o produto de fermentação é recuperado. O processo pode ser um processo em lote, um processo em batelada alimentada ou um processo contínuo, tal como é bem conhecido na técnica. No processo da invenção, a fonte de glicerol pode ser qualquer fonte de carbono que tem um estado mais reduzido do que a glicose. Uma fonte de carbono tendo um estado mais reduzido do que a glicose é entendida como uma fonte de carbono da qual o estado de redução média por C- mol (dos seus compostos) é maior do que o estado de redução por C-mol de glicose. Exemplos de fontes de carbono, tendo um estado mais reduzido do que a glicose inclui, por exemplo alcanóis tais como propanol e butanol; polióis tais como 1,3-propano-diol, butanodiol, glicerol, manitol e xilitol.

[084] Em um processo preferido, a fonte de hexose compreende ou consiste em glicose. De preferência, a fonte de pentose compreende ou consiste em pelo menos uma de xilose e arabinose. De preferência, o meio fermentado pelas células da invenção compreende ou é alimentado com (frações de) biomassa hidrolisada que compreende pelo menos uma de uma hexose e de uma pentose, tal como glicose, xilose e/ou arabinose. As (frações de) biomassa hidrolisada compreendendo as hexoses e pentoses em geral também compreendem ácido acético (ou um seu sal). Um exemplo de biomassa hidrolisada a ser fermentada no processo da invenção é, por exemplo, biomassa lignocelulósica hidrolisada. A biomassa lignocelulósica é aqui entendida como a biomassa de plantas, que é composta por celulose, hemicelulose e lignina. Os polímeros de carboidratos (celulose e hemicelulose) estão fortemente ligados à lignina. Exemplos de biomassa lignocelulósica para ser hidrolisada para uso na presente invenção incluem os resíduos agrícolas (incluindo palha de milho e bagaço de cana), resíduos de madeira (inclusive restos de serraria e de fábrica de papel), e resíduos de papel (municipal).

Métodos para hidrólise de biomassa, como lignoceluloses, são conhecidos na técnica por si e incluem, por exemplo ácidos, tais como ácido sulfúrico e enzimas, tais como celulases e hemicelulases.

[085] No processo da invenção, as fontes de xilose, glucose e arabinose podem ser xilose, glucose e arabinose, como tais (por exemplo, como os açúcares monoméricos) ou podem estar sob a forma de qualquer hidrato de carbono oligo- ou polimérico contendo xilose, glucose e/ou unidades de arabinose, como por exemplo de lignocelulose, arabinanos, xilanos, celulose, amido e afins. Para libertação de xilose, glucose e/ou unidades de arabinose a partir de tais hidratos de carbono, carboidrases apropriadas (tais como arabinases, xilanases, glucanases, celulases, amilases, glucanases e semelhantes) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. Neste último caso, a célula hospedeira pode ser modificada por engenharia genética para produzir e excretar tais carboidrases. Uma vantagem adicional do uso de fontes de glicose de polímeros ou oligo- é que permite manter um nível baixo (ou mais baixo) de concentração de glicose livre, durante a fermentação, por exemplo, usando quantidades de carboidrases limitantes de velocidade de preferência durante a fermentação. Isto, por sua vez, irá impedir a repressão dos sistemas necessários para o metabolismo e o transporte de açúcares não-glicose, tais como xilose e arabinose. Em um processo preferido, a célula hospedeira modificada fermenta tanto a glucose e pelo menos uma de xilose e de arabinose, de preferência simultaneamente, caso em que, de preferência é utilizada uma célula hospedeira modificada que é insensível à repressão de glicose para prevenir o crescimento diáuxico. Além de uma fonte de pelo menos uma de xilose e de arabinose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação irá ainda compreender o ingrediente adequado necessário para o crescimento da célula hospedeira modificada. As composições de meios de fermentação para crescimento de microrganismos eucarióticos, tais como leveduras, são bem conhecidas na técnica.

[086] No processo da invenção, o meio de um modo mais preferido compreende e/ou é alimentado com uma fonte de glicerol. Glicerol para uso no processo da presente invenção pode vantajosamente ser o glicerol que é gerado como um subproduto na produção de biodiesel a partir de reações de transesterificação usando óleos vegetais ou de gorduras animais e de um álcool.

[087] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbio ou anaeróbio. Um processo de fermentação anaeróbio é aqui definido como um processo de fermentação realizado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, mais preferencialmente, 0 mmol/L/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem tanto como dadoras de elétrons e como aceitadoras de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na glicólise e na formação de biomassa não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver este problema muitos microrganismos utilizam piruvato ou um de seus derivados como um aceitante de elétrons e de hidrogênio regenerando assim NAD+. Assim, em um processo de fermentação anaeróbica preferido, piruvato é utilizado como um aceitador de elétrons (e de hidrogénio) e é reduzido em produtos de fermentação, tais como etanol, bem como em produtos de fermentação não-etanol, tais como ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1,3-

propano-diol, butanois (1-butanol, 2-butanol, iso-butanol) produtos derivados de isoprenóides. Os processos anaeróbios da invenção são preferidos em relação aos processos aeróbios pois os processos anaeróbios não necessitam de investimentos e de energia para o arejamento e, além disso, processos anaeróbios produzem maiores rendimentos de produto do que os processos aeróbios.

[088] Alternativamente, o processo de fermentação da presente invenção pode ser executado sob condições aeróbicas limitadas em oxigênio. De preferência, num processo aeróbico sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais de preferência pelo menos 6, e ainda mais preferencialmente pelo menos 7 mmol/L/h. Em um processo de fermentação aeróbico limitado em oxigênio preferido da invenção, a célula de levedura da invenção consome menos do que 30, 20, 18, 15, 12, 10, 8 ou 5% da quantidade de oxigênio numa base C-molar relacionada com a fonte de carbono consumida durante a conversão da fonte de carbono no produto de fermentação. O coeficiente de conversão de oxigênio consumido em relação ao substrato utilizado em uma base C- molar (COS) é aqui entendido como mol de O2 usado por C-mol consumido de fonte de carbono. Assim, um processo da invenção pode ser realizado sob condições anaeróbicas estritas (ou seja, COS = 0,0), ou o processo da invenção pode ser realizado sob condições aeróbicas, de preferência limitadas em oxigênio, em que o COS é de preferência inferior a 0,3, 0,2, 0,18, 0,15, 0,12, 0,1, 0,08 ou 0,05.

[089] O processo de fermentação é preferivelmente realizado a uma temperatura que é ótima para as células modificadas da invenção. Assim, para a maioria das células de leveduras, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que é inferior a 42°C, de preferência inferior a 38°C. Para as células de levedura, o processo de fermentação é preferivelmente realizado a uma temperatura que é menor do que 35, 33, 30 ou 28°C e a uma temperatura que é mais elevada do que 20, 22 ou 25°C.

[090] Um processo de fermentação preferido de acordo com a invenção é um processo para a produção de etanol, em que o processo compreende o passo de fermentar um meio com uma célula de levedura, em que o meio contém ou é alimentado com: a) uma fonte de pelo menos uma de uma hexose e uma pentose; b) uma fonte de ácido acético; e, c) uma fonte de glicerol, em que a célula de levedura fermenta o ácido acético, glicerol e, pelo menos, uma das hexoses e pentoses em etanol e, opcionalmente, b) recuperação do etanol. O meio de fermentação pode ainda ser efetuado como descrito acima. No processo, a produtividade volumétrica de etanol é preferencialmente de pelo menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 e 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol de xilose e/ou glucose e/ou arabinose e/ou etil e/ou glicerol no processo é de preferência pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98%. O rendimento de etanol é aqui definido como uma percentagem do rendimento teórico máximo, que, para a xilose, glucose e arabinose é de 0,51 g de etanol por g. de xilose, glucose ou arabinose. Para glicerol o rendimento máximo teórico é de 0,50 g. de etanol por g. de glicerol e para o ácido acético, o rendimento teórico máximo é de 0,77 g. de etanol por g. de ácido acético.

[091] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações é usado em seu sentido não limitante para significar que os itens seguintes à palavra estão incluídos, mas que os itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais do que um dos elementos está presente, a menos que o contexto claramente exija que haja um, e apenas um, dos elementos. O artigo indefinido "um" ou "uma", portanto, geralmente significa "pelo menos um".

[092] Todas as referências de patentes e literatura citadas na presente descrição são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[093] Os exemplos que se seguem são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção de qualquer forma.

Descrição das Figuras

[094] Figura 1. A evolução dos níveis líquidos de glicerol (g/l) (ou seja, a produção menos o consumo) ao longo do tempo (horas) é mostrada para as cepas RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 e RN1189 de S.

cerevisiae.

[095] Figura 2. A evolução dos níveis líquidos de ácido acético (g/l) (ou seja, a produção menos o consumo) ao longo do tempo (horas) é mostrada para as cepas RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 e RN1189 de S.

cerevisiae.

Exemplos

1. Ensaios de atividade de enzima

[096] Extratos celulares para ensaios de atividade foram preparados a partir de culturas em lotes aeróbicos ou anaeróbicos em crescimento exponencial e analisadas quanto ao teor de proteína, como descrito por Abbot et al.,(2009, Appl. Environ. Microbiol. 75: 2320-2325).

[097] Atividade de acetaldeído desidrogenase dependente de NAD+ (EC 1.2.1.10) foi medida a 30°C através da monitorização da oxidação de NADH a 340 nm. A mistura de reação (volume total de 1 ml) continha 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5), 0,15 mM de NADH, e extrato de células. A reação foi iniciada pela adição de 0,5 mM de acetil-Coenzima A.

[098] Para a determinação da atividade de glicerol-3- fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.8), os extratos celulares foram preparados como descrito acima, exceto que o tampão de fosfato foi substituído por tampão de trietanolamina (10 mM, pH 5). Glicerol-3-fosfato desidrogenase foi testada em extratos de células a 30°C tal como anteriormente descrito (Blomberg e Adler, 1989, J. Bacteriol. 171: 1087-1092,9).

Taxas de reação foram proporcionais às quantidades de extrato celular adicionados.

[099] A atividade de acetil-CoA sintase (EC 6.2.1.1) foi medida como descrito por Frenkel e Kitchens (1977, J.

Biol. Chem. 252: 504-507), que é uma modificação do método de Webster (Webster, 1969, Methods Enzymol. 13: 375-381).

Formação de NADH é medido espetrofotometricamente quando a acetil-CoA produzida é acoplada por reações com citrato sintase e malato desidrogenase. O sistema de ensaio continha 100 mM de Tris-Cl (pH 7,6), 10 mM de MgCl2, 6 mM de ATP, 5 mM de malato, 1 mM de NAD+, 0,1 mM de NADH, 2,5 mM de ditiotreitol ou 2-mercaptoetanol, 0,2 mM de coenzima A, 25 µg de citrato sintase (80 unidades/mg), 20 µg de malato desidrogenase (1.000 unidades/mg), e 10 mM de acetato, e a taxa de reação foi medida a 340 nm e calculada a partir do coeficiente de extinção de NADH (6,22 x 106 cm2/mol).

[100] A atividade da glicerol desidrogenase e dihidroxiacetona quinase são medidas a 30°C, em extratos de células, essencialmente como descrito anteriormente (Gonzalez et al., 2008, Metab. Eng. 10, 234-245). As atividades enzimáticas de glicerol desidrogenase e dihidroxiacetona quinase são relatadas como µmols de substrato/min/mg de proteína celular.

2. Construção de cepas

[101] Todas as modificações começam com a cepa RN1008 his- fermentadora de xilose e arabinose. RN1008 his-, também aqui referida como RN1041, é uma cepa fermentadora de arabinose e xilose baseada em CEN.PK) com o genótipo: Mat a, ura3-52, leu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-Ptpi::TAL1, loxP-Ptpi::RKI1, loxP-Ptpi-TKL1, loxP- Ptpi-RPE1, delta:: -LEU2, delta:: Padh1XKS1Tcyc1-URA3-Ptpi- xylA-Tcyc1, delta:: LEU2-AAAaraABD.

Mat a = mating type a Mutações ura3-52, leu2-112, his3::loxP nos genes ura3, leu2 e his3 são complementadas pela construção de superexpressão xylA-XKS, leu2 é complementado pela construção de superexpressão AraABD. his3 poderia ser utilizada para a seleção de plasmídeos adicionais, RN1041 precisa de histidina no meio de crescimento.

gre3::loxP = deleção do gene gre3 codificando xilose redutase, o local loxP é deixado após a retirada do marcador.

loxP-PTPI .....= superexpressão da via de het pentose fosfato, o local loxP a montante do promotor constitutivo é deixado após a retirada do marcador delta:: = integração da construção após a recombinação nas repetições terminais longas do retrotranspóson Ty1.

AAAaraABD = genes araA, araB e araD de Arthrobacter aurescens otimizado para códons, (ver WO2009/011591) Construções de eliminação para GPD1 e GPD2

[102] A deleção de GPD1 em RN1041 produz a cepa RN1197. A deleção de GPD2 em RN1041 produz a cepa RN1198.

Nesta cepa posteriormente gpd1 é eliminado para produzir a cepa RN1199. Nestas cepas, plasmídeos foram introduzidos para a superexpressão dos genes ACS (RN1200 a RN1207, Tabela 4) e mais genes, tal como indicado na Tabela 4.

gpd1::hphMX

[103] Os iniciadores gpd1uf, gpd1ur, gpd1df e gpd1dr são utilizados para a amplificação de fragmentos de sequências genômicas a montante e a jusante do gene GPD1 para a sua inativação. Ambos os fragmentos de GPD1 a montante e a jusante, são clonados num vetor Blunt TOPO (Invitrogen) para se obter pGPD1up e pGPD1down, respectivamente.

gpd1uf: AAGCTTGGTACCCGCCTTGCTTCTCTCCCC (SEQ ID NO: 41) gpd1ur: TCTAGACCAGCATTCAAGTGGCCGGA (SEQ ID NO: 42) gpd1df: CGTACGAGTTGTTGAATGGCCAATCCGCT (SEQ ID NO: 43) gpd1dr: CCATGGTACCGAGTGGTGTTGTAACCACCCT (SEQ ID NO: 44) gpd1cf: ACCAATACGTAAACGGGGCG (SEQ ID NO: 45) gpd1cr: AATACACCCATACATACGGACGC (SEQ ID NO: 46)

[104] O plasmídeo pRN593 (SEQ ID NO: 40) é construído por ligação do fragmento cortado com Hind III e XbaI de pGPD1up com o fragmento hphMX cortado com SpeI e BsrGI (coleção de plasmídeos C5YeastCompany) e do fragmento cortado com BsiWI e NcoI de pGPD1down para o vetor T/A (Invitrogen) cortado com HindIII e NcoI. O plasmídeo pRN593 é cortado com Kpn1 para obter o fragmento de deleção para interromper a cópia genômica (SEQ ID NO: 17). A mistura de fragmentos lineares é utilizada para a transformação de levedura. Os transformantes são selecionados por resistência a higromicina. Integração correta resulta na deleção da fase de leitura aberta GPD1. A integração é verificada por PCR com os iniciadores gpd1cf e gpd1cr.

gpd2::natMX

[105] Os iniciadores GPD2uf, GPD2ur, GPD2df e GPD2dr são utilizados para a amplificação de sequências de fragmentos gnômicos a montante e a jusante do gene GPD2 para a sua inativação. Um fragmento de 407bp de PCR a montante com um local AflII na extremidade 3' (derivado da sequência GPD2) e um local BglII na extremidade 5' (para o isolamento da construção de deleção) é amplificado utilizando GPD2uf, GPD2ur e clonado em pCR2.1 (topo T/A, Invitrogen).

GPD2uf: GGTACCAGATCTTTTGCGGCGAGGTGCCG (SEQ ID NO: 32) GPD2ur: TCTAGACTTAAGGAATGTGTATCTTGTTAATCTTCTGACAGC (SEQ ID NO: 33)

[106] Um fragmento de 417bp de PCR a jusante com um local XhoI na extremidade 5', e um local BglII na extremidade 3' é amplificado utilizando GPD2df e GPD2dr.

GPD2df: CTCGAGATAGTCTACAACAACGTCCGCA (SEQ ID NO: 34) GPD2dr: CCATGGAGATCTGCAGTGAAAAAGCTCGAAGAAACAGCT (SEQ ID NO: 35)

[107] Para a construção final o plasmídeo contendo o fragmento a montante é cortado com AflII e Kpn, o fragmento a jusante é cortado com XhoI e NcoI e o marcador natMX (plasmid collection Royal Nedalco) é cortado com AflII e XhoI e os fragmentos são ligados para produzir o plasmídeo pRN594 (SEQ ID NO: 36). pRN594 é cortado com BglII antes da transformação da levedura. Os transformantes são selecionados para resistência a nourseotricina. Integração correta é verificada por PCR.

Método de clonagem para superexpressão de genes ACS1 e ACS2 de Saccharomyces cerevisiae

[108] A fase de leitura aberta ACS1 é amplificado por PCR com os iniciadores acslf e acslr.

acs1f: TTAAGCTTAAAATGTCGCCCTCTGCCGT (SEQ ID NO: 47) acs1r: AAGCGCGCTACAACTTGACCGAATCAATTAGATGTCTAACAATGCCAGGG (SEQ ID NO: 48)

[109] Este fragmento de PCR é cortado com as enzimas de restrição HindIII e BssHII e ligado ao fragmento promotor TEF1 cortado com Sa1I e HindIII (coleção C5YeastCompany) e com o fragmento terminador ADH1 cortado com BssHII e BsiWI (coleção C5YeastCompany). Este fragmento combinado é amplificado por PCR com iniciadores específicos de promotor e terminador e clonados no vetor Blunt TOPO (Invitrogen) para dar pACS1.

[110] A fase de leitura aberta ACS2 é amplificado por PCR com os iniciadores acs2f e acs2r.

acs2f: AACTGCAGAAAATGACAATCAAGGAACATAAAGTAGTTTATGAAGCTCA (SEQ ID NO: 49) acs2r: ACGTCGACTATTTCTTTTTTTGAGAGAAAAATTGGTTCTCTACAGCAGA (SEQ ID NO: 50)

[111] Este fragmento de PCR é cortado com as enzimas de restrição PstI e SalI e ligado ao fragmento promotor PGK1 cortado com SpeI e PstI (coleção C5YeastCompany) e ao fragmento terminador PGI1 cortado com XhoI e BsiWI (coleção C5YeastCompany). Este fragmento combinado é amplificado por PCR com iniciadores específicos de promotor e terminador e clonados no vetor Blunt TOPO (Invitrogen) para dar o plasmídeo pACS2.

[112] A construção de superexpressão ACS1 é cortada a partir de pACS1 com as enzimas de restrição SalI e BsiWI, a construção de superexpressão ACS2 é cortada a partir de pACS2 com as enzimas de restrição SpeI e BsiWI, o marcador KanMX é cortado com BspEI e XbaI (coleção de plasmídeos C5YeastCompany). Estes fragmentos são ligados ao plasmídeo pRS306 + 2mu ORI (coleção de plasmídeos C5YeastCompany) cortado com BspEI e XhoI para dar o plasmídeo final pRN753 (SEQ ID NO: 51). Este plasmídeo é usado para transformar as cepas de levedura, tal como indicado na Tabela 4 e os transformantes são selecionados para resistência a G418. A superexpressão é verificada por qPCR. Um plasmídeo alternativo que pode ser utilizado para a superexpressão de ACS1 e ACS2 é pRN500 (SEQ ID NO: 20).

A expressão de adhE de E. coli, ADH2 de E. histolytica ou FHPM de E. coli

[113] O promotor PGK1 (SpeI-PstI) e a sequência de terminação ADH1 (AflII-NotI) são adicionados aos fragmentos sintéticos otimizados para códons e clonados em pRS303 com 2µ ori cortado com SpeI e NotI e a construção de expressão é clonada neste vetor. A expressão é verificada por qPCR.

Sequências otimizadas para códons para FHPM de E. coli (SEQ ID NO: 2), adhE de E. coli (SEQ ID NO: 4) e ADH2 de E.

histolytica (SEQ ID NO: 6) são tal como indicado na listagem de sequências.

[114] Para a expressão do gene mhpF de E. coli, um fragmento promotor de PGK1 de levedura (SpeI-PstI) e um fragmento terminador de ADH1 (AflII-NotI) (ambos a partir da coleção de plasmídeos Nedalco) foram ligados no fragmento sintético otimizados para códons que codificam mhpF de E. coli (SEQ ID NO: 2). pRS 303 com 2µ ori (= pRN347, coleção de plasmídeos Real Nedalco) foi cortado com SpeI e NotI e a construção de expressão mhpF foi clonada neste vetor para produzir pRN558 (SEQ ID NO: 29).

[115] Para a expressão do gene adhE de E. coli, um fragmento sintético otimizado para códons que codifica para adhE de E. coli (SEQ ID NO: 4) foi cortado com XbaI e AflII e ligado a pRN558 cortado com XbaI e AflII (substituindo o gene mhpF de E. coli no pRN558) para produzir pRN595 (SEQ ID NO: 30).

[116] Para a expressão de adh2 de Entamoeba histolytica, um fragmento sintético otimizado para códons que codifica a adh2 de E. histolytica (SEQ ID NO: 6) é cortado com XbaI e AflII e ligado no pRN558 cortado com

XbaI e AflII (substituindo o gene mhpF de E. coli em pRN558) para produzir pRN596 (SEQ ID NO: 31).

[117] pRN595 é utilizado para posterior construção de pRN957 e pRN977 (ver abaixo). É claro que pRN558 e pRN596 podem ser usados da mesma forma, substituindo assim a expressão de adhE de E. coli com de mhpF de E. coli ou adh2 de E. histolytica, respectivamente.

Expressão de gldA de E. coli

[118] A construção para a expressão em levedura de gldA de E. coli foi feita através da ligação de um fragmento promotor ACT1 de levedura (cortado com as enzimas de restrição SpeI e PstI), uma ORF sintética (SEQ ID NO: 21), que codifica para gldA de E. coli, (cortada com PstI e BssHII) e fragmento terminador CYC1 de levedura (cortado com BssHII e BsiWI) juntos em pCRII blunt (Invitrogen) para produzir pRNgldA (SEQ ID NO: 28).

Superexpressão de DAK1

[119] PCR é realizada em DNA gnômico de S. cerevisiae com os iniciadores introduzindo um local de XbaI a 5' do ATG e um local de SalI a 3' de TAA para produzir o fragmento da SEQ ID NO: 22. Um fragmento de DNA que compreende o promotor TPI1 de S. cerevisiae é ligado a montante do fragmento da ORF de DAK1 e o fragmento DNA compreendendo o terminador PGI1 de S. cerevisiae é ligado a jusante da ORF de DAK1 para produzir pRNDAK (SEQ ID NO: 38).

Expressão de dhak de C. freundii

[120] A construção para a expressão em levedura de dhak de Citrobacter freundii foi feito através da ligação do fragmento promotor TPI1 de levedura (cortado com as enzimas de restrição XhoI e XbaI), uma ORF sintética (SEQ ID NO: 26), que codifica para dhak de C. freundii, (cortado com XbaI e SalI) e um fragmento terminador PGI1 de levedura (cortado com XhoI e BsiWI) juntos em pCRII blunt (Invitrogen) para dar pRNdhaK (SEQ ID NO: 27).

Superexpressão de GUP1

[121] PCR é realizada em DNA genômico de S. cerevisiae com iniciadores que introduzem um local HindIII a 5' do ATG e um local BamHI a 3' do TAA para produzir o fragmento de SEQ ID NO: 23. Um fragmento de DNA compreendendo o promotor TDH3 de S. cerevisiae é ligado a montante do fragmento da ORF de GUP1 e DNA compreendendo o fragmento terminador de CYC1 de S. cerevisiae é ligado a jusante da ORF de GUP1.

Superexpressão de FPS1

[122] PCR é realizada em DNA genômico de S. cerevisiae com iniciadores que introduzem um local NsiI a 5' do ATG e um local BamHI a 3' do TAA para produzir o fragmento de SEQ ID NO: 24. Um fragmento de DNA compreendendo o promotor (médio) ADH1 de S. cerevisiae é ligado a montante do fragmento da ORF de FSP1 e DNA que compreende o fragmento terminador de CYC1 de S. cerevisiae é ligado a jusante da ORF de FSP1.

Construção de pRN347 e cepa RN1151 de levedura

[123] pRN347 é construído por clonagem da origem de replicação 2µ (que foi amplificado por PCR a partir de pYES2) em pRS303 (com o gene HIS3 para complementação).

RN1041 é transformada com o plasmídeo pRN347 para produzir a cepa RN1151.

As cepas expressando gldA de E. coli e dhak de C.

freundii ou superexpressando DAK1

[124] Para a construção de pRN957, a construção de expressão de gldA de E. coli é cortada a partir do plasmídeo pRNgldA com as enzimas de restrição SpeI e BsiWI.

A construção de expressão de dhak de C. freundii é cortada a partir do plasmídeo pRNdhaK com as enzimas de restrição XhoI e BsiWI. Estes fragmentos são ligados ao plasmídeo pRN595 cortado com as enzimas de restrição SpeI e SalI para produzir pRN957 (SEQ ID NO: 37).

[125] Para a construção de pRN977, a construção de expressão de gldA de E. coli é cortada a partir do plasmídeo pRNgldA com as enzimas de restrição SpeI e BsiWI.

A construção de expressão DAK1 é cortada a partir do plasmídeo pRNDAK com as enzimas de restrição XhoI e BsiWI.

Estes fragmentos são ligados ao plasmídeo pRN595 cortado com as enzimas de restrição SpeI e SalI para produzir pRN977 (SEQ ID NO: 39).

[126] Plasmídeos pRN957 e pRN977 são usados para transformar RN1041, RN1197, RN1198 e RN1199 para produzir as cepas de levedura, tal como indicado na Tabela 4.

[127] Tabelas 4 A e B: Visão geral das cepas construídas

Tabela 4A ACS1 ACS2 GPD1 GPD2 adhE DAK1 Cf dhaK Ec gldA HIS3 Marcador de cepa kanMX kanMX hphMX natMX HIS3 HIS3 HIS3 HIS3 RN1041 wt wt wt wt ausente wt ausente ausente del RN1151 wt wt wt wt ausente wt ausente ausente wt RN1197 wt wt del wt ausente wt ausente ausente wt RN1198 wt wt wt del ausente wt ausente ausente wt RN1199 wt wt del del ausente wt ausente ausente wt RN1200 up up wt wt expressão up ausente expressão RN1201 up up wt wt expressão wt expressão expressão RN1202 up up del wt expressão up ausente expressão RN1203 up up del wt expressão wt expressão expressão RN1204 up up wt del expressão up ausente expressão RN1205 up up wt del expressão wt expressão expressão RN1206 up up del del expressão up ausente expressão RN1207 up up del del expressão wt expressão expressão Table 4B ACS1/2 gpd1∆ gpd2∆ adhE, gldA, DAK1 adhE, gldA, dhaK HIS3 RN1041 RN1151 pRN347 RN1197 pRN593 pRN347 RN1198 pRN347 RN1199 pRN593 pRN594 pRN347 RN1200 pRN753 pRN957 RN1201 pRN753 pRN977 RN1202 pRN753 pRN593 pRN957 RN1203 pRN753 pRN593 pRN977 RN1204 pRN753 pRN594 pRN957 RN1205 pRN753 pRN594 pRN977 RN1206 pRN753 pRN593 pRN594 pRN957 RN1207 pRN753 pRN593 pRN594 pRN977

3. Fermentações anóxicas em meio estéril de peptona de extrato de levedura com cepas construídas na presença e na ausência de glicerol e ou de ácido acético

[128] A prova de conceito da redução concomitante de ácido acético e da oxidação do glicerol foi obtido utilizando-se um meio contendo 1% de extrato de levedura e 1% de peptona. As experiências foram realizadas em cultura em quimiostato (volume de trabalho de 1 litro), a D = 0,05 h-1 e o pH foi mantido a 5,5 por adição automática de ou KOH ou de H2SO4. Glicose (50 g/l) e xilose (50 g/l) foram adicionados como fonte de carbono e de energia ao meio de peptona de extrato de levedura. Para estas experiências demonstrando a prova de conceito, nenhuma arabinose foi incluída. Onde relevante, ácido acético foi adicionado ao meio de peptona de extrato de levedura a 4 g/L e glicerol a 10 g/l. A temperatura foi mantida a 32°C.

[129] Pré-culturas das cepas são preparadas por inoculação de uma cultura de estoque de glicerol congelado da levedura em um meio YP (extrato de levedura a 1% p/v e peptona a 1% p/v) com a adição de cada um dos açúcares glicose e xilose (cada a 1% p/v) a 32°C e pH 5,5. Após 24 h de incubação, sob condições óxicas em frascos de agitação, 50 ml desta cultura é usada para inocular as culturas em quimiostato.

[130] Num estado estacionário das fermentações (5 alterações de volume), foi retirada uma amostra para análise do consumo de açúcar (glicose e xilose), consumo de ácido acético, e metabolito (etanol e glicerol). As concentrações de etanol, glicerol e ácido acético são monitorados por análise de HPLC. Para determinar o consumo de açúcar, glicose e xilose são determinadas por análise de HPAEC (Dionex).

[131] A cepa RN1151 não é capaz de atingir uma situação de estado estacionário no meio que contém 4 g/L de ácido acético ou na presença ou na ausência de glicerol. Se nenhum ácido acético é adicionado ao meio, o organismo no estado estacionário consumiu toda a glicose e xilose (menos de 1 g/L remanescente). Nenhum glicerol foi consumido, mas em vez disso, foi produzido.

[132] As cepas RN1200 e RN1201 são igualmente testadas em meio com ácido acético e com ou sem glicerol adicionado.

Essas cepas tiveram um desempenho distintamente diferente do da cepa RN1151. No meio contendo glicerol os açúcares glicose e xilose são consumidos quase até a conclusão (menos de 1 g/L remanescente). Os níveis de ácido acético diminuem para 0,5 g/L e as concentrações de glicerol no final da fermentação são de 3 g/L, em todos os três casos.

As quantidades de etanol produzidos pela cepa RN1200 e RN1201 variaram entre 43 e 47 g/L em várias experiências.

No meio não contendo glicerol, mas contendo 4 g/L de ácido acético, nenhum estado estacionário estável foi obtido. As cepas não podem crescer sob estas condições. A partir destes resultados conclui-se que a expressão dos genes gldA e adhE de E. coli em combinação com a regulação positiva de DAK1 ou expressão de dhak de C. freundii tem um efeito profundo no desempenho das cepas. Na presença de glicerol, são capazes de consumir o glicerol e o ácido acético.

[133] As cepas RN1202 para RN1207 são semelhantes às cepas RN1200 e RN1201, exceto pelo fato de que os genes GPD1 e/ou GPD2 foram excluídos. No meio que continha 4 g/L de ácido acético, os açúcares glicose e xilose são consumidos quase até a conclusão (menos de 1 g/L remanescente), se glicerol for adicionado ao meio como é o caso para as cepas RN1200 e RN1201. Se nenhum glicerol for adicionado, nenhum estado estável é obtido.

4. Fermentações anóxicas com as cepas construídas, em ácido acético compreendendo hidrolisados lignocelulósicos na presença ou na ausência de glicerol

[134] O hidrolisado de fibra de milho contém: glucose (38 g/l), xilose (28 g/l), arabinose (12 g/l) e ácido acético (4 g/l). Tinha sido preparado por tratamento de fibras de milho, a 160°C e pH 3,0 durante 20 minutos, seguido por hidrólise enzimática por celulases e hemicelulases. O ácido acético foi adicionado a este hidrolisado resultando numa concentração total de ácido acético, no hidrolisado, de 10 g/l. O pH deste hidrolisado enriquecido em ácido acético, foi restaurado a pH = 4,5 por adição de KOH. Extrato de levedura foi adicionado a este hidrolisado para atingir uma concentração final de 5 g/l.

Em todas as experiências subsequentes, foi empregue este hidrolisado enriquecido. O pH durante as fermentações foi mantido a 6,5 por adição automática de KOH ou H2SO4.

[135] Pré-culturas das cepas são preparadas por inoculação de uma cultura de estoque de glicerol congelado da levedura em um meio YP (extrato de levedura a 1% p/v e peptona a 1% p/v) com a adição de cada um dos açúcares glicose, xilose e de arabinose (cada a 1% p/v) a 32°C e pH 5,5. Após 24 h de incubação, sob condições óxicas em frascos de agitação, 50 ml desta cultura é usada para inocular as culturas de fermentação. As fermentações são realizadas em uma configuração de fermentação em batelada alimentada. Hidrolisado (com ou sem glicerol a 50 g/l) é bombeado para o fermentador. Se nenhum glicerol foi adicionado, então foi adicionado 40 ml de água. Durante as primeiras 6 horas, a taxa de fluxo para o hidrolisado é ajustado a uma velocidade de 5 ml por hora. Durante as 6 horas seguintes, a taxa de fluxo é fixada em 10 ml por hora. Posteriormente, durante outras 43 horas, a taxa de fluxo é fixada em 20 ml por hora. O volume total no final da fermentação atinge 1000 ml. Estas fermentações em batelada alimentada anóxicas são realizadas a cerca de pH = 4,5, com agitação suave a 100 rpm. A temperatura durante as fermentações é fixada em 32°C. Para minimizar a infecção, os hidrolisados são aquecidos durante 10 min a 105°C antes das fermentações e o antibiótico canamicina com uma concentração final de 50 µg/ml é adicionado.

[136] No final das fermentações, após 55 h, foi retirada uma amostra para análise do consumo de açúcar (glucose, xilose e arabinose), consumo de ácido acético, e metabolito (etanol e glicerol). As concentrações de ácido acético, etanol, e glicerol são monitoradas ao longo do tempo por análise de HPLC. Para determinar o consumo de açúcar, glicose, xilose, arabinose são determinadas por análise de HPAEC (Dionex).

[137] A cepa RN1151 (= RN1041 complementado com HIS3) foi testada no hidrolisado, com ou sem glicerol. Em ambos os casos, a concentração de glucose no final do prazo de fermentação (55 h) é de 35 g/l, enquanto a xilose e arabinose permanecem nas suas concentrações iniciais de 28 e 12 g/l, respectivamente. As quantidades de etanol produzidas são de 2 g/L e ácido acético está presente em 9,5 g/l. Nenhum consumo de glicerol é detectado no hidrolisado contendo glicerol. A fermentação dos açúcares é interrompida durante o curso da operação em batelada alimentada por causa dos níveis crescentes de ácido acético. Inicialmente, nenhum ácido acético está presente no fermentador, mas durante o bombeamento do hidrolisado que continha níveis tóxicos de ácido acético, a concentração atinge rapidamente níveis tóxicos.

[138] As cepas RN1200 e RN1201 são igualmente testadas em hidrolisado, com ou sem glicerol. Essas cepas têm desempenhos distintamente diferentes da cepa RN1151. No hidrolisado contendo glicerol, o açúcares glicose, xilose e arabinose são consumidos até a conclusão. Os níveis de ácido acético diminuem para 2 g/L e as concentrações de glicerol, no final da fermentação, são de 29,5 g/l, em todos os três casos. As quantidades de etanol produzidas pelas cepas RN1200 e RN1201 são de 51,7 e 52,2 g/l, respectivamente. No hidrolisado que não contêm glicerol, consideravelmente menos do açúcar é consumido. Níveis de xilose e arabinose ficam inalterados em 28 e 12 g/l, respectivamente. A glucose é consumida, mas apenas de forma limitada. No final da fermentação, a concentração remanescente é de 32 g/l, em todos os três casos, com etanol alcançando uma concentração de 3 g/l. A concentração de ácido acético cai para 9,1 g/L no final da fermentação, enquanto algum glicerol é produzido (menos de 0,5 g/l). A partir destes resultados conclui-se que a expressão dos genes gldA e adhE de E. coli em combinação com a regulação positiva de DAK1 ou a expressão de dhak de C. freundii tem um efeito profundo no desempenho das cepas. Na presença de glicerol, são capazes de consumir o glicerol e ácido acético, e produzem etanol adicional (em comparação com a cepa RN1151). Na ausência de glicerol, as cepas consomem algum ácido acético. Mas durante a fermentação, o nível de ácido acético sobe para níveis tóxicos.

[139] As cepas de RN1202 a RN1207 são semelhantes às cepas RN1200 e RN1201, exceto pelo fato de que os genes GPD1 e/ou GPD2 foram excluídos. No hidrolisado contendo glicerol, os açúcares glicose, xilose e arabinose são consumidos até a conclusão, como foi o caso para a cepa RN1200. Os níveis de ácido acético de forma semelhante diminuíram até cerca de 2 g/L e as concentrações de glicerol, no final da fermentação são de 28 g/L nestes três casos. As quantidades de etanol produzidos pelas cepas RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 e RN1207 são 51,6, 52,9, 52,1, 52,5, 53,1 e 52,3 g/l, respectivamente. No hidrolisado que não contem glicerol, consideravelmente menos açúcar é consumido. Níveis de xilose e arabinose ficam inalterados em 28 e 12 g/l, respectivamente. A glucose é consumida, mas apenas de forma limitada. No final da fermentação, no hidrolisado sem glicerol, a concentração remanescente de glucose é de 31 g/l, em todos os três casos, com etanol alcançando uma concentração de 3 g/l. A concentração de ácido acético cai para 9,1 g/L no final da fermentação, enquanto algum glicerol é produzido (menos de 0,5 g/l). A partir destes resultados podemos concluir que a exclusão de genes GPD1 e/ou GPD2 junto com as outras modificações em RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 e RN1207 resultam em cepas que podem realizar as reações desejadas.

Materiais e Métodos para os Exemplos 5 a 8 Técnicas gerais de biologia molecular

[140] Salvo indicação em contrário, os métodos usados são técnicas bioquímicas convencionais. Exemplos de livros de texto de metodologia geral adequados incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Meios

[141] Os meios usados nas experiências foram ou meio YEP (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L peptona) ou meio YNB sólido (6,7 g/L de base de azoto de levedura, 15 g/L de ágar), suplementado com açúcares tal como indicado nos exemplos. Para meio YEP sólido, 15 g/L de ágar foi adicionado ao meio líquido, antes da esterilização.

[142] Nas experiências de AFM, meio mineral foi utilizado. A composição de meio mineral foi descrita por Verduyn et al. (Yeast (1992), volume 8, 501-517) e foi suplementado com 2,325 g/L de ureia e de açúcares, como indicado nos exemplos.

A transformação de células de levedura

[143] Transformação da levedura foi realizada de acordo com o método descrito por Schiestl e Gietz (Current Genetics (1989), Volume 16, 339-346).

PCR de colônia

[144] O DNA genômico foi extraído de colónias individuais de leveduras para PCR de acordo com o método descrito por Looke et al. (BioTechniques (2011), Volume 50, 325-328). Procedimento AFM

[145] O Alcohol Fermentation Monitor [monitor de fermentação de álcool] (AFM; Halotec, Veenendaal, Países Baixos) é um biorreator paralelo de laboratório robusto e fácil de usar que permite comparações precisas de taxas de conversão de carbono e de rendimentos para seis fermentações anaeróbias simultâneas.

[146] A cultura inicial da experiência de AFM continha 50 mg de levedura (peso seco). Para determinar isto, uma curva de calibração foi feita da cepa RN1041 de biomassa versus OD700. Esta curva de calibração foi utilizada na experiência para determinar o volume de cultura de células necessário para 50 mg de levedura (peso seco).

[147] Antes do início da experiência de AFM, pré- culturas foram cultivadas como indicado nos exemplos. Para cada cepa o OD700 o foi medido e 50 mg de levedura (peso seco) foi inoculada em 400 ml de meio mineral (Verduyn et al. (Yeast (1992), volume 8, 501-517), suplementado com 2,325 g/L de ureia e açúcares, como indicado nos exemplos.

Ensaio da atividade glicerol desidrogenase.

[148] O método para a determinação do ensaio da atividade glicerol desidrogenase foi adoptado a partir de Lin e Magasanik (1960) J Biol Chem.235: 1820-1823.

[149] Tabela 5: Condições de ensaio 1,0 M de tampão de 800 µl carbonato/bicarbonato pH 10

1.0 M sulfato de amónio 33 µl

0.1 M NAD+ 33 µl Extrato livre de células 5 µl

[150] Extrato livre de células foi preparado colhendo células por centrifugação. As células foram recolhidas na fase exponencial. O sedimento de células foi lavado uma vez com 1 M de tampão de carbonato/bicarbonato (pH10) e um extrato livre de células foi preparado do mesmo por meio da adição de esferas de vidro e misturado num misturador de vórtice à velocidade máxima durante intervalos de 1 minuto até que as células foram rompidas. Isto foi verificado microscopicamente.

Experiências em frascos de agitação

[151] Experiências em frascos de agitação anaeróbios foram realizadas tal como indicado nos exemplos.

Experiências típicas utilizam frascos Erlenmeyer de 100 ml com 25 ml de meio. De modo a assegurar condições de anaerobiose, o frasco foi fechado com uma válvula hidráulica.

[152] Para cada ponto de tempo, um frasco de agitação separado foi inoculado, evitando assim o arejamento durante as amostragens.

Cepas

[153] A cepa progenitora usada nas experiências descritas nos exemplos 5 a 8 é a RN1041.

[154] RN1041 foi descrita no documento WO 2012067510.

Esta cepa tem o seguinte genótipo: MAT a, ura3-52, leu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-pTPI1::TAL1, loxP-pTPI1::RKI1, loxP-pTPI1-TKL1, loxP- pTPI1-RPE1, delta::pADH1-XKS1-tCYC1-LEU2, delta:: URA3- pTPI1-xylA-tCYC1 Mat a = mating type a mutações ura3-52, leu2-112, HIS3::loxP nos genes URA3, LEU2 e HIS3 respectivamente. A mutação ura3-52 é complementada pelo gene URA3 na construção de superexpressão xylA; a mutação leu2-112 é complementada pelo gene LEU2 na construção de superexpressão XKS1. A supressão do gene HIS3 causa uma auxotrofia à histidina.

Por esta razão, RN1041 precisa de histidina no meio de crescimento.

gre3::loxP é uma deleção do gene GRE3, que codifica a aldose redutase. O local loxP é deixado para trás no genoma após a remoção do marcador.

loxP-pTPI1 designa a superexpressão os genes, nas experiências aqui descritas, da via das pentoses fosfato não-oxidativas por substituição do promotor nativo pelo promotor do gene TPI1. O local de loxP a montante do promotor forte, constitutivo de TPI1 permanece no genoma após a remoção do marcador (Kuyper et al, FEMS Yeast Research 5 (2005) 925–934).

delta:: significa a integração cromossómica da construção após recombinação nas repetições terminais longas do retrotranspóson Ty1.

Exemplo 5 Construção de cepas

[155] As seguintes cepas foram construídas:

[156] Tabela 6: cepas construídas RN1041 Cepa progenitora (ver acima) RN1067 RN1041 gpd1::hphMX RN1068 RN1041 gpd2::natMX RN1069 RN1041 gpd1::hphMX gpd2::natMX RN1186 RN1041 + pRN977 RN1187 RN1067 + pRN977 RN1188 RN1068 + pRN977 RN1189 RN1069 + pRN977

[157] A deleção do gene GPD1 (gpd1) e/ou o gene GPD2 (gpd2) foi realizada como descrito no Exemplo 2.

[158] A cepas RN1041, RN1067, RN1068 e RN1069 foram transformadas com plasmídeo pRN977. Este plasmídeo contém as seguintes características: o gene HIS3 para seleção de transformantes, a origem de replicação 2µ, o marcador de resistência à ampicilina para seleção em E. coli, o gene adhE de E. coli sob o controle do promotor PGK1 e do terminador ADH1, o gene DAK1 de S. cerevisiae sob o controle do promotor TPI1 e do terminador PGI1 e o gene gldA de E. coli sob o controle do promotor ACT1 e do terminador CYC1. Todos os promotores e terminadores são de S. cerevisiae. A sequência do plasmídeo pRN977 está estabelecida na SEQ ID NO: 39.

[159] Após a transformação das cepas RN1041, RN1067, RN1068 e RN1069, isoladas de colónias individuais foram sujeitas a análise por PCR de colónias, a fim de verificar a presença do plasmídeo pRN977. Uma colónia representativa de cada transformação foi selecionada para mais experimentação. Essas cepas selecionadas são designadas RN1186, RN1187, RN1188 e RN1189.

[160] Similarmente, os transformantes foram gerados com as seguintes especificações:

[161] Tabela 7: transformantes RN1190 RN1041 + pRN957 RN1191 RN1067 + pRN957 RN1192 RN1068 + pRN957 RN1193 RN1069 + pRN957

[162] O plasmídeo pRN957 é semelhante ao pRN977; no entanto, o gene DAK1 de S. cerevisiae tem sido substituído pelo gene dhak de Citrobacter freundii. A sequência deste plasmídeo, pRN957, é estabelecida na SEQ ID NO: 37.

[163] Como uma cepa de controle, a cepa RN1041 foi transformada com o plasmídeo pRN595 (RN1041 + pRN595). Este plasmídeo, pRN595, é semelhante ao pRN977; no entanto, não tem os genes gldA e DAK1. A sequência do plasmídeo pRN595 está estabelecida na SEQ ID NO: 30.

Exemplo 6 Experiências em frascos de agitação

[164] O desempenho das cepas construídas foi testado em uma experiência anaeróbia com um frasco de agitação.

Para este fim, as células foram pré-cultivas em meio mineral (Verduyn) suplementado com glucose como fonte de carbono. As culturas foram incubadas durante a noite num agitador rotativo a 280 rpm e 30°C.

[165] Uma alíquota das células foi retirada a partir das culturas noturnas para inoculação das culturas anaeróbias. A quantidade de células foi tal que a cultura anaeróbica tinha uma densidade ótica inicial a 600 nm de aproximadamente 0,1.

[166] A composição de carbono do meio mineral: 2,5% de glucose, 2,5% de xilose, 1% de glicerol e 2 g/L de HAc. O pH foi ajustado para um pH de 4,5. Os frascos de agitação foram fechados com uma válvula hidráulica, a fim de garantir as condições anaeróbicas. Para cada ponto de tempo, um frasco separado foi inoculado.

[167] Os resultados do aumento ou diminuição líquidos de glicerol, após 94 horas de fermentação, e o consumo de HAc, estão indicados na tabela abaixo.

[168] Tabela 8: Consumo de glicerol e de HAc e valores de produção de etanol por cepa Cepa Aumento (+) ou Diminuição Consumo de HAc Título de (-) líquidos de glicerol (em gramas/ etanol (em gramas/litro) litro) (em gramas por litro) RN1041 + 1.47 0.24 23.28 RN1186 - 1.20 0.99 25.32 RN1187 - 1.52 0.99 23.76 RN1188 - 0.80 0.97 25.01 RN1189 - 0.86 0.89 24.85 RN1190 - 0.47 0.71 24.38 RN1191 - 0.80 0.93 24.77 RN1192 + 0.93 0.29 23.60 RN1193 - 0.84 0.92 24.93

[169] A cepa indicada no quadro 8 como RN1041 foi transformada com o plasmídeo pRS323, um vetor de clonagem padrão contendo o gene HIS3 e uma origem de replicação 2µ, complementando assim a auxotrofia de histidina.

[170] Os resultados mostram: - RN1041 produz glicerol, o que faz sentido uma vez que ambos os genes GPD1 e GPD2 estão ativos e gldA e DAK1 não estão superexpressos. Como adhE não é expresso nesta cepa, o consumo de HAc é baixo.

- As cepas RN1186 a RN1189 mostram consumo de glicerol e de HAc, resultando num aumento do título de etanol, em comparação com RN1041.

- As experiências com os transformantes RN1190, RN1191 e RN1193 mostram os mesmos resultados, isto é, o consumo de glicerol e de acetato, no entanto, num grau um pouco menor.

Também aqui, a título de etanol é maior, em comparação com RN1041. O resultado da cepa RN1192 é um artefato, como caracterização posterior mostrou que esta cepa tinha perdido o seu plasmídeo pRN957.

[171] A superexpressão de uma dihidroxiacetona quinase homóloga ou heteróloga, em combinação com a superexpressão de gldA e adhE, resulta num consumo simultâneo de acetato e de glicerol em condições anaeróbias.

Exemplo 7 Experiências de AFM

[172] A experiência descrita no Exemplo 6 foi repetida numa configuração ligeiramente diferente, isto é, a AFM (monitor de fermentação alcóolica), que permite a determinação de dióxido de carbono em tempo real, durante a experiência.

[173] As cepas testadas foram RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 e RN1189. A cepa RN1041 foi transformada com o plasmídeo pRS323, um vetor de clonagem padrão contendo o gene HIS3, e uma origem de replicação 2µ, complementando assim a auxotrofia de histidina.

As amostras foram pré-cultivadas durante a noite em meio mineral com 2% de glicose como fonte de carbono, em um agitador rotativo a 280 rpm e 30°C.

[174] As células foram colhidas e uma experiência de AFM foi iniciada como descrito acima.

[175] As amostras foram tomadas a intervalos regulares e açúcares, etanol, glicerol e HAc foram determinados por HPLC.

[176] Os resultados são apresentados na Tabela abaixo.

[177] Tabela 9: consumo de glicerol e HAc e os valores de produção de etanol por cepa ao tempo = 112 horas.

Cepa Aumento (+) ou Consumo de HAc Produção de Diminuição (-) (em gramas/ etanol líquidos de litro) (em gramas por glicerol (em litro) gramas/litro) RN1041 + 1.4 0.1 24.0 RN1041+pRN595 + 1.1 0.4 24.1 RN1186 - 0.3 0.7 25.5 RN1187 - 1.2 1.0 25.5 RN1188 - 0.3 0.7 25.2 RN1189 - 1.1 1.0 25.6

[178] A evolução dos níveis de glicerol e de HAc no tempo são mostrados nas Figuras 1 e 2.

[179] As cepas RN1041 e RN1041+pRN595 estão mostrando uma produção líquida de glicerol. As cepas RN1186 e RN1188 estão inicialmente mostrando produção de glicerol; no entanto, depois de cerca de 24 a 32 horas, o consumo de glicerol iniciou-se e continuou até que no final foi observado um consumo líquido de glicerol.

[180] As cepas RN1187 e RN1189 não exibem a produção inicial de glicerol, como visto com RN1186 e RN1188. Após 24 horas, o consumo de glicerol começa. O consumo de glicerol é significativamente mais elevado nestas amostras, em comparação com RN1186 e RN1188. Estes resultados indicam que a deleção do gene GPD1 resulta num maior consumo de glicerol do que a deleção do gene GPD2.

[181] A cepa RN1041 + pRN595 está mostrando um consumo de HAc superior à cepa RN1041 de referência. RN1186 e RN1188 estão exibindo um consumo de HAc mais elevado do que RN1041+pRN595. Este resultado indica que o consumo de glicerol reforça o consumo HAc. Este efeito é ainda mais forte nas cepas RN1187 e RN1189.

Exemplo 8 Ensaio da atividade de glicerol desidrogenase

[182] Extratos livres de células (CFE) da cepa RN1041 e RN1190 foram preparadas como descrito acima. O ensaio da atividade de glicerol desidrogenase, adotado a partir do protocolo de Lin e Magasanik (1960) J Biol. Chem. 235: 1820-1823, foi realizado. Os resultados são apresentados na Tabela abaixo.

[183] Tabela 10: ensaio de atividade de glicerol desidrogenase Amostra Cofator Aumento em A340/min RN1041 5 µl CFE NAD+ 0.00 RN1190 5 µl CFE NAD+ 0.02

RN1041 20 µl CFE NAD+ 0.00 RN1190 20 µl CFE NAD+ 0.09 RN1041 5 µl CFE NADP+ 0.00 RN1190 5 µl CFE NADP+ 0.00 RN1041 20 µl CFE NADP+ 0.00 RN1190 20 µl CFE NADP+ 0.00

[184] A cepa indicada na tabela 10 como RN1041 foi transformada com o plasmídeo pRS323, um vetor de clonagem padrão contendo o gene HIS3 e uma origem de replicação 2µ, complementando assim a auxotrofia de histidina.

[185] Estes resultados indicam que: a) gldA de E.

coli, expressa em RN1190, é dependente de NAD+, e b) que o aumento no valor de CFE resultou em um aumento proporcional da taxa de conversão de NAD+, e portanto, de glicerol em dihidroxiacetona.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a produção de etanol caracterizado pelo fato de compreender a etapa de fermentar um meio com uma célula de levedura, em que o meio contém ou é alimentado com: a) uma fonte de pelo menos um dentre hexose e pentose; b) uma fonte de ácido acético; e, c) uma fonte de glicerol, em que a célula de levedura fermenta o ácido acético, glicerol e pelo menos um entre hexoses e pentoses em etanol e, opcionalmente, a recuperação do etanol, em que a célula de levedura compreende um gene exógeno que codifica uma enzima com atividade de acetaldeído desidrogenase, tal gene confere à célula a capacidade de converter o ácido acético em etanol, e em que a célula de levedura compreende um gene bacteriano que codifica uma enzima com atividade de glicerol desidrogenase ligada a NAD+.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura não é uma célula de levedura compreendendo uma modificação genética que reduz a atividade formato desidrogenase dependente de NAD+ específica na célula.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene exógeno que codifica a enzima com atividade de acetaldeído desidrogenase compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos um dentre: i) pelo menos 64% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, ii) pelo menos 76% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 3 e, iii) pelo menos 61% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5; e em que o gene bacteriano que codifica uma enzima com atividade de glicerol desidrogenase ligada a NAD+ compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 45% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 7.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura compreende uma modificação genética que reduz a atividade específica de glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NAD+ na célula.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a modificação genética que reduz a atividade específica de glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NAD+ na célula é uma modificação genética que reduz ou inativa a expressão de um gene endógeno que codifica uma glicerolfosfato desidrogenase tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura compreende uma modificação genética que aumenta a atividade específica de dihidroxiacetona quinase, em que a modificação genética é a sobre-expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma dihidroxiacetona quinase, e em que, de preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a dihidroxiacetona quinase compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50% de identidade de sequência de aminoácidos com, pelo menos, uma das SEQ ID NO: 8, 9 e 25.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que a célula compreende ainda uma modificação genética que aumenta, pelo menos, uma dentre: i) a atividade específica da acetil-CoA sintetase e em que, preferencialmente, a modificação genética é a sobre- expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma acetil-CoA sintetase; e, ii) o transporte de glicerol para dentro da célula.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica uma acetil-CoA sintetase codifica uma acetil-

CoA sintetase com uma taxa máxima maior do que a acetil-CoA sintetase codificada pelo gene ACS1 de S. cerevisiae, ou em que a sequência de nucleotídeos que codifica uma acetil-CoA sintetase codifica uma acetil-CoA sintetase com uma afinidade maior para acetato do que a acetil-CoA sintetase codificada pelo gene ACS2 de S. cerevisiae, e em que a modificação genética que aumenta o transporte de glicerol para dentro da célula é a sobre-expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um dentre uma proteína de captação de glicerol e um canal de glicerol, em que, de preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de captação de glicerol compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50% de identidade de sequência de aminoácidos com pelo menos uma das SEQ ID NO: 10 e 11, e em que, de preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica o canal de glicerol compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 30% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos entre os aminoácidos 250 e 530 de SEQ ID NO: 12.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codificando a Acetil-CoA sintetase é a Acetil-CoA sintetase codificada pelo gene ACS1 ou ACS2 de S. cerevisiae.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a modificação genética aumenta a atividade específica da acetil-CoA sintetase em condições anaeróbias.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura compreende, pelo menos: i) um gene exógeno funcional de xilose isomerase, cujo gene confere à célula a capacidade de isomerizar a xilose em xilulose; e, ii) genes exógenos funcionais que codificam uma L- arabinose isomerase, uma L-ribuloquinase e uma L-ribulose- 5-fosfato-4-epimerase, tais genes em conjunto conferem à célula a capacidade de converter a L-arabinose em D- xilulose-5-fosfato, e em que, de preferência, a célula de levedura compreende, pelo menos, outra modificação genética que resulta em uma característica selecionada a partir do grupo que consiste em: a) aumento da atividade específica de xilulose quinase; b) aumento do fluxo da via das pentoses-fosfato c) redução da atividade inespecífica da aldose redutase d) aumento do transporte de pelo menos um dentre xilose e arabinose para dentro da célula hospedeira; e) diminuição da sensibilidade à repressão catabólica; f) aumento da tolerância ao etanol, osmolaridade ou ácidos orgânicos; e, g) redução da produção de subprodutos.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura é de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces e Yarrowia.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura pertence a uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K.

lactis, K. marxianus e Schizosaccharomyces pombe.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o meio contém ou é alimentado com um hidrolisado lignocelulósico.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura é fermenta sob condições anaeróbias.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que os termos “aumento” e “redução” são definidos como comparados a atividade específica da enzima em uma célula de levedura idêntica do tipo selvagem.

17. Célula de levedura caracterizada pelo fato de compreender: a) um gene exógeno que codifica uma enzima com atividade de acetaldeído desidrogenase, tal gene confere à célula a capacidade de converter o ácido acético em etanol; e, b) um gene bacteriano que codifica uma enzima com atividade de glicerol desidrogenase ligada a NAD+.

em que a célula de levedura não é uma célula de levedura compreendendo uma modificação genética que reduz a atividade específica de formato desidrogenase dependente de NAD+ na célula.

18. Célula de levedura, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura é como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 16.

19. Uso de uma célula de levedura como definida em na reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de ser na preparação de etanol.