BR112017009571B1 - Cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica,micro-organismo geneticamente modificado com eficiente consumo de xilose e processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos - Google Patents
Cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica,micro-organismo geneticamente modificado com eficiente consumo de xilose e processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos Download PDFInfo
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Abstract
cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica, micro-organismo geneticamente modificado com eficiente consumo de xilose, processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e biocombustível e/ou bioquímico e/ou etanol assim produzido. a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo a partir de polímeros da parede celular. dentre outros objetos, a presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado, com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis e eficiente resistência aos inibidores gerados pelas etapas de processamento da biomassa para disponibilização dos açúcares, principalmente ao ácido acético, favorecendo assim seu desempenho em escala industrial. o processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos utilizando-se o micro-organismo descrito no presente documento, também é objeto da presente invenção, bem como os biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos.
Description
[0001] A referida invenção situa-se nos campos dos biocombustíveis, bioquímicos e processos para sua obtenção. Mais especificamente, a presente invenção proporciona soluções técnicas para a produção de combustíveis de segunda geração baseados na conversão de biomassa vegetal, por exemplo a partir de polímeros da parede celular. Dentre outros objetos, a presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado e submetido a processo de engenharia evolutiva com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares presentes na biomassa vegetal em bioquímicos e/ou biocombustíveis em presença de alta concentração de inibidores gerados pelas etapas de processamento da biomassa para disponibilização dos açúcares. O processo de melhoramento por engenharia evolutiva permite que o microorganismo amplie seu consumo de xilose e sua resistência aos inibidores, principalmente ácidos, entre os quais se destaca o ácido acético. As modificações descritas no presente relatório favorecem o desempenho do dito micro-organismo quando em escala industrial. Adicionalmente, são também descritos um processo para a obtenção de biocombustíveis e/ou bioquímicos e os produtos assim obtidos.
[0002] A necessidade da substituição da matriz mundial de combustíveis baseada em fontes fósseis por alternativas renováveis tornou a produção de combustíveis de segunda geração, por exemplo, etanol, uma das mais promissoras tecnologias em fase de desenvolvimento. Este processo consiste na conversão de polímeros que formam a biomassa vegetal, principalmente aqueles presentes na parede celular como celulose, hemicelulose e lignina, em biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0003] A biomassa vegetal é uma mistura complexa de compostos quimicamente distintos que podem ser fracionados gerando componentes com aplicações específicas. Assim, do mesmo modo que uma refinaria petroquímica produz uma grande variedade de produtos derivados do petróleo bruto, os mesmos princípios podem ser aplicados a biorrefinarias, ou seja, refinarias baseadas em biomassa (Santos, L. V.; Pereira, G. A. G. Petroquímica verde - Anais do Simpósio Microrganismos em Agroenergia: da Prospecção aos Bioprocessos. Editora Embrapa. ISSN 2177-4439, 2013).
[0004] A utilização da biomassa vegetal como fonte de açúcares fermentescíveis é uma alternativa promissora e sustentável, entretanto, alguns desafios ainda precisam ser superados, como a disponibilização dos açúcares da parede celular vegetal. Esse procedimento pode ser feito, por exemplo, através da ação de enzimas hidrolíticas (celulases e hemicelulases), as quais disponibilizam os monômeros de açúcares (hexoses e pentoses) que, por sua vez, são posteriormente metabolizados por micro-organismos durante processo de fermentação para geração de bioquímicos e biocombustíveis.
[0005] Nesse contexto, é relevante considerarmos que o processo para liberação desses monômeros de açúcares envolve principalmente duas etapas: a) A primeira etapa é o pré-tratamento da biomassa vegetal, que consiste de processo térmico sob pressão para disruptura da matriz ligno- celulósica e solubilização da hemicelulose e celulose sólida. Assim, há um aumento da acessibilidade dos polímeros que constituem a parede celular vegetal às enzimas que realizarão o posterior processo de hidrólise. b) A segunda etapa é a hidrólise, na qual enzimas hidrolíticas (ou um tratamento ácido) adicionadas ao processo irão agir diretamente sobre polímeros que formam a parede celular, reduzindo esses polímeros a monômeros de açúcares, os quais serão posteriormente convertidos a etanol por leveduras especializadas durante a fermentação.
[0006] A solução resultante destes dois tratamentos é genericamente referida como hidrolisado, por conter altos teores de açúcares monoméricos disponibilizados pela hidrólise (ácida ou enzimática).
[0007] Nessas etapas, entretanto, é liberada alta concentração de substâncias que afetam negativamente os micro-organismos fermentadores, genericamente conhecidas como inibidores, os quais prejudicam significativamente o metabolismo desses micro-organismos e, consequentemente, seu crescimento e o rendimento na conversão de açúcares em combustíveis e/ou bioquímicos (Palmqvist et al., 1998, 1999; Palmqvist & Hahn-Hagerdal, 2000a, b; Larsson et al., 2001; Zaldivar et al., 2001; Klinke et al., 2004; Lima et al., 2004).
[0008] Esses inibidores que estão presentes no hidrolisado lignocelulósico e que interferem negativamente na performance dos micro-organismos incluem ácidos orgânicos fracos, compostos derivados do açúcar como furfural e hidroximetil furfural, e produtos provenientes da degradação da lignina.
[0009] O ácido acético merece destaque nesse processo, pois é um dos principais inibidores liberado durante a solubilização e hidrólise de hemicelulose. A taxa de ácido acético em hidrolisado pode variar geralmente entre 0 e aproximadamente 17 g/L dependendo do material utilizado para hidrólise e sua toxicidade é altamente elevada em pH baixo (Palmqvist & Hahn-Hagerdal, 2000b; Zaldivar et al., 2001; Lima et al., 2004). É relevante salientar também, em relação a compostos inibidores do metabolismo de micro-organismos fermentadores no processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos, que mesmo o processo de primeira geração submete as leveduras a esses inibidores principalmente os ácidos. Esses inibidores podem ser também provenientes do melaço ou metabolitos produzidos por bactérias, como ácido lático, ácido acético, entre outros (Basso, L. C., H. V. de Amorim, A. J. de Oliveira and M. L. Lopes. "Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil." Fems Yeast Research 8(7): 1155-1163, 2008).
[0010] É relevante salientar que a maior parte dos micro-organismos fermentadores como, por exemplo, a levedura Saccharomyces cerevisiae não são naturalmente capazes de fermentar pentoses, como, por exemplo, a xilose, presente na biomassa. Entretanto, diversos trabalhos já realizaram procedimentos de engenharia metabólica em S. cerevisiae introduzindo nesses organismos as vias metabólicas para consumo de xilose, tendo como foco duas vias principais: a via Xilose Redutase - Xilitol Desidrogenase (XR-XDH) e a via Xilose Isomerase (XI).
[0011] É descrito no estado da técnica que a introdução de gene que codifica a enzima xilose isomerase (XI) permite que a cepa apresente maior rendimento na produção de álcool e/ou ácidos do que quando ela é modificada com outros genes, como por exemplo, gene que codifica a enzima xilose redutase ou xilitol desidrogenase, visto que o metabolismo utilizando xilose isomerase permite menor acúmulo de subprodutos não desejáveis, como xilitol e glicerol [2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664].
[0012] A via XR-XDH, comum em micro-organismos eucariotos, tem maior produtividade inicial por permitir que o etanol seja produzido mais rapidamente, apenas com a inserção dos genes responsáveis pela conversão da xilose. Essa via consiste em duas reações de oxi-redução, sendo que na primeira, a xilose é reduzida a xilitol pela ação da enzima xilose redutase (XR), em reação mediada por NADPH/NADH e, em seguida, o xilitol é oxidado a xilulose por meio da enzima xilitol desidrogenase (XDH), mediada exclusivamente por NAD+. O cofator NADPH é principalmente regenerado na fase oxidativa da via das pentoses fosfato, com produção de CO2. Porém, NAD+ é regenerado principalmente na cadeia respiratória, com o O2 como aceptor final de elétrons. Sob limitadas concentrações de oxigênio, não ocorre a completa reoxidação de NAD+, resultando em um desbalanço redox e no acúmulo de xilitol, o que impacta diretamente no rendimento final de etanol [Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v.12, n.1, p.49-59, 2002]. Além do xilitol, outro subproduto formado é o glicerol [FEMS Yeast Research, Delft, v.4, n.6, p.655-664, 2004].
[0013] Por sua vez, o metabolismo de xilose realizado através da via xilose isomerase (XI) é mais comum em procariotos e ocorre em um único passo, evitando assim o desbalanço redox e permitindo menor formação de subprodutos que diminuem o rendimento de etanol. Adicionalmente, a via da XI pode resultar em um maior rendimento de etanol por acumular menor quantidade de subprodutos da fermentação [Microbial Cell Factories, Londres, v.6, n.5, p.1-10, 2007].
[0014] Assim, micro-organismos descritos no estado da técnica, que foram geneticamente modificados para consumo de xilose, invariavelmente possuem as modificações genéticas descritas acima. Basicamente, o diferencial de cada um desses micro-organismos é a combinação entre os genes da via das pentoses fosfato e dos promotores pelos quais estão regulados, além, principalmente, do gene que codifica a xilose isomerase, pois é esse o gene fundamental que possibilita o consumo de xilose por cada micro-organismo modificado.
[0015] Entretanto, esses micro-organismos que se tornam capazes de consumir açúcares presentes nas cadeias de celulose e hemi-celulose, não são geralmente passíveis de utilização em escala industrial de forma eficiente. Isso acontece pois tais cepas modificadas acabam sendo susceptíveis a ter seu desempenho fermentativo comprometido quando submetidas a condições muito desfavoráveis para fermentação como, por exemplo, meio com alta concentração de inibidores, fato que, como observado, ocorre regularmente nos processos de segunda geração.
[0016] Grande parte dessa ineficiência ocorre principalmente graças ao ácido acético, um dos principais inibidores gerados no processamento de biomassa lignocelulósica, e que afeta negativamente a cinética de fermentação de açúcares realizada, por exemplo, por Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas para realizarem consumo de xilose.
[0017] Ressalta-se ainda que, no que se refere especificamente à produção de etanol de segunda geração, a levedura Saccharomyces cerevisiae recebe papel de destaque devido à sua robustez e tolerância em condições industriais de fermentação. Adicionalmente, trata-se de um micro-organismo cuja manipulação genética é facilitada, e o uso de ferramentas de engenharia metabólica, em sinergia com biologia de sistemas e biologia sintética, tem possibilitado a inclusão de novas rotas metabólicas para a produção de combustíveis e químicos como etanol, biobutanol, biodiesel, 1,2-propanediol, ácido succínico, ácido pirúvico, entre outros [Cellular and Molecular Life Sciences, 69(16):2671-90, 2012].
[0018] Apesar dos documentos WO2006/009434, WO2011/153516, US8399215, EP2679686 e WO2014018552 descreverem micro-organismos capazes de converter xilose à bioquímicos e/ou biocombustíveis, verifica-se que a obtenção de micro-organismos que, além de serem capazes de converter açúcares presentes na biomassa lignocelulósica em biocombustíveis e/ou bioquímicos, sejam também suficientemente resistentes aos inibidores derivados do processo de pré-tratamento, não é trivial.
[0019] Assim, o micro-organismo descrito na presente invenção mostra-se eficiente na conversão de açúcares presentes na biomassa vegetal lignocelulósica, principalmente em altas concentrações de inibidores do metabolismo celular, sendo o principal inibidor o ácido acético, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, dentre eles, principalmente etanol.
[0020] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento.
[0021] O dito micro-organismo, adicionalmente submetido a processo de engenharia evolutiva, apresenta modificações genéticas suplementares que são decorrentes do processo de evolução e que o permitem não somente mostrar- se eficiente na conversão de pentoses em combustíveis e/ou bioquímicos, como também ser vantajosamente eficaz em realizar essa dita conversão na presença de elevada concentração de substâncias inibidoras de seu metabolismo e que normalmente estão presentes no hidrolisado lignocelulósico. Entre esses inibidores podemos citar, principalmente, ácido acético.
[0022] De modo mais específico, o micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a uma célula eucariótica transformada geneticamente, por exemplo uma levedura ou fungo filamentoso, preferencialmente uma levedura do gênero Saccharomyces.
[0023] A pentose preferencialmente utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é xilose, sem, entretanto, restringir-se a ela.
[0024] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução da sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1 que codifica um peptídeo com função xilose isomerase, proporcionando a expressão de uma enzima que favorece a isomerização de xilose em xilulose.
[0025] Assim, a presente invenção descreve também um cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1, que codifica o peptídeo do tipo xilose isomerase e que, opcionalmente, é inserido em uma célula eucariótica para a expressão da referida isomerase em sua forma ativa.
[0026] O cassete de expressão da invenção é caracterizado por compreender: - uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase SEQ ID NO:1; - ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante; e - uma ou mais sequências nucleotídicas selecionadas dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outra enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas. Um ou mais cassetes de expressão são usados na transformação de células eucarióticas de acordo com a invenção.
[0027] Opcionalmente, o cassete de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:9), Transaldolase (SEQ NO ID:5), Transcetolase (SEQ ID NO:11), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:12) e/ou combinações destas.
[0028] Portanto, a presente invenção proporciona uma célula eucariótica, leveduras ou fungos filamentosos, sendo, por exemplo, uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, transformada com uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 1, a qual pode apresentar-se em cópia única ou, por exemplo, múltiplas cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) dessa sequência de nucleotídeos podem ser inseridas no genoma.
[0029] Dentre as enzimas apresentadas, e que constituem a via das pentose- fosfato, assim como a xilose isomerase representada por SEQ ID NO:1, ao menos um dos genes que as codificam deve apresentar-se superexpresso e, por exemplo, ligado a promotores constitutivos ou naturalmente induzíveis.
[0030] Em uma concretização, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um cassete de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, por exemplo, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos.
[0031] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14. A produção de xilitol diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.
[0032] Quando realizadas em Saccharomyces cerevisiae, as modificações genéticas acima citadas favorecem o fluxo da parte não oxidativa da via das pentoses-fosfato. O favorecimento dessa via pode ser diretamente correlacionado ao consumo de xilose pela célula hospedeira. Assim, quanto mais xilose fosse consumida, mais ativo estaria o fluxo por essa via.
[0033] Adicionalmente, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) do cassete que expressa a XI (SEQ ID N:1) no genoma da célula hospedeira.
[0034] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, por exemplo, micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos, por exemplo, em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente. Possuindo toda a via metabólica necessária para conversão de xilose, em condições aeróbicas, a linhagem é capaz de consumir a xilose presente no meio de cultivo, porém, em condições anaeróbicas, o consumo é muito lento.
[0035] O micro-organismo após ser submetido às modificações genéticas descritas no presente documento, é, então, submetido a processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do micro-organismo de interesse em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo, principalmente xilose, e concentrações variáveis e crescentes de pelo menos uma substância inibidora do metabolismo do micro-organismo, preferencialmente ácido acético acrescido, como observado no Exemplo 4.
[0036] Assim, em uma concretização, o processo de obtenção de microorganismos da invenção, permite a obtenção de um micro-organismo com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis e/ou bioquímicos e concomitante resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico, principalmente ao ácido acético. Ou seja, o processo buscou selecionar micro-organismos que produzam ou sejam capazes de produzir bioquímicos e/ou biocombustíveis de interesse em menor tempo e/ou maior quantidade, na presença da fonte de açúcar de interesse e com alta concentração de inibidores em relação à quantidade de açúcares no meio de cultura, quando comparados com micro-organismos não evoluídos para resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico.
[0037] Em uma concretização, o micro-organismo é cultivado em um meio de cultura contendo um hidrolisado lignocelulósico que compreende um ou mais inibidores como, por exemplo, ácido acético e/ou ácido fórmico, como pode ser observado no Exemplo 5. Opcionalmente, o meio é suplementado com nitrogênio. Os micro-organismos com melhor velocidade de crescimento no referido meio (são) selecionado(s) e isolado(s), para subsequente uso. Esse micro-organismo selecionado possui mutações genéticas aleatórias decorrentes do processo de evolução e encontra-se depositado na Coleção Alemã de Microorganismos e Cultura de Células - Leibniz-Institut Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788). O depósito do microrganismo foi realizado na data de 14 de maio de 2014.
[0038] O micro-organismo DSM28788 descrito na presente invenção é, por exemplo, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir espuma, entre outros.
[0039] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal, preferencialmente a porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção (DSM 28788) para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0040] Em uma concretização, o referido processo compreende as seguintes etapas: a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o microorganismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0041] O processo da invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).
[0042] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, por exemplo etanol, e/ou bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção, como o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0043] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir da presente descrição, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.
[0044] Salienta-se, então, que o micro-organismo que é um dos objetos da invenção é particularmente eficiente na conversão de pentoses constituintes de material lignocelulósico em álcoois e/ou ácidos. Referido micro-organismo é eficiente na conversão de pentoses, incluindo xilose, presentes no material lignocelulósico, como aquele previamente submetido a processo de hidrólise.
[0045] Adicionalmente, salienta-se também que o micro-organismo descrito no presente documento, além de eficiente capacidade na conversão, por exemplo, de xilose em etanol, apresenta também eficaz resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico durante o processo de fermentação, sendo o principal inibidor compreendido nesse hidrolisado o ácido acético. Destaca-se também a presença de ácidos, incluindo o ácido acético, no processo de primeira geração para produção de bioquímicos e ou biocombustíveis, permitindo eficiente rendimento do presente micro-organismo também nesse processo.
[0046] Na Figura 1 é apresentada a sequência de nucleotídeos representada como SEQ ID NO:17, sendo indicada a região que codifica LEU2 (sublinhada), juntamente com seu promotor e terminador (não sublinhado).
[0047] A Figura 2 mostra o consumo de xilose e produção de etanol em condições anaeróbias pelo micro-organismo descrito na presente invenção após o processo de manipulação genética para inserção de genes da via das pentoses fosfato e gene geneticamente modificado da xilose isomerase, SEQ ID NO:1, e antes do processo de evolução. No eixo vertical é descrita a concentração em gramas por Litro e no eixo horizontal, o tempo em horas. A concentração de xilose é indicada por (♦), enquanto a concentração de etanol por tempo, é representada por (■).
[0048] Na Figura 3 observa-se o consumo de xilose e produção de etanol em condições anaeróbias pelo micro-organismo descrito na presente invenção após o processo de manipulação genética para inserção de genes da via das pentoses fosfato e gene geneticamente modificado da xilose isomerase, SEQ ID NO:1, e após processo de evolução. No eixo vertical é descrita a concentração em g/L e no eixo horizontal, o tempo em horas. A concentração de xilose é indicada por (♦), enquanto a concentração de etanol por tempo, é representada por (■).
[0049] A Figura 4 mostra a comparação no consumo de xilose entre o micro-organismo controle (modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores), representado por (▲) e o micro-organismo DSM28788, representado por (•). No eixo vertical mostra-se a concentração de xilose em gramas por Litro, enquanto o eixo horizontal apresenta o tempo em horas.
[0050] A Figura 5 mostra a comparação na produção de etanol entre o micro-organismo controle (modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores), representado por (•) e o micro-organismo DSM28788, representado por (▲). No eixo vertical mostra-se a concentração de etanol em gramas por Litro, enquanto o eixo horizontal apresenta o tempo em horas.
[0051] A Figura 6 nos mostra na linha (1) a performance do micro-organismo controle, ou seja, eficientemente evoluído para consumo de xilose e, na linha (2), a performance do micro-organismo DSM28788, quando submetidos a diferentes concentrações ácido acético no meio de cultura, em diferentes tempos. Cada uma das concentrações de ácido acético e tempo a que as linhagens foram submetidas foram: (A) 5 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 24hs; (B) 11 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 24 horas; (C) 12 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 30 horas; (D) 12 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 48 horas; (E) 14 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD, por 48 horas.
[0052] Na Figura 7 observamos a comparação da cinética de consumo de glicose entre o micro-organismo DSM28788 (■) e o microrganismo controle (•), evoluído apenas para consumo de xilose. No eixo vertical à esquerda observa- se a escala de Glicose em g/L, enquanto no eixo horizontal é mostrado o tempo em horas. No eixo vertical à direita, observa-se a escala de ácido fórmico (linha tracejada) e de ácido acético (linha pontilhada), ambos em g/L.
[0053] A Figura 8 mostra a comparação da cinética de consumo de xilose entre o micro-organismo DSM28788 (■) e o microrganismo controle (•), evoluído apenas para consumo de xilose. No eixo vertical à esquerda observa-se a escala de Xilose em g/L, enquanto no eixo horizontal é mostrado o tempo em horas. No eixo vertical à direita, observa-se a escala de ácido fórmico (linha tracejada) e de ácido acético (linha pontilhada), ambos em g/L.
[0054] Na Figura 9 vemos a comparação da cinética de produção de etanol entre o micro-organismo DSM28788 (■) e o microrganismo controle (•), evoluído apenas para consumo de xilose. No eixo vertical à esquerda observa-se a escala de Etanol em g/L, enquanto no eixo horizontal é mostrado o tempo em horas. No eixo vertical à direita, observa-se a escala de ácido fórmico (linha tracejada) e de ácido acético (linha pontilhada), ambos em g/L.
[0055] A Figura 10 mostra a compilação dos valores relativos ao consumo de glicose, xilose e produção de etanol pelo micro-organismo DSM28788, quando em hidrolisado lignocelulósico. As concentrações de glicose (•), xilose (■) e etanol (▲) são mostradas no eixo vertical em gramas por Litro, enquanto no eixo horizontal é apresentado o tempo em horas.
[0056] A presente invenção descreve, dentre outros objetos, um microorganismo geneticamente modificado com eficiente performance fermentativa na conversão dos açúcares contidos na biomassa vegetal como, por exemplo, materiais lignocelulósicos, em biocombustíveis e/ou bioquímicos, quando comparado à sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento.
[0057] Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica compreendendo: a) pelo menos 95% de identidade de pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo de: xilose isomerase (SEQ ID NO:1), transaldolase (SEQ ID NO:5), ribose 5-fosfato isomerase (SEQ ID NO:7), xiluloquinase (SEQ ID NO:9), transcetolase (SEQ ID NO:11) e ribose 5-fosfato epimerase (SEQ ID NO:12); b) pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica promotora selecionada do grupo consistindo de: promotor gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:2), promotor 3-fosfato quinase (SEQ ID NO:6), promotor da enzima álcool desidrogenase 1 (SEQ ID NO:8); c) pelo menos 95% de identidade de pelo menos uma sequência nucleotídica terminadora selecionada do grupo consistindo de: terminador gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (SEQ ID NO:3), terminador de álcool desidrogenase (SEQ ID NO:10), terminador 3- fosfato quinase (SEQ ID NO:13); e em que a sequência nucleotídica definida em a) está funcionalmente ligada à sequência nucleotídica promotora definida em b) e à sequência nucleotídica terminadora definida em c), sendo heteróloga qualquer das referidas sequências.
[0058] Em uma concretização da presente invenção, o cassete de expressão é selecionado do grupo consistindo de: a) cassete de expressão que compreende gene que codifica xilose isomerase de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:1, promotor TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, e terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência nucleotídica SEQ ID NO:3; b) cassete de expressão que compreende promotor ADH1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:8, gene XKS1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:9 e terminador ADH1 representado por pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:10; c) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência pelo menos 95% de identidade de pelo menos nucleotídica SEQ ID NO:2, gene TAL1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:5, gene terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:6, de pelo menos 95% de identidade de pelo menos gene RKI1 (SEQ ID NO:7) e de terminador de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência 5 nucleotídica SEQ ID NO:13; d) cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:02, gene TKL1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:11, gene codificador de Ribose 5-Fosfato Epimerase pelo menos 95% de identidade da (SEQ ID NO:7), terminador TDH1 de pelo menos 95% de identidade de pelo menos sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:6, gene RPE1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:12 e terminador PGK1 de pelo menos 95% de identidade da sequência SEQ ID NO:13; e combinações de pelo menos dois cassetes de expressão conforme descritos acima. e em que o(s) dito(s) cassete(s) de expressão é(são) funcional(is) na(s) célula(s) eucariótica(s).
[0059] Em uma concretização do cassete de expressão, pelo menos um dos referidos promotores serem constitutivos ou naturalmente induzíveis.
[0060] Em um segundo aspecto, a presente invenção apresenta um microorganismo geneticamente modificado compreendendo pelo menos um cassete de expressão conforme definido acima.
[0061] Em uma concretização do micro-organismo da presente invenção, um ou mais dos referidos cassetes de expressão estão presentes na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente.
[0062] Em uma concretização do micro-organismo da presente invenção, as sequências promotoras, sequências codificantes e sequências terminadoras dos cassetes de expressão são estáveis no genoma do micro-organismo ou estão presentes em no mínimo 5 cópias no genoma do micro-organismo ou ambos.
[0063] Em uma concretização do micro-organismo da presente invenção, o gene GRE3 (SEQ ID NO:14) é inativado ou deletado em seu genoma.
[0064] Em uma concretização da presente invenção, o micro-organismo é uma levedura do gênero selecionado do grupo consistindo de: Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia. Em uma concretização, o micro-organismo é levedura Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
[0065] Em um terceiro aspecto, a presente invenção apresenta um microorganismo geneticamente modificado para expressão peptídeo com função xilose isomerase o qual é Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
[0066] Em um quarto aspecto, a presente invenção apresenta um processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos compreendendo a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o microorganismo conforme definido acima, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0067] Em uma concretização da presente invenção, o processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos compreende a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o microorganismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0068] Em uma concretização, o processo produz pelo menos 0,70 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulósico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 12 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulósico.
[0069] Em uma concretização, o processo produz pelo menos 0,74 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulósico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 15 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulósico.
[0070] Em um quinto aspecto, a presente invenção apresenta um biocombustível obtido pelo processo conforme definido acima.
[0071] Em um sexto aspecto, a presente invenção apresenta um bioquímico obtido pelo processo conforme definido acima.
[0072] Em um sétimo aspecto, a presente invenção apresenta etanol obtido pelo processo conforme definido acima.
[0073] O dito micro-organismo, adicionalmente submetido a processo de engenharia evolutiva, apresenta modificações genéticas suplementares que são decorrentes do processo de evolução e que o permitem não somente mostrar- se eficiente na conversão de pentoses em combustíveis e/ou bioquímicos, como também ser vantajosamente eficaz em realizar essa dita conversão na presença de elevada concentração de substâncias inibidoras de seu metabolismo e que normalmente estão presentes no hidrolisado lignocelulósico. Entre esses inibidores podemos citar, principalmente, ácido acético e ácido fórmico. Pode produzir pelo menos 0,70 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulósico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 12 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulósico.
[0074] Em uma concretização, o processo produz pelo menos 0,74 gramas de etanol por Litro de hidrolisado lignocelulósico por hora em condições anaeróbias em meio compreendendo pelo menos 15 gramas de ácido acético por Litro de hidrolisado lignocelulósico.
[0075] De modo mais específico, o micro-organismo geneticamente modificado descrito na presente invenção refere-se a uma célula eucariótica transformada geneticamente, por exemplo uma levedura ou fungo filamentoso.
[0076] Na presente invenção, leveduras são consideradas como qualquer indivíduo do grupo Eumycotina, ou seja, fungos verdadeiros, que crescem de modo unicelular e que façam preferencialmente fermentação anaeróbia, como por exemplo, Saccharomyces, Scheffersomyces, Spathaspora, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Brettanomyces, Hansenula e Yarrowia.
[0077] Fungos filamentosos, por sua vez, são aqueles caracterizados por apresentarem micélio vegetativo e crescerem a partir da elongação das hifas, além de realizarem respiração aeróbia, como por exemplo, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Moniliophthora e Acremonium.
[0078] De forma ainda mais específica, a presente invenção descreve um micro-organismo geneticamente modificado, por exemplo uma levedura do gênero Saccharomyces.
[0079] Uma concretização da invenção descreve um micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae mais eficiente na conversão de pentoses presentes no material lignocelulósico em álcoois e/ou bioquímicos, tais como, por exemplo, ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, PHB - poli(hidróxido butirato), sem entretanto restringir-se a eles, quando comparado com sua versão sem as modificações genéticas descritas no presente documento.
[0080] A pentose preferencialmente utilizada pelo micro-organismo para conversão em álcoois e/ou bioquímicos acima indicados é xilose, sem, entretanto, restringir-se a ela.
[0081] Na presente invenção são feitas referências a diversas sequências gênicas, todas listadas na seção Listagem de Sequências. Para breve referência e facilidade de compreensão, suas funções ou genes respectivos são indicados na Tabela 1 a seguir. Tabela 1 - Sequências referidas na presente invenção e respectivos genes/funções.
[0082] O micro-organismo descrito na presente invenção é geneticamente modificado pela introdução da sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1 que codifica um peptídeo com função xilose isomerase, proporcionando a expressão de uma enzima que favorece a isomerização de xilose em xilulose.
[0083] Uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase foi descrita em Orpinomyces sp. (XI, EC 5.3.1.5). Tal sequência foi manualmente otimizada pelos inventores para os códons preferencialmente utilizados por Saccharomyces cerevisiae. A sequência otimizada de xilose isomerase SEQ ID NO:1, utilizada na presente invenção, é, portanto, não natural e diferente de sequências naturais de xilose isomerase já descritas em bancos.
[0084] Após otimização da sequência representada em SEQ ID NO:1, o CAI (Codon Adaptation Index), índice que determina a possibilidade de altos níveis de expressão de proteína, foi de 0,79 para 0,91, indicando a obtenção de uma eficiente expressão dessa proteína em S. cerevisiae. O índice CAI é a média geométrica dos valores relativos de adaptação e para seu cálculo são excluídos códons não sinônimos e, em alguns casos, também os de terminação. Os valores variam entre 0 e 1, sendo que os maiores indicam maior proporção dos códons mais abundantes [Nucleic Acids Research 15: 1281-1295].
[0085] Assim, a presente invenção descreve também um cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:1, que codifica o peptídeo do tipo xilose isomerase e que, opcionalmente, é inserido em uma célula eucariótica para a expressão da referida isomerase em sua forma ativa.
[0086] O cassete de expressão da invenção é caracterizado por compreender: - uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo com função xilose isomerase SEQ ID NO:1; - ao menos um promotor para a referida sequência nucleotídica codificante; e - uma ou mais sequências nucleotídicas selecionadas dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma ou mais sequência(s) nucleotídica(s) codificante(s) de outra enzimas; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências, sendo heteróloga ao menos uma das sequências nucleotídicas acima definidas. Um ou mais cassetes de expressão são usados na transformação de células eucarióticas de acordo com a invenção.
[0087] Opcionalmente, o cassete de expressão da invenção compreende também sequências selecionadas do grupo que compreende as sequências codificantes das enzimas Xiluloquinase (SEQ ID NO:9), Transaldolase (SEQ NO ID:5), Transcetolase (SEQ ID NO:11), Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7) e/ou Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:12) e/ou combinações destas.
[0088] Em uma concretização, a célula hospedeira eucariótica/micro-organismo é uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, porém salienta-se que qualquer célula eucariótica pode ser transformada com um ou mais cassetes de expressão da invenção, que compreende a sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID NO:1.
[0089] Portanto, a presente invenção proporciona uma célula eucariótica, leveduras ou fungos filamentosos, sendo, por exemplo, uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, transformada com uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 1, a qual pode apresentar-se em cópia única ou, por exemplo, múltiplas cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) dessa sequência de nucleotídeos podem ser inseridas no genoma.
[0090] Em uma concretização, a célula hospedeira geneticamente modificada adicionalmente compreende genes da via das pentoses fosfato, para que a inserção de SEQ ID NO:1, que codifica xilose isomerase, favoreça a isomerização de xilose em xilulose. Portanto, adicionalmente à inserção de SEQ ID NO:1 na célula hospedeira, a presente invenção descreve modificações genéticas nessa mesma célula que visam o favorecimento do fluxo metabólico através da via das pentoses fosfato, não sendo essas modificações, entretanto, um fator restritivo para transformação da célula hospedeira com a sequência de nucleotídeos representada em SEQ ID NO:1.
[0091] Dentre as enzimas apresentadas, e que constituem a via das pentose- fosfato, assim como a xilose isomerase representada por SEQ ID NO:1, ao menos um dos genes que as codificam deve apresentar-se superexpresso e, por exemplo, ligado a promotores constitutivos ou naturalmente induzíveis. A superexpressão dos genes que codificam essas enzimas pode ser em decorrência do aumento do número de cópias da sequência de nucleotídeos que as codifica, expressão de genes epissomais presentes em vetores que podem ser inseridos na célula eucariótica hospedeira, através do uso de promotores heterólogos àquela sequência na qual ele encontra-se operativamente ligado, ou mesmo homólogos da célula onde foram inseridos, ou como endógenos na célula hospedeira, desde que eles sejam capazes de produzir um estado estável de transcrição mais elevado do que seria realizado pela célula em sua versão sem as presentes modificações genéticas, nas situações em que fontes de carbono como glicose e xilose estiverem disponíveis no meio. Esses promotores podem ser constitutivos ou naturalmente induzíveis.
[0092] Em uma concretização, a presente invenção descreve célula hospedeira compreendendo um cassete de expressão contendo genes endógenos de enzimas da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, os quais são, por exemplo, construídos utilizando-se promotores fortes e constitutivos da célula na qual serão inseridos. Especificamente, a presente invenção descreve quatro concretizações de cassetes de expressão integrativos, que foram construídos utilizando-se promotores de alta expressão e constitutivos de Saccharomyces cerevisiae, e estavelmente integrados ao genoma da célula hospedeira.
[0093] Um dos cassetes descritos compreende o gene que codifica xilose isomerase, SEQ ID NO:1. Em uma concretização, cópia de SEQ ID NO:1 é inserida na célula hospedeira flanqueado, por exemplo, pela região promotora e terminadora do gene Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1). Assim, de forma resumida, o cassete que contém o gene que codifica xilose isomerase e que foi inserido no genoma da célula hospedeira é formado pelo promotor TDH1, cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:2, gene XI (SEQ ID NO:1e terminador TDH1, cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:3).
[0094] Um segundo cassete descrito na presente invenção, contém gene que codifica a enzima Xiluloquinase (SEQ ID NO:9). A presente descrição indica que o cassete é, por exemplo, construído utilizando-se promotor e terminador do gene que codifica enzima álcool desidrogenase (ADH1). Assim, descreve-se que o cassete que contém o gene codificador de Xiluloquinase é constituído pelo promotor ADH1, representado por SEQ ID NO:8, gene XKS1 (SEQ ID NO:9) e terminador ADH1, representado por SEQ ID NO:10.
[0095] Mais um cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transaldolase (SEQ NO ID:5) e Ribose 5-Fosfato Isomerase (SEQ ID NO:7). Este cassete é construído, por exemplo, utilizando-se promotores e terminadores do gene que codifica a enzima Gliceraldeído 3- Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1) para flanquear o gene da Transaldolase e promotores e terminadores da enzima 3-fosfoglicerato Quinase (PGK1) para flanquear o gene de Ribose 5-Fosfato Isomerase. Assim, de forma resumida, o cassete de expressão é constituído, por exemplo, de promotor TDH1 (SEQ ID NO:2), gene TAL1 (SEQ ID NO:5,) e terminador TDH1 (SEQ ID NO:3), seguido de promotor PGK1, cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:6, gene RKI1 (SEQ ID NO:7 e terminador, cuja sequência de nucleotídeos é representada por SEQ ID NO:13.
[0096] Um último cassete descrito na presente invenção contém genes codificadores de Transcetolase (SEQ ID NO:11) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:7), por exemplo, com função associada aos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1), flanqueando o gene de Transcetolase e promotor e terminador do gene que codifica a enzima 3-fosfoglicerato Quinase (PGK1). Assim, de forma resumida, o cassete de expressão que foi inserido no genoma da célula hospedeira e contém os genes de Transcetolase e Ribose 5-Fosfato Epimerase, é constituído por exemplo por promotor TDH1 (SEQ ID NO:2), gene TKL1 (SEQ ID NO:11) e terminador TDH1 (SEQ ID NO:3), seguido de promotor PGK1 (SEQ ID NO:6), gene RPE1 (SEQ ID NO:12) e terminador PGK1 (SEQ ID NO:13).
[0097] Todos os cassetes de expressão com os genes da via metabólica das pentoses fosfato que favorecem o consumo de xilose são inseridos na região do cromossomo alvo localizada entre o centrômero e o primeiro gene adjacente a ele, por exemplo na região dos 5 mil primeiros pares de bases contados a partir do centrômero tanto na direção upstream quanto downstream, podendo inclusive ser apenas upstream, apenas downstream ou ambos simultaneamente.
[0098] Direção upstream é considerada aquela localizada anteriormente ao ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA, a qual se inicia no promotor e encerra no terminador. Por sua vez, downstream é considerada a região localizada após o ponto de início da unidade de transcrição de uma sequência de DNA.
[0099] Adicionalmente à inserção dos cassetes de expressão, a presente invenção descreve também a deleção ou inativação do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14. A produção de xilitol diminui o rendimento total de etanol que pode ser obtido. Além disso, o xilitol é um inibidor da ação da enzima xilose isomerase.
[0100] Quando realizadas em Saccharomyces cerevisiae, as modificações genéticas acima citadas favorecem o fluxo da parte não oxidativa da via das pentoses-fosfato. O favorecimento dessa via pode ser diretamente correlacionado ao consumo de xilose pela célula hospedeira. Assim, quanto mais xilose fosse consumida, mais ativo estaria o fluxo por essa via.
[0101] Adicionalmente, a presente invenção descreve a integração estável e em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) do cassete que expressa a XI (SEQ ID N:1) no genoma da célula hospedeira.
[0102] O presente documento descreve, portanto, uma célula eucariótica, por exemplo, micro-organismo da espécie Saccharomyces cerevisiae, geneticamente modificada contendo em seu genoma pelo menos um dos genes das enzimas necessárias para favorecer a parte não oxidativa da via das pentoses fosfato, inseridos, por exemplo, em alto número de cópias (pelo menos entre cinco e vinte cópias ou, ainda, mais de vinte cópias) e na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente. Possuindo toda a via metabólica necessária para conversão de xilose, em condições aeróbicas, a linhagem é capaz de consumir a xilose presente no meio de cultivo, porém, em condições anaeróbicas, o consumo é muito lento.
[0103] O micro-organismo após ser submetido às modificações genéticas descritas no presente documento, é, então, submetido a processo de engenharia evolutiva que compreende sucessivas repicagens do micro-organismo de interesse em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono utilizável pelo micro-organismo, principalmente xilose, e concentrações variáveis e crescentes de pelo menos uma substância inibidora do metabolismo do micro-organismo, preferencialmente ácido acético acrescido, como observado no Exemplo 4. A repetição desta operação permite a seleção de micro-organismos que possuem modificações genéticas aleatórias derivadas do processo de evolução, sendo esses micro-organismos resistentes ao referido inibidor de interesse, como mostrado no Exemplo 4.
[0104] Assim, em uma concretização, o processo de obtenção de microorganismos da invenção, permite a obtenção de um micro-organismo com substancial e melhorada performance na conversão de pentoses, principalmente xilose em combustíveis e/ou bioquímicos e concomitante resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico, principalmente ao ácido acético. Ou seja, o processo buscou selecionar micro-organismos que produzam ou sejam capazes de produzir bioquímicos e/ou biocombustíveis de interesse em menor tempo e/ou maior quantidade, na presença da fonte de açúcar de interesse e com alta concentração de inibidores em relação à quantidade de açúcares no meio de cultura, quando comparados com micro-organismos não evoluídos para resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico.
[0105] Em uma concretização, o micro-organismo é cultivado em um meio de cultura contendo um hidrolisado lignocelulósico que compreende um ou mais inibidores como, por exemplo, ácido acético e/ou ácido fórmico, como pode ser observado no Exemplo 5. Opcionalmente, o meio é suplementado com nitrogênio. Os micro-organismos com melhor velocidade de crescimento no referido meio (são) selecionado(s) e isolado(s), para subsequente uso. Esse micro-organismo selecionado possui mutações genéticas aleatórias decorrentes do processo de evolução e encontra-se depositado na Coleção Alemã de Microorganismos e Cultura de Células - Leibniz-Institut Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0106] O micro-organismo DSM28788 descrito na presente invenção é, por exemplo, de linhagem industrial e apresenta diferencialmente as características de ser não floculante, permitir baixa formação de glicerol e xilitol, ter alta viabilidade, alta taxa de crescimento, não produzir espuma, entre outros.
[0107] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal, preferencialmente a porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção (DSM 28788) para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0108] Em uma concretização, o referido processo compreende as seguintes etapas: a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o micro-organismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0109] O processo da invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).
[0110] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, por exemplo etanol, e/ou bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção, como o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0111] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir da presente descrição, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.
[0112] Salienta-se, então, que o micro-organismo que é um dos objetos da invenção é particularmente eficiente na conversão de pentoses constituintes de material lignocelulósico em álcoois e/ou ácidos. Referido micro-organismo é eficiente na conversão de pentoses, incluindo xilose, presentes no material lignocelulósico, como aquele previamente submetido a processo de hidrólise.
[0113] Adicionalmente, salienta-se também que o micro-organismo descrito no presente documento, além de eficiente capacidade na conversão, por exemplo, de xilose em etanol, apresenta também eficaz resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico durante o processo de fermentação, sendo o principal inibidor compreendido nesse hidrolisado o ácido acético. Destaca-se também a presença de ácidos, incluindo o ácido acético, no processo de primeira geração para produção de bioquímicos e ou biocombustíveis, permitindo eficiente rendimento do presente micro-organismo também nesse processo.
[0114] Para construção de cada um dos cassetes que continham genes da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato, incluindo gene da Xilose Isomerase, cada um dos genes foi amplificado por PCR do genoma de S. cerevisiae e clonado em cassetes de expressão integrativos.
[0115] Adjacente ao terminador de cada cassete, foi clonado o gene URA3 flanqueado por duas regiões loxP na mesma orientação, permitindo que essa região pudesse ser retirada pela expressão da recombinase Cre e o marcador auxotrófico URA3 pudesse ser utilizado em todos os cassetes de expressão com os genes descritos.
[0116] Em relação à construção do cassete de expressão contendo gene que codifica xilose isomerase, adicionalmente à construção acima descrita, nas extremidades do cassete foram clonadas 126 pb de cada lado com homologia a uma região próxima ao cromossomo cinco de Saccharomyces cerevisiae, permitindo a integração via recombinação homóloga nessa região.
[0117] Para a construção do cassete de expressão com gene que codifica xiluloquinase, por exemplo, amplificou-se esse gene por PCR do genoma de S. cerevisiae e ele foi clonado adjacente ao promotor e terminador do gene que codifica Álcool desidrogenase (ADH1). Após o terminador, foi inserido o gene URA3 flanqueado por duas regiões loxP na mesma orientação. Na extremidade do cassete foi clonado regiões de homologia próximas ao centrômero dois e oito de S. cerevisiae. Foram realizadas duas transformações para inserir os cassetes expressando o gene XKS1 a 288 pb do centrômero dois e a 228 pb do centrômero oito. Dessa maneira, além da cópia endógena, o transformante tem mais duas cópias do gene XKS1 sob a ação de um promotor constitutivo de alta expressão.
[0118] Em relação ao cassete de expressão que contém genes codificadores de Transaldolase (TAL1) e Ribose 5-Fosfato Isomerase (RKI1), por exemplo, esses genes foram clonados sob a ação dos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1) e 3-fosfoglicerato Quinase (PGK1), respectivamente, separados pelo marcador URA3 flanqueado pelos sítios loxP, e devidamente inseridos no cromossomo da célula hospedeira.
[0119] Em relação ao cassete de expressão que contém genes codificadores de Transcetolase (TKL1) e Ribose 5-Fosfato Epimerase (RPE1), por exemplo, esses genes foram clonados sob a ação dos promotores e terminadores dos genes Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase, isoenzima 1 (TDH1) e 3- fosfoglicerato Quinase (PGK1), respectivamente, separados pelo marcador URA3 flanqueado pelos sítios loxP, e devidamente inseridos no cromossomo da célula hospedeira.
[0120] A transformação da célula hospedeira com cada um dos cassetes contendo genes da fase não oxidativa da via das pentoses fosfato seguiu o protocolo de Gietz e Schiestl [Nature Protocols 2, 31 - 34; 2007], via acetato de lítio, e cada um dos genes, flanqueados por promotores e terminadores forte e constitutivos de Saccharomyces cerevisiae, foi estavelmente integrado ao cromossomo da célula hospedeira. A correta integração foi confirmada por PCR. Após a confirmação, a região URA3 foi excisada do genoma pela expressão transiente da recombinase Cre, deixando apenas um sítio loxP no local, após o terminador do gene inserido.
[0121] Nas extremidades do cassete da Xilose Isomerase, foram clonadas 126 pb de cada lado com homologia a uma região próxima ao cromossomo cinco de Saccharomyces cerevisiae, permitindo a integração via recombinação homóloga nessa região.
[0122] Para garantir a integração estável e em alto número de cópias na célula hospedeira, o cassete que expressa a Xilose Isomerase representada por SEQ ID NO:1 foi modificado com a inclusão, nas extremidades do cassete, de elementos delta do retrotransposon Ty1 (elemento presente em alto número de cópias no genoma de S. cerevisiae).
[0123] O marcador URA3 flanqueado pelas regiões loxP é substituído nesse plasmídeo pelo marcador LEU2. Previamente, o gene LEU2 é deletado em uma etapa de manipulação genética. Nessa etapa, integra-se o gene URA3, flanqueado pelas regiões loxP adjacentes a regiões de homologia ao promotor e terminador de LEU2, resultando na deleção desse gene. Em seguida, é inserido o cassete da XI, flanqueado pelos elementos Ty1 e usando o marcador auxotrófico LEU2 para seleção dos transformantes.
[0124] A deleção do gene GRE3, o qual codifica uma aldose redutase e está representado em SEQ ID NO:14, foi realizado em duas etapas através de manipulação genética, visando a diminuição da produção de xilitol a partir de xilose. Na primeira etapa, foi integrado o gene URA3, flanqueado pelas regiões loxP adjacentes a regiões de homologia ao promotor e terminador do gene GRE3, resultando na deleção dessa região. Na segunda etapa, após confirmada a deleção, o marcador URA3 foi retirado pela expressão transiente da recombinase Cre.
[0125] Além de ser manipulado geneticamente com a inserção de todos os genes da via metabólica necessária para conversão de xilose, o microorganismo geneticamente modificado descrito na presente invenção, quando em condições anaeróbias, consome xilose presente no meio de cultivo de forma lenta e com baixa geração de biocombustível, no caso etanol, como pode ser observado na Figura 2.
[0126] O referido micro-organismo foi submetido a um processo de engenharia evolutiva que consistiu de repicagens sucessivas em meio contendo 50 g/L de xilose em condições semi-anaeróbicas. O inóculo era iniciado com densidade óptica (OD) de ~1,0. Devido a um baixo crescimento inicial, nos dois primeiros experimentos foi adicionado uma baixa quantidade de glicose (0,5%) ao meio visando um crescimento mais rápido da cultura. Após 48 horas de cultivo, uma alíquota era transferida para um novo frasco com meio de cultura e o experimento era repetido. Na terceira transferência, não foi necessária a adição de glicose ao meio de cultivo por notar-se um aumento na velocidade de crescimento do micro-organismo em xilose como única fonte de carbono. Foram isoladas e analisadas 20 colônias da mistura de células evoluídas.
[0127] Para seleção de micro-organismo com eficiente resistência aos inibidores presentes no hidrolisado lignocelulósico, micro-organismos que apresentavam eficiente crescimento utilizando xilose como única fonte de carbono foram inoculados em meio contendo 50 g/L xilose, 6 g/L extrato de levedura, 1 g/L Cloreto de amônio, 5 g/L Fosfato de potássio monobásico, 1,5 g/L Cloreto de magnésio e iniciando com 5 g/L ácido acético, em pH4,5 e temperatura de 30°C.
[0128] O inóculo inicial apresentava Densidade Óptica (OD) igual a 0,2 e repicagens sucessivas eram realizadas a cada 48 horas, selecionando-se a cada repicagem aquelas linhagens com maior potencial de crescimento em meio contendo ácido acético. Ao final, a linhagem com melhor potencial de resistência em meio contendo ácido acético, contendo mutações genéticas aleatórias decorrentes do processo de evolução foi depositada no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788). Essa linhagem foi selecionada também devido ao seu desempenho superior quanto à capacidade de conversão de xilose a etanol, como pode ser observado na Figura 3.
[0129] Dois micro-organismos, sendo um deles controle, ou seja, modificado e evoluído apenas para consumo eficiente de xilose, e o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788) foram testados em hidrolisado lignocelulósico de palha de cana, cujo conteúdo foi anteriormente descrito por compreender xilose, glicose, ácido acético, HMF, furfural, os principais inibidores que ocorrem no processo de fermentação. Além disso, o meio utilizado para esses testes foi suplementado com nutrientes adequados para suportar o crescimento da levedura, as amostras foram mantidas em condição semi- anaeróbica de modo a induzir fermentação, e cada uma das amostras foi acondicionada em shaker a 30°C, sob agitação de 200rpm. As Densidades Ópticas (DO) foram medidas em alguns pontos, nos quais foram quantificados xilose e etanol.
[0130] A comparação das performances do micro-organismo controle e do micro-organismo DSM28788 em relação ao consumo de xilose e produção de etanol, nas condições indicadas no parágrafo anterior, pode ser observada nas Figuras 4 e 5 respectivamente.
[0131] O meio de cultivo foi preparado utilizando hidrolisado de palha de cana que compreendia entre 1 g/L e 50 g/L de xilose, sendo por exemplo 42 g/L e entre 1 e 60 g/L de glicose, sendo por exemplo 55 g/L, além de 0-1% de ácido acético, 0-0,5% de HMF e 0-0,5% de furfural, os principais inibidores que ocorrem no processo de fermentação. O hidrolisado foi suplementado com os nutrientes adequados para suportar o crescimento da levedura.
[0132] Uma alíquota de cultura do micro-organismo controle e do micro- organismo DSM28788, cada uma previamente criopreservada a -85oC (em solução de glicerol 20%w/v) foi reativada em meio YEPD (20 g/L de glicose, 10 g de extrato de levedura e 20 g/l de peptona), durante 6 horas em 50 mL de meio YEPD 20 g/L de glicose em um agitador orbital a 200 rpm e 30oC. Posteriormente uma alíquota destas culturas foi transferida para dois diferentes recipientes contendo 200 ml de meio YEPD 40 g/l de glicose.
[0133] Cada uma das culturas foi iniciada com uma Densidade Óptica (DO) igual a 0,1, quando aferida em 600 nm de comprimento de onda e incubada a 200 rpm a 30oC durante 16 horas. Um volume de cada cultura foi centrifugado a 4000 rpm por 10 min. As células do pellet foram lavadas em água destilada e ressuspendidas no meio de cultura adequado para transferência no biorreator.
[0134] As quantificações de xilose e etanol foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência HPLC e utilizando o cromatógrafo Alliance HT (Waters) com detector de índice de refração (Waters 2414). As corridas foram realizadas utilizando uma coluna HPX-87H (BioRad) mantida a 35oC, com ácido sulfúrico 4 mM como fase móvel e um fluxo de 0,6 mL/min.
[0135] Na Figura 6 vemos que o consumo de xilose pelo micro-organismo DSM28788 ocorre de forma mais rápida em relação ao micro-organismo controle, que foi modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores. Este resultado é particularmente relevante no que diz respeito à capacidade do micro-organismo em consumir xilose de forma eficiente na presença de inibidores.
[0136] A Figura 7 mostra a ampliada capacidade de produção de etanol pelo micro-organismo DSM28788 em comparação a um micro-organismo controle que foi modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores, mostrando-se assim o mais adequado para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos, por exemplo o etanol.
[0137] Duas linhagens, sendo uma delas controle, em que o micro-organismo foi evoluído apenas para consumo de xilose e não para resistência a inibidores, e a segunda linhagem formada pelo micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788), foram testadas em meio de cultura YEPD suplementado com concentrações crescentes de ácido acético (concentração variável entre 5 e 15 gramas de ácido acético por Litro de meio YEPD).
[0138] O pré-inóculo das linhagens foi feito em meio YEPD (20 g/L de glicose, 20 g/L de peptona e 10 g/L de extrato de levedura) e crescido em shaker por aproximadamente 16 horas à 30°C por 200 rpm. Após esse período, as células foram centrifugadas, lavadas e ressuspendidas em água destilada esterilizada com OD final de 1,0.
[0139] Uma alíquota de 10 microlitros de cada cultura foi aplicada nas placas contendo meio suplementado com ácido acético. As placas foram incubadas a 30°C e o crescimento foi observado por três dias. Os experimentos foram feitos em duplicata.
[0140] Na menor concentração testada (5 g/L), as duas linhagens apresentaram crescimento. Nessas condições, o micro-organismo DSM28788 apresentou crescimento superior em relação ao micro-organismo controle após 24 horas (Figura 6, coluna A).
[0141] No mesmo período, o micro-organismo DSM28788 que foi evoluído para resistir aos inibidores compreendido no hidrolisado lignocelulósico, por exemplo ácido acético, também apresentou maior crescimento em meio suplementado com 11 g/L de ácido acético, em relação ao micro-organismo controle (Figura 6, coluna B).
[0142] Em concentrações superiores (aproximadamente 15g/L), como mostrado na Figura 6, linha 2, coluna E, observa-se que o micro-organismo DSM28788 ainda apresenta crescimento em ácido acético pronunciadamente superior ao micro-organismo controle.
[0143] Dois micro-organismos, sendo um deles controle, ou seja, modificado e evoluído apenas para consumo eficiente de xilose, e o microorganismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788) foram testados meio de laboratório compreendendo a combinação de altas concentrações de ácido acético e ácido fórmico, visando avaliar o desempenho de ambos microorganismos quando submetidos a altas concentrações de inibidores.
[0144] O meio de laboratório utilizado foi YEP (10 g/L extrato de levedura e 20 g/L peptona bacteriológica) contendo uma mistura de açúcares (50 g/L de glicose e 40 g/L xilose) e dois inibidores normalmente encontrados em hidrolisados lignocelulosicos (8 g/L de ácido acético e 4 g/L de ácido fórmico). As culturas foram iniciadas com aproximadamente 0,4 g/L de células em base seca. Além disso, as culturas foram mantidas em condição anaeróbica de modo a induzir fermentação, cada uma das culturas foi incubada em um biorreator onde o pH foi ajustado e controlado em 5 e onde a temperatura foi mantida em 32 oC. Amostras foram retiradas em intervalos adequados e foram quantificados xilose, glicose e etanol.
[0145] A comparação das performances do micro-organismo DSM28788 em relação ao consumo de glicose, consumo de xilose e produção de etanol, nas condições indicadas no parágrafo anterior, pode ser observada nas Figuras 7, 8 e 9, respectivamente.
[0146] Na Figura 7 observamos a comparação em relação ao consumo de glicose pelo micro-organismo DSM28788 e pelo micro-organismo controle. Pode ser notado, que nas condições testadas, o micro-organismo DSM28788 apresenta uma velocidade de consumo de glicose significativamente superior em relação ao micro-organismo controle (modificado geneticamente para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores).
[0147] Este resultado demonstra que o micro-organismo descrito na presente invenção e que foi evoluído para eficiente consumo de xilose e resistência a inibidores, como, por exemplo, ácido acético e ácido fórmico, apresenta também maior taxa de consumo de glicose.
[0148] Por sua vez, na Figura 8 vemos que o consumo de xilose pelo micro-organismo DSM28788 ocorre de forma mais rápida em relação ao microorganismo controle, que foi modificado apenas para consumo de xilose, sem seleção para resistência a inibidores. Esta comparação mostra claramente a capacidade do micro-organismo em consumir xilose mais rapidamente em relação ao micro-organismo controle mesmo quando submetido à combinação de altas concentrações de inibidores como ácido acético e ácido fórmico.
[0149] Adicionalmente, na Figura 9, observa-se que a produção de etanol condiz com a maior velocidade de consumo dos açúcares. Ou seja, o etanol é produzido mais rapidamente pelo micro-organismo DSM28788, quando comparado ao micro-organismo controle.
[0150] Finalmente na Tabela 2, pode ser observada comparação numérica produtividade volumétrica de etanol (que avalia a velocidade produção de etanol por cada litro e a cada hora, g/Lh) e o índice de consumo de açúcar total (que mensura a quantidade de açúcar consumido em função do açúcar alimentado para cada cultura). Para ambos os parâmetros avaliados, vemos que os números são significativamente superiores para o micro-organismo DSM28788, quando comparado ao micro-organismo controle.
[0151] A tabela X nos mostra a comparação da produtividade volumétrica e o índice de consumo de açúcares entre o micro-organismo DSM28788 e o microorganismo controle que foi evoluído apenas para consumo de xilose. Tabela 2: Comparação da produtividade volumétrica e o índice de consumo de açúcares.
[0152] A presente invenção também revela e compreende um processo de produção de biocombustíveis e bioquímicos a partir de biomassa vegetal, por exemplo a porção lignocelulósica da biomassa vegetal. O processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos descrito na presente invenção utiliza o micro-organismo da invenção para produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos.
[0153] Em uma concretização, o referido processo consiste nas seguintes etapas: a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o microorganismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788), preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
[0154] O presente processo é capaz de apresentar rendimento pelo menos de 0,46 gramas de etanol produzido a cada grama de açúcar consumido, quando realizado em hidrolisado lignocelulósico. Adicionalmente, o presente processo apresenta produtividade de, pelo menos, 0,74 gramas de etanol produzido por litro de hidrolisado a cada hora. Esses resultados podem ser observados na Figura 9.
[0155] O processo da invenção proporciona a produção de biocombustíveis que compreendem predominantemente álcoois, especialmente o etanol. O processo da invenção proporciona a produção de bioquímicos selecionados do grupo que compreende, mas não se limita a: ácido succínico, ácido málico, 1,3-propanediol, 1,2-propanediol, butanol, isobutanol, biodiesel, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol e/ou PHB - poli(hidróxido butirato).
[0156] A presente invenção descreve, finalmente, os biocombustíveis, por exemplo etanol, e bioquímicos produzidos através do processo que utiliza o micro-organismo da invenção, como o micro-organismo depositado no Instituto Leibniz - Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número 28788 (DSM28788).
[0157] Os versados na arte/técnica imediatamente compreenderão, a partir da presente descrição, que o conceito inventivo ora reivindicado não se limita às concretizações exemplificadas acima, que devem ser interpretadas: como prova da existência material da invenção; e como meio informacional que prontamente permite que um técnico no assunto consiga reproduzi-lo - tanto nas formas específicas ora exemplificadas como em outras legalmente abrangidas pelo escopo completo do conceito inventivo revelado e dos objetos reivindicados.
Claims (9)
1. Cassete de expressão para a transformação de célula eucariótica caracterizado por compreender os seguintes cassetes: a. cassete de expressão que compreende um gene que codifica a xilose isomerase de sequência SEQ ID NO:1, promotor TDH1 de sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, e terminador TDH1 de sequência nucleotídica SEQ ID NO:3; b. cassete de expressão que compreende promotor ADH1 representado pela sequência SEQ ID NO:8, gene XKS1 representado pela sequência SEQ ID NO:9 e terminador ADH1 representado pela sequência SEQ ID NO:10; c. cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência nucleotídica SEQ ID NO:2, gene TAL1 de sequência SEQ ID NO:5, gene terminador TDH1 de sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de sequência SEQ ID NO:6, de gene RKI1 (SEQ ID NO:7) e de terminador de sequência nucleotídica SEQ ID NO:13; e d. cassete de expressão que compreende promotor TDH1 de sequência SEQ ID NO:02, gene TKL1 de sequência SEQ ID NO:11, gene codificador de Ribose 5-Fosfato Epimerase (SEQ ID NO:7), terminador TDH1 de sequência SEQ ID NO:3, seguido de promotor PGK1 de sequência SEQ ID NO:6, gene RPE1 de sequência SEQ ID NO:12 e terminador PGK1 de sequência SEQ ID NO:13; e e. e em que os ditos cassetes de expressão são funcionais em Sacharomyces cerevisiae.
2. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de pelo menos um dos referidos promotores serem constitutivos ou naturalmente induzíveis.
3. Micro-organismo geneticamente modificado caracterizado por compreender o cassete de expressão conforme definido na reivindicação 1, em que um ou mais dos referidos cassetes de expressão serem presentes na região entre o centrômero e seu primeiro gene adjacente, e pelo fato do microorganismo ser Sacharomyces cerevisiae.
4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as sequências promotoras, sequências codificantes e sequências terminadoras dos cassetes de expressão são estáveis no genoma do micro-organismo ou estão presentes em no mínimo 5 cópias no genoma do micro-organismo ou ambos.
5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o gene GRE3 (SEQ ID NO:14) ser inativado ou deletado em seu genoma.
6. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por ser levedura Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
7. Micro-organismo geneticamente modificado para expressão peptídeo com função xilose isomerase caracterizado por ser Saccharomyces cerevisiae DSM28788.
8. Processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos caracterizado por a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o microrganismo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 7, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
9. Processo de produção de biocombustíveis e/ou bioquímicos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a. colocar biomassa vegetal lignocelulósica, opcionalmente submetida previamente a pré-tratamento e hidrólise, em contato com o microrganismo DSM28788, preferencialmente em condições anaeróbias, não sendo esta, entretanto, uma condição restritiva para o processo; e b. opcionalmente, fazer o posterior recolhimento do composto gerado.
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