CN116814643A - 植物诱导分泌型表达盒及其调控元件 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含有植物诱导分泌型表达盒及其调控元件的DNA分子，属于基因工程领域。本发明公开的DNA分子包括4个表达盒，每个所述表达盒分别包括启动子、与所述启动子相连的5’UTR、与所述5’UTR相连的信号肽编码基因、与所述信号肽编码基因相连的功能基因、与所述功能基因相连的3’UTR和与所述3’UTR相连的终止子；所述启动子、5’UTR、3’UTR和终止子均来源于茉莉酸诱导表达基因；所述信号肽来源于分泌型蛋白；每个所述表达盒中的功能基因的核苷酸序列(如编码序列)不同，每个所述表达盒中的启动子、5’UTR、3’UTR、信号肽编码基因和终止子的核苷酸序列不同或相同。本发明提供的DNA分子可应用于任何植物，用于植物的遗传改良。

Description

植物诱导分泌型表达盒及其调控元件
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及植物诱导分泌型表达盒及其调控元件。
背景技术
茉莉酸(jasmonic acid,JA)及其衍生物是一类含氧脂类激素，它们普遍存在于植物界，在植物发育和对非生物胁迫和病原菌的反应中发挥着重要作用(Yang Z,Huang Y,Yang J,Yao S,Zhao K,Wang D,Qin Q,Bian Z,Li Y,Lan Y,Zhou T,Wang H,Liu C,WangW,Qi Y,Xu Z,Li Y.Jasmonate Signaling Enhances RNA Silencing and AntiviralDefense in Rice.Cell Host Microbe.2020Jul 8；28(1):89-103.e8.doi:10.1016/j.chom.2020.05.001.Epub 2020Jun 5.PMID:32504578.)。寄主植物在经受机械损伤或害虫取食后，植物体内的JA含量受诱导迅速大量合成，JA合成途径基因包括LOX2、VSP2、LOX3、VSP1、JAR1、AOS等基因的表达会迅速上调，启动下游防御机制(Ye M,Glauser G,Lou Y,ErbM,Hu L.Molecular Dissection of Early Defense Signaling Underlying Volatile-Mediated Defense Regulation and Herbivore Resistance in Rice.PlantCell.2019Mar；31(3):687-698.doi:10.1105/tpc.18.00569.Epub 2019Feb 13.PMID:30760558；PMCID:PMC6482627.)。因此，利用被茉莉酸甲酯高效诱导的基因的启动子驱动植物体内功能基因进行作物的遗传改良，可使转基因植物在感受到损伤信号后驱动植物体内功能基因高效表达，从而赋予转基因植物良好的防御能力。
在基因工程中，病虫害损伤诱导型基因表达调控元件包括启动子、5’UTR、3’UTR和终止子，以及高效分泌表达的信号肽序列等，对目标基因诱导高效表达至关重要(Lu Y,Rijzaani H,Karcher D,Ruf S,Bock R.Efficient metabolic pathway engineering intransgenic tobacco and tomato plastids with synthetic multigene operons.ProcNatl Acad Sci U S A.2013Feb 19；110(8):E623-32.doi:10.1073/pnas.1216898110.Epub 2013Feb 4.PMID:23382222；PMCID:PMC3581966.)。
启动子是直接影响基因表达水平的重要的基因组调控元件，它通常位于基因5’端上游，能正确有效起始转录，在DNA转录成RNA的过程中发挥关键作用。植物基因工程中根据基因表达方式不同将启动子分为三种类型：组成型、诱导型和组织特异性启动子。诱导型启动子是指在激素、胁迫等条件诱导下，使得目的基因的表达量大幅提高(李甜甜,李丽丽,陈利红,高利芬.水稻茉莉酸甲酯和白叶枯病菌诱导型启动子的克隆及功能鉴定[J].分子植物育种,2018,16(03):689-695.DOI:10.13271/j.mpb.016.000689.)。因此开发此类诱导型启动子的转化体系对植物转基因育种具有重要意义，可以使外源基因在特定的诱导条件下表达，这样既能提高外源基因在转基因植物组织中的表达水平，还可以避免由于不必要的代谢造成的资源浪费。
除启动子外，5’UTR、3’UTR等序列和信号肽等元件也会影响蛋白的表达(专利：CN103114102B)。对于蛋白表达系统需要多个关键特征，比如，该系统应该对宿主细胞的存活性和完整性带来可以忽略的有害影响，因此，要表达具有杀虫等特性的毒蛋白时要考虑避开对植物细胞的伤害，其应该需要向重组目的蛋白的氨基酸序列添加信号肽序列从而实现分泌。在该背景下，本发明人已经研究了植物中蛋白定位在细胞外的分泌型蛋白及基因，比如拟南芥PR1、PR3、PR5、PDF1.2等，这些基因的氨基酸序列具有信号肽功能，可以引导蛋白从宿主细胞分泌和释放。目的蛋白可以是技术人员所能理解的任意目的蛋白，可以通过组合使用不同顺式-调节元件提高启动子特性，借助元件组合可以构成目的蛋白在不同植物物种中确保高度专用和可控、符合需求的损伤诱导分泌型表达。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何使功能基因在植物受虫害损伤和/或病害损伤和/或机械损伤诱导后迅速响应并分泌表达功能蛋白。
为解决上述的技术问题，本发明提供DNA分子(多基因表达盒)，所述DNA分子包括4个表达盒，每个所述表达盒分别包括启动子、与所述启动子相连的5’UTR、与所述5’UTR相连的信号肽编码基因、与所述信号肽编码基因相连的功能基因、与所述功能基因相连的3’UTR和与所述3’UTR相连的终止子；
所述启动子、5’UTR、3’UTR和终止子均来源于茉莉酸诱导表达基因；
所述信号肽来源于分泌型蛋白；
每个所述表达盒中的功能基因的核苷酸序列(如编码序列)不同，每个所述表达盒中的启动子、5’UTR、3’UTR、信号肽编码基因和终止子的核苷酸序列不同或相同。
本发明中所述茉莉酸诱导表达基因包括但不限于：AtLOX2、AtVSP2、AtLOX3、AtVSP1、AtJAR1、AtAOS、AtMYC2等。
本发明中，所述分泌型蛋白包括但不限于：AtPR1、AtPR3、AtPR5、AtPDF1.2、AtPIP1等。
本发明中，所述功能基因编码的蛋白质的氨基酸序列可相同或不同。
进一步地，上述的DNA分子中，所述4个表达盒为表达盒A、表达盒B、表达盒C和表达盒D；
所述表达盒A的启动子为p-AtLOX2，所述p-AtLOX2的核苷酸序列为SEQ ID No.1第1-896位所示；所述表达盒A的5’UTR为AtLOX2-5’UTR，所述AtLOX2-5’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第897-1088位；所述表达盒A的3’UTR为AtLOX2-3’UTR，所述AtLOX2-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第1548-1672位；所述表达盒A的终止子为t-AtLOX2，所述t-AtLOX2的核苷酸序列是SEQ ID No.1第1673-1872位；
所述表达盒B的启动子为p-AtVSP2，所述p-AtVSP2的核苷酸序列是SEQ ID No.1第1873-2964位；所述表达盒B的5’UTR为AtVSP2-5’UTR，所述AtVSP2-5’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第2965-3344位；所述表达盒B的3’UTR为AtVSP2-3’UTR，所述AtVSP2-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第3829-4078位；所述表达盒B的终止子为t-AtVSP2，所述t-AtVSP2的核苷酸序列是SEQ ID No.1第4079-4278位；
所述表达盒C的启动子为p-AtLOX3，所述p-AtLOX3的核苷酸序列是SEQ ID No.1第4279-5278位；所述表达盒C的5’UTR为AtLOX3-5’UTR，所述AtLOX3-5’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第5279-5467位；所述表达盒C的3’UTR为AtLOX3-3’UTR，所述AtLOX3-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第5892-6747位；所述表达盒C的终止子为t-AtLOX3，所述t-AtLOX3的核苷酸序列是SEQ ID No.1第6748-6947位；
所述表达盒D的启动子为p-AtVSP1，所述p-AtVSP1的核苷酸序列是SEQ ID No.1第6948-7947位；所述表达盒D的5’UTR为AtVSP1-5’UTR，所述AtVSP1-5’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第7948-8259位；所述表达盒D的3’UTR为AtVSP1-3’UTR，所述AtVSP1-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第9409-9607位；所述表达盒D的终止子为t-AtVSP1，所述t-AtVSP1的核苷酸序列是SEQ ID No.1第9608-9807位。
进一步地，上述的DNA分子中，所述信号肽选自sp-AtPR1、sp-AtPR3、sp-AtPR5、sp-AtPDF1.2；所述sp-AtPR1的氨基酸序列是SEQ ID No.2，所述sp-AtPR3的氨基酸序列是SEQID No.3，所述sp-AtPR5的氨基酸序列是SEQ ID No.4，所述sp-AtPDF1.2的氨基酸序列是SEQ ID No.5。
进一步地，上述的DNA分子中，所述信号肽编码基因为所述sp-AtPR1的编码基因、所述sp-AtPR3的编码基因、所述sp-AtPR5的编码基因或所述sp-AtPDF1.2的编码基因，所述sp-AtPR1的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第1089-1163位的DNA分子；所述sp-AtPR3的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第3345-3440位的DNA分子；所述sp-AtPR5的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第5468-5533位的DNA分子；所述sp-AtPDF1.2的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第8260-8343位的DNA分子。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供含有上述DNA分子的重组载体。
本发明中，所述重组载体可为pMDC100。
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供含有上述DNA分子或含有上述重组载体的重组微生物；
为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供含有上述DNA分子或含有上述重组载体的转基因植物细胞系或/和转基因植物组织或/和转基因植物器官。
上述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。
为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供应用，所述应用为A1)-A3)中任意一项：
A1)上述的多基因表达盒和/或上述的生物材料在植物功能基因的损伤诱导型表达中的应用；
A2)上述的多基因表达盒和/或上述的生物材料在提高植物功能基因表达量中的应用；
A3)上述的多基因表达盒和/或上述的生物材料在植物抗逆性中的应用。
为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供提高植物抗逆性的方法，所述方法包括用上述的表达盒在受体植物中表达功能基因。
进一步地，上述的方法中，所述功能基因为损伤诱导型基因。
上述方法中，所述损伤诱导型基因包括但不限于：GhJAZ8等任何功能基因。
示例性的，上述方法中所述损伤诱导性基因包括但不限于G1)-G4)中任一项：
G1)、根据玉米密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-Maize(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1164-1520位)；G2)、根据小麦密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-Wheat(核苷酸序列是SEQ ID No.1第3441-3797位)；G3)、根据大豆密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-soybean(核苷酸序列是SEQ ID No.1第5534-5890位)；G4)、根据水稻密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-Rice(核苷酸序列是SEQ ID No.1第8344-8700位)。
上述方法中，所述受体植物包括但不限于玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、辣椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草和大麦。
本发明取得的有益效果如下：
本发明首次实现了功能基因的损伤诱导型表达，且验证了信号肽能高效介导外源蛋白分泌表达。诱导前，在转基因的叶片中GFP报告基因的表达量很低，说明该含有诱导分泌型表达盒及其调控元件的植物重组表达载体的启动子自身表达水平低，启动子在损伤诱导时就能大量启动GFP报告基因的表达，说明启动子应答速度快，诱导基因表达的程度高。另外，信号肽引导功能蛋白分泌到细胞间，这对于在植物中过表达毒蛋白提高植物抗性非常关键，该诱导分泌型表达盒及其调控元件的这些特征符合植物基因工程研究中理想调控元件的要求，可以为植物基因工程提供有价值的材料。
附图说明
图1为调控植物体内功能基因的元件构成图。
图2为含有诱导分泌型表达盒及其调控元件的骨架载体示意图。
图3为含有诱导分泌型表达盒及其调控元件的植物双元表达载体示意图。
图4为转基因植株水稻、玉米、棉花和烟草的PCR鉴定。
图5为qRT-PCR测定4个表达盒均表达的实验结果。
图6为转基因植株GMO水稻和非转基因水稻叶片的扎孔损伤处理。
图7为转基因植株GMO玉米和非转基因植株B73玉米叶片的扎孔损伤处理。
图8为转基因植株GMO棉花的扎孔损伤处理。
图9为转基因植株GMO烟草的扎孔损伤处理。
图10为诱导分泌型表达盒及其调控元件的分泌型证据。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、损伤诱导型启动子和终止子元件的获得
通过Genevestigator软件获取拟南芥响应茉莉酸诱导表达基因，使用UniGene中EST模式去除数据中的假阳性基因，随机选取4个基因AtLOX2、AtVSP2、AtLOX3、AtVSP1。从TAIR(The Arabidopsis Information Resource，http://www.arabidopsis.org/)网站获取这些基因启动子区域序列，用PlantCARE(plant cis-acting regulatory elements，http://www.bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)在线启动子预测工具分析表明：该4个基因的启动子序列含有启动子基本结构。然后在TAIR网站获取该4个基因的5’UTR、3’UTR、终止子序列。拟南芥响应茉莉酸诱导的AtLOX2(Gene ID AT3G45140)、AtVSP2(Gene ID AT5G24770)、AtLOX3(Gene ID AT1G17420)、AtVSP1(Gene ID AT5G24780)基因具有启动子功能的DNA片段分别命名为启动子p-AtLOX2、p-AtVSP2、p-AtLOX3、p-AtVSP1，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1第1-896位、SEQ ID No.1第1873-2964位、SEQ IDNo.1第4279-5278位、SEQ ID No.1第6948-7947位。AtLOX2、AtVSP2、AtLOX3、AtVSP1基因的5’UTR顺式-调节元件序列分别为SEQ ID No.1第897-1088位、SEQ ID No.1第2965-3344位、SEQ ID No.1第5279-5467位、SEQ ID No.1第7948-8259位。AtLOX2、AtVSP2、AtLOX3、AtVSP1基因的3’UTR顺式-调节元件序列分别为SEQ ID No.1第1548-1672位、SEQ ID No.1第3829-4078位、SEQ ID No.1第5892-6747位、SEQ ID No.1第9409-9607位。AtLOX2、AtVSP2、AtLOX3、AtVSP1基因具有终止子功能的DNA片段分别命名为终止子t-AtLOX2、t-AtVSP2、t-AtLOX3、t-AtVSP1，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1第1673-1872位、SEQ ID No.1第4079-4278位、SEQ ID No.1第6748-6947位、SEQ ID No.1第9608-9807位。
实施例2、分泌型信号肽元件的获得
通过文献及TAIR数据库搜索拟南芥分泌型蛋白基因序列，使用SignalP 5.0在线预测服务(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对蛋白预测信号肽，根据预测结果，进一步筛选具有信号肽的蛋白，最终筛选到4个蛋白表达量较高且具有信号肽的蛋白基因AtPR1(Gene ID AT2G14610)、AtPR3(Gene ID AT3G12500)、AtPR5(Gene ID AT1G75040)、AtPDF1.2(Gene ID AT5G44420)，信号肽分别命名为sp-AtPR1、sp-AtPR3、sp-AtPR5、sp-AtPDF1.2，信号肽的氨基酸序列分别是SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5，编码信号肽的核苷酸序列分别是SEQ ID No.1第1089-1163位、SEQ ID No.1第3345-3440位、SEQ ID No.1第5468-5533位或SEQ ID No.1第8260-8343位。
实施例3、诱导分泌型表达盒及其调控元件的植物重组表达载体构建
构建了棉花GhJAZ8(在棉花数据库(https://cottonfgd.org/analyze/)的基因ID为Gh_A05G1241，Sun H,Chen L,Li J,Hu M,Ullah A,He X,Yang X,Zhang X.TheJASMONATE ZIM-Domain Gene Family Mediates JA Signaling and Stress Response inCotton.Plant Cell Physiol.2017Dec 1；58(12):2139-2154.doi:10.1093/pcp/pcx148.PMID:29036515.)植物重组表达载体的4个表达盒，每个表达盒的元件依次为启动子、与启动子相连的5’UTR、与5’UTR相连的信号肽编码基因、与信号肽编码基因相连的功能基因、与功能基因相连的3’UTR和与3’UTR相连的终止子。
另外，以不同作物的偏爱密码子对每个GhJAZ8基因序列进行优化，根据玉米密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-Maize(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1164-1520位)；根据小麦密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-Wheat(核苷酸序列是SEQ ID No.1第3441-3797位)；根据大豆密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-soybean(核苷酸序列是SEQ ID No.1第5534-5890位)；根据水稻密码子偏爱性对GhJAZ8核苷酸序列进行优化GhJAZ8-Rice(核苷酸序列是SEQ ID No.1第8344-8700位)。
表达盒A：p-AtLOX2、AtLOX2-5’UTR、sp-AtPR1、GhJAZ8-Maize基因、HA标签、AtLOX2-3’UTR、t-AtLOX2；
表达盒B：p-AtVSP2、AtVSP2-5’UTR、sp-AtPR3、GhJAZ8-Wheat基因、CMYC标签、AtVSP2-3’UTR、t-AtVSP2；
表达盒C：p-AtLOX3、AtLOX3-5’UTR、sp-AtPR5、GhJAZ8-soybean基因、GFP标签、AtLOX3-3’UTR、t-AtLOX3；
表达盒D：p-AtVSP1、AtVSP1-5’UTR、sp-PDF1.2、GhJAZ8-Rice基因、mCherry标签、AtVSP1-3’UTR、t-AtVSP1。
表达盒A：p-AtLOX2(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1-896位)、AtLOX2-5’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第897-1088位)、sp-AtPR1(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1089-1163位)、GhJAZ8-Maize基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1164-1520位)、HA标签(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1521-1547位)、AtLOX2-3’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1548-1672位)、t-AtLOX2(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1673-1872位)；
表达盒B：p-AtVSP2(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1873-2964位)、AtVSP2-5’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第2965-3344位)、sp-AtPR3(核苷酸序列是SEQ ID No.1第3345-3440位)、GhJAZ8-Wheat基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第3441-3797位)、CMYC标签(核苷酸序列是SEQ ID No.1第3798-3828位)、AtVSP2-3’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第3829-4078位)、t-AtVSP2(核苷酸序列是SEQ ID No.1第4079-4278位)；
表达盒C：p-AtLOX3(核苷酸序列是SEQ ID No.1第4279-5278位)、AtLOX3-5’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第5279-5467位)、sp-AtPR5(核苷酸序列是SEQ ID No.1第5468-5533位)、GhJAZ8-soybean基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第5534-5890位)、GFP标签(核苷酸序列是SEQ ID No.1第5891-6604位)、AtLOX3-3’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第5892-6747位)、t-AtLOX3(核苷酸序列是SEQ ID No.1第6748-6947位)；
表达盒D：p-AtVSP1(核苷酸序列是SEQ ID No.1第6948-7947位)、AtVSP1-5’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第7948-8259位)、sp-PDF1.2(核苷酸序列是SEQ ID No.1第8260-8343位)、GhJAZ8-Rice基因(核苷酸序列是SEQ ID No.1第8344-8700位)、mCherry标签(核苷酸序列是SEQ ID No.1第8701-9408位)、AtVSP1-3’UTR(核苷酸序列是SEQ ID No.1第9409-9607位)、t-AtVSP1(核苷酸序列是SEQ ID No.1第9608-9807位)。
以HA、CMYC、GFP和mcherry分别作为4个表达盒的蛋白标签，4个表达盒依次排序，其结构如图1所示。
图1中，前缀p表示启动子(promoter，含5’UTR序列)；前缀sp表示信号肽(signalpeptide)；前缀t表示终止子(terminator，含3’UTR序列)；HA(核苷酸序列是SEQ ID No.1第1521-1547位)、cMYC(核苷酸序列是SEQ ID No.1第3798-3828位)、GFP(核苷酸序列是SEQID No.1第5891-6604位)和mCherry(核苷酸序列是SEQ ID No.1第8701-9408位)为蛋白标签。p-35S为组成型表达启动子(SEQ ID No.6)，NPTII为抗性标记(SEQ ID No.7)，t-NOS为终止子(SEQ ID No.8)。
然后对整个调控植物体内功能基因的元件进行全序列合成(上海生工)，合成的全序列命名为GhJAZ8-4X，其核苷酸序列是SEQ ID No.1。将GhJAZ8-4X构建到M35S-8GWN载体，获得的载体命名为pCR8GW+GhJAZ8-4X(图2)。
图2为含有诱导分泌型表达盒及其调控元件的骨架载体示意图。骨架载体为M35S-8GWN(pCR8 GW，Invitrogen，货号K250020)，GhJAZ8-4X指GhJAZ8的4个多基因表达盒。attL1(SEQ ID No.9)和attL2(SEQ ID No.10)将在构建重组的植物双元表达载体时进行LR反应使用。
将多基因表达盒通过Gateway LR反应连接到目标表达载体pMDC100(BioVector，货号：CD3-746)上，获得的重组载体命名为PMDC100-LR1-GhJAZ8-4X(图3)。
图3为含有诱导分泌型表达盒及其调控元件的植物双元表达载体示意图。骨架载体为pMDC100，attB1(SEQ ID No.11)和attB2(SEQ ID No.12)为骨架载体和表达载体LR后的重组序列。CaMV35S promoter为组成型表达启动子(SEQ ID No.6)，NPTII为抗性标记(SEQ ID No.7)，t-NOS为终止子(SEQ ID No.8)。
实施例4、转基因植株获得与鉴定
用电激法将构建的含有诱导分泌型表达盒及其调控元件的pMDC100-LR1-GhJAZ8-4X重组表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行水稻、玉米、棉花和烟草遗传转化。上述的植物表达载体通过农杆菌介导水稻、玉米、棉花和烟草下胚轴转化方法导入受体植物。
水稻的受体品种为日本晴，转化方法参照文献：Zhao W,Zheng S,Ling H Q.Anefficient regeneration system and Agrobacterium-mediated transformation ofChinese upland rice cultivar Handao297.Plant Cell Tissue&Organ Culture.2011,106(3):475.)。
玉米的受体品种为B73，转化方法参照文献：Lee H,Zhang ZJ.Agrobacterium-mediated transformation of maize(Zea mays)immature embryos.Methods MolBiol.2014；1099:273-280.)。
棉花的受体品种为ZM24，转化方法参照文献：Yang Z,Ge X,Yang Z,Qin W,Sun G,Wang Z,Li Z,Liu J,Wu J,Wang Y,Lu L,Wang P,Mo H,Zhang X,Li F.Extensiveintraspecific gene order and gene structural variations in upland cottoncultivars.Nat Commun.2019Jul 5；10(1):2989.doi:10.1038/s41467-019-10820-x.PMID:31278252；PMCID:PMC6611876.。
烟草的受体品种为本氏烟，转化方法参照文献：Sunilkumar G,Vijayachandra K,Veluthambi K.Preincubation of cut tobacco leaf explants promotesAgrobacterium-mediated transformation by increasing vir gene induction.PlantScience,1999.141(1):51-58.)。
每组受体植株设置20株。待水稻、玉米、棉花和烟草植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取水稻、玉米、棉花和烟草基因组DNA，以跨载体引物(JAZ7：ggtttacccgccaatatatcc，JAZ7：tcaattcgaacatggctataac，PCR产物大小为967bp)扩增超量表达转基因水稻、玉米、棉花和烟草。电泳结果如图4，图4中M为DNA marker，从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp。PCR产物大小为967bp。1-5为转基因株系编号。P为质粒阳性对照。H为水阴性对照。
图4结果显示转基因水稻、玉米、棉花和烟草植株都能扩增出一条与阳性对照一致的条带，说明植物表达载体的T-DNA区段已经整合到转基因水稻、玉米、棉花和烟草基因组中，获得阳性植株各5株。
实施例5、诱导分泌型表达盒及其调控元件的损伤诱导型特征鉴定
5.1、qRT-PCR方法测定4个表达盒的表达
对获得的GMO水稻、玉米、棉花和烟草叶片提取RNA，通过qRT-PCR方法测定4个表达盒的表达情况。
以GhTub1作为内参基因，分别以qBox A-F和qBox A-R、qBox B-F和qBox B-R、qBoxC-F和qBox C-R、Box D-F和qBox D-R作为引物，测定GMO棉花中表达盒A、B、C、D中目的基因GhJAZ8的相对表达量；
以OsActin作为内参基因，以qBox A-F和qBox A-R、qBox B-F和qBox B-R、qBox C-F和qBox C-R、Box D-F和qBox D-R作为引物，测定GMO水稻中表达盒A、B、C、D中目的基因GhJAZ8的相对表达量；
以ZmActin作为内参基因，以qBox A-F和qBox A-R、qBox B-F和qBox B-R、qBox C-F和qBox C-R、Box D-F和qBox D-R作为引物，测定GMO玉米中表达盒A、B、C、D中目的基因GhJAZ8的相对表达量；
以NbActin作为内参基因，以qBox A-F和qBox A-R、qBox B-F和qBox B-R、qBox C-F和qBox C-R、Box D-F和qBox D-R作为引物，测定GMO烟草中表达盒A、B、C、D中目的基因GhJAZ8的相对表达量。
qRT-PCR的引物序列见表1，qRT-PCR的结果如图5所示。图5中A为转基因水稻中4个表达盒的目的基因的相对表达量，图5中B为转基因棉花中4个表达盒的目的基因的相对表达量，图5中C为转基因玉米中4个表达盒的目的基因的相对表达量，图5中D为转基因烟草的4个表达盒中目的基因的相对表达量。
图5结果显示转基因水稻、玉米、棉花和烟草植株的4个表达盒都能表达，说明功能蛋白已经在转基因水稻、玉米、棉花和烟草基因组中成功表达。
表1 qRT-PCR方法测定4个表达盒的表达情况所使用的引物序列。
5.2、4个表达盒的损伤诱导型表达
对获得的GMO水稻、玉米、棉花和烟草叶片分别进行扎孔损伤处理。相对于野生型水稻叶片，GMO水稻叶片扎孔损伤处理后20分钟可以观察到GFP的强荧光信号，但是扎孔的野生型水稻叶片未观察到GFP的强荧光信号(图6)。相对于野生型玉米叶片，GMO玉米叶片扎孔损伤处理后20分钟可以观察到GFP的强荧光信号，但是扎孔的野生型玉米叶片未观察到GFP的强荧光信号(图7)。对来自于同一株GMO棉花的临近叶片进行实验发现，未扎孔的GMO棉花叶片未观察到GFP的强荧光信号，相对比的，GMO棉花叶片扎孔后10分钟就观察到GFP的强荧光信号(图8)。对整株GMO烟草的两个临近叶片进行扎孔损伤实验发现，GMO烟草叶片扎孔损伤后20分钟就观察到GFP的强荧光信号，未扎孔的GMO烟草叶片未观察到GFP的强荧光信号(图9)。综上，证明调控植物体内功能基因的元件是损伤诱导表达型。
实施例6、诱导分泌型表达盒及其调控元件的分泌型特征鉴定
诱导分泌型表达盒及其调控元件对功能基因GhJAZ8的4个表达盒分别加入了信号肽spAtPR1、spAtPR3、spAtPR5、spAtPDF1.2，为验证信号肽的功能，构建GFP-GhJAZ8蛋白和GFP-sp-GhJAZ8蛋白亚细胞定位载体，设置GFP空载体对照(GFP空载体名称为pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp，在文献“Liu F,Huang N,Wang L,Ling H,Sun T,Ahmad W,Muhammad K,GuoJ,Xu L,Gao S,Que Y,Su Y.A Novel L-ascorbate Peroxidase 6Gene,ScAPX6,Plays anImportant Role in the Regulation of Response to Biotic and Abiotic Stressesin Sugarcane.Front Plant Sci.2018Jan 17；8:2262.doi:10.3389/fpls.2017.02262.PMID:29387074；PMCID:PMC5776131.”中公开，公众可从申请人处获得该材料，获得的材料仅可用于重复本技术方案)。
用核苷酸序列是SEQ ID No.1第1164-1520位的DNA分子替换GFP空载体(pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp)的BsaI和Eco31I之间的片段(BsaI和Eco31I之间的小片段)，保持GFP空载体其他核苷酸序列不变，得到GFP-GhJAZ8的表达载体。
用核苷酸序列是SEQ ID No.1第1089-1520位的DNA分子替换GFP空载体(pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp)的BsaI和Eco31I之间的片段(BsaI和Eco31I之间的小片段)，保持GFP空载体其他核苷酸序列不变，得到GFP-spAtPR1-GhJAZ8的表达载体。
用核苷酸序列是SEQ ID No.1第3345-3797位的DNA分子替换GFP空载体(pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp)的BsaI和Eco31I之间的片段(BsaI和Eco31I之间的小片段)，保持GFP空载体其他核苷酸序列不变，得到GFP-spAtPR3-GhJAZ8的表达载体。
用核苷酸序列是SEQ ID No.1第5468-5890位的DNA分子替换GFP空载体(pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp)的BsaI和Eco31I之间的片段(BsaI和Eco31I之间的小片段)，保持GFP空载体其他核苷酸序列不变，得到GFP-spAtPR5-GhJAZ8的表达载体。
用核苷酸序列是SEQ ID No.1第8260-8700位的DNA分子替换GFP空载体(pBWA(V)HS-ccdb-Glosgfp)的BsaI和Eco31I之间的片段(BsaI和Eco31I之间的小片段)，保持GFP空载体其他核苷酸序列不变，得到GFP-spAtPDF1.2-GhJAZ8的表达载体。
将上述获得的表达载体分别瞬时转染水稻原生质体细胞，在激光共聚焦显微镜下观察GFP荧光在细胞中的定位。
图10示出了诱导分泌型表达盒及其调控元件的分泌型证据。图10中GFP空载体对照的GFP荧光在细胞多个位置出现，GhJAZ8-GFP荧光出现在细胞核上，GFP-spAtPR1-GhJAZ8、GFP-spAtPR3-GhJAZ8、GFP-spAtPR5-GhJAZ8、GFP-spAtPDF1.2-GhJAZ8荧光出现在细胞间。明场，即没有荧光激发；融合，表示激发。
结果表明：未加信号肽的对照GhJAZ8-GFP融合蛋白在水稻细胞原生质体的亚细胞定位是细胞核，加入信号肽的sp-GhJAZ8-GFP融合蛋白的亚细胞定位在细胞间，即GhJAZ8加入分泌肽序列后改变了原始的核定位。GhJAZ8蛋白储存在细胞间，更容易在害虫咬食时被吸收摄取。综上，证明调控植物体内功能基因的元件是分泌型。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 植物诱导分泌型表达盒及其调控元件
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9807
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgtcaa ttgcccgaag gtacagtatt agtttgaatt gggcaacaac aacaaaaacg 60
tgcgttctct aatactcact tctctagaaa acaacaaata tgataacgta acctcctttg 120
cttcttttct tactgatcaa gaccactcgt aactaataaa gatgatagat cttttatata 180
aaaaattgta ttcgtcaatg ctcttttatg aaaacaatag ttcaactacc catacttgca 240
tctattagct atctagtatt ctcatattat tacaaacatt atgcagattg gagataatta 300
ccaacatttc tatataaaca atccgaattt ggtgattata aatacttaat taccattctg 360
gaagtaacaa tataacaggt agtatctatg ttattttggc atgaaaggaa atgatcttaa 420
cttctcaaag tatatttccc acttttctca agaagatcat taataaacta atacctcttc 480
ttggacagac atttttgagt tatcttgttt ttgtttcggt cactagttaa gaaaagagaa 540
gaaaactcaa cataccattt tatcacgtta tagccatgtt cgaattgaaa actaaccacc 600
taaaactaga ggatatgatt tcttatctat tttttggttt cattttaagc aggaccaaaa 660
cctaaatggc cggttcctcc aaaactagtt atattttttt tttgtataat tgcaaattca 720
taaagatgaa aagagctgca ttcttgggta tatacatgtt aacatatctt tctttagata 780
cagtggtcct cctatgcatc acatgcaata tcgggtaagg tcaaaaagat attgaattgt 840
ccacaacaca taagaagtta agatgtcact cgtggacatt aacgtcgtag agtacccata 900
tattcccatg gaaattattg gtattcgtaa ctcttggata tttttaaacg ttgttaatac 960
tttaataaaa tatattatat tgtctaccga atcaaacaca gctgtatcaa caaaaataat 1020
ttgaaacttg tataaataga tgaagtggat atgagaggaa tgtaagcctt atagaagaga 1080
aaaaaaatat gaattttact ggctattctc gatttttaat cgtctttgta gctcttgtag 1140
gtgctcttgt tcttccctcg aaaatgagga ggaactgcaa cctggagctg aggctgctgc 1200
cgagcagcta cccgagcgac agccacgaca tgatggagga gaggatcgag agcccgaaga 1260
cccagcagca gcagctgacc atcttctaca acggcagggt gtgcgtgagc gacgtgaccg 1320
agctgcaggc caaggccatc ctgatgctgg ccaacaggga gagggacgag aggatgaaga 1380
gcccgaccgg ctgggagccg gtgagcccga ccctgaagag ccaggtgaag tgcccgaaca 1440
ccgccctgag catgaagagg agcctgcaga ggttcctgca gaagaggaag accaggatcc 1500
aggccaccag cccgtaccac tacccctacg acgtgcccga ctacgcctga tgatctatgc 1560
attttctttc tcaaaaatgc tttcattaat tttctgtatc tctgtcttct tgataaaatg 1620
aataaaacaa atgctccttt gtctcctata ttaatctcaa acagataaag ctgaaaatcc 1680
caaaaacctc ttagtaattc aaaaaaaaaa aaaatagctg aaaagcaaat ctctatttga 1740
tcaattaatt cgaacgctca atagtatgta agaagtcatt tacacagtac ctcggtaagt 1800
gtttgagggt taaatatttg ttgaattttt aacatcacac taatttagag tataatctaa 1860
attataaggt atttctctct ggttatattt tgttgctgct tggacgattt tgtgaatgat 1920
ggtagaaaaa tataaagatg agaattatca atgttttcga cgggttttcg acggacgtcc 1980
gacgggtttt ggcgacgaat ttccgacgga aattttgaat atttattttt taaaataaaa 2040
aaatgcacgg ctatgtgacc gtgcggcgaa ttgaccgagt agctacttga ccgagtgtat 2100
ttcgttggaa ttccgtcgga aaagtgcaga atattctgat gaatattcta gggatcaaaa 2160
cggatatatt ttggtcggaa atccgtcgaa acatttggtc ggatttaatt tggtcggatt 2220
taatttggtc ggagtttcgt tggaaatgac tgatgaattg tcgatcattt agaattcgtc 2280
agaaaagttc gacgacattt tgacggaaaa catgtcgtca gaaaaccgtc ggaataccat 2340
tacgaaaccg tcgaaaattt tcgaccgttt atttatcgtc gaaaagtctg tcgaaaaggg 2400
ttttgttctc ttgtagtgta ccacaacttg gtttgcaaca ctatatatac tttttgatat 2460
ataaaaattc tattaaacta cttaaatatt tcgtcatgag gttatatgca ttagaaaaaa 2520
atatataaca atattgttgg aagactggac aattatcgtt gaaactatag ctatcaccaa 2580
gatacaactt tttgtggaaa atcttggtgg caattagaaa ctgttcccaa tctcgggcat 2640
gaaaatcgtt attcaaatat ttgtcaacaa ctagtgaata gtgatacagc tatatatgtt 2700
tgctaattta ttgaattatt taatgttacg actttacgta acaattattt aacgtctatt 2760
cttgtgtacc tcacatttct tatcgtcatg tctcatctct tatattattc acagtacacc 2820
catctcttct cgctcactgt ggaacctgtt gtcaattact cgttttgcat tttattggtt 2880
ttcccaatta ctctatcaat tatttatcaa aaaaaaaaaa atgaaacatt tactctatat 2940
attatttccg caaacacaaa ttatactcac atcaacatat tcaatacatt tttctagtaa 3000
tgtagaacaa ctttacagta ttctccaaaa cgaaactcta attcaaaatt tacaagcaga 3060
taagccaaag ataatagaac aacaaaacgc caaattctag ttaagcacac aatctcaacg 3120
tgcactaaaa acgagtggtg taagtgaaaa atatcgtcga ttataaacat tatgggacca 3180
gtagcatttg ttgcaccaat cgaaaacaga caagcacaca tatctcctca tttctcatct 3240
ggcttcttaa tcatttctca taaccccacc tcattataaa taccaccctt tgcgtcacac 3300
atataaacat cacaaactaa acaataaacc ataccataaa aaacatgcct ccacaaaaag 3360
aaaaccatag aacattgaac aaaatgaaga ctaatctttt tctctttctc atcttttcac 3420
ttctcctatc attatcctcg atgaggagga actgcaacct cgagctcagg ctcctcccat 3480
cctcctaccc atccgactcc cacgacatga tggaggagag gatcgagtcc ccaaagaccc 3540
aacaacaaca actcaccatc ttctacaacg gcagggtgtg cgtgtccgac gtgaccgagc 3600
tccaagccaa ggccatcctc atgctcgcca acagggagag ggacgagagg atgaagtccc 3660
caaccggctg ggagccagtg tccccaaccc tcaagtccca agtgaagtgc ccaaacaccg 3720
ccctctccat gaagaggtcc ctccaaaggt tcctccaaaa gaggaagacc aggatccaag 3780
ccacctcccc ataccacgaa cagaaactga tctctgaaga agatctgtga tgagaatcta 3840
tcttcatcgc attgtcccct tgtatacact tcatatctat gtcgtttcgt ttatctttgt 3900
agccgttttg gcaccgctgc ataaataaaa tgtctatcct atcgtaactt aataagtaca 3960
aagacttcgt actaaatgtt gtttttcttt aaaggggtca ttatataagt ggccatgaaa 4020
tgatattcac catgtaaatc taatacaatg aaaagtataa atttgaactg gaaactaact 4080
tagctaaata aatttataaa attaaaaata aaatttaatt gggaaatttg gaataaaaat 4140
atttctataa tttatattat gaaaagtaaa atattaacca tgtcgcaatt tagtaaatcg 4200
aaggttggta tgtgttgtga cacaatctcg taaattaaag gttggtatgt gtcaccattt 4260
tgtgagtcac gtttaattga tggtcaacat tctccggtta acccccataa tgcaaaatct 4320
tattttgggc aaatgagagg gtaaaatagt catttaaaga attccgaccg gagtttctcc 4380
tttgattcct cgcccctata ctacgcgtcg tgtcagactc gtaactccgt ttgactcaat 4440
taccccacat ttttcattcc atcatttcct ttttcattgt tttcattgtt tttggctagt 4500
taacatagcc aaactatgtt cattatgcaa ctcacgaaac ttaatacaaa gatgaatcta 4560
ataactctgg ttaacgaagt atattctccg ttgacaaaaa aaaaaaaaaa cacaaacaga 4620
gaaaagtgaa atctgttgta ttaagaactt tgtagctcct acaagccttt tcatatattg 4680
aaaattcaca tatttagcaa aagaaaaaaa agaaaattga aaaatcattc ccgttttcat 4740
gtactaaaaa gttttaacag taaatatgca tatatttagg aaatgtatag ttgccttgat 4800
aaattggtaa gtttgattta atatgcattt aaatataaaa ctctttttac atatacttaa 4860
tcttcaacta tcattctaaa gtcataccct tttaacactt tatttatcct ctcttttttt 4920
tttttggaca actaacttta ttttatccaa tcagctttta aaatcttata taacatggtt 4980
tggattggac aagctaagta ataatactat aatacgccac gtatatatac gacgtatcct 5040
tcttctcttc acgtataaaa taaaaatagt gtgttattgc cataacatac gtgttttcta 5100
aaatttaaaa gaaagtcatt tatcatgaaa aggtatcata atcagaataa gagtaatcag 5160
tttgaaaact agctagttga ctaaaacaga aagaaaaata tctttacttg aaacatgtgt 5220
tgagaattca cattatataa aaggaaaaaa aataaaacat gacttttgcg tagacaatcc 5280
atagtccaat caacaaaacg tgtggacggc aagggttcct tctagctctc tctatttata 5340
tctctcactc gccgattttt actagtaatt aaccagaacg ttcatctacc aacaaatcct 5400
caactccttc ttcttcacta atagtatacc acaaaacctc aaaattgtaa tttattagat 5460
tatcgtgatg gcaaatatct ccagtattca cattctcttc ctcgtgttca tcacaagcgg 5520
cattgctgtt atgatgagaa gaaactgtaa ccttgagctt agacttcttc catcttctta 5580
tccatctgat tctcatgata tgatggagga gagaattgag tctccaaaga ctcaacaaca 5640
acaacttact attttttata acggaagagt ttgtgtttct gatgttactg agcttcaagc 5700
taaggctatt cttatgcttg ctaacagaga gagagatgag agaatgaagt ctccaactgg 5760
atgggagcca gtttctccaa ctcttaagtc tcaagttaag tgtccaaaca ctgctctttc 5820
tatgaagaga tctcttcaaa gatttcttca aaagagaaag actagaattc aagctacttc 5880
tccatatcat atgagcaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccga tcctggtgga 5940
gctggacggc gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgagc ggcgagggcg agggcgacgc 6000
cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc cggtgccgtg 6060
gccgaccctg gtgaccacct tcagctacgg cgtgcagtgc ttcagcaggt acccggacca 6120
catgaagcag cacgacttct tcaagagcgc catgccggag ggctacgtgc aggagaggac 6180
catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gaccagggcc gaggtgaagt tcgagggcga 6240
caccctggtg aacaggatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 6300
gggccacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtg tacatcatgg ccgacaagca 6360
gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat caggcacaac atcgaggacg gcagcgtgca 6420
gctggccgac cactaccagc agaacacccc gatcggcgac ggcccggtgc tgctgccgga 6480
caaccactac ctgagcaccc agagcgccct gagcaaggac ccgaacgaga agagggacca 6540
catggtgctg ctggagttcg tgaccgccgc cggcatcacc cacggcatgg acgagctgta 6600
caagtgatga ttaagaagga aattatttat aagaagtaaa tgtagaaaac acataaataa 6660
tttcttgtaa accatgatat ataatatata aagataattt tcgtaaagtt atgccaaaat 6720
caaaatgact agaaaggtta atgtaaacta tcttcttcgg tattgaccta agtctagcct 6780
gaaatttgag atggcttctt gggttctgac ctaacttggg tctcaaacta ccttctgatc 6840
acacggataa agtataaacc ttgaaattat aaggtgctat gagaaaaaaa aaatgagaga 6900
tagaagagta cctttattct cctgggaact caaggtagag accctcaatt ggaaaagagt 6960
ctcatgacta aattattccc aaaatgtttt cggtttcagc ttgatgaaga ggaagacgta 7020
attgttgaat ttgcttatcc tttgttgcct ccaaaatgtt ctcgttgtgg taaatggggt 7080
catctagggg atgtgtgcgt gattaaacct cagtctccaa tgaaagaaaa agcaatagta 7140
gtagaggaag gtgagattgt gtctgttgat tctgcaaaca taattcagac tattccagat 7200
actaagactg tcaacaaagt taaagctgta gaagaatata agaattcata gtagttggta 7260
gcacagaaat tcttagagtt gactaaatta tagtataaat agttatccat tagttctcat 7320
agaaacaaga aaacttaaat ttatgtcgtt gcaaaacctt gctttgtttt tgtttagttt 7380
tcttgttaat cgggtgaatt cttgagtcca ttttaatctc catggtctat agaaattcat 7440
gttttctggt catgcaagac gtttaccgat cgccaaacat tttaaaaaat agttgaagaa 7500
aatcaagctt taacctaaaa tcaacataag aactccaaat tttaagcgga agctgctact 7560
accccaccac aacttgattt gcaacacttt gccttaatat atataaattc tttaagctat 7620
tttaaataga tctcacgagg ttgtatgcct tagaaaaaat aattatattg ttggaagaac 7680
gtacaattat cgttgaaact ataattatcg ttgtacagta cacccatctt ttctcgctca 7740
ttgcggaagc tgttgccaat tactcgttta tacacatcac gttttgcatt attgtttttg 7800
tcaactactc tatcaattat ttatcaaaga aataaaaact ttactctata aattatttcc 7860
gcaaactcaa gttatacacg caaacatcat catgtccacg tacatttttc tactaatgtg 7920
gaataataac ttcacagtaa ttgaaaccct gatccaaaat caacaagcac aaaagcgaac 7980
gataataata gaacttaaac aacgacacgc caaattctaa tttagcacag tctcaacgtg 8040
ctctaaaaac gagtggtgta agtgaaaata tctcgttggt tacaagcata atgggaccaa 8100
caagcatttg catcactcga agccatacgt acacttatct ccgcattttc ccatcggtct 8160
tcataagtaa tcatacctaa cccacctcat tatataatac caccctttgt gtcacacaaa 8220
taaacaccat aaactaaaca ataaaccata caaaaaaata tggctaagtt tgcttccatc 8280
atcaccctta tcttcgctgc tcttgttctc tttgctgctt tcgacgcacc ggcaatggtg 8340
gaaatgagaa gaaattgtaa tcttgaactt agacttcttc cttcttctta tccttctgat 8400
tctcatgata tgatggaaga aagaattgaa tctcctaaga ctcaacaaca acaacttact 8460
attttttata atggaagagt ttgtgtttct gatgttactg aacttcaagc taaggctatt 8520
cttatgcttg ctaatagaga aagagatgaa agaatgaagt ctcctactgg atgggaacct 8580
gtttctccta ctcttaagtc tcaagttaag tgtcctaata ctgctctttc tatgaagaga 8640
tctcttcaaa gatttcttca aaagagaaag actagaattc aagctacttc tccttatcat 8700
atggtgagca agggcgagga ggacaacatg gccatcatca aggagttcat gaggttcaag 8760
gtgcacatgg agggcagcgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 8820
aggccgtacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggcgg cccgctgccg 8880
ttcgcctggg acatcctgag cccgcagttc atgtacggca gcaaggccta cgtgaagcac 8940
ccggccgaca tcccggacta cctgaagctg agcttcccgg agggcttcaa gtgggagagg 9000
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggacagcag cctgcaggac 9060
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgagg ggcaccaact tcccgagcga cggcccggtg 9120
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc agcagcgaga ggatgtaccc ggaggacggc 9180
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgcc 9240
gaggtgaaga ccacctacaa ggccaagaag ccggtgcagc tgccgggcgc ctacaacgtg 9300
aacatcaagc tggacatcac cagccacaac gaggactaca ccatcgtgga gcagtacgag 9360
agggccgagg gcaggcacag caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg atgattaagc 9420
atctatcttc atggcattgt ccccttgtat ccatttcata tctatgtcgt ttcgtttatc 9480
tttgtagccg ttttggcacc actgcttaaa taaaatgcca atcctatcat aactcaataa 9540
gtacaacgac ttcgtactaa attttgtttt tcgttaaagg gatcattaat caagtttcca 9600
tgaaatgata tctccatgta aatataacag ttaacacaac actataccaa tctctttaat 9660
catgtataga gtatagacta tcattttcta tgaatatctt ctcaccattt acgttaagct 9720
ggtagtggta taacactcat tcctttacgt tatatgatga aaccaatgtt taaaccgact 9780
aatccttagg attgatatta gttggga 9807
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 2
Met Asn Phe Thr Gly Tyr Ser Arg Phe Leu Ile Val Phe Val Ala Leu
1 5 10 15
Val Gly Ala Leu Val Leu Pro Ser Lys
20 25
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 3
Met Pro Pro Gln Lys Glu Asn His Arg Thr Leu Asn Lys Met Lys Thr
1 5 10 15
Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser Leu Ser Ser
20 25 30
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 4
Met Ala Asn Ile Ser Ser Ile His Ile Leu Phe Leu Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Ile Ala Val Met
20
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 5
Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Thr Leu Ile Phe Ala Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Phe Ala Ala Phe Asp Ala Pro Ala Met Val Glu
20 25
<210> 6
<211> 770
<212> DNA
<213> 花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)
<400> 6
cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggctat 60
tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 120
ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg 180
cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 240
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 300
ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga 360
tacagtctca gaagaccaaa gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa 420
cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga 480
aggtggcacc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc 540
tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 600
cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 660
tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat 720
ttggagagga cacgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa atctatctct 770
<210> 7
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggggattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta 60
ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg 120
tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa 180
ctccaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct 240
gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg 300
caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca 360
atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat 420
cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac 480
gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc 540
gacggcgagg atctcgtcgt gacacatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa 600
aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag 660
gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc 720
ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt 780
cttgacgagt tcttc 795
<210> 8
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgagcgggac tctggggttc ggatcgatcc tctagctaga gtcgatcgac aagctcgagt 60
ttctccataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttcc tatagggttt 120
cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc 180
tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga 240
attaattcgg cgttaattca gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta 300
agcgtcaatt tgtttaca 318
<210> 9
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaataatga ttttattttg actgatagtg acctgttcgt tgcaacaaat tgatgagcaa 60
tgctttttta taatgccaac tttgtacaaa aaagcaggct 100
<210> 10
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acccagcttt cttgtacaaa gttggcatta taaaaaataa ttgctcatca atttgttgca 60
acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa tcattatttg 100
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acccagcttt cttgtacaaa gtggt 25

Claims (10)

1.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子包括4个表达盒，每个所述表达盒分别包括启动子、与所述启动子相连的5’UTR、与所述5’UTR相连的信号肽编码基因、与所述信号肽编码基因相连的功能基因、与所述功能基因相连的3’UTR和与所述3’UTR相连的终止子；
所述启动子、5’UTR、3’UTR和终止子均来源于茉莉酸诱导表达基因；
所述信号肽来源于分泌型蛋白；
每个所述表达盒中的功能基因的核苷酸序列不同，每个所述表达盒中的启动子、5’UTR、3’UTR、信号肽编码基因和终止子的核苷酸序列不同或相同。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述4个表达盒为表达盒A、表达盒B、表达盒C和表达盒D；
所述表达盒A的启动子为p-AtLOX2，所述p-AtLOX2的核苷酸序列是SEQ ID No.1第1-896位；所述表达盒A的5’UTR为AtLOX2-5’UTR，所述AtLOX2-5’UTR的核苷酸序列是SEQ IDNo.1第897-1088位；所述表达盒A的3’UTR为AtLOX2-3’UTR，所述AtLOX2-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第1548-1672位；所述表达盒A的终止子为t-AtLOX2，所述t-AtLOX2的核苷酸序列是SEQ ID No.1第1673-1872位；
所述表达盒B的启动子为p-AtVSP2，所述p-AtVSP2的核苷酸序列是SEQ ID No.1第1873-2964位；所述表达盒B的5’UTR为AtVSP2-5’UTR，所述AtVSP2-5’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第2965-3344位；所述表达盒B的3’UTR为AtVSP2-3’UTR，所述AtVSP2-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第3829-4078位；所述表达盒B的终止子为t-AtVSP2，所述t-AtVSP2的核苷酸序列是SEQ ID No.1第4079-4278位；
所述表达盒C的启动子为p-AtLOX3，所述p-AtLOX3的核苷酸序列是SEQ ID No.1第4279-5278位；所述表达盒C的5’UTR为AtLOX3-5’UTR，所述AtLOX3-5’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第5279-5467位；所述表达盒C的3’UTR为AtLOX3-3’UTR，所述AtLOX3-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第5892-6747位；所述表达盒C的终止子为t-AtLOX3，所述t-AtLOX3的核苷酸序列是SEQ ID No.1第6748-6947位；
所述表达盒D的启动子为p-AtVSP1，所述p-AtVSP1的核苷酸序列是SEQ ID No.1第6948-7947位；所述表达盒D的5’UTR为AtVSP1-5’UTR，所述AtVSP1-5’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第7948-8259位；所述表达盒D的3’UTR为AtVSP1-3’UTR，所述AtVSP1-3’UTR的核苷酸序列是SEQ ID No.1第9409-9607位；所述表达盒D的终止子为t-AtVSP1，所述t-AtVSP1的核苷酸序列是SEQ ID No.1第9608-9807位。
3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特诊在于：所述信号肽选自sp-AtPR1、sp-AtPR3、sp-AtPR5、sp-AtPDF1.2；所述sp-AtPR1的氨基酸序列是SEQ ID No.2，所述sp-AtPR3的氨基酸序列是SEQ ID No.3，所述sp-AtPR5的氨基酸序列是SEQ ID No.4，所述sp-AtPDF1.2的氨基酸序列是SEQ ID No.5。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的DNA分子，其特征在于：所述信号肽编码基因为所述sp-AtPR1的编码基因、所述sp-AtPR3的编码基因、所述sp-AtPR5的编码基因或所述sp-AtPDF1.2的编码基因，所述sp-AtPR1的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第1089-1163位的DNA分子；所述sp-AtPR3的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第3345-3440位的DNA分子；所述sp-AtPR5的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第5468-5533位的DNA分子；所述sp-AtPDF1.2的编码基因是核苷酸序列是SEQ ID No.1第8260-8343位的DNA分子。
5.含有权利要求1-4中任一项所述DNA分子的重组载体。
6.含有权利要求1-4中任一项所述DNA分子或含有权利要求5所述重组载体的重组微生物。
7.含有权利要求1-4中任一项所述DNA分子或含有权利要求5所述重组载体的转基因植物细胞系或/和转基因植物组织或/和转基因植物器官。
8.应用，其特征在于：所述应用为A1)-A3)中任意一项：
A1)权利要求1-4中任一项所述的DNA分子和/或权利要求5所述的重组表达载体和/或权利要求6所述的重组微生物和/或权利要求7所述的转基因植物细胞系或/和转基因植物组织或/和转基因植物器官在植物功能基因的损伤诱导型表达中的应用；
A2)权利要求1-4中任一项所述的DNA分子和/或权利要求5所述的重组表达载体和/或权利要求6所述的重组微生物和/或权利要求7所述的转基因植物细胞系或/和转基因植物组织或/和转基因植物器官在提高植物功能基因表达量中的应用；
A3)权利要求1-4中任一项所述的DNA分子和/或权利要求5所述的重组表达载体和/或权利要求6所述的重组微生物和/或权利要求7所述的转基因植物细胞系或/和转基因植物组织或/和转基因植物器官在植物抗逆性中的应用。
9.提高植物抗逆性的方法，其特征在于：所述方法包括用权利要求1-4中任一项所述的表达盒在受体植物中表达功能基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述功能基因为损伤诱导型基因。
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