CN117256406A - 一种便捷的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种便捷的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法，属于生物技术领域。所述人工制备方法包括将超声处理后的苗木放入培养基质中，将鲜艳乳菇菌剂分层接种在所述苗木根部，对接种后的苗木进行培育，获得所述鲜艳乳菇菌根苗的步骤。本发明使用PBS缓冲液制备鲜艳乳菇菌剂，并将其保存在聚丙烯棕色试剂瓶，使菌剂便于长途运输，并降低污染率，通过优化接种方法和营养液的配方，使菌种能够在基质中快速萌发生长，并增加菌种与苗木根部接触面积。本发明的方法操作便捷，有效提高了菌根苗的合成率和生产效率，对促进鲜艳乳菇菌根的市场化运作和规模化生产具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种便捷的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法。
背景技术
鲜艳乳菇(Lactarius vividus)是一种美味的食用菌，其肉质细嫩，味道鲜美独特，营养丰富且富含高营养价值的矿质元素和氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)，被视为山中珍品，在国内外均受到人们的喜爱。
鲜艳乳菇属于外生菌根真菌，需要与目标树木形成共生体，进而生长发育形成子实体，因此人工培育技术难度大。根据现有研究报道，该菌的人工培育方法通常需要在实验室环境下进行无菌苗的培育和菌剂接种，在此过程中操作步骤复杂，生产成本较高。并且，制备的菌剂往往因杂菌污染率高而不利于保存和运输，只能在实验室现用现配，加剧了操作过程的复杂性和生产的局限性。
因此，亟需提供一种便捷高效的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法，以促进鲜艳乳菇菌根的市场化运作和规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种便捷的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明的方法操作便捷，有效提高了菌根苗的合成率和生产效率，对促进鲜艳乳菇菌根的市场化运作和规模化生产具有重要意义。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种便捷的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法，包括将超声处理后的苗木放入培养基质中；将鲜艳乳菇菌剂分层接种在所述苗木根部，对接种后的苗木进行培育，获得所述鲜艳乳菇菌根苗的步骤。
进一步地，所述鲜艳乳菇菌剂的制备方法包括：将鲜艳乳菇的液体菌种过滤，得到菌丝，将所述菌丝重悬于PBS缓冲液中，避光保存，获得所述鲜艳乳菇菌菌剂。
进一步地，所述超声处理的条件为超声功率120～240w，处理温度15～30℃，处理时间15～30min。
进一步地，所述分层接种具体为在距离所述培养基质底部的1/4处和3/4/处分别接种所述鲜艳乳菇菌菌剂。
进一步地，所述培养基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比3:1:1组成。
进一步地，对接种后的苗木进行培育的过程中，还包括每隔15天向培养基质中添加一次营养液。
进一步地，所述营养液由磷酸二氢钾1～1.5g、氯化钙1～1.5g和超纯水1L配制而成。
进一步地，对接种后的苗木进行培育时，所述培育的温度为15～27℃，湿度为50-70％，培育时间为2～4个月。
进一步地，所述苗木包括半年至一年生的松属苗木。
进一步地，所述松属苗木包括马尾松和华山松。
本发明公开了以下技术效果：
本发明将松属苗木经过超声处理后直接进行接种，优化生产步骤，提高菌根合成率。改变了目前行业内需要在实验室内进行无菌苗培育和接种的复杂步骤，提高了生产效率。
本发明使用PBS缓冲液制备鲜艳乳菇菌菌剂，并将其保存在聚丙烯棕色试剂瓶，使菌剂便于长途运输，且降低运输过程中的菌种污染率，改变了目前行业内需要在实验室条件下进行就地接种而导致的生产局限性。
本发明通过优化接种方法和营养液的配方，使菌种能够在基质中快速萌发生长，并增加菌种与苗木根部接触面积，有效提高菌根合成率。
本发明提供的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法，操作便捷，有效提高了菌根苗的合成率和生产效率，对促进鲜艳乳菇菌根的市场化运作和规模化生产具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为松属苗木根部超声处理图；
图2为菌剂“分层法”接种示意图；
图3为体视显微镜下观察的鲜艳乳菇菌根苗显示图；其中，A为150倍下的观察结果，B为50倍下的观察结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
1.供试菌种和供试苗木
供试菌种：鲜艳乳菇(Lactarius vividus)，采自贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县。
供试苗木：马尾松苗和华山松苗，产自贵州省黔东南苗族侗族自治州。
2.培养基
PDA培养基由马铃薯浸粉5g、葡萄糖20g、琼脂15g和超纯水1L配制而成。
YD液体培养基由酵母浸粉5g、糊精20g、硫酸镁1g、磷酸二氢钾1.5g和超纯水1L配制而成。
PBS缓冲液由磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g和蒸馏水1L配制而成。
营养液由磷酸二氢钾1g、氯化钙1g和超纯水1L配制而成。
3.计算公式
菌根合成率＝(形成菌根的苗木株数/接种苗木总株数)×100％，
菌剂污染率＝(菌剂污染瓶数/菌剂总瓶数)×100％，
菌种萌发率＝(菌种萌发数/菌种活化总数)×100％。
实施例1
(1)菌种的制备：取新鲜、无病虫害侵染的鲜艳乳菇子实体的菌柄与菌盖连接处3mm大小菌肉，置于PDA培养基中，于25℃下组织培养20天。然后取菌落边缘处无污染、长势较好的菌块接种至YD液体培养基中(500mL培养皿中YD液体培养基装液量为300mL，100mLYD液体培养基接种2个菌块)，预先于25℃，避光静置2天，再于25℃、150r/min的条件下，进行摇床培养20天，得到鲜艳乳菇液体菌种。培养基均经过121℃、30min高温灭菌处理。
(2)菌剂的制备：将步骤(1)中获得的鲜艳乳菇液体菌种在无菌环境下使用100目的不锈钢筛网进行过滤，再将过滤得到的菌丝装入含有PBS缓冲液(pH值7.2)的聚丙烯棕色试剂瓶中，获得鲜艳乳菇菌剂，菌剂中菌丝浓度为8mg/mL。其中聚丙烯棕色试剂瓶、不锈钢筛网和PBS缓冲液，预先经过121℃、30min高温灭菌处理。
(3)苗木处理：选用半年生马尾松苗木，苗高20cm，苗木状态健康、无倒伏、无病害，苗木前期未进行过微生物菌剂种衣处理。将苗木根部用清水清洗多次至表面泥沙去除，再将根部放入装有超纯水的超声清洗机中进行超声处理(图1)，超声功率180W，温度20℃，时间20min。
(4)菌根合成：将步骤(3)中处理过的马尾松苗木放入装有培养基质的育苗盆中，育苗盆内径17cm，高度25cm，具有多孔透气功能。培养基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比3:1:1组成。将步骤(2)中制备的鲜艳乳菇菌剂通过“分层法”加入到苗木根部周围的培养基质中，即先在距离育苗盆底部1/4处加一层菌剂，然后覆盖一层培养基质，再在距离育苗盆底部3/4处加一层菌剂(图2)，然后再覆盖一层培养基质，每次添加的菌剂量为10mL。
(5)菌根苗培育：将步骤(4)中接种过的马尾松苗木，放入育苗大棚中培养，室内温度20℃，培养基质湿度60％。在培育过程中，每间隔15天，向培养基质中添加一次营养液。培育3个月，可获得鲜艳乳菇菌根苗(图3)，菌根苗合成率为83％。
实施例2
(1)菌种的制备：取新鲜、无病虫害侵染的鲜艳乳菇子实体的菌柄与菌盖连接处2mm大小菌肉，置于PDA培养基中，于27℃下组织培养15天。然后取菌落边缘处无污染、长势较好的菌块接种至YD液体培养基中(500mL培养皿中YD液体培养基装液量为300mL，100mLYD液体培养基接种4个菌块)，预先于28℃，避光静置2天，再于26℃、170r/min的条件下，进行摇床培养25天，得到鲜艳乳菇液体菌种。培养基均经过121℃、25min高温灭菌处理。
(2)菌剂的制备：将步骤(1)中获得的鲜艳乳菇液体菌种在无菌环境下使用160目的不锈钢筛网进行过滤，再将过滤得到的菌丝装入含有PBS缓冲液(pH值7.3)的聚丙烯棕色试剂瓶中，获得鲜艳乳菇菌剂，菌剂中菌丝浓度为5mg/mL。其中聚丙烯棕色试剂瓶、不锈钢筛网和PBS缓冲液，预先经过121℃、25min高温灭菌处理。
(3)苗木处理：选用半年生华山松苗木，苗高30cm，苗木状态健康、无倒伏、无病害，苗木前期未进行过微生物菌剂种衣处理。将苗木根部用清水清洗多次至表面泥沙去除，再将根部放入装有超纯水的超声清洗机中进行超声处理，超声功率120W，温度30℃，时间30min。
(4)菌根合成：将步骤(3)中处理过的华山松苗木放入装有培养基质的育苗盆中，育苗盆内径15cm，高度28cm，具有多孔透气功能。培养基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比3:1:1组成。将步骤(2)中制备的鲜艳乳菇菌剂通过“分层法”加入到苗木根部周围的培养基质中，即先在距离育苗盆底部1/4处加一层菌剂，然后覆盖一层培养基质，再在距离育苗盆底部3/4处加一层菌剂，然后再覆盖一层培养基质，每次添加的菌剂量为15mL。
(5)菌根苗培育：将步骤(4)中接种过的马尾松苗木，放入育苗大棚中培养，室内温度23℃，培养基质湿度50％。在培育过程中，每间隔15天，向培养基质中添加一次营养液。培育2个月，可获得鲜艳乳菇菌根苗，菌根苗合成率为81％。
实施例3
(1)菌种的制备：取新鲜、无病虫害侵染的鲜艳乳菇子实体的菌柄与菌盖连接处4mm大小菌肉，置于PDA培养基中，于28℃下组织培养25天。然后取菌落边缘处无污染、长势较好的菌块接种至YD液体培养基中(500mL培养皿中YD液体培养基装液量为200mL，100mLYD液体培养基接种3个菌块)，预先于26℃，避光静置3天，再于28℃、160r/min的条件下，进行摇床培养15天，得到鲜艳乳菇液体菌种。培养基均经过121℃、20min高温灭菌处理。
(2)菌剂的制备：将步骤(1)中获得的鲜艳乳菇液体菌种在无菌环境下使用130目的不锈钢筛网进行过滤，再将过滤得到的菌丝装入含有PBS缓冲液(pH值7.4)的聚丙烯棕色试剂瓶中，获得鲜艳乳菇菌剂，菌剂中菌丝浓度为10mg/mL。其中聚丙烯棕色试剂瓶、不锈钢筛网和PBS缓冲液，预先经过121℃、20min高温灭菌处理。
(3)苗木处理：选用一年生马尾松苗木，苗高10cm，苗木状态健康、无倒伏、无病害，苗木前期未进行过微生物菌剂种衣处理。将苗木根部用清水清洗多次至表面泥沙去除，再将根部放入装有超纯水的超声清洗机中进行超声处理，超声功率240W，温度15℃，时间15min。
(4)菌根合成：将步骤(3)中处理过的马尾松苗木放入装有培养基质的育苗盆中，育苗盆内径20cm，高度18cm，具有多孔透气功能。培养基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比3:1:1组成。将步骤(2)中制备的鲜艳乳菇菌剂通过“分层法”加入到苗木根部周围的培养基质中，即先在距离育苗盆底部1/4处加一层菌剂，然后覆盖一层培养基质，再在距离育苗盆底部3/4处加一层菌剂，然后再覆盖一层培养基质，每次添加的菌剂量为20mL。
(5)菌根苗培育：将步骤(4)中接种过的马尾松苗木，放入育苗大棚中培养，室内温度27℃，培养基质湿度70％。在培育过程中，每间隔15天，向培养基质中添加一次营养液。培育4个月，可获得鲜艳乳菇菌根苗，菌根苗合成率为82％。
试验例1
按照实验例1中的具体步骤进行鲜艳乳菇菌根苗制备，其中设置苗木根部不同超声处理(超声功率、超声温度、超声时间)及空白对照(即不做超声处理)，试验结果如表1-3所示。
表1不同超声功率对鲜艳乳菇菌根合成率的影响
表2不同超声时间对鲜艳乳菇菌根合成率的影响
表3不同超声温度对鲜艳乳菇菌根合成率的影响
由表1-3可知，超声处理可以提高鲜艳乳菇菌根合成率。其中超声功率分别为120w、180w、240w时菌根合成率较高，而较低和较高超声功率时菌根合成率低。超声时间分别为15min、20min、25min和30min时菌根合成率较高，低于15min和超过30min则降低菌根合成率。超声温度分别为15℃、20℃、25℃和30℃时菌根合成率较高，低于15℃和高于30℃时菌根合成受抑制。其原因可能是因为低频超声和短时间超声处理对苗木根部影响较小，而高频超声和长时间超声处理对苗木根部细胞破坏程度较强，造成损伤，影响菌根合成。用较高温度处理则苗木根部移栽后易腐烂，也不利于菌根合成。故采取适宜的超声功率、超声时间和超声温度处理，才能够促进菌根合成和苗木健康生长。
试验例2
按照实验例1中的具体步骤进行鲜艳乳菇菌根苗制备，其中设置菌剂的不同制备方法：采用不同溶液保存(PBS缓冲液、YD液体培养基)及不同类型瓶装(A:聚丙烯棕色试剂瓶；B:聚丙烯透明试剂瓶；C:玻璃三角瓶)。并进行15天的常温静置观测，试验结果如表4所示。
表4不同鲜艳乳菇菌剂制备方法对菌剂污染率和菌种萌发率的影响
由表4可知，采用PBS缓冲液进行菌种保存和运输，能够显著降低菌剂污染率，且不影响菌种萌发。而采用聚丙烯棕色试剂瓶进行装液，能够减少菌种光老化，提高菌种萌发率，减少运输成本。故采用装有PBS缓冲液的聚丙烯棕色试剂瓶作为菌剂保存和运输方法，具有高效、便捷、低污染的作用。
试验例3
按照实验例1中的具体步骤进行鲜艳乳菇菌根苗制备，其中设置不同接种方法处理，试验结果如表5-6所示。
表5不同接种方法对鲜艳乳菇菌根合成率的影响
表6添加营养液对鲜艳乳菇菌根合成率的影响
由表5-6可知，“分层接种”法相较于单层接种能够有效提高鲜艳乳菇菌根合成率。添加含有磷酸二氢钾(1-1.5g/L)和氯化钙(1-1.5g/L)的营养液，能够显著促进菌根形成。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种便捷的鲜艳乳菇菌根苗的人工制备方法，其特征在于，包括将超声处理后的苗木放入培养基质中；将鲜艳乳菇菌剂分层接种在所述苗木根部，对接种后的苗木进行培育，获得所述鲜艳乳菇菌根苗的步骤。
2.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，所述鲜艳乳菇菌剂的制备方法包括：将鲜艳乳菇的液体菌种过滤，得到菌丝，将所述菌丝重悬于PBS缓冲液中，避光保存，获得所述鲜艳乳菇菌剂。
3.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，所述超声处理的条件为超声功率120～240w，处理温度15～30℃，处理时间15～30min。
4.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，所述分层接种具体为在距离所述培养基质底部的1/4处和3/4/处分别接种所述鲜艳乳菇菌菌剂。
5.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，所述培养基质由泥炭土、珍珠岩和蛭石按体积比3:1:1组成。
6.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，对接种后的苗木进行培育的过程中，还包括每隔15天向培养基质中添加一次营养液。
7.根据权利要求6所述的人工制备方法，其特征在于，所述营养液由磷酸二氢钾1～1.5g、氯化钙1～1.5g和超纯水1L配制而成。
8.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，对接种后的苗木进行培育时，所述培育的温度为15～27℃，湿度为50-70％，培育时间为2～4个月。
9.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，所述苗木包括半年至一年生的松属苗木。
10.根据权利要求1所述的人工制备方法，其特征在于，所述松属苗木包括马尾松和华山松。
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