CN107779480B - 他喷他多手性中间体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及他喷他多手性中间体(S)‑4‑(3‑甲氧基苯基)‑3‑甲基‑4羰基丁酸的制备方法，包括下述步骤：(1)以混旋4‑(3‑甲氧基苯基)‑3‑甲基‑4‑羰基丁酸为底物，在酮基还原酶作用下，添加葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶，反应得到4‑羟基‑4‑(3‑甲氧基苯基)‑3‑甲基丁酸；(2)加入碱性高锰酸钾，反应得到(S)‑4‑(3‑甲氧基苯基)‑3‑甲基‑4‑羰基丁酸。本发明采用了生物催化法，具有反应条件温和，安全无公害，成本低、产物立体选择性高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，主要涉及药物制备领域，具体涉及他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的制备方法。
背景技术
他喷他多(Tapentadol)是由美国强生制药(Johnson&Johnson.)和德国Gruenenthal GmbH公司联合研制的新型口服止痛药，其速释片剂于2008年11月经美国FDA批准上市(商品名：NUCNTA)，用于缓解中度及重度急性疼痛。其缓释片剂于2012年8月经美国FDA批准上市(商品名：NUCYNTA ER)，用于治疗成人糖尿病周围神经病变(DPN)引起的相关的神经性疼痛。他喷他多属阿片类药物，该制剂耐冲击挤压，可防止(作为毒品)滥用。他喷他多是一种新型双重作用方式的中枢性镇痛药，他喷他多通过两种互补的作用机制实现更加强效的镇痛效用，它既是阿片受体激动药，又是去甲肾上腺素重吸收抑制药，对急性、炎性和慢性神经病理性疼痛的多种动物模型有镇痛作用，其效能介于吗啡和曲马多之间，但他喷他多比其它阿片类镇痛药如吗啡、曲马多等，更不易产生镇痛耐受性和依赖性,，不良反应(如恶心、呕吐等)较轻，副作用小。因此，该药具有广阔的市场前景。目前他喷他多药物的合成工艺路线存在许多可改进的地方。由于他喷他多药物含有2个手性碳原子，因此其合成采用传统化学方法很难完成。
专利CN102936205A提供了一种他喷他多的化学合成方法，以1-二甲氨基-2-甲基-3-戊酮为起始原料，经过还原和卤代反应后，得到3-溴-N，N-2-三甲基戊-1-胺，然后在过渡金属的催化下，与金属试剂发生偶联反应，得到3-(3-甲氧基苯基)-N，N-2-三甲基戊-1-胺，然后经过去甲基化和拆分，得到他喷他多。此方法合成路线长，废弃物多，很难实现规模化生产。
专利CN104803861A提供了通过手性化学催化合成他喷他多的方法。该发明通过反应直接得到所要的手性异构体，避免了因手性拆分而产生的大量废弃物和环保问题，整个路线短，原料利用率较，但由于使用重金属络合物为手性催化剂，价格昂贵，合成成本偏高，限制了其工业化应用。
专利CN103787898A提供了一种以间位取代肉桂酸为起始原料利用手性辅基(手性伪麻黄素)一锅法形成两个手性中心的合成他喷他多的方法。但其路线由于使用的是手性辅基，在催化反应中立体选择性还不够高，同时存在手性辅基回收再利用问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是：现有合成他喷他多的方法都是化学催化或手性辅基合成法，污染严重，反应条件苛刻，产物立体选择性差。目前还没有利用酶法来实现他喷他多关键手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的方法。
本发明的目的是：用反应条件温和、安全环保、立体选择性高的生物催化法替代原有的反应条件苛刻、污染严重、立体选择性低的化学合成。
为解决上述技术问题，本发明选择采用酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶生物催化合成他喷他多关键手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸，具有操作简单、反应条件温和、立体选择性高和绿色环保等优势，本技术涉及生物催化和绿色化学范畴，属于生物化工技术领域。本发明采用了生物催化法，反应条件温和，安全无公害，立体选择性强，转化率90％，产物ee值98％以上。
具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：
一种他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)以混旋4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸为底物，在酮基还原酶作用下，添加葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶，反应得到4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸；
(2)加入碱性高锰酸钾，反应得到(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸。
优选的，上述制备方法中，所述葡萄糖脱氢酶选自以下多肽或蛋白质中的一种：
(a)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
优选的，上述制备方法中，所述葡萄糖脱氢酶由菌株生产得到，所述生产葡萄糖脱氢酶的菌株为大肠杆菌Escherichia coli.A149-170，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016102。
优选的，上述葡萄糖脱氢酶的(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有葡萄糖脱氢酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第149位为亮氨酸，第170位为赖氨酸。
优选的，上述葡萄糖脱氢酶的菌株发酵时添加外援诱导剂阿拉伯糖。
优选的，所述制备方法中，所述酮基还原酶选自以下多肽或蛋白质中的一种：
(a)SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的多肽或蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质。
优选的，上述制备方法中，在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有酮基还原酶活性的由(a)衍生的多肽或蛋白质的第102位为丝氨酸，第133位为异亮氨酸。
优选的，上述制备方法中，所述酮基还原酶由菌株制备得到，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli.B102-133，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016101。
优选的，上述制备方法中，第(1)步中所述反应过程中，还需添加缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH值为6.5-7.5。
优选的，上述制备方法中，所述葡萄糖的添加质量为底物的1-2.5倍。
优选的，上述制备方法中，所述葡萄糖脱氢酶的添加质量为底物的0.5-1.5倍。
优选的，上述制备方法中，所述酮基还原酶的添加质量为底物的0.6-1倍。
优选的，上述制备方法中，所述辅酶的添加量占底物的10wt％-15wt％，所述辅酶选自辅酶I(NAD+)和辅酶II(NADP+)中的一种或两种。
优选的，上述制备方法中，步骤(1)中所述反应的温度为25-35℃。
优选的，上述制备方法中，步骤(2)中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
优选的，上述制备方法中，步骤(2)中所述碱性高锰酸钾的pH值为9-11。
优选的，上述制备方法中，所述步骤(2)之前还包括灭酶的过程。
本发明还提供(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸，由上述制备方法制备得到。
本发明还提供他喷他多，由上述(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸制备得到。
其中，本发明中各术语的含义如下：
(1)酮基还原酶：酮基还原酶是指能催化还原酮基(-CO-)化合物的一类酶，该酶催化酮类化合物的还原需要辅因子NADPH或NADH向羰基转移氢。
(2)葡萄糖脱氢酶：葡萄糖脱氢酶是能够特异性的催化葡萄糖分子生成葡萄糖酸，并向辅酶II(即NADP+)或辅酶I(即NAD+)提供还原氢，形成辅因子NADPH或NADH的一类酶。
(3)手性催化：是一种利用化学催化剂或生物催化实现从非手性到手性转化的方法，包括生物催化和手性化学催化，具有效率高、选择性好的特点。
(4)他喷他多：一种对急、慢性疼痛有光谱功效，产生高镇痛效能的镇痛药。该药物对镇痛效应不易产生耐受和躯体依赖，比吗啡或羟考酮更能改善治疗窗和减少副作用，合成路线如下：
(5)(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸：他喷他多合成中的关键手性中间体，结构式如下：
(6)生物催化：生物催化是指利用酶或者生物有机体(全细胞、细胞器或组织等)作为催化剂进行化学转化的过程，生物催化具有反应条件温和、底物转化率高、立体选择性强等多种优点。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供了生物催化合成他喷他多关键手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的思路和方法，相对与目前技术来说，具有操作简单、转化率和立体选择性高等明显的优势。(2)本发明首次提供了用生物酶作催化剂来合成(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的方法，属于绿色合成范畴，而目前的化学合成法，采用贵金属催化剂或手性辅基、进行反复的分子内基团的保护和去保护，操作步骤繁琐、反应条件苛刻、环境污染严重、成本高、不安全、产物立体选择性差。所以本发明相对于目前的技术具有反应条件温和、安全环保、成本低、产物立体选择性高等优点。
保藏信息
本发明所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli.B102-133，保藏编号为CCTCCM2016101，于2016年3月10号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码：430072；电话：(027)-68752319。
本发明所述生产葡萄糖脱氢酶的菌株为大肠杆菌Escherichia coli.A149-170，保藏编号为CCTCC NO:M2016102，保藏日期为2016年3月10日，保藏中心为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072，电话：(027)-68752319。
具体实施方式
鉴于目前他喷他多的制备方法成本偏高，工艺复杂，废弃物多，易造成二次污染等问题，本发明提供一种利用酮基还原酶和葡萄糖脱氢酶偶联催化合成他喷他多关键手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的方法。
一种优选的实施方式中，本发明所述他喷他多中间体的制备方法如下所述：
本发明的技术路线如下：
本发明的第一步是在pH为6.5-7.5的缓冲液中，控制温度在25-35℃，以混旋4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸(物质的量R:S＝1:1，ee值为50％)为底物，在酮基还原酶作用下，添加葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶，搅拌反应5-12小时，得4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸。后者在碱性高锰酸钾的作用下，生成(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸，转化率90％，ee值98％以上。
其中，本发明所述葡萄糖脱氢酶菌株通过将目的基因片段同载体连接，得到重组载体，然后转化到大肠杆菌中，得到生产葡萄糖脱氢酶的菌株。
其中，本发明筛选出的目的基因序列为SEQ ID NO.1所示：
其中，SEQ ID NO.1基因对应的编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示：
其中，本发明所述酮基还原酶通过将目的基因片段同载体连接，得到重组载体，然后转化到大肠杆菌中，得到生产酮基还原酶的菌株。
其中，本发明筛选出的目的基因序列为SEQ ID NO.10所示：
其中，SEQ ID NO.10基因对应的编码氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示：
下面通过具体实施例来进一步说明本发明所述他喷他多手性中间体的制备方法。其中，实施例中所用各试剂和设备的信息如下：
葡萄糖，厂家：西王集团；为无水型；
辅酶NADP+，厂家：邦泰生物，为氧化型；
4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸，厂家：能特科技。
PCR扩增仪：厂家：Bio-rad，型号：T100。
蛋白电泳仪器：厂家：Bio-rad，型号：Mini-protean tetra。
实施例一 葡萄糖脱氢酶的制备
一种构建本发明突变体基因的路线，如下所示：
(1)突变体基因的筛选
利用关键字“glucose dehydrogenase”在NCBI上进行搜索，比对分析后，选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.AG1839)中的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因序列作为研究模板，其中Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.AG1839的葡萄糖脱氢酶的序列为SEQ ID NO.3，
其中，SEQ ID NO.3序列如下：
利用SEQ ID NO.3序列转换的氨基酸序列在NCBI蛋白质数据库(PDB)中搜索同源性高的蛋白质结构序列，与已知原始序列(SEQ ID NO.3)经CLUSTALW比对，将GlcDH已知序列在NCBI中BLAST后，同时通过分析蛋白质功能区域中的氢键、辅酶与葡萄糖氢酶的结合位点、亚基相互作用，选取三个氨基酸突变点，分别为V149L(gtg-cta)、R170K(cga-aag)和L252V(cta-gta)。即将149位氨基酸由缬氨酸(Val)替换为亮氨酸(Leu)，将170位氨基酸由精氨酸(Arg)替换为赖氨酸(Lys)，将252位氨基酸由亮氨酸(Leu)替换为缬氨酸(Val)。
(2)突变体的设计与构建：
对149、170和252位点的氨基酸进行7种组合方式的突变，分别为3个单突变；149-170、170-252、149-252两两组合的3个双突变和1个149-170-252结合的三突变，通过定点突变的方法，获得7种突变体目的片段。
其中，通过定点突变试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，直接通过引物设计以及PCR的方法获得突变片段。
其中定点突变时所用到的引物序列如表1所示，按照突变位点，先进行单个位点的突变，然后再进行另一位点的突变(得到双突变突变)，然后再进行第三个位点的突变(得到三位点突变)。
表1引物序列
| 序列编号 | ||
| SEQIDNO.4 | A149-P1 | GTGTGCACGAACTAATTCCTTGGCCGTTA |
| SEQIDNO.5 | A149-P2 | CCAAGGAATTAGTTCGTGCACACTGGACAT |
| SEQIDNO.6 | A170-P1 | GCTGATGACAAAGACATTAGCGTTGGAA |
| SEQIDNO.7 | A170-P2 | CGCTAATGTCTTTGTCATCAGCTTTATCC |
| SEQIDNO.8 | A252-P1 | GGTATGACAGTATATCCTTCATTCCAGG |
| SEQIDNO.9 | A252-P2 | GAAGGATATACTGTCATACCGCCGTC |
反应体系：
PCR反应条件如下：
1)94℃，5min；
2)94℃，30sec；
3)60℃，30sec；
4)72℃，8min；
5)2)-4)循环30次
6)72℃，10min。
Taq酶，pfu酶，北京全式金生物技术有限公司
(3)工程菌的构建与筛选
第一步：分别将突变体的目的片段(即149突变片段，170突变片段，252突变片段，149-170突变片段，170-252突变片段，149-252突变片段，149-170-252突变片段)与质粒pBAD大片段混匀后，进行连接。
第二步：连接产物转化大肠杆菌
取10μL连接反应物加入到100μL感受态细菌(MC1061)中，在EP管中轻轻混匀，冰浴30min后，42℃下热击90s，取出后快速冰浴2min，使细菌冷却。加入lmL不含抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡1h。取100μL均匀涂布于含AMP(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。经电泳检测连接成功。
第三步：葡萄糖脱氢酶的摇瓶发酵及优势菌株筛选
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成20小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含10mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为菌体：缓冲液＝1：10(m:v)的浓度超声破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得葡萄糖脱氢酶粗酶液。粗酶液经絮凝后得到葡萄糖脱氢酶酶液。通过比较酶活大小和发酵稳定性，筛选出突变体A149-170具有最高酶活。
表2不同突变片段的发酵酶活
从表2可以看出，采用原始基因即未突变的片段合成的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活为550u/ml，而采用定点突变后的A149片段，A170片段，A149-170片段，A170-252片段，A149-170-252片段合成的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活均有不同程度的提高，尤其是A149片段，更重要的是A149-170片段，发酵后的酶活提高了3倍，为2500U/ml。从以上结果不难看出，采用本实施例的方法构建的特异位点的突变片段，特定位点氨基酸的突变对发酵酶活带来了巨大的改变，显著提高了发酵酶活。
其中，酶活的测定方法如下：
A.1酶活定义
在反应温度为30℃，pH值为7.0的条件下，每分钟催化还原1mmolNAD+所需的酶量，定义为一个单位(U)。
A.2原理
经磷酸戊糖途径，葡萄糖脱氢酶特异性的氧化分解葡萄糖分子生成葡萄糖酸，同时伴随氢负离子的产生。电子受体NAD+迅速与氢负离子结合，生成还原型辅酶NADH，后者在λ＝340nm处有特征吸收。通过紫外-可见分观光度法，以时间为横坐标，OD340值为纵坐标，作线性回归曲线，求得曲线斜率。将曲线斜率代入下面的计算公式，测得葡萄糖脱氢酶的酶活大小。
A.3溶液的配置
A.3.1葡萄糖水溶液的制备：称取9.9g葡萄糖溶于50mL纯净水中得1M葡萄糖水溶液。
A.3.2磷酸钠缓冲液的制备：称取3.12g磷酸二氢钠溶于100mL纯净水中得磷酸二氢钠溶液，称取7.17g磷酸氢二钠溶于100mL纯净水中得磷酸氢二钠溶液。量取39mL磷酸二氢钠溶液和61mL磷酸二氢钠溶液混匀，加水稀释至200mL得100mmol的磷酸钠缓冲液。
A.3.3NAD+水溶液的制备：称取6.64mgNAD+溶液1mL水溶液中得0.01mol/L的NAD+水溶液。
A.3.4酶液的制备：量取一定量的酶液(按4.1方法融化，并搅拌均匀)于25mL容量瓶中，用纯净水定溶至刻度，得稀释X倍的稀释酶液。
A.4实验操作
A.4.1向4mL体系石英比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液，2mL磷酸缓冲液，100uL葡萄糖脱氢酶液，300uL水作空白对照组。
A.4.2向4mL体系石英比色皿中加入400uL葡萄糖水溶液，2mL磷酸缓冲液，100uL葡萄糖脱氢酶液，300uLNAD+水溶液作实验组。340nm波长处测OD值，每2s记一次读数，记录2min。
A.4.3平行测定三次，以时间为横坐标，OD340值为纵坐标作线性回归曲线，求得曲线斜率k1、k2、k3。
A.5酶活计算
酶活计算公式：E(U/mL)＝[ΔA/min]*[1/S]*[1/d]*[Vt/Vs]*X
ΔA/min：每分钟吸光度的变化值(曲线斜率)，ΔA/min＝(k1+k2+k3)/3
S：摩尔消光系数，S＝1
d：比色皿光径，d＝1
Vt：反应液总体积，Vt＝2.8mL
Vs：酶液体积，Vs＝0.1mL
X：酶液稀释倍数，X倍
A.6检测要求
A.6.1调节稀释倍数，吸光度值必须控制在0.2-1.2之间，且读数必须从0.200-0.220开始。
A.6.2测量完毕后，每隔30s取一个读数，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，作线性回归曲线，根据相关系数验证曲线的相关性，要求r≥0.999。
A.6.3检测同一个样品，对照组只须配一次，检测不同样品时，对照组要求重新配制。
A.6.4每次量取酶液之前，务必先将酶液融化，混合均匀后再取样，取样务必准确。
A.6.5氧化型辅酶NAD+要求现配现用，其他溶液配制后放置时间不超过1个月。
A.7结果的允许误差
平行试验相对误差为±5％。每个样品检测三次，检测结果记为En(n＝1,2,3)，其算数平均值记为
则需满足要求式(Ⅰ)：
实施例二 酮基还原酶的制备
(1)突变体基因的筛选
将解脂假丝酵、葡萄牙假丝酵母和木兰假丝酵母等三种不同来源野生菌的酮基还原酶的4H8N、3WG6、K氨基酸序列进行比对，进行同源性比较分析，通过对蛋白质功能区域中的氢键、辅酶与酮基还原酶的结合位点、亚基相互作用的分析，确定以木兰假丝酵母的酮基还原酶K序列SEQ ID NO.12为模板。
其中，SEQ ID NO.12的序列如下：
以酮基还原酶K序列SEQ ID NO.12为基础，通过计算机辅助的半理性设计，选定了三个氨基酸突变位点，分别为E102S(gag-tcc)、L133I(tta-atc)和E172D(gaa-gat)，即将第102位的谷氨酸(Glu)替换为丝氨酸(Ser)，将第133位的亮氨酸(Leu)替换为异亮氨酸(Ile)，将第172位谷氨酸(Glu)替换为天冬氨酸(Asp)。
(2)突变体的设计与构建
对102、133和172位点的氨基酸进行7种组合方式的突变，分别为3个单突变102、133、172；两两组合102-133、133-172、172-102的3个双突变和1个三组合的102-133-172结合的三突变，通过定点突变方法，获得7种突变体目的片段。
其中，可以通过定点突变试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，直接通过引物设计以及PCR的方法获得突变片段。
其中，定点突变时所用到的引物序列如表3所示，按照突变位点，先进行单个位点的突变，然后再进行另一位点的突变(得到双突变突变)，然后再进行第三个位点的突变(得到三位点突变)。
表3引物序列
| 序列编号 | 引物序列 | |
| SEQIDNO.13 | B102-P1 | CCCAGCGTCCGGACTAGATTTAG |
| SEQIDNO.14 | B102-P2 | CTAGTCCGGACGCTGGGGAATC |
| SEQIDNO.15 | B133-P1 | CAACGGGATCAGTTTGGAGGAA |
| SEQIDNO.16 | B133-P2 | CAAACTGATCCCGTTGGCCTC |
| SEQIDNO.17 | B172-P1 | TGCGGATGTCAAGCCCCAA |
| SEQIDNO.18 | B172-P2 | CTTGACATCCGCAACTTTCAGAA |
PCR反应体系：
Taq酶，pfu酶，北京全式金生物技术有限公司
PCR反应条件如下：
1)94℃，5min；
2)94℃，30sec；
3)63℃，30sec；
4)72℃，8min；
5)条件2)-4)循环30次；
6)72℃，10min。
(3)工程菌的构建与筛选
第一步：将突变体的目的片段(102突变片段，133突变片段，172突变片段，102-133突变片段，133-172突变片段，102-172突变片段，102-133-172突变片段)与质粒pBAD大片段混匀后，进行连接。
连接体系：混匀后16℃连接过夜，反应体系见表4。
表4pBAD和目的基因连接体系
第二步连接产物转化大肠杆菌
取10μL连接反应物加入到100μL感受态细菌中，在EP管中轻轻混匀，冰浴30min后，42℃下热击90s，取出后快速冰浴2min，使细菌冷却。加入lmL 不含抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡1h。取100μL均匀涂布于含AMP(100μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，经电泳检测连接成功。
第三步酮基还原酶的摇瓶发酵及优势菌株筛选
从斜面培养基上接种重组大肠杆菌到30mL含30uL氨苄青霉素的液体LB培养基中，然后在30℃、240rpm条件下，完成18-20小时的一级培养过程。接下来，将一级培养种子接种到1L含10mL阿拉伯糖诱导剂的液体LB培养基中，在相同温度和转动频率下培养24小时，完成二级培养过程。将培养液于4000rpm离心12分钟后，收集菌体，并称量菌体湿重，然后按质量体积比为菌体：缓冲液＝1：10(m：v)的浓度超声破碎。破碎完全后，离心收集液体，即得酮基还原酶粗酶液，经絮凝得酮基还原酶酶液。测定酶活大小，筛选出突变体B102-133具有最高发酵酶活。
表5不同突变体的发酵酶活
| 菌株 | 发酵酶活(U/mL) |
| 原始基因 | 30 |
| B102突变片段 | 40 |
| B133突变片段 | 30 |
| B172突变片段 | 15 |
| B102-133突变片段 | 120 |
| B102-172突变片段 | 50 |
| B133-172突变片段 | 25 |
| B102-133-172突变片段 | 35 |
从表5可以看出，采用原始基因即未突变的片段构建的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活为30U/mL，而采用定点突变后的B102片段、B102-133片段、B102-172片段和B102-133-172片段构建的重组质粒转化到大肠杆菌之后，发酵酶活均有不同程度的提高，尤其是B102-133片段，发酵酶活提高到未突变体的4倍，为120U/mL。从以上结果不难看出，采用本实施例方法构建的特异性位点突变体，构建重组质粒后，对发酵酶活带来巨大变化，显著提高了发酵酶活。
其中，酶活的测定方法如下：
A.1酶活定义
在反应温度为30℃，pH为7.0的条件下，每5分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量，定义为一个单位(U)。
A.2原理：
葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化型辅酶NADP+通过磷酸戊糖途径产生还原型辅酶NADPH，后者与他汀类酮基还原酶共同作用于底物4-氯乙酰乙酸乙酯，生成4-氯-3-羟基丁酸乙酯。还原型辅酶NADPH与他汀类酮基还原酶协同作用后，被氧化为氧化型辅酶NADP+，并再次通过磷酸戊糖途径生成NADPH，形成辅因子再生循环。整个反应过程中，辅酶NADPH与他汀类酮基还原酶作用的反应速度最慢，可以作为衡量他汀类酮基还原酶酶活的标准。最后，通过单位时间内底物4-氯乙酰乙酸乙酯转化为产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的物质的量计算他汀类酮基还原酶酶活大小。
A.3溶液的配制
A3.1磷酸钠缓冲液：称取3.12g二水磷酸二氢钠溶于100mL纯净水中得磷酸二氢钠溶液，称取7.17g十二水磷酸氢二钠溶于100mL纯净水中得磷酸氢二钠溶液。量取39mL磷酸二氢钠溶液和61mL磷酸二氢钠溶液混匀，得200mmol磷酸盐缓冲溶液，溶液pH为7.0。
A3.2辅酶NADP+溶液：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotidephosphate)缩写NADP，取0.6mgNADP+固体粉末于1mL蒸馏水中，充分溶解，得0.6mg/mL辅酶NADP+溶液。
A3.3葡萄糖脱氢酶：安琪GS2500型葡萄糖脱氢酶，按照葡萄糖脱氢酶酶活力检测方法检测酶活E(单位U/mL)，酮基还原酶酶活检测过程该酶添加量为3000U。
A3.44-氯乙酰乙酸乙酯：分子式C6H9ClO3，分子量164.59，CAS号：638-07-3，含量≥97％。
A3.54-氯-3-羟基丁酸乙酯：分子式C6H11ClO3，分子量166.7，CAS号：86728-85-0，含量≥95％。
A4实验操作：
准确称取0.5g 4-氯乙酰乙酸乙酯和1.0g葡萄糖固体于150mL磷酸钠缓冲液(200mmol，pH＝7.0)中，30℃搅拌10min。然后向反应体系中加入3000U葡萄糖脱氢酶和1mL辅酶NADP+(0.6mg/mL)，搅拌5min。然后向反应体系加入1mL酮基还原酶，磁力搅拌60min后终止反应。迅速量取2mL反应液于4mL离心管中，加入2mL乙酸乙酯，上下震摇使两者混合均匀，然后在4500r/min条件离心3min，取有机层待检。
A5气相检测：
A5.1气相检测条件：色谱柱型号为HP-5；进样量为2uL；进样器温度为270℃；柱箱温度：程序升温100℃保持3min，然后10℃/min升温至220℃；FID检测器温度为270℃；氢气压力为0.1MPa(30ml/min)；空气压力为0.1MPa(300ml/min)；分流比为1:100；载气压力为0.04MPa；斜率为100uv/min；最小峰宽为1sec；最小面积为10uv*s；最小峰高为10uv。
A5.2标样检测：准确称取0.01g4-氯乙酰乙酸乙酯，加入1ml乙酸乙酯充分溶解，然后按照上述气相检测检测条件检测，获得底物标样4-氯乙酰乙酸乙酯气相色谱图。采用相同的方法获取产物标样4-氯-3-羟基丁酸乙酯的气相色谱图。
A5.3样品检测：取上述A4实验操作获得的有机层液，按照气相色谱检测条件检测，获得样品气相色谱图。
参照标样4-氯乙酰乙酸乙酯和4-氯-3-羟基丁酸乙酯的出峰特征，分析检测样品气相色谱图谱中底物4-乙酰乙酸乙酯和产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的峰面积(或峰面积百分比)，酶活计算时备用。
A6酶活计算：
酶活力E(U/mL)＝(0.5×106/164.59)×转化率/(60/5)
其中，转化率＝产物的峰面积/(底物峰面积+产物峰面积)×100％；
0.5×106表示底物4-氯乙酰乙酸乙酯的质量(ug)；
164.59为底物4-氯乙酰乙酸乙酯的相对分子质量(g/mol)；
60为反应时间(min)；
5为酶活定义中的单位时间(min)。
A7酶活检测要求：
氧化型辅酶NADP+要求现配现用，其他溶液配制放置时间不超过1个月。
转化率必须控制在20-40％的线性范围，超出线性范围需要将酶液用纯净水稀释后重新检测，酶活计算时乘以稀释倍数。
A.8结果的允许误差
平行试验相对误差为±5％。每个样品检测三次，检测结果记为En(n＝1,2,3)，其算数平均值记为
满足下述要求：
实施例三 他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的制备
向3L三颈瓶中加入1L磷酸盐缓冲液(组分：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水，100mmol，pH＝7.0)调节反应体系的pH为7.0，加入0.2kg葡萄糖固体、0.1kg实施例一所得突变体A149-170所得葡萄糖脱氢酶酶液、0.2kg实施例二所得突变体B102-133所得酮基还原酶酶液和20g辅酶NADP+，搅拌均匀。然后向三颈瓶中加入底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸0.2kg，在25℃下保温反应9小时，HPLC检测至反应完全。
反应结束以后升温灭酶、离心、萃取、浓缩，得4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸浓缩液。向反应体系加入上述浓缩液和1.2L碱性高锰酸钾(pH＝9，组分：高锰酸钾浓度为0.1mol/L，加入氢氧化钠溶液调节pH值)溶液，继续搅拌3小时，待反应结束以后，依次用700mL、500mL、300mL乙酸乙酯萃取，得有机相。有机相经200g饱和食盐水洗涤、干燥后减压浓缩，得产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸0.22kg，含量82.4％，ee值98.4％。
其中，HPLC高效液相色谱仪的厂家：安捷伦，型号：Agilent 1200；HPLC检测过程为：色谱柱为C18(尺寸：4.6mm×250mm，固定相粒度为5μm)，流动相：乙腈：水，比例为V水：V乙腈＝95:5；流速1mL/min；柱温：35℃；检测波长：254nm。4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸保留时间为15.95min，(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸保留时间为10.04min，(R)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸保留时间为10.49min。
所述含量的计算方式为：
m标：标样质量；
m样：样品质量；
c标：标样浓度；
s标：标样峰面积；
s样：样品峰面积
所述ee值的检测过程为：将浓缩后产物用HPLC流动相溶解，用HPLC检测ee值。所用色谱柱为C18(尺寸：4.6mm×250mm，固定相粒度为5μm)，流动相：乙腈：水，比例为V水：V乙腈＝95:5；流速1mL/min；柱温：35℃；检测波长：254nm。4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸保留时间为15.95min，(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸保留时间为10.04min，(R)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸保留时间为10.49min。
实施例四 他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的制备
向3L三颈瓶中加入1L磷酸盐缓冲液调节反应体系的pH为6.5，加入0.5kg葡萄糖固体、0.3kg葡萄糖脱氢酶、0.6kg酮基还原酶和30g辅酶NADP+，搅拌均匀。然后向三颈瓶中加入底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸0.2kg，在30℃下保温反应12小时，HPLC检测至反应完全。
反应结束以后升温灭酶、离心，得4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸水溶液。向反应体系加入100g碱性高锰酸钾溶液(pH＝10，组分：高锰酸钾浓度为0.1mol/L，加入NaOH调节pH值)，继续搅拌5小时，待反应结束以后，依次用700mL、500mL、300mL乙酸乙酯萃取，得有机相。有机相经200g饱和食盐水洗涤、干燥后减压浓缩，得产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸0.24kg，含量78.6％，ee值98.6％。
实施例五 他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的制备
向3L三颈瓶中加入1L磷酸盐缓冲液，调节反应体系的pH为6.8，加入 0.3kg葡萄糖固体、0.2kg葡萄糖脱氢酶、0.4kg酮基还原酶和25g辅酶NADP+，搅拌均匀。然后向三颈瓶中加入底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸0.2kg，在30℃下保温反应10小时，HPLC检测至反应完全。
反应结束以后升温灭酶、离心，得4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸水溶液。
向反应体系加入80g碱性高锰酸钾溶液(pH＝11，组分：高锰酸钾浓度为0.1mol/L，加入NaOH调节pH值)，继续搅拌5小时，待反应结束以后，依次用700mL、500mL、300mL乙酸乙酯萃取，得有机相。
有机相经200g饱和食盐水洗涤、干燥后减压浓缩，得产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸0.21kg，含量86.3％，ee值98.5％。
实施例六 他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的制备
向50L反应釜中依次加入12kg磷酸盐缓冲液，调节反应体系的pH为6.5、2kg葡萄糖固体、1kg葡萄糖脱氢酶、2kg酮基还原酶和200g辅酶NADP+，搅拌均匀。
然后向反应釜中加入底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸2kg，在25℃下保温反应12小时，HPLC检测至反应完全。
反应结束以后升温灭酶、离心，得4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸水溶液。
向反应体系加入0.5kg碱性高锰酸钾溶液(pH＝10，组分：高锰酸钾浓度为0.1mol/L，加入NaOH调节pH值)，继续搅拌3小时，待反应结束以后，依次用7L、5mL、3mL乙酸乙酯萃取，得有机相。
有机相经2kg饱和食盐水洗涤、干燥后减压浓缩，得产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸2.3kg，含量81.5％，ee值99.2％。
实施例七 他喷他多手性中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的制备
向50L反应釜中依次加入12kg磷酸盐缓冲液，调节反应体系的pH为,7.0、5kg葡萄糖固体、3kg葡萄糖脱氢酶、6kg酮基还原酶和300g辅酶NADP+，搅拌均匀。
然后向反应釜中加入底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸2kg，在30℃下保温反应9小时，HPLC检测至反应完全。
反应结束以后升温灭酶、离心，得4-羟基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸水溶液。
向反应体系加入1.0kg碱性高锰酸钾溶液(pH＝10，组分：高锰酸钾浓度为0.1mol/L，加入NaOH调节pH值)，继续搅拌5小时，待反应结束以后，依次用7L、5mL、3mL乙酸乙酯萃取，得有机相。
有机相经2kg饱和食盐水洗涤、干燥后减压浓缩，得产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸2.4kg，含量81.3％，ee值99.3％。
对比例一
对比例一的技术方案与实施例三类似，区别仅在于：葡萄糖固体添加量为0.1kg，葡萄糖脱氢酶添加量为0.1kg。
结果表明，产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的质量为0.21kg，含量56.1％，ee值为60.2％。
对比例二
对比例二技术方案与实施例四类似，区别仅在于：葡萄糖固体添加量为0.6kg，葡萄糖脱氢酶添加量为0.4kg。
结果表明，产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的质量为0.24kg，含量78.8％，ee值为98.6％。
对比例三
对比例三技术方案与实施例六类似，区别仅在于，酮基还原酶添加量为1kg，辅酶NADP+添加量为150g。
结果表明，产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的质量为2kg，含量72.6％，ee值为85.9％。
对比例四
对比例四技术方案与实施例七类似，区别仅在于：酮基还原酶添加量为6.5kg，辅酶NADP+添加量为350g。
结果表明，产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的质量为2.4kg，含量81.5％，ee值为99.2％。
对比例五
对比例五与实施例三类似，区别仅在于：将所述酮基还原酶改为汉酶生物酮基还原酶(厂家：苏州汉酶生物技术有限公司，型号：EW101-KH)。
结果表明，产物(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的质量为0.22kg，含量0，ee值为0。即，产物中不含(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸。
综上所述，本发明首次提供了用生物酶作催化剂来合成(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸的方法，并成功合成了中间体(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-羰基丁酸，反应条件温和、安全环保、成本低，具有广阔的应用前景。
Claims (30)
1.他喷他多手性中间体（S）-4-（3-甲氧基苯基）-3-甲基-4-羰基丁酸的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）以混旋4-（3-甲氧基苯基）-3-甲基-4-羰基丁酸为底物，在酮基还原酶作用下，添加葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶，反应得到4-羟基-4-（3-甲氧基苯基）-3-甲基丁酸；
（2）加入碱性高锰酸钾，反应得到（S）-4-（3-甲氧基苯基）-3-甲基-4-羰基丁酸；
所述酮基还原酶的氨基酸序列如序列SEQ ID NO .11所示；
所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如序列SEQ ID NO .2所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述酮基还原酶由菌株生产得到，所述生产酮基还原酶的菌株为大肠杆菌（Escherichia coli. ）B102-133， 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016101。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述葡萄糖脱氢酶由菌株生产得到，所述生产葡萄糖脱氢酶的菌株为大肠杆菌（Escherichia coli. ）A149-170，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016102。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述葡萄糖脱氢酶由菌株生产得到，所述生产葡萄糖脱氢酶的菌株为大肠杆菌（Escherichia coli. ）A149-170，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016102。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，第（1）步中所述反应过程中，还需添加缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH值为6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述葡萄糖的添加质量为底物的1-2.5倍。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述葡萄糖的添加质量为底物的1-2.5倍。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述葡萄糖的添加质量为底物的1-2.5倍。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述葡萄糖的添加质量为底物的1-2.5倍。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述葡萄糖的添加质量为底物的1-2.5倍。
11.根据权利要求1-10任一项所述的制备方法，其中，所述葡萄糖脱氢酶的添加质量为底物的0.5-1.5倍。
12.根据权利要求1-10任一项所述的制备方法，其中，所述酮基还原酶的添加质量为底物的0.6-1倍。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述酮基还原酶的添加质量为底物的0.6-1倍。
14.根据权利要求1-10任一项所述的制备方法，其中，所述辅酶的添加量占底物的10wt%-15wt%，所述辅酶选自辅酶I NAD+ 和辅酶II NADP+中的一种或两种。
15.根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述辅酶的添加量占底物的10wt%-15wt%，所述辅酶选自辅酶I NAD+ 和辅酶II NADP+中的一种或两种。
16.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述辅酶的添加量占底物的10wt%-15wt%，所述辅酶选自辅酶I NAD+ 和辅酶II NADP+中的一种或两种。
17.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述辅酶的添加量占底物的10wt%-15wt%，所述辅酶选自辅酶I NAD+ 和辅酶II NADP+中的一种或两种。
18.根据权利要求1-10任一项所述的制备方法，其中，步骤（1）中所述反应的温度为25-35℃。
19.根据权利要求1-10任一项所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
20.根据权利要求11所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
21.根据权利要求12所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
22.根据权利要求13所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
23.根据权利要求14所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
24.根据权利要求15所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
25.根据权利要求16所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
26.根据权利要求17所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
27.根据权利要求18所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述高锰酸钾为浓度为0.1-0.3mol/L的碱性高锰酸钾溶液，添加量为底物质量的10-100倍。
28.根据权利要求1-10任一项所述的制备方法，其中，步骤（2）中所述碱性高锰酸钾的pH值为9-11。
29.根据1-10任一项所述的制备方法，其中，所述步骤（2）之前还包括灭酶的过程。
30.权利要求1-29任一项所述制备方法在制备他喷他多中的应用。
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| CN105624125A (zh) * | 2014-11-26 | 2016-06-01 | 南京博优康远生物医药科技有限公司 | 醛酮还原酶及其在合成(2s,3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用 |
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2016
- 2016-08-31 CN CN201610785156.4A patent/CN107779480B/zh active Active
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