CN101862349A - 蜈蚣有效部位及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜈蚣提取的有效部位，还公开了这种有效部位的制备方法，它是蜈蚣通过仿生酶解法制得。同时，公开了该有效部位在制备抗凝血和溶栓的药物中的应用。

Description

蜈蚣有效部位及其应用
技术领域
本发明涉及一种中药制药领域，具体地，具体涉及蜈蚣有效部位及其提取方法和应用。
背景技术
为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch的干燥体。主产于江苏、浙江、湖北、湖南、河南、陕西等地。春、夏二季捕捉，用竹片插入头尾，绷直，干燥。功效为息风镇痉，攻毒散结，通络止痛。蜈蚣的主要功能主治熄风镇痉，攻毒散结，通络止痛。用于小儿惊风，抽搐痉挛，中风口
Figure B2009100741347D0000011
，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，疮疡瘰痢，毒蛇咬伤【中国药典2005年版一部】。
传统中药以蜈蚣全虫入药，研究表明不同提取物所含活性物质不同，药效有明显差异。在体外抑菌方面，发现蜈蚣的酸性提取液对致病性真菌均有较强的抑制作用，而碱提液和水提液效果不佳。不同提取液对致病性真菌和细菌的作用，3％醋酸提取液能强烈抑制真菌生长，但各提取物对细菌均无作用。蜈蚣水提取物表现出广谱抗菌活性。在抗惊厥方面，干燥蜈蚣水煎液对小鼠具有明显中枢抑制作用。干燥蜈蚣醇提物、水提物对士的宁所致惊厥均有不同程度的拮抗作用【时珍国医国药2008年第19卷第11期.蜈蚣醇提取物和水提取物部分药理作用比较.周丽丽、黄迎春、仁超】。
现有技术中提取蜈蚣一般为将蜈蚣粗粉经醇提脱脂，所得残渣在4-8℃水提，再减压浓缩后冻干得水提物冻干粉；所述冻干粉经柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干；将D部分的冻干粉经活性碳脱色后，得脱色冻干粉，再经柱层析，蒸馏水洗脱，UV220检测，收集第二峰(主峰)，30-40℃旋转浓缩、冻干，即得抑癌有效部分D-1。该方法简便易行，有利于以蜈蚣为主药的抗癌制剂的研究和开始。(中国专利：zl01100288.3)
或以少棘蜈蚣为原料母体，清洗，干燥；研磨干燥后的原料母体得蜈蚣细粉；将蜈蚣细粉经水提、过滤得残渣再重复水提，离心后取上清；减压浓缩上清，经醇提后得沉淀；将沉淀经硫酸铵分段盐析后收集60％饱和度的沉淀物；将沉淀物经DEAE-50纤维素离子交换层析柱、洗脱、脱盐后浓缩；将所得浓缩液经Sephadex G-200柱纯化，得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品。制备方法易行，操作简便，原料来源广泛，且应用在制备抗肿瘤药物中能有效杀伤肿瘤细胞和提高机体免疫力，疗效显著。该多糖蛋白复合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。(中国专利：200710053587.2)
发明内容
本发明公开了一种蜈蚣有效部位及其应用。鉴于动物类蛋白质、粘多糖等大分子物质只有到达胃肠道后受消化酶、酸、碱等作用，方可被酶解或水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物质，吸收入血而发挥药效，故本实验模拟胃和小肠的环境及消化过程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶仿生提取蜈蚣，使药材中的大分子蛋白水解为小分子肽类以利于人体吸收。APTT法、纤维蛋白原平板法为较常用的体外抗凝，溶纤试验方法，本实验以其为考察指标，证明酶解工艺的可行性。具体为以水解度为指标，单因素考察了仿生酶解法提取蜈蚣的工艺条件；以APTT法、纤维蛋白原平板法为考察指标，对仿生酶解法提取蜈蚣的工艺进行验证。结果证实，仿生酶解法凝血时间长，抗血栓效果明显。
具体方法和结果通过以下实验证实：
1材料
1.1药材蜈蚣(由河北以岭医药研究院有限公司提供)
1.2试剂牛血清白蛋白(Sigma A7906，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；牛纤维蛋白原(Sigma F8630，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；胰蛋白酶1∶250(Amresco0458，购自北京华美转导科技有限公司)；胃蛋白酶1∶10000(Sigma P7000，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；医用注射性尿激酶(购自北京市望京医院)；凝血酶(Sigma T4648，购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司)；APTT试剂10*1.5ml(购自上海太阳生物试剂公司)；Protein Assay Dye Rgnt(Bio-red 5000006，北京泽平科技有限责任公司)；三氯乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙醇(分析纯)；屈臣氏纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
生理盐水(称取氯化钠9g，加蒸馏水定容至1000ml，摇匀，即得)；人工胃液(取盐酸9ml，加蒸馏水稀释成1000ml，即得)；人工肠液(取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)。
1.3仪器UV-2000型分光光度计；800B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；ES-120型电子分析天平(长沙湘平科技发展有限公司)；恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂)；DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.4动物健康日本大耳白兔(雄性)，体重约2Kg(均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，符合国家健康一级动物标准。
2方法与结果
2.1以水解度为指标，考察仿生酶解工艺
工艺步骤如下：将1g蜈蚣细粉置于50ml具塞圆底烧瓶中，加入20ml人工胃液，密闭，于37℃水浴恒温作用30min，分别加入一定量胃蛋白酶酶解一定时间，将酶解液置85℃恒温水浴作用15min，流水冷却至室温后，以4200r/min离心15min，取上清液，即得，残渣60℃真空干燥称重，得干燥残渣。
称定胃蛋白酶解后的残渣1.0g，置50ml具塞圆底烧瓶中，加入20ml人工肠液，密闭于37℃水浴恒温作用30min，分别加入一定量胰蛋白酶酶解一定时间，将酶解液置85℃恒温水浴作用15min，流水冷却至室温后，以4200r/min离心15min，取上清液，即得。
以水解度为指标，进一步确定酶底比和酶解时间。
2.1.1水解度测定方法
2.1.1.1标准曲线的制备
染色液的配制：准确量取Bio-Rad Protein Assay 50ml，加入蒸馏水稀释定容至250ml，滤去不溶性物质即得，置室温下可保存6个月。
牛血清白蛋白(BSA)1mg/ml的配制：准确称取10mg BSA，蒸馏水定容于10ml，其浓度为1mg/ml(1000mg/L)，置冰箱保存。
精密吸取BSA溶液0.02、0.06、0.08、0.1ml分别置于10ml试管中，依次用蒸馏水补至0.1ml，加入5ml考马斯亮蓝染色液，漩涡混合器震荡混匀。以蒸馏水为空白对照，于595nm处测定吸光度。以牛血清白蛋白浓度(mg/ml)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程：y＝0.9947x+0.0238(r＝0.9986)：结果表明，BSA在0～1mg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。见表1。
表1测定蛋白质浓度的标准曲线的制备
Figure B2009100741347D0000041
2.1.1.2水解度测定法
水解度计算公式： DH = N 2 - N 1 N 0 - N 1 × 100 %
式中：N2为药材酶解液加入20％TCA后测得的可溶性蛋白量(g/L)，即样品2及样品4；N1为药材酶解前加入20％TCA测得的可溶性蛋白量(g/L)-1g药材细粉加入10ml20％TCA，过滤，所得上清液；N0为不同酶解工艺提取总蛋白量(g/L)，即样品1或样品3。
胃蛋白酶酶解工艺筛选
2.1.2.1酶底比考察结果见表2
表2胃蛋白酶酶解酶底比考察结果
Figure B2009100741347D0000043
结论：随着酶底比增大，吸光度基本呈上升趋势；4％、5％、％酶底比的吸光度较高但差别不大，从节约成本考虑，确定酶底比为4％。
2.1.2.2酶解时间考察结果见表3
表3胃蛋白酶酶解的酶解时间考察结果
  酶解时间(h)   N0值   N2值   水解度(％)
  3   0.572   0.115   16.63
  酶解时间(h)   N0值   N2值   水解度(％)
  4   0.553   0.164   26.48
  5   0.526   0.163   27.71
  6   0.487   0.166   30.67
  7   0.484   0.171   31.93
结论
随着酶水解时间的延长，吸光度呈上升趋势；但考虑到酶解时间过长会影响到下一步的操作，及会发生变质等问题，故酶解时间确定为4h。
2.1.3胰蛋白酶酶解工艺筛选
2.1.3.1蜈蚣胰蛋白酶酶底比考察结果见表4
表4胰蛋白酶酶解的酶底比考察结果
  酶解时间(h)   N0值   N2值   水解度(％)
  3.00 0.657 0.607 3.99
  4.00 0.652 0.609 8.66
  5.00 0.633 0.612 25.22
  6.00 0.642 0.615 27.18
  7.00 0.619 0.609 28.98
结论：随着酶底比增大，吸光度呈上升趋势；酶底比在5.0％、6.0％、7.0％时吸光度增加趋势平缓。为节约成本选择酶底比为5.0％较为合适。
2.1.3.2酶解时间考察结果见表5
表5胰蛋白酶酶解的酶解时间考察
  酶解时间(h)   N0值   N2值   水解度(％)
  3 0.722 0.642 25.29
  酶解时间(h)   N0值   N2值   水解度(％)
  4 0.693 0.653 48.77
  5 0.688 0.652 50.74
  6 0.681 0.649 51.58
  7 0.680 0.651 55.442
结论
随着酶水解时间的延长，吸光度呈上升趋势；但考虑到酶解时间过长会影响到下一步的操作，及会发生变质等问题，故酶解时间确定为4h。
综上，以水解度为指标，通过单因素考察，蜈蚣的仿生酶解工艺为：蜈蚣药材细粉加入人工胃液(固液比1∶20)，密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入4.0％胃蛋白酶水解4h，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胃蛋白酶酶解物；沉淀干燥，继加入20倍量人工肠液，密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入5％胰蛋白酶水解4h，将酶解液于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。
2.2复合酶解法
按照上述仿生酶解法的条件，对蜈蚣进行复合酶解作为仿生酶解法的对照。
称取2g蜈蚣药材细粉于50ml圆底烧瓶，加入40ml人工胃液，密闭于37℃水浴锅30min后加入60mg胃蛋白酶水解，3h后用1mol/mlNaOH溶液调节酶解液的pH＝6.8，加入100mg胰蛋白酶酶解4h，于85℃水浴灭酶15min，4200r/min离心15min，取上清液，60℃真空干燥称重，得干燥复合酶解物。
3药效实验
3.1样品制备
称取以上各种提取方法所得干燥物适量，加入生理盐水制成每320μl生理盐水含有0.25g原药材的样品。
3.2APTT法
3.2.1血浆的制备
取大耳白兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉后，颈动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝(1∶9)，混匀后以3000r/min，离心15min，取上清液，分离出贫血小板血浆(PPP)。
3.2.1APTT时间的测定
取PPP100μl于测试槽中，加样品液10μl(预温5min)和APTT试剂100μl(预温10min)，孵育5min后加入CaCl2100μl(预温15min)，同时计时，用针尖拨动溶液，当有丝状凝结物被针挑起时，记录时间。以生理盐水为阴性对照(每个样品平行测定6份)，结果见表：
表6蜈蚣酶解法APTT抗凝药效考察(n＝6)
Figure B2009100741347D0000071
注：与生理盐水组相比P＜0.05。
结论：各样品都能显著延长APTT时间，其中仿生酶解组比复合酶解组抗凝下效果更显著，证明仿生酶解方案可行。
3.3纤维蛋白原平板法
3.3.1试液的配制
磷酸缓冲液(PBS)：称取3.12g磷酸二氢钠，加蒸馏水定容到100ml，即得A液；称取磷酸氢二钠7.1632g，加蒸馏水定容到100ml，即得B液；使用时，取A液760μl、B液3240μl加入76ml生理盐水，即得磷酸缓冲液。
纤维蛋白原溶液：称取纤维蛋白原0.3g加入60mlPBS，振摇，溶解，即得。
3.3.2纤维蛋白平板的制备
在平皿内加入9ml 5g·L-1的纤维蛋白原溶液，再加入2×103μ·L-1的凝血酶溶液1ml，立即打旋混匀大约10s，即形成1mm厚的纤维蛋白凝块，在平皿上盖加滤纸，水平处放置，凝固后形成纤维蛋白平板。
3.3.3测定步骤：将样品液、尿激酶(6×105μ·L-1)和生理盐水各10μl分别点在纤维蛋白平板上，各点间距大于1.5cm。置纤维蛋白平板于湿盒内，放入37℃烘箱中，4h后观察有无溶解圈，并测量溶解圈的直径，计算溶解圈面积，以溶解圈面积大小衡量纤溶活性的大小。结果见表7。
表7纤维蛋白平板溶栓实验结果
  样品   面积均值   备注
  仿生酶解组胃酶酶解部分   131992.7   溶解圈明显
  仿生酶解组胰酶酶解部分   7850.327   溶解圈明显
  复合酶解   12965.84   溶解圈明显
  尿激酶阳性对照   33993.29   溶解圈明显
  生理盐水阴性对照   0.00   溶解圈无
结果表明仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分有明显溶解圈，其中胃酶酶解部分溶解圈最大，各个样品在热板上均无溶解圈，证明仿生酶解的工艺方案可行。
具体实施方式
实施例1：
称取2g蜈蚣药材细粉于50ml圆底烧瓶，加入40ml人工胃液，密闭于37℃水浴锅30min后加入60mg胃蛋白酶水解，3h后用1mol/mlNaOH溶液调节酶解液的pH＝6.8，加入100mg胰蛋白酶酶解4h，于85℃水浴灭酶15min，4200r/min离心15min，取上清液，60℃真空干燥称重，得干燥复合酶解物。
结果
纤维蛋白原平板实验结果是通过1000万长焦数码相机拍照，辅以作图工具ipwin32测量所得。减少误差，提高精确度。
试验结果表明蜈蚣仿生酶解法所得提取物均能显著延长APTT作用时间，纤维蛋白原平板实验表明均有明显溶解圈；其中仿生酶解法胃酶酶解部分溶解圈最大，APTT时间最长，证明仿生酶解工艺可行。
由于目前动物药多以全粉入药，存在着剂量大、易造成微生物污染、用药剂量不当而引起敏反应、急性肝肾功能损害、溶血反应、中枢抑制和致畸等毒副作用。本发明提供了蜈蚣进行抗凝、抗血栓活性成分的分离纯化方法，可以有效的解决以上问题。

Claims (5)

1.一种蜈蚣有效部位提取物，可通过以下方法制备：
蜈蚣用人工胃液加入胃蛋白酶酶解，残渣转入人工肠液，加入胰蛋白酶酶解，得到蜈蚣复合酶解物。
2.根据权利要求1所述的蜈蚣有效部位提取物，该提取物的制备方法特征在于该方法包括下列步骤：
a.蜈蚣净选，粉碎成细粉；
b.将蜈蚣细粉加入人工胃液，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入胃蛋白酶水解4小时，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，离心，取上清液，干燥得蜈蚣胃蛋白酶酶解物；
c.将步骤b)所得的蜈蚣胃蛋白酶酶解物沉淀干燥，加入人工肠液，密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入胰蛋白酶水解，将酶解液于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，离心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。
3.根据权利要求2所述的蜈蚣有效部位提取物，该提取物的制备方法特征在于该方法包括下列步骤：
a.蜈蚣净选，粉碎成细粉；
b.将蜈蚣细粉加入重量体积比为1∶20的人工胃液中，密闭，于37℃恒温水浴30min，加入4.0％胃蛋白酶水解4小时，将酶解液置于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胃蛋白酶酶解物；
c.将步骤b)所得的蜈蚣胃蛋白酶酶解物沉淀干燥，继加入20倍量人工肠液，密闭，于37℃恒温水浴作用30min后，加入5％胰蛋白酶水解4h，将酶解液于85℃恒温水浴作用15min，冷却至室温，以4200r/min离心15min，取上清液，干燥得蜈蚣胰蛋白酶酶解物。
4.根据权利要求1所述的蜈蚣有效部位提取物在制备抗凝血和溶栓的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于其中所述的药物的剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。
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