发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于治疗原发性高血压的药物组合物及其有效成分的配比,该药物组合物的有效成分是由天麻总苷和钩藤总碱组成,二者在药物中的重量配比为0.2~5∶1;优选后的配比为0.5~2∶1。
本发明中的天麻总苷以天麻素作对照,以比色法测定其中总苷含量不低于50%;钩藤总碱以钩藤碱作对照,采用酸性染料比色法测定其总碱含量不低于50%。这两种提取物中有效成分的含量达到了中药领域中关于有效部位的要求,具有较高的技术水平。
本发明中的天麻钩藤有效成分组合物可以单独应用,也可以与其他药物一起联合应用,即:在药物活性成分中,可以只有该组合物,也可以是该组合物与其他药物的混合物。所有以天麻总苷和钩藤总碱按本发明技术方案明确的比例和方法使用的行为均属本发明保护的范围。
本发明的第二目的是提供该组合物中两种有效成分的制备方法:
a、取天麻饮片,加入用氢氧化钙溶液调pH为6.5~7.5、浓度为20%~80%的乙醇提取2~3次,每次加入6~15倍量、提取0.5~3小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇,浓缩至每毫升相当于0.2~2g生药的浓缩液,离心,取上清液,加乙醇至醇含量60%~80%,加氢氧化钙溶液调PH7.5~8.5,静置,滤过,滤液加稀氢氧化钙溶液调pH值至8.5~10.5,静置,滤过,取沉淀,加水搅匀,用稀硫酸试液调pH3~6,滤过,滤液浓缩,干燥,得天麻总苷。
b、取钩藤饮片,加入含有0.02%~0.4%盐酸的40%~95%的乙醇,回流提取1~4次,每次加5~15倍量、提取0.5~3小时,滤过,合并滤液,浓缩,加于已处理好的H型强酸性阳离子交换树脂柱上,以去离子水冲洗至洗脱液pH值5~7,弃去;再用含0.05%~0.5%氨水的70%~95%乙醇洗脱,以硅钨酸试剂检查至沉淀反应为阴性时止,收集洗脱液,减压浓缩,将析出的固体减压干燥,再用无水乙醇回流提取至生物碱提取完全,滤过,滤液减压干燥,得钩藤总碱。
发明人经过进一步优选,确定了以下制备方法:
a、取天麻饮片,用氢氧化钙溶液调pH为7.5、浓度为40%的乙醇提取3次,每次加入10倍量、提取1小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇,浓缩至每毫升相当于1g生药的清膏,以5000r/min离心15min,取上清液,加乙醇至醇含量80%,加氢氧化钙溶液调pH8.0,静置24h,滤过,滤液加稀氢氧化钙溶液调pH值至9.5,静置24h,滤过,取沉淀,加水搅匀,用20%硫酸试液调pH4~5,滤过,滤液减压浓缩,真空干燥,得天麻总苷。
b、取钩藤饮片,加入含0.1%盐酸的80%乙醇回流提取2次,每次加入10倍量、提取1小时,滤过,合并滤液,浓缩至每毫升相当于相当于3g生药的清膏,加于已处理好的H型强酸性阳离子交换树脂柱上,以去离子水冲洗至洗脱液pH值6~7,弃去;再用含0.25%氨水的95%乙醇洗脱,以10%硅钨酸试剂检查至沉淀反应为阴性时止,收集洗脱液,减压浓缩,将析出的固体减压干燥,再用无水乙醇回流提取至生物碱提取完全,滤过,滤液减压干燥,得钩藤总碱。
本发明中采用的阳离子树脂可以是001×3、001×7、001×11等,但不限于这些型号的阳离子交换树脂。
将两种有效成分按比例混合后,加入适宜的辅料,即可制成临床所需的滴丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、软胶囊剂、凝胶剂等药学可以接受的剂型。如:
a、将天麻总苷、钩藤总碱混合,加入适量的常规辅料如淀粉、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等制成胶囊剂、颗粒剂、片剂等制剂。
b、将天麻总苷、钩藤总碱混合,可加入到熔融的PEG4000中以滴制法制成滴丸。
c、将天麻总苷、钩藤总碱混合,以适量水溶解后直接加卡波姆、壳聚糖等常规药用辅料,制成凝胶剂、湿敷剂、喷雾剂等制剂。
有益效果
本发明的药物组合物,具有平肝熄风、镇静降压之功效,可用于治疗原发性高血压。发明人通过以下实验研究,来说明本发明的突出效果。
1实验材料
1.1受试药物
(1)实施例8所制丸剂,天麻总苷与钩藤总碱的比例为1∶1。
(2)中药阳性对照药:牛黄降压片,为哈药集团世一堂制药厂生产。
规格:每片重0.59g,口服,一次2-4片,一日1次。
1.2实验动物
(1)自发性高血压大鼠,简称SHR大鼠,由北京维通利华实验技术有限公司提供,合格证号为SCXK(京)2002-0003。
(2)大白鼠为Wistar种,由山东大学实验动物中心繁殖提供,合格证为SCXK(鲁)2003004号。
1.3仪器及主要试剂
“BESN-II”多通道动物无创测压仪:南京德赛生物技术有限公司生产;
酶标仪:CliniBio 128
低温离心机:BECKMAN COULTER Allegra 21R centrifuge
大鼠血管紧张素II(Rat Ang II)试剂盒:Catalog No:R1282;Lot No 1205H1
大鼠一氧化氮(Rat No)试剂盒:Catalog No:ER060;Lot No 1210E1
其他试剂均为分析纯。
2实验方法
2.1动物分组
取原发性高血压大鼠(SHR)30只,雄性,12周龄,随机抽取5只,测量血压,其基础血压无明显的差异性,故按体重随机分为3组,每组10只,分别设为SHR模型组;天钩降压组;中药阳性对照药组,即牛黄降压片组。
2.2给药剂量
自SHR大鼠13周龄血压开始升高时,各组开始同时灌胃给药,每日灌服剂量9.64mg/250g牛黄降压片组灌服0.135g/kg体重。SHR模型组灌服相应量常水。实验期间各组均饲以普通饲料,并自由饮水。
3实验过程
每周测量一次体重,并且依据体重调整给药剂量,另外每周用BESN-II多通道动物无创测压仪在清醒状态下测量大鼠尾动脉的收缩压,时间均选在下午灌药后进行,以比较各组治疗后血压的变化情况。实验周期共计12周,在处理动物前称量体重(BW),更换垫料并且禁食12小时,不禁水。大鼠麻醉,腹主静脉取血,分离血清,低温放置,以备测量No、AngII、ET含量。开胸取出心脏,沿室间隔肌止端去除右心房及右心室组织,保留左心室及室间隔,称取左心室的重量(LVW),以LVW/BW值作为评价左室肥厚(LVH)程度的定量指标。
4指标测定
4.1收缩压的测定
用“BESN-H”多通道动物无创测压仪在动物清醒状态下测量大鼠尾动脉的收缩压,时间均选在下午灌药后进行。
4.2左室重量与体重之比(LVW/BW)的测定
左室重量与体重之比(LVW/BW)可作为左室肥厚(LVH)的定量指标。动物处理前记录其体重(BW),开胸取出心脏,沿室间隔肌止端去除右心房及右心室组织,保留左心室及室间隔,称取左心室的重量(LVW),计算左室重量与体重之比(LVW/BW),以衡量比较各组左室肥厚的程度。另取Wistar大鼠10只作为对照,雄性,称为Wistar组。
4.3血清NO含量的测定
取血清,采用ELISA法测定血清中NO的含量。原理为NO(缓冲液)NO3-,NO2-(酶)NO-(显色液)而生成有色物质。操作步骤按试剂盒的要求进行。取空白管、标准管及测定管,加液顺序及剂量按试剂盒要求做,轻轻混匀30秒,37℃温育60分钟,分别加显色液A、显色液B各500μl,轻轻混匀30秒,20~25℃温育10分钟,用0.5cm比色杯,空白管调零,530nm读取各管的OD值。大鼠NO的浓度(nmol/L)=(测定管OD/标准管OD)只标准品的浓度(100μmol/L)。另取Wistar大鼠10只作为对照,雄性,称为Wistar组。
4.4血清血管紧张素II(ANGII)含量的测定
取血清,采用双抗夹心ELISA法检测。抗大鼠ANG II单抗包被于酶标板上,大鼠标本中的ANG II会与单抗结合,未结合的将被洗去。加入生物素化的抗大鼠ANG II(二抗),它将与结合在单抗上的ANG II结合形成免疫复合物。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合,多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。ANGII的浓度与OD值成正比。方法如下:将不同浓度的标准品及标本100μl加入相应的酶标板反应孔中,每孔加入50μlAnti ratANGIIBiotin。封住板孔,摇动状态下(500~700rpm)室温孵育180分钟。甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板,并去除水滴,反复洗涤5次。每孔加入100μl稀释液,封住板孔,摇动状态下(500~700rpm)室温孵育30分钟。甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板,并去除水滴,反复洗涤5次,每孔加入100μl显色液,封住板孔,摇动状态下(500~700rpm)室温孵15分钟,每孔加入100μl终止液,轻轻混匀30秒,30分钟内在450nm处读OD值,以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线根据样品的OD值可在标准曲线上查出浓度。另取Wistar大鼠10只作为对照,雄性,称为Wistar组。
5实验结果
5.1各组给药后不同时间血压变化值的比较,见表1。
表1各组给药后不同时间的血压
组别 |
正常 |
1周 |
2周 |
3周 |
4周 |
SHR模型组 |
158.3±11.62 |
161.4±11.36 |
165.7±15.74 |
167.9±12.44 |
173.6±10.14 |
天钩降压组 |
157.2±9.84 |
141.2±12.36# |
139.2±10.04# |
142.4±10.08 |
143.4±10.08 |
牛黄降压组 |
156.4±10.22 |
144.8±10.84# |
148.9±9.80 |
151.7±11.20 |
159.3±9.94 |
组别 |
5周 |
6周 |
7周 |
8周 |
SHR模型组 |
181.6±11.98 |
188.3±12.74 |
196.8±14.22 |
204.8±10.76 |
天钩降压组 |
146.2±9.86# |
149.8±10.10# |
153.7±11.70 |
157.4±10.08# |
组别 |
5周 |
6周 |
7周 |
8周 |
牛黄降压组 |
164.3±10.24 |
167.9±11.14 |
170.2±10.04 |
172.5±9.78 |
组别 |
9周 |
10周 |
11周 |
12周 |
SHR模型组 |
206.5±12.02* |
205.8±9.88* |
208.2±11.42* |
210.4±11.48* |
天钩降压组 |
161.4±9.84# |
170.3±10.14 |
180.8±9.88 |
182.7±10.38 |
牛黄降压组 |
175.2±11.23 |
180.4±10.18 |
184.6±10.47 |
194.3±10.62 |
注:*表示与其他各组相比较P<0.01;#表示SHR模型组与其他各组相比P<0.01。
由表1所示,可以得出以下结论:Wistar组的收缩压处于正常范围,且明显小于其他各治疗组(P节0.01),表明SHR大鼠原发性高血压模型成立;天钩降压组降压幅度最大,与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。表明长期服用天钩降压组可在一定程度内控制血压的升高。
5.2左室重量与体重之比(LVW/BW)的测定,结果见表2。
表2左室重量与体重之比(LVW/BW)的测定结果(X±S)
组别 |
例数(只) |
LVW/BW(mg/g) |
Wistar组 |
10 |
1.94±0.15 |
牛黄降压组 |
10 |
3.51±0.24 |
SHR模型组 |
10 |
3.62±0.38 |
天钩降压组 |
10 |
3.14±0.19* |
由表2可知,Wistar组LVW/BW比值最小,且明显小于SHR模型组(P<0.01),表明SHR大鼠已引起左心室重量增加,即左室肥厚;而各给药组分别同SHR模型组相比,天钩降压组LVW/BW比值明显降低(P<0.05);牛黄降压片组有降低的趋势,但不明显(P>0.05)。表明天钩降压组对原发性高血压大鼠引起的心室肥厚有明显的抑制作用。
5.3血清一氧化氮(NO)含量的测定,结果见表3。
表3血清一氧化氮(NO)含量的测定结果(X±S)
组别 |
例数(只) |
NO(μmol/L) |
Wistar组 |
10 |
36.21±10.87 |
组别 |
例数(只) |
NO(μmol/L) |
牛黄降压组 |
10 |
37.00±8.14 |
SHR模型组 |
10 |
30.78±5.86 |
天钩降压组 |
10 |
41.12±12.06* |
注*与SHR模型组比较P<0.05。
由表3可知,天钩降压组NO含量最高,SHR模型组NO含量最少,两者相比较有显著性差异(P<0.05)。表明天钩降压组可提高血清中NO含量。
5.4血清中血管紧张素II(Ang II)含量的测定,结果见表4。
表4血管紧张素II(Ang II)含量的测定结果(X±S)
组别 |
例数(只) |
AngII(pg/ml) |
Wistar组 |
10 |
297.87±10.46 |
牛黄降压组 |
10 |
326.65±8.51 |
SHR模型组 |
10 |
336.92±10.45 |
天钩降压组 |
10 |
315.78±9.04* |
由表4可知Wistar组AngII含量最少,明显小于SHR模型组(P<0.01),表明SHR大鼠血压升高与血清中AngII含量增高有显著关系;而给药组分别同SHR模型组相比,天钩降压组Ang II含量明显降低(P<0.05);牛黄降压片组有降低的趋势,但不明显(P>0.05)。表明天钩降压组的配比制成的胶囊对原发性高血压大鼠引起的血管紧张素II含量增高有明显的抑制作用。
以下各实施例制得的药物组合物均能达到上述实验效果。
具体实施方式
实施例1:天麻总苷的制备
取天麻粗粉10kg,加20%乙醇(加氢氧化钙溶液调PH为6.5)提取2次,每次加6倍量提取3h,滤过,合并滤液,减压回收乙醇,浓缩至相当于生药1g/mL,离心,取上清液,加乙醇至醇含量60%,加氢氧化钙溶液调PH7.5,静置,滤过,滤液加稀氢氧化钙溶液调pH值至8.5,静置,滤过,取沉淀,加水搅匀,用稀硫酸试液调PH3,滤过,滤液浓缩,干燥,制得天麻总苷。
实施例2:天麻总苷的制备
取天麻粗粉5kg,加80%乙醇(加氢氧化钙溶液调PH为7.5)提取3次,每次加15倍量提取0.5h,滤过,合并滤液,减压回收乙醇,浓缩至相当于生药0.2g/mL,离心,取上清液,加乙醇至醇含量80%,加氢氧化钙溶液调PH8.5,静置,滤过,滤液加稀氢氧化钙溶液调pH值至10.5,静置,滤过,取沉淀,加水搅匀,用稀硫酸试液调PH6,滤过,滤液浓缩,干燥,制得天麻总苷。
实施例3天麻总苷的制备
取天麻粗粉50kg,加40%乙醇(加氢氧化钙溶液调PH为7.5)提取3次,每次加10倍量提取1h,滤过,合并滤液,减压回收乙醇,浓缩至相当于生药1g/mL,5000r/min离心15min,取上清液,加乙醇至醇含量80%,加氢氧化钙溶液调PH8.0,静置24h,滤过,滤液加稀氢氧化钙溶液调pH值至9.5,静置24h,滤过,取沉淀,加水搅匀,用20%硫酸试液调PH4~5,滤过,滤液减压浓缩,真空干燥,制得天麻总苷。
实施例4:钩藤总碱的制备
取钩藤饮片10kg,粗粉,加入含有0.02%盐酸的40%乙醇回流提取4次,每次加5倍量提取0.5小时,合并滤液,滤过,滤液浓缩,取滤液加于已处理好的H型强酸性阳离子(001×3)交换树脂柱上,加完药液后,以去离子水继续冲洗,至水洗脱液pH5,弃去;再用70%乙醇0.05%氨水洗脱,以硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止,收集洗脱液,减压浓缩至析出大量固体,减压干燥的干品,用无水乙醇回流提取3小时,滤过,滤液减压干燥,得钩藤总碱。
实施例5:钩藤总碱的制备
取钩藤饮片20kg,粗粉,加15倍量含有0.4%盐酸的95%乙醇浸泡36h后回流提取1次,3小时,合并滤液,滤过,滤液浓缩,取滤液加于已处理好的H型强酸性阳离子(001×11)交换树脂柱上,加完药液后,以去离子水继续冲洗,至水洗脱液pH7,弃去;再用含有0.5%氨水的95%乙醇洗脱,以硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止,收集洗脱液,减压浓缩至析出大量固体,减压干燥的干品,用无水乙醇回流提取1小时,滤过,滤液减压干燥,得钩藤总碱。
实施例6:钩藤总碱的制备
取钩藤饮片50kg,粗粉,加入含有0.1%盐酸的80%乙醇浸泡12h后回流提取2次,每次加10倍量提取1小时,合并滤液,滤过,滤液浓缩至相当于每1ml含3g生药的清膏,取滤液加于已处理好的H型强酸性阳离子交换树脂(001×7型)柱上,加完药液后,以去离子水继续冲洗,至水洗脱液pH6~7,弃去;再用含有0.25%氨水的95%乙醇洗脱,以10%硅钨酸试剂检查至沉淀反应阴性为止,收集洗脱液,减压浓缩至析出大量固体,减压干燥的干品,用无水乙醇回流提取2小时,滤过,滤液减压干燥,得钩藤总碱。
实施例7:
处方:天麻总苷600g 钩藤总碱900g
制法:取上述两味,混合,粉碎,加入熔融的聚乙二醇4000∶聚乙二醇6000(1∶1)中,搅匀,将药液置滴丸机贮料缸中,保温(90℃),30滴/分钟速度,滴入5~10℃的甲基硅油中,制成10000丸,取出滴丸,吸除冷却剂,干燥,即得。
实施例8:
处方:天麻总苷500g 钩藤总碱500g
制法:取以上两味,混匀,加入羧甲淀粉钠500g,再加微晶纤维素至总量5000g,混匀,以水为黏合剂,制丸条,压制成丸,即得。
实施例9:
处方:天麻总苷200g 钩藤总碱1000g
制法:取上述两味,混匀,加20%微晶纤维素和2%羧甲淀粉钠,加淀粉至3000g,混匀,制粒,压片,包薄膜衣,制成10000片,即得。
实施例10:
处方:天麻总苷1000g 钩藤总碱200g
制法:取上述两味,粉碎,过筛,分剂量包装,制成散剂。
实施例11:
处方:天麻总苷1000g 钩藤总碱400g 葛根提取物300g
制法:以上三味,混匀,加10%微晶纤维素,混匀,制粒,装胶囊,制成10000粒,即得。
实施例12:
处方:天麻总苷600g 钩藤总碱900g
制法:取上述两味,混匀,加羟丙甲基纤维素(HPMC)1000g,乙基纤维素(EC)800g,乳糖200g,共制成10000粒胶囊。
实施例13:
处方:天麻总苷400g 钩藤总碱200g杜仲提取物200g 菊花提取物200g
制法:取上述四味,混匀,加羟丙甲基纤维素(HPMC)1000g,乙基纤维素(EC)800g,乳糖200g,共制成10000粒胶囊。
实施例14:
取实施例12所制胶囊剂治疗90例原发性高血压患者。治疗方案:口服,一次1粒,一日2次,4周为一个疗程。1个疗程后治愈43例,好转29例,显效10例,无效8例,总有效率为91.1%。