CN111732633A - 一种抗肿瘤多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途 - Google Patents

一种抗肿瘤多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体是涉及到一种抗肿瘤多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途，包括如下氨基酸序列的多肽，氨基酸序列为：NKRAQNHYCKEH，本抗肿瘤多肽提高抑制肿瘤的效果。

Description

一种抗肿瘤多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体是涉及到一种抗肿瘤多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途。
背景技术
蜈蚣属节肢动物门唇足纲蜈蚣目蜈蚣科，味辛，性温，有毒，归肝经，具辛温走窜、通经逐邪、调达肝经的功效，为祛风镇痛、攻毒散结之要药，在我国作为中草药始见于两千多年前《神农本草经》。蜈蚣作为防病、治病的传统中药材沿用至今，现代蜈蚣的临床应用、药理作用又有新的扩展。
蜈蚣毒素具有抗癌的用途，中国专利申请号为201010104802.9的专利申请公开了一种多肽，其序列为Phe-Thr-Gly-Gly-Asp-Glu-Ser-Arg-Ile-Gln-Glu-Gly组成的十二肽，分子量为1296.05Da，其测定了对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。从蜈蚣的毒素中能提取出抑制肿瘤的物质，比如上文中提到的多肽，但是由于多肽类物质本身是小分子物质，提取液中具有多种不同的多肽和其他物质，导致难以从上述提取物中得到最有效的作用于肿瘤的多肽物质，蜈蚣毒素价格昂贵，多肽的抗肿瘤效果一般。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途，提高抑制肿瘤的效果，具备抗肿瘤药物的前景。
本发明的内容包括抗肿瘤多肽，包括如下氨基酸序列的多肽，氨基酸序列为：
NKRAQNHYCKEH，
即：SEQ ID NO：1，为Asns-Lys-Arg-Ala-Gln-Asn-His-Tyr-Cys-Lys-Glu-His。
其分子结构式为：C63H98N24O19S，分子量为1527.67kD。
合成后成品为白色到灰白色的冻干粉。
本发明包括抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物方面的用途，优选的，所述肿瘤为肝肿瘤。
本发明的有益效果是，本申请采用蜈蚣药材本身提取得到，原料更加低廉，采用过柱提取并结合高效液相分离提纯，纯度更高。本申请对结构进行了优化，活性更为稳定。
本申请通过试验分析发现，本申请的抗肿瘤多肽，对肿瘤细胞特别是对肝肿瘤细胞具有强烈的抑制作用。
附图说明
图1为质谱离子流图，a峰为所需物质。
图2为色谱峰质谱鉴定图。
图3为结构优化后的抗肿瘤多肽的结构图。
具体实施方式
实施例1蜈蚣小分子多肽(本申请的抗肿瘤多肽)生物合成及检测
蜈蚣小分子多肽提取及结构分析
蜈蚣小分子多肽提取：蜈蚣粉(少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipesmutilans))与胰蛋白酶混合，用蒸馏水溶解，置入46℃水浴箱中抚育4h，99℃水浴中灭活后离心取上清液，加丙酮低温离心，取沉淀，加5ml双蒸水溶解，重复加丙酮离心并用蒸馏水溶解，再加1倍体积丙酮，1倍体积石油醚，离心取沉淀，加入5ml蒸馏水溶解，制备冻干粉，加入双蒸水溶解，注入蛋白纯化仪进行分离，加丙酮离心，取沉淀，加双蒸水溶解，再重复一次后，制成冻干粉。
蜈蚣小分子多肽结构液质分析：
(1)实验步骤：
①样品准备：在样品中加去离子超纯水1.5mL，超声，过膜；
②仪器平衡：打开二元泵，柱温箱，紫外灯，质谱等，对流动相进行管路排气后，根据做采用的方法设置液相、质谱参数、样品序列等；按照液相梯度对色谱柱进行平衡；
③上机，首先对样品进行一级质谱分析，根据所得结果，在对可能的物质进行目标二级分离；二级质谱模式所选用碰撞能为30V。
(2)实验参数：
①液相参数：进样量5μL，柱温25℃、流速0.3/min、50％乙腈50％水等度洗脱。洗脱时间：5min。
②质谱参数：离子源：电喷雾离子源、离子模式：正离子模式、气温：300℃、气流量：11L/min、喷雾压：15psi。
实施例2蜈蚣小分子多肽生物合成及检测
①克隆基因或合成
根据多肽NKRAQNHYCKEH的序列，翻译成DNA序列，DNA序列为SEQ ID NO：2，具体为：
Figure BDA0002603681400000021
②传统酶切连接或者一步法无缝连接到表达载体pGEX-4T-1/pEHT28a，目的基因将与GST蛋白或His标签蛋白融合表达。
③测序确认后，转入表达感受态细胞如BL21DE3等，低温培养经低浓度1mM之类的IPTG诱导表达足够时间如20小时以上。
4、提取菌体，冻融法或超声破碎法分离总蛋白，去除核酸。
5、与对应的蛋白纯化琼脂糖体系孵育或者直接过纯化柱子离心纯化。
6、SDS-PAGE跑胶确认，对应的酶识别切除，去除标签蛋白GST或His，得到多肽。
蜈蚣小分子多肽检测
①HPLC检测纯度
实验步骤：样品准备，仪器平衡，上机。
实验参数：
A泵：100％的水，含0.1％的三氟醋酸
B泵：100％的乙腈，含0.1％的三氟醋酸
总流速：1.0ml/min
波长：214nm
分析柱类型：SHIMADZU Inertsil ODS-SP(4.6*250MM*5UM)
溶解方法：0.5mg样本溶解于0.5mL100％水
进样量：60ul。
②MS检测分子量
实验步骤：样品准备，仪器调试选用Digest.m，仪器质量准确度校正，进样检测。
实验参数：
气流流速：1.50L/min
溶解方法：0.1mg样本溶解于0.5mL100％水
进样量：1ul。
实施例3蜈蚣小分子多肽细胞毒性试验
细胞培养及传代：LO2细胞培养于10％Gibco FBS+1％双抗(青霉素和链霉素)的1640培养基中，Hepg2细胞培养于10％Gibco FBS+1％双抗的DMEM培养基中，2-3d换一次液，细胞汇合率达80％左右，胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。
CCK8法细胞增殖活性的检测
(1)细胞准备及铺板：消化收集对数生长期且细胞状态良好的细胞，用细胞计数板计数，并用完全培养基调整细胞密度至5*104/ml。吹打混匀细胞悬液，吸取细胞悬液100μl至96孔板，在96孔板多余孔处加入完全培养基作为调零组，细胞周围孔加入无菌PBS，防止边缘效应。
(2)分组及给药：铺板4h后，确认细胞贴壁后进行加药。按照每组3个复孔铺板，5组，4个时间点，共60孔。进行如下分组的处理：
①对照组：100μl细胞悬液+100μl完全培养基。
②调零组：200μL完全培养基。
③蜈蚣小分子多肽药物组：
100ug/mL：100μl细胞悬液+100ug/mL的蜈蚣小分子多肽药物处理细胞6h，12h，24h。
150ug/mL：100μl细胞悬液+150ug/mL的蜈蚣小分子多肽药物处理细胞6h，12h，24h。
200ug/mL：100μl细胞悬液+200ug/mL的蜈蚣小分子多肽药物处理细胞6h，12h，24h。
200ug/mL：100μl细胞悬液+200ug/mL的蜈蚣小分子多肽药物处理细胞6h，12h，24h。
250ug/mL：100μl细胞悬液+250ug/mL的蜈蚣小分子多肽药物处理细胞6h，12h，24h。
(3)药物溶解
3mg的本申请的抗肿瘤多肽溶于60uL的PBS中，此时母液浓度为50mg/mL，
Figure BDA0002603681400000041
(4)CCK8法细胞增殖活性的检测
加药培养到预定时间12h后，每孔加入100ul含有10％CCK8的培养基。37℃，5％C02继续孵育2小时后于Bio-Tek酶标仪分析450nm处吸光度(OD)值，取均值。细胞生存率的计算按照公式：抑制率＝1-(实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
统计学分析
用SPSS 22.0软件(5d2d5a0ea089654bca48)分析，数据均以
Figure BDA0002603681400000042
表示，用方差齐性检验后，用单因素方差分析，对多组均值进行比较，用LSD法对均值进行两两比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义的标准。
结果
蜈蚣小分子多肽(即蜈蚣提取多肽)生物合成及检测
蜈蚣小分子多肽结构分析
本申请采用胰蛋白酶解法粗提，用Sephadex G-25凝胶过滤层析对所得粗提物进行分离纯化。用高效液相色谱法分析分离，并采用MTT法检测纯化物对HepG2细胞、Eca-109细胞和A549细胞的增殖抑制作用；将经过高效液相色谱法分离的有效成分通过四极杆飞行时间质谱(QTOF)检测，得到本申请的抗肿瘤多肽。
由色谱峰(图1、2)可知多肽序列为NKRAQNHYCKEH。
蜈蚣小分子多肽生物合成
蜈蚣小分子肽的合成序列为NKRAQNHYCKEH，长度为12AA，结构图如图3，合成后成品为白色到灰白色的冻干粉。
实施例4蜈蚣小分子肽细胞毒性试验
CCK8检测显示蜈蚣小分子肽降低人肝癌HepG2细胞生存率
为了探究蜈蚣小分子肽对肝癌HepG2细胞的作用，我们采用了CCK-8方法检测了其对肝癌HepG2的抑制率。不同浓度的蜈蚣小分子合成肽(100ug/mL，150ug/mL，200ug/mL，250ug/mL)作用于肝癌HepG2细胞6h，12h，24h后，抑制率显著上升，一定药物浓度内，呈现浓度依赖特征(见表1)。
表1不同浓度蜈蚣小分子肽对肝癌HepG2细胞增殖活性的影响(X±s)
Figure BDA0002603681400000051
注：与对照组比较：a P<0.01。
本申请对比了不同序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)对HepG2细胞增殖活性的影响，具体见表2。SEQ ID NO：3的序列为RAQNHYCK。
表2不同蜈蚣小分子肽对肝癌HepG2细胞增殖活性的影响(X±s)
Figure BDA0002603681400000052
注：与对照组比较：a P<0.01。
从表2中可以看出，本申请多肽的效果要明显优于优化前多肽，具备成为抗肿瘤药物的良好前景。
实施例5其他蜈蚣多肽对肝癌Hepg2细胞增殖活性的影响
取其他蜈蚣多肽，多肽分别表示为：P19390-1、P19390-2、P19390-3、P19390-4、P19390-5、P19390-7、P19390-8，多肽序列分别为：SEQ ID NO：4-10，其中：
SEQ ID NO：4为ACMN，SEQ ID NO：5为ARGVD，SEQ ID NO：6为HKDY，SEQ ID NO：7为LFVD，SEQ ID NO：8为HFCWW，SEQ ID NO：9为YMYW，SEQ ID NO：10为HHIGS。
细胞培养步骤
Hepg2细胞培养于10％Gibco FBS+1％双抗的DMEM培养基中，2-3d换一次液，细胞汇合率达80％左右，胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。取对数生长的细胞，胰酶消化铺96孔板，9组，每组5个复孔，共45孔，进行如下分组的处理：
①P19390-1：200ug/mL的小分子肽药物P19390-1处理细胞48h；
②P19390-2：200ug/mL的小分子肽药物P19390-2处理细胞48h；
③P19390-3：200ug/mL的小分子肽药物P19390-3处理细胞48h；
④P19390-4：200ug/mL的小分子肽药物P19390-4处理细胞48h；
⑤P19390-5：200ug/mL的小分子肽药物P19390-5处理细胞48h；
⑥P19390-7：200ug/mL的小分子肽药物P19390-7处理细胞48h；
⑦P19390-8：200ug/mL的小分子肽药物P19390-8处理细胞48h；
空白组：0ug/mL的小分子肽药物处理细胞48h。
CCK8法细胞增殖活性的检测
加药培养到预定时间48h后，每孔加入100ul含有10％CCK8的培养基。37℃，5％C02继续孵育2小时后于Bio-Tek酶标仪分析450nm处吸光度(OD)值，取均值。
表3药物处理后细胞OD值
Figure BDA0002603681400000061
对比表2和表3的数据，发现本申请的抗肿瘤多肽具有非常好的抗肿瘤效果。
<110> 湖南中医药大学
<120> 一种抗肿瘤多肽和在制备抗肿瘤药物方面的用途
<160>11
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>1
Asn Lys Arg Ala Gln Asn His Tyr Cys Lys Glu His
1 5 10
<210>2
<211>251
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atgttggttt tttacgctct tcttttcgtg actgtatttt cgaacacagt catgggagcc 60
acaattgata agccaattcc taagccaatt cttcgtgagg ccattgaaga gatcgaagtt 120
aataagcgag cccagaatca ttactgtaaa gaacataatt gtccacctgg caaacattgt 180
cctaaggtac caatagcatg cgtctacggt ccctgttgtt tttaactcaa tgccatcacc 240
ttaggcatca t 251
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>3
Arg Ala Gln Asn His Tyr Cys Lys
1 5
<210>4
<211>4
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>4
Ala Cys Met Asn
1
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>5
Ala Arg Gly Val Asp
1 5
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>6
His Lys Asp Tyr
1
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>7
Leu Phe Val Asp
1
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>8
His Phe Cys Trp Trp
1 5
<210>9
<211>4
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>9
Tyr Met Tyr Trp
1
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>少棘巨蜈蚣（Scolopendra subspinipes mutilans）
<400>10
His His Ile Gly Ser
1 5

Claims (3)

1.一种抗肿瘤多肽，其特征是，包括如下氨基酸序列的多肽，氨基酸序列为：NKRAQNHYCKEH。
2.一种如权利要求1所述的蜈蚣提取多肽在制备抗肿瘤药物方面的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肝肿瘤。
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