CN103421874B - 一种功能性小米糠多肽的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种功能性小米糠多肽的制备方法，该功能性小米糠多肽可在制备抗肝损伤保健食品和抗肿瘤药物中应用。该方法是以小米糠为原料，用浸提法得到清蛋白，经超滤或透析除杂后，分别采用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶和胃蛋白酶、537酸性蛋白酶和胃蛋白酶三种双酶水解方式水解小米糠清蛋白，水解液经灭酶、离心后，得到三种小米糠多肽。将获得的多肽用截留分子量为1000Da的超滤膜进行超滤，得到三种分子量＜1000Da的小米糠多肽，试验表明，这3种多肽抗肝损伤及抑制肿瘤生长作用显著。受试人每天摄入该小米糠多肽10-30g，无任何副作用，可应用于保肝的保健食品和抗肿瘤的药物中。

Description

一种功能性小米糠多肽的制备和应用

技术领域

本发明涉及小米糠深加工，具体涉及功能性小米糠多肽的制备方法，该功能性小米糠多肽可在制备抗肝损伤保健食品和抗肿瘤药物中应用。

背景技术

小米糠是小米加工过程中的副产品，其中含有丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维、B族维生素、VE和矿物质等营养素。我国是世界上最大的小米生产国家，大部分小米糠被低效利用，主要是用作饲料，或是废料处理。近年来,植物多肽的生理功能受到越来越多的重视。大量研究结果表明,植物蛋白利用特定的蛋白酶，在一定条件下水解后，可以得到不同的保健功能。我国对小米糠的深加工还处于初级阶段，如果将小米糠中的蛋白加工成功能性多肽，可以大大提高小米糠的经济效益和利用率，并减少浪费与污染。但是目前对小米糠蛋白和多肽的研究很少，尚未见以小米糠清蛋白为原料研制抗肝损伤和抗肿瘤多肽的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种功能性小米糠多肽的制备方法，该功能性小米糠多肽可在制备抗肝损伤保健食品和抗肿瘤药物中应用。

本发明提供的一种功能性小米糠多肽的制备方法，包括如下步骤：

1.取脱脂米糠，加入8-12倍重量的纯水，按米糠重量的0.5-3％分别加入植酸酶和单宁酶，pH调至3.5-5.0，35-55℃水浴7-12h后，高温灭酶，冷却至室温；pH调至6.5-7.5，置于45-55℃水浴提取4-6h；然后3500r/min离心15min，收集上清液；

2.上清液用截留分子量为7000Da透析膜或超滤膜，透析或超滤，除去灰分等小分子杂质，得到小米糠清蛋白；

3.在小米糠清蛋白中加入木瓜蛋白酶，酶解温度40-55℃、pH5.5-7.5，时间2-5h；（或在小米糠清蛋白中加入枯草杆菌中性蛋白酶，酶解温度35-50℃、pH5.0-7.0、时间3-6h；或在小米谷糠清蛋白中加入537酸性蛋白酶，酶解温度30-45℃、pH3.0-5.0、时间2.5-4.5h；）灭酶、冷却后，再加入胃蛋白酶，酶解温度30-45℃、pH1.5-4.0、时间0.5-3h，得酶解液；

4.将酶解液灭酶、离心、微滤后，利用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，收集滤出液，浓缩干燥后，得小分子小米糠多肽。

本发明制得的小米糠多肽可以在制备抗肝损伤及癌前病变保健食品中应用，试验结果表明，5g、10g/Kg·d剂量的小分子小米糠多肽对小鼠肝损伤及癌前病变具有明显效果；

也可以在制备抗肿瘤药物中应用。试验结果表明，5g、10g/Kg·d剂量的小分子小米糠多肽对H₂₂肿瘤细胞都有显著的抑制作用，抑瘤率分别为42.7%、51.6%，直接反映了小米谷糠多肽的抗肿瘤作用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1.由于小米糠含有植酸盐和单宁类物质，小米糠中的蛋白质分子与植酸结合，形成不溶性蛋白质―植酸复合体；而单宁类物质会使可溶性蛋白结合，成为不可溶性蛋白。植酸酶和単宁酶通过水解植酸和单宁类物质，释放出大量水溶性蛋白质，有利于增加蛋白溶解性和小米糠多肽的得率。

2.本发明采用复合蛋白酶水解，先用一种蛋白酶进行一次水解，再用胃蛋白酶进行二次水解。这种复合酶水解可大大提高1000Da以下小分子肽所占比例，达到80%以上；有研究表明，多数抗肝损伤和抗肿瘤寡肽分子量在200-1000Da，如谷胱甘肽、酪丝亮肽等。

3.任何蛋白进入人体后，都要经过胃蛋白酶水解；一些具有生物活性的蛋白经过胃蛋白酶水解大多会失去活性。本发明的3种抗肿瘤米糠多肽均经过胃蛋白酶水解，该多肽进入人体后稳定性提高，制成抗肝损伤保健食品或抗肿瘤药物后，可以保证其在胃液中的稳定性。

4.利用截留分子量为1000Da的超滤膜对小米糠多肽进行超滤，可以将具有抗肝损伤和抗肿瘤作用的小米糠多肽滤出，得到抗肝损伤和抗肿瘤效果显著的多肽。

5.本发明比较了多种蛋白酶水解小米糠清蛋白得到的不同的多肽，分别用体外MTT分析各多肽的抗肿瘤活性。结果发现，多数多肽没有抗肿瘤作用。只有用木瓜蛋白酶+胃蛋白酶、枯草中性蛋白酶+胃蛋白酶和537酸性蛋白酶+胃蛋白酶3组复合酶水解、分离得到的＜1000Da的小米糠多肽具有明显的抗肿瘤作用；由此可见，特定的蛋白酶在一定条件下对小米糠清蛋白的特定肽链位点进行剪切，才可能得到具有明显抗肿瘤作用的多肽分子。

说明书附图

图1小分子小米糠多肽与模型组的肝脏组织切片对比图

其中：A基础组；B模型组；C小分子小米糠多肽低剂量组；D小分子小米糠多肽高剂量组

具体实施方式

实施例1

取1kg脱脂米糠为原料，加入8L的纯水，pH调至3.8，加入15g植酸酶和10g单宁酶，温度45℃，水浴12h，进行高温灭酶，灭酶后迅速冷却至室温,pH调至6.5，置于45℃水浴提取6h。3500r/min离心15min，收集上清液，利用7000Da透析膜将小米谷糠清蛋白透析24h，得到小米糠清蛋白,先利用木瓜蛋白酶在酶添加量3000U/g、50℃、pH6.5条件下水解3.5h，高温灭酶冷却后，胃蛋白酶在酶添加量500U/g、30℃、pH1.5条件下水解2.5h，将水解液高温灭酶、离心、微滤后，选取截留分子量为1000Da的超滤膜对小米糠多肽进行超滤，收集滤出液，浓缩干燥后得到小分子小米糠多肽。

取昆明小鼠，分为基础组、阳性对照组（环磷酰胺）、模型组（氨基比林-亚硝酸钠）、小分子小米糠多肽高、低剂量组（10g、5g/Kg·d），试验结束后，测定各组小鼠血清ALT、r-GT活性以及肝组织MDA含量和GSH-Px活性，并观察各组小鼠肝脏病理变化。试验结果表明该小分子小米糠多肽具有抗肝损伤及抑制癌前病变的作用。见表1及附图。

表1小分子小米糠多肽对小鼠血清、肝脏指标的影响

注：a指与模型组相比，差异显著（P＜0.05）；b指与模型组相比，差异极显著（P＜0.01）。

通过MTT体外试验可知，分子量＜1000的小分子小米糠多肽对S₁₈₀、H₂₂肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用。由图1可知，基础组小鼠肝细胞大小均匀，分布规则，无坏死或变性。模型组小鼠肝细胞有明显的变性与增生现象，肝细胞出现异常增生。小分子小米糠多肽组肝细胞病变性质与模型组相比，其病变程度明显减轻，增生程度减小，未见大片的坏死细胞，且高剂量组效果更加显著。

选36名有肝硬化疾病的患者，每天饮用浓度为10mg/mL的小分子小米糠多肽20-30mL。试食结束后，测量试食人群的血压、心率均无异常无任何体征不适，绝大多数患者的病情均有不同程度的减轻。综上，表明小分子小米糠多肽可作为一种抗肝损伤的保健食品。

实施例2

取1kg脱脂米糠，加入10L纯水，pH调至4.0，加入20g植酸酶，5g单宁酶，温度50℃水浴8h后，高温灭酶后迅速冷却至室温,pH调至7.0，置于53℃水浴提取4h。3500r/min离心15min，收集上清液，使用7000Da超滤膜将小米糠清蛋白超滤，得到小米糠清蛋白,先利用枯草杆菌中性蛋白酶在酶添加量2500U/g、45℃、pH6.5条件下水解5h，高温灭酶冷却后，胃蛋白酶在酶添加量700U/g、37℃、pH2.2条件下水解1h，将水解液高温灭酶、离心、微滤后，选取截留分子量为1000Da的超滤膜对小米谷糠多肽进行超滤，收集滤出液，浓缩干燥后得到小分子小米糠多肽。

取昆明小鼠，分为基础组、H₂₂肿瘤模型组、环磷酰胺阳性对照组、小米糠多肽组（饲料添加5g、10g/Kg·d），每组10只小鼠。试验结束后，测量瘤直径，眼眶取血计数白细胞数；计算抑瘤率、免疫器官指数。试验期间测定血清溶血素以及迟发型免疫变态反应的指数--小鼠耳廓肿胀度。

试验结果表明，小分子小米糠多肽高、低剂量对H₂₂肿瘤细胞都有显著的抑制作用，抑瘤率分别为42.7%、51.6%，直接反映小米谷糠多肽的抗肿瘤作用。小米糠多肽组与模型组相比（见表2），可显著增加小鼠的脾脏指数、胸腺指数（P＜0.05），说明小米谷糠多肽可显著增强非特异性免疫能力。血清溶血素检测和迟发型免疫变态反应试验结果表明，小米糠多肽组的体液免疫和细胞免疫指数显著提高（P＜0.05）。说明小米谷糠多肽可以通过增强机体的免疫功能来提高抗肿瘤能力。

表2小分子小米糠多肽对H₂₂肿瘤的抑制作用

注：a指与模型组相比，差异显著（P＜0.05）；b指与模型组相比，差异极显著（P＜0.01）。

实施例3

取1kg脱脂米糠，加入12L纯水，pH调至4.5，加入25g植酸酶和7g单宁酶，温度55℃水浴10h后，高温灭酶后迅速冷却至室温,pH调至7.5，置于50℃水浴提取5h。3500r/min离心15min，收集上清液，使用7000Da超滤膜将小米糠清蛋白超滤，得到小米糠清蛋白,先利用537酸性蛋白酶在酶添加量2500U/g、40℃、pH3.5条件下水解4h，高温灭酶冷却后，胃蛋白酶在酶添加量300U/g、35℃、pH3.0条件下水解2h，将水解液高温灭酶、离心、微滤后，选取截留分子量为1000Da的超滤膜对小米糠多肽进行超滤，收集滤出液，浓缩干燥后得到小分子小米糠多肽。

取昆明小鼠，建立二甲基苯蒽/巴豆油诱导的皮肤乳头瘤动物模型。将小鼠随机分为基础组、肿瘤模型组、环磷酰胺阳性对照组（20mg/kg·d）、小分子小米糠多肽高、低剂量组（10g、5g/Kg·d），每组10只鼠。连续给药90d。试验表明，小分子小米糠多肽对小鼠皮肤乳头瘤有显著抑制作用（P＜0.05，见表3），小分子小米糠多肽高、低剂量组的抑瘤率分别为78.64%和71.29%，可见小分子小米糠多肽有显著的抗肿瘤作用。

表3小分子小米糠多肽对小鼠皮肤乳头状瘤的影响

注：a指与模型组相比，差异显著（P＜0.05）；b指与模型组相比，差异极显著（P＜0.01）。

Claims (5)

1.一种功能性小米糠多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取脱脂米糠，加入8-12倍重量的纯水，按米糠重量的0.5-3％分别加入植酸酶和单宁酶，pH调至3.5-5.0，35-55℃水浴7-12h，95-100℃高温灭酶，冷却至室温；pH调至6.5-7.5，置于45-55℃水浴提取4-6h；然后3500r/min离心15min，收集上清液；

(2)上清液用分子截流量7000Da透析膜或超滤膜，透析或超滤，除去灰分小分子杂质，得到小米糠清蛋白；

(3)在小米糠清蛋白中加入木瓜蛋白酶，酶解温度40-55℃、pH5.5-7.5，时间2-5h；灭酶、冷却后，再加入胃蛋白酶，酶解温度30-45℃、pH1.5-4.0、时间0.5-3h，得酶解液；

(4)将酶解液灭酶、离心、微滤后，利用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，收集滤出液，浓缩干燥后，得小分子小米糠多肽。

2.一种功能性小米糠多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取脱脂米糠，加入8-12倍重量的纯水，按米糠重量的0.5-3％分别加入植酸酶和单宁酶，pH调至3.5-5.0，35-55℃水浴7-12h，95-100℃高温灭酶，冷却至室温；pH调至6.5-7.5，置于45-55℃水浴提取4-6h；然后3500r/min离心15min，收集上清液；

(2)上清液用分子截流量7000Da透析膜或超滤膜，透析或超滤，除去灰分小分子杂质，得到小米糠清蛋白；

(3)在小米糠清蛋白中加入枯草杆菌中性蛋白酶，酶解温度35-50℃、pH5.0-7.0、时间3-6h；灭酶、冷却后，再加入胃蛋白酶，酶解温度30-45℃、pH1.5-4.0、时间0.5-3h，得酶解液；

(4)将酶解液灭酶、离心、微滤后，利用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，收集滤出液，浓缩干燥后，得小分子小米糠多肽。

3.一种功能性小米糠多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取脱脂米糠，加入8-12倍重量的纯水，按米糠重量的0.5-3％分别加入植酸酶和单宁酶，pH调至3.5-5.0，35-55℃水浴7-12h，95-100℃高温灭酶，冷却至室温；pH调至6.5-7.5，置于45-55℃水浴提取4-6h；然后3500r/min离心15min，收集上清液；

(2)上清液用分子截流量7000Da透析膜或超滤膜，透析或超滤，除去灰分小分子杂质，得到小米糠清蛋白；

(3)在小米谷糠清蛋白中加入537酸性蛋白酶，酶解温度30-45℃、pH3.0-5.0、时间2.5-4.5h；灭酶、冷却后，再加入胃蛋白酶，酶解温度30-45℃、pH1.5-4.0、时间0.5-3h，得酶解液；

(4)将酶解液灭酶、离心、微滤后，利用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，收集滤出液，浓缩干燥后，得小分子小米糠多肽。

4.如权利要求1或2或3所述的一种功能性小米糠多肽的制备方法制得的小米糠多肽在制备抗肝损伤保健食品中的应用。

5.如权利要求1或2或3所述的一种功能性小米糠多肽的制备方法制得的小米糠多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。