CN104745677A - 大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的aflp指纹图谱构建 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，属于大豆疫霉菌变异的检测领域，采用大豆疫霉菌对甲霜灵的抗药性稳定突变体，进行AFLP指纹图谱构建并获得特异性条带，通过构建的大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱，提供一种有效的持久性抗病品种。

Description

大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建

【技术领域】

本发明涉及大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建。 

【背景技术】

大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)可引起大豆生产中危害极严重的大豆疫霉根腐病，是中国对外公布的I类危险性检疫对象，也是内检对象。大豆疫病已成为我国大豆生产上的突出问题，给我国的大豆生产带来严重的经济损失。 

大豆疫霉菌为土传真菌，但病菌寄生性强，不能在土壤颗粒上竞争生长和定殖，卵抱子在植株病残体和土壤中能存活多年。大豆疫霉菌在利马豆、玉米粉、V₈汁等培养基上生长较快，菌落均匀，边缘整齐。菌丝宽3～9μm，易卷曲；菌丝体珊瑚状，分枝近直角，在分枝基部稍绕缩，老熟后产生隔膜；菌丝可形成结节状、膨大体和厚垣抱子。孢囊梗简单，顶生游动孢子囊；游动孢子囊倒梨形和椭圆形，无乳突；游动抱子卵圆形，一端或两端钝圆，侧面平滑，有两根鞭毛。周肇惠等研究证实卵孢子只产生于带菌种子的种皮，检测大豆种皮存在卵孢子与否可以作为大豆种子带菌检测方法之一。1957年，Bemard发现了大豆对大豆疫霉菌存在抗性分化。1959年Hildebrand发现不同大豆疫霉菌分离物在毒力上有差异，认为大豆疫霉菌存在生理株系。1965年Morgan和Hartwig首次报道了大豆疫霉菌的生理专化型，描述为1号和2号小种。1963年育成了含有单抗性Rps-I的大豆商业品种，此后的十年间抗病品种在美国北部地区广泛推广种植，大豆疫霉根腐病得到了基本控制。但正是由于这些抗病品种的广泛应用，对病原菌造成相对高的选择压，加速了大豆疫霉菌的毒力分化。1972年，schmitthenner在美国北部地区发现对当时推广的带有抗病基因的品种Harosoy63具有毒力的分离物，并定名为3号小种，随后4～9号小种也相继在北部地区和加拿大被鉴定。此后，在中国农业科学院硕士学位论文第一章引言抗病品种一小种互作下新的大豆疫霉菌生理小种便不断，其变异速度远远高于从1号、2号小种到3号小种的变异。有研究认为，在土壤中还可能存在更为丰富的生理小种多样性，由于田间种植品种的同质性较高，存在于土壤中的许多小种尚不能通过田间发病植株的分离来进行检测。大豆疫霉菌是具有寄主专化性的致病菌。已有的研究表明，大豆疫霉菌与大豆品种之间的互作具有基因对基因的特征。在与寄主抗病性互作中，大豆疫霉菌毒力也在演变和快速进化，新的生理小种不断出现，而且在大豆抗病性利用越多的地区，大豆疫霉菌的毒力变异就越快。至2000年，通过在13个大豆疫霉菌生理小种鉴别寄主上接种鉴定，国际上已报道了63个大豆疫霉菌生理小种，许多研究者还报道了更多的毒力基因类型。事实上，一些研究者己直接从土壤中分离鉴别出许多新生理小种。 大豆疫霉菌分离物在实验室条件下，经过长时间的保存，也会在致病毒性上发生变异，产生新生理小种。 

目前，防治大豆疫病主要是通过选用抗病品种和使用化学药剂。使用抗病品种是最经济，有效的防治途径。但是，目前培育的抗病品种大多为单基因控制的垂直抗性，生产中缺乏有效的持久性抗病品种；同时大豆疫霉菌的变异常导致抗病品种抗性的丧失，而且目前在商业上推广使用的农艺性状好的品种大多都是感病品种，这些因素的存在给大豆抗病品种的培育和推广带来了困难。因此，化学药剂防治在大豆疫病的防治中占有重要地位。目前大豆疫病已成为我国大豆生产上的突出问题，给我国的大豆生产带来严重的经济损失。 

甲霜灵(Metalaxyl)属于苯酰胺类内吸杀菌剂，具有低毒、高效和持效期长等特性，尤其对卵菌纲中的霜霉属、疫霉属和腐霉属的病原菌具有很强的活性。已被广泛应用于包括大豆疫霉菌在内的卵菌所致植物病害的防治。但随着甲霜灵的普遍使用，病原菌的抗药性问题接踵而来，病原菌的抗药性发展速度非常之快，使得病原菌对甲霜灵的抗药性问题在同类杀菌剂中也显得最为突出。实验表明在甲霜灵的压力下，我国大豆疫霉菌在田间可能产生抗性突变体，存在产生抗性群体的风险。到目前为止，已经有许多研究方法用于大豆疫霉菌的检测鉴定，但现有的大豆疫霉菌检测技术存在许多不足之处，主要是检测的灵敏度和准确性低，检测时间长，不适应检疫部门特别是口岸快速检测的要求，也无法通过建立抗性监测体系来指导生产实践。 

迄今为止，植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征，大豆疫霉菌也不例外。传统的大豆疫霉的检测方法是通过分离培养、显微镜观察形态及简单的生理性状测定来实现。然而由于形态特征容易受到培养条件和其它因素的影响，而且许多子实体类型经常难以获得，故给鉴定工作带来困难。大豆疫霉菌生长缓慢，以卵孢子存在于土壤中，条件适宜时萌发产生游动孢子侵染大豆根系导致根部腐烂。由于患病部位经常感染其它大豆根腐病菌和腐生菌，因此分离培养和纯化有一定难度，一般采用的病土中种植感病的品种或用叶碟法诱捕土壤中的病菌游动孢子，然后用含有多种抗菌素的培养基从发病的植株或叶碟中分离并纯化病原菌。上述方法虽然可以有效检测大豆疫霉菌，但所需时间长、程序繁琐、灵敏度低。 

随着血清学技术和核酸技术的研究及应用，使真菌检测鉴定方法在快速、灵敏方面有了更大发展。近年来，有关利用血清技术检测疫霉菌(包括大豆疫霉菌)的报道较多，但血清学方法在实际应用时则有很多困难，主要是多克隆抗体抗血清效价不高、特异性不强，很难达到实际应用水平；单克隆抗体又过于单一(可能是属级水平，也可能是种级水平甚至生理 小种级水平)，在实际应用时可能会出现漏检现象，难于应用。 

【发明内容】

本发明的目的是提供一种检测大豆疫霉菌变异的检测方法和技术。 

为实现上述目的，本发明提供了一种大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，、采用大豆疫霉菌对甲霜灵的抗药性稳定突变体，进行AFLP指纹图谱构建并获得特异性条带； 

抗药性稳定突变体的筛选采用：甲霜灵驯化诱导，甲霜灵直接诱变和EMS化学诱变，将获得的抗甲霜灵突变体进行稳定性分析并测定其对甲霜灵的抗性水平； 

AFLP指纹图谱的构建包括下述步骤：利用优化体系引物组合构建诱导钱的野生菌株和诱导后的抗性菌株不同引物组合的DNA指纹图谱，获得特异性条带。 

本发明提供的大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，其中，抗药性稳定突变体的筛选方式为： 

甲霜灵驯化诱导：将供试菌株置于胡萝卜琼脂培养基(CA)上，25℃、黑暗培养6-8d，然后移入含有0.1μg／mL甲霜灵的CA平板上，8d后将在含甲霜灵平板上生长相对较快的菌丝块转移至含有相同含量的甲霜灵平板上，以后每隔8d转1次，并逐渐增大甲霜灵的含量，直至能在含10μg／mL甲霜灵的CA平板上生长，从而获得驯化抗性突变菌株； 

甲霜灵抗性突变株的直接诱导：将供试菌株置于CA平板上，25℃、黑暗培养6-8d，然后移入含有甲霜灵0.1μg／mL的CA上，每培养皿接种4块，每菌株接种10个培养皿，接种后的培养皿用封口膜封口，置25℃黑暗培养，3d后每隔1d观察菌丝块生长情况。将各菌株菌丝块边缘产生的快速生长角变区分别移至含甲霜灵0.1μg／mL的CA上，能较好生长的菌株即可能为突变菌株，直至找到能在含10μg／mL甲霜灵的CA平板上生长的抗性菌株为止； 

甲霜灵抗性突变株的化学诱导采用甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变剂处理大豆疫霉菌游动孢子悬浮液，然后涂布在含甲霜灵的CA培养基上，筛选抗性突变体。 

本发明提供的大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，其中，AFLP指纹图谱的构建按如下步骤进行： 

1.提取抗性突变菌株DNA，制备高纯度DNA样品备用； 

1)酶切连接：反应体系50μL：DNA50ng，EcoR I12U，Mse I10U，BSA1.2μg，NEB Buffer；加入10μL连接混合液：EcoR I接头5pmol和Mse I接头50pmol，ATP10pmol，T4DNA连接酶3U，充分混匀离心，分别37℃水浴6h； 

2)预扩和选扩：取5μL连接后的DNA样品，加入15μL预扩增混合液：EcoR I预扩引物 和Mse I预扩引物各75ng，1×PCR Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混匀后，94℃30s，56℃30s，72℃60s，循环30个；取5μL预扩增稀释产物，加入15μL选择性扩增混合液：dNTP4nmol，引物混合液0.5μL，Taq酶0.5U，1×PCR Buffer，混匀后，94℃30s，65℃30s，72℃60s，12个循环后变为：94℃30s，56℃30s，72℃60s，23个循环；加入20μL Loading Buffer，混匀后，95℃变性5min，冰浴冷却，聚丙烯酰胺胶电泳、数据分析；其中所述的连接混合液指的是：EcoR I和Mse I接头各25pmol，ATP1nmol，T4DNA连接酶2U，1×Reaction Buffer； 

预扩增混合液我：EcoR I预扩引物和Mse I预扩引物各75ng，1×PCR Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混匀； 

选择性扩增混合液指的是：dNTP4nmol，引物混合液0.5μL，Taq酶0.5U，1×PCR Buffer； 

预扩增稀释产物指的是：取5μL步骤(1)连接后的DNA样品，EcoR I预扩引物和Mse I预扩引物各75ng，1×PCR Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混匀后，94℃30s，56℃30s，72℃60s，循环30个，反应所得； 

EcoR I预扩引物和Mse I预扩引物序列为： 

EcoR I预扩引物序列：5′-CTCGTAGACTGCGTACCC-3′NO1 

EcoR I预扩引物序列：5′-CATCTGACGCATGGTTAA-3′NO2 

Mse I预扩引物序列：5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′NO3 

Mse I预扩引物序列：5′-TACTCAGGACTCAT-3′NO4 

引物混合液指的是EcoR I引物1μl，Mse I引物1μl； 

ISSR反应体系20μl：10×Buffer2μl，20mM的dNTPs2μl，2U／μl的Taq酶1μl，模板DNA1μl，20mM的Mg2+3μl，4pmol／μl的引物1.25μl；94℃预变性5min；94℃1min，52℃1min，72℃1.5min40次循环，72℃5min，4℃保存，取8μl扩增产物于2.5％的琼脂糖凝胶上电泳、数据分析； 

所述引物指的是下面任意一种： 

其中的Y代表C或T； 

SSR共显性标记： 

反应体系25μl：ddH2O12.5μl，10×Buffer2.5μl，2mM的dNTPs2.5μl，25mM的Mg2+1.75μl， 2U／μl的Taq酶0.75μl，20ng的模版DNA1μl，上游引物2μl，8pmol／μl的下游引物2μl；94.0℃5min；94.0℃1min，58.0℃1min，72.0℃1min，35个循环，72.0℃5min，4℃保存，取8μl扩增产物于2.5％的琼脂糖凝胶上电泳、数据分析； 

所述上游引物指的是NO13～20任意一个；下游引物指的是NO21～28任意一个，且上游引物与下游引物一一对应： 

遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。遗传标记可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。在作物育种中通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行跟踪选择。在现代分子育种研究中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段。遗传标记可以分为形态标记、细胞学标记、蛋白质标记和DNA标记。基于PCR和限制性酶切技术相结合的分子标记。这类标记可分为两种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，主要包括AFLP标记。 

AFLP标记技术 

AFLP分析技术(Amplified Fragment Length polymoplvism)是由Zabeau等于1992年发明并由vos等发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。由于结合了RFLP和RAPD的技术优势，AFLP兼具了稳定性强和灵敏度高的特点，同时也因为它丰富的多态信息量(polymorphism information contents，PIC)和易操作性而被广泛用于DNA指纹分析、遗传图谱构建、品种资源鉴定、标记辅助育种和基因鉴定和克隆等方面，是近几年发展最快的DNA分子标记技术。 

AFLP的基本原理是选择性扩增基因组DNA的酶切片段而产生多态性，选择性扩增是通过在引物末端加上选择性核苷酸实现的。基因组DNA经两种可产生粘性末端的限制性内切酶切割形成大小不同的限制性片段，然后针对限制性内切酶设计的双链接头连接到限制性片段的末端，已知的接头序列和相邻的限制性位点修饰序列成为专用引物的结合位点。引物由三部分组成：一为核心碱基序列(core sequence，CORE)。该碱基序列与人工接头互补；二为特异性酶切序列(enzyme specifics sequence，ENZ)；三为引物3′端的选择性碱基延伸序列(selective extension，EXT)，该序列由几个(1-3bp)碱基组成。选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段被扩增。PCR反应产物最终经变性聚丙烯酸胺凝胶电泳进行分辨。由此可见，AFLP提示的DNA多态性取决于采用的内切酶及引物3′端选择碱基的种类、数目和所研究的基因组的复杂性。通过改变限制性酶的种类以及3′端的选择碱基种类与数目，就可以调节AFLP产物的条带的特异性和数量。在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中扩增得到大量的片段。AFLP产物需要使用同位素或非同位素标记(如荧光标记)来检测。 

利用分子生物学技术，不同国家的研究人员自20世纪90年代以来开展了大豆疫霉菌的分子研究，并获得了许多重要进展。whisson等研究了收集自澳大利亚和北美地区的大豆疫霉菌菌株间的遗传关系。用来自大豆疫霉基因的10个多拷贝探针对经8种内切酶处理的供试菌株的总DNA进行RPLP分析。结果发现澳大利亚和北美地区的大豆疫霉菌菌株间的遗传距离较小，认为两地的菌株演化自共同的祖先。Forster等利用RFLP分析研究了大豆疫霉菌生理小种的产生机理，认为在种植含有Rps抗性基因大豆品种田内，少量1号小种株系的专化性非毒力基因发生突变，这些株系具有选择优势，从而产生一些与1号小种分离物具有相同或几乎相同的核RFLPs模式但具有不同毒力基因的新小种。Drenth等利用RFLP技术对澳大利亚大豆疫霉菌的5个生理小种的进化进行研究，发现所有小种产生相同RFLP模式，认为新小种是从一个共同遗传背景株系通过突变而产生。Meng等利用RAPD技术对来自美国不同地区的55个大豆疫霉菌土壤和植株分离物进行分析，发现同一小种内的不同分离物存在明显的差异。 这些研究结果表明在大豆抗性基因选择压力下产生突变(无性繁殖进化)是大豆疫霉菌产生新生理小种的重要机制。此外，Forster等1994年的研究结果还表明一些相同生理小种分离物之间具有很大的遗传变异，认为除了无性繁殖进化外，偶尔的异型间杂交也是大豆疫霉菌新小种产生的重要机制。王化波等利用RAPD技术分析大豆疫霉菌的遗传多样性，在对我国7省的75个大豆疫霉菌分离物和11个美国标准生理小种菌株进行RAPD指纹分析，发现病原分离物间的遗传相异系数在0.047-0.390之间，中国菌株具有丰富的DNA多态性，与中国菌株相比，美国菌株间RAPD连锁距离较近。激发子(Elicitor)是一类能诱导寄主植物产生防卫反应的特殊化合物，而激发素(Elicitin)则是一类由疫霉属(Phytophthora)等真菌所分泌的分子量约为10kb、由98个氨基酸组成的蛋白类激发子，用低浓度的Elicitins处理茄科、十字花科等多种植物可诱导产生过敏性反应(Hypersensitive Response，HR)，并使植物获得对病原物的系统抗病性(system Aquired Resistance，SAR)。大豆疫霉菌的Elicitin家族由至少九个基因组成，其中预先报道相似的Elicitin(SODA-2，SOJB，SoJ2，SOB，SOJ5，SOJ6和SOJ7)和高度变异的已知序列(SOJX和SON)，其中SODA-2，SOJB，SOJ2，SOB，SOJ5，SOJ6和SOJ7都具有一个主导信号序列和激发子中心区域，有5个(SOJZ，SOB，SOJ6，SOJX和SON)具有C末端亲水区域，而SOJX和SON具有C末端疏水区域。除了SOJX和SON，所有Elicitin蛋白区域都导致产生过敏性反应。在侵染期间SODA-2，SOJB，SOJ2，SOB和SOJ6呈指数生长，在孢子状态时则不是。所有研究表明大豆疫霉菌的Elicitin家族大而且分化，改变着模式、表达方式和诱导产生过敏性反应。陈庆河等从福建省大豆根腐病株上分离的疫霉菌株，使用传统方法及DNA-ITS序列分析，分离的菌株与大豆疫霉的ITS序列同源性为99.8％，证明该菌为大豆疫霉菌，这是首次在福建发现分离到大豆疫霉菌和国内用分子技术检测大豆疫霉的先例。 

【附图说明】

图1是大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法流程图。

【具体实施方式】

实验材料准备过程 

1实验菌株 

1.1土壤菌株的分离 

1.1.1采集地点：黑龙江省大庆市林甸地区大豆疫霉菌发病地块。 

1.1.2采集方法： 

1.1.3病组织检查：将病组织剪成1cm的小块，置于10％的KOH水溶液中，室温下放置4h，病组织透明后剥开表皮，显微镜下观察组织内病原体。 

1.1.4土壤准备：将采集到的病土在室温下风干，碾碎，过筛(孔径2mm)，置于4℃ 冰箱内保存30～60d，使病土中的P.s以卵孢子的形态存在。 

1.1.5叶碟诱集法：供试叶碟为不舍Rps基因的美国品种叶碟。称取5g病土，5g灭菌砂混匀置50ml烧杯内，加水至饱和状态.24～26℃光照条件下保湿培养4～6d.加水过土面1cm，剪取直径为5咖大豆叶碟20片，置于水面，光照条件下诱集6～12h后取出叶碟用无菌水(SDW)中冲洗2～3次，放入装有SDW的培养皿内光照条件下培养2～3d后，吸取游动孢子悬浮液，涂于由PA与安比西林组成的半选择性培养基上，24～26℃黑暗条件下培养4～12h，显微镜下用接种针挑取含单个孢子的琼脂块转移到半选择性培养基上，25℃黑暗条件下继续培养，4～6d后继续转皿纯化。以叶碟被侵染率和诱集孢子囊数量来比较诱集效果。叶碟边缘有一个孢子囊或Ps的特征菌丝即认为该叶碟已被侵染。显徽镜下观察到的叶碟边缘孢子囊和孢囊梗的数量总和为诱集孢子囊数量。 

1.2供试培养基 

1.2.1胡萝卜琼脂(CA)：200g新鲜胡萝卜加适量蒸馏水用组织捣碎机捣碎，8层纱布过滤去掉残渣，滤液中加20g琼脂煮沸熔化，加蒸馏水补足至1000mL，分装，121℃高压灭菌30min。 

1.2.2胡萝卜液体培养基：200g新鲜胡萝卜加适量蒸馏水用组织捣碎机捣碎，8层纱布过滤去掉残渣，滤液中加加蒸馏水补足至1000mL，分装，121℃高压灭菌30min。 

1.3甲霜灵抗性突变株的诱导 

1.3.1甲霜灵驯化诱导：将供试菌株置于胡萝卜琼脂培养基(CA)上，25℃、黑暗培养6-8d，然后移入含有0.1μg／mL甲霜灵的CA平板上，8d后将在含甲霜灵平板上生长相对较快的菌丝块转移至含有相同含量的甲霜灵平板上，以后每隔8d转1次，并逐渐加大甲霜灵的含量，直至能在含10μg／mL甲霜灵的CA平板上生长，从而获得驯化抗性突变菌株。 

1.3.2甲霜灵抗性突变株的直接诱导：将供试菌株置于CA平板上，25℃、黑暗培养6-8d，然后移入含有甲霜灵0.1μg／mL的CA上，每培养皿接种4块，每菌株接种10皿；接种后的培养皿用封口膜封口，置25℃黑暗培养，3d后每隔1d观察菌丝块生长情况。将各菌株菌丝块边缘产生的快速生长角变区分别移至含甲霜灵0.1μg／mL的CA上，能较好生长的菌株即可能为突变菌株，直至找到能在含10μg／mL甲霜灵的CA平板上生长的抗性菌株为止。 

1.3.3甲霜灵抗性突变株的化学诱导采用甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变剂处理大豆疫霉菌游动孢子悬浮液，然后涂布在含甲霜灵的CA培养基上，筛选抗性突变体。 

1.4抗性突变菌株的抗性稳定性研究 

将获得的抗药突变菌株在无药CA平板上继代培养，每隔8d转移1次，连续转移5次， 在斜面上于10℃下保存30d后，转接到含甲霜灵的CA平板培养，选取抗药性稳定的突变体。 

1.5抗甲霜灵菌株的抗性水平测定 

参照高智谋等(1997)的方法，将抗性菌株分别接种于含有0，1，5，10，20，50，100，150，200，300，400μg／mL甲霜灵的CA平板上，置于25℃黑暗条件下培养，7d后测定菌落生长量，每个处理重复三次，求出抗性菌株的EC50，以野生型菌株Ps411为对照，然后按下式求出各抗性菌株的抗性水平。 

抗性水平(倍数)=抗性菌株的EC50／野生亲本菌株的EC50 

1.6DNA的提取与检测 

AFLP标记对模板DNA的纯度要求很高，对DNA的浓度要求不高。如果模板DNA中残存蛋白，将直接影响酶切的效果。本发明采用CTAB法： 

(1)2.0mL的离心管中加入约250mg研磨成粉的冻干菌丝； 

(2)加入800mL裂解液，同时加入80mLTris饱和酚，65℃水浴30min，期间摇动几次； 

(3)取出加入等体积氯仿，静置一会，离心13000rpm，10min，取上清液； 

(4)加入酚：氯仿：异戊醇抽提两次，13000rpm，5min，取上清液； 

(5)加入氯仿抽提两次，13000rpm，5min，取上清液； 

(6)加入等体积无水乙醇，-80℃冷却10min，离心13000rpm，10min，弃上清； 

(7)用70％乙醇及无水乙醇各洗一次； 

(8)干燥后溶于50μlddH₂O中4℃保存。 

提取的基因组DNA用1.2％-检测其完整性，并采用紫外分光光度法和λDNA法检测DNA的纯度与浓度，终浓度定位50ng／uL，用以做酶切连接。 

1.7酶切连接 

将终浓度为50ng／uL用做酶切连接，酶切连接体系详见表1。 

表1AFLP酶切连接(50μL体系) 

充分混匀离心，分别37℃水浴6h 

37℃水浴12h观察结果。 

Mseladapter和EcoRladapter引物均为宝生物公司合成。 

Mseladapter和EcoRladapter的序列如附录所示。 

1.8预扩增 

具体的体系筛选方案见表2。 

表2预扩增反应体系(20μL体系) 

引物为宝生物公司合成，Eoo和Moo的序列附录所示。 

分别把MgCL₂、dNTps设成不同浓度，筛选最佳体系。 

1.9预备扩增程序筛选 

设置三个扩增程序，以筛选效果最佳的程序，程序如下： 

表3预备扩增程序 

程序1、2、3第五步循环数分别是15、20和25。 

1.10选择性扩增 

1.10.1选择性扩增体系筛选 

选择性扩增体系筛选，具体的体系筛选方案见表4。 

表4选择性扩增体系(20μL体系) 

引物为宝生物公司合成，E₂和M₂的序列附录所示。 

1.10.2分别把MgCl₂、dNTPs设成不同浓度，筛选最佳体系。选择性扩增体系筛选 

在扩增体系一定的情况下，比较3套不同的扩增程序对扩增结果的影响，设置如下3套选择性扩增程序： 

表5选择性扩增体系 

程序1、2、3第五步循环数分别是15、20和25。 

1.11AFLP指纹图谱构建 

利用前面的优化体系及较好的引物组合构建诱导前的野生菌株和诱导后的抗性菌株不同引物组合的DNA指纹图谱，找到特异性条带。 

Claims (3)

1.大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，其特征在于采用大豆疫霉菌对甲霜灵的抗药性稳定突变体，进行AFLP指纹图谱构建并获得特异性条带；

所述抗药性稳定突变体的筛选采用：甲霜灵驯化诱导，甲霜灵直接诱变和EMS化学诱变，将获得的抗甲霜灵突变体进行稳定性分析并测定其对甲霜灵的抗性水平；

所述AFLP指纹图谱的构建包括下述步骤：利用优化体系引物组合构建诱导钱的野生菌株和诱导后的抗性菌株不同引物组合的DNA指纹图谱，获得特异性条带。

2.如权利要求1所述的大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，其特征在于：所述抗药性稳定突变体的筛选方式为：

所述甲霜灵驯化诱导：将供试菌株置于胡萝卜琼脂培养基(CA)上，25℃、黑暗培养6-8d，然后移入含有0.1μg／mL甲霜灵的CA平板上，8d后将在含甲霜灵平板上生长相对较快的菌丝块转移至含有相同含量的甲霜灵平板上，以后每隔8d转1次，并逐渐增大甲霜灵的含量，直至能在含10μg／mL甲霜灵的CA平板上生长，从而获得驯化抗性突变菌株；

所述甲霜灵抗性突变株的直接诱导：将供试菌株置于CA平板上，25℃、黑暗培养6-8d，然后移入含有甲霜灵0.1μg／mL的CA上，每培养皿接种4块，每菌株接种10个培养皿，接种后的培养皿用封口膜封口，置25℃黑暗培养，3d后每隔1d观察菌丝块生长情况。将各菌株菌丝块边缘产生的快速生长角变区分别移至含甲霜灵0.1μg／mL的CA上，能较好生长的菌株即可能为突变菌株，直至找到能在含10μg／mL甲霜灵的CA平板上生长的抗性菌株为止；

所述甲霜灵抗性突变株的化学诱导采用甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变剂处理大豆疫霉菌游动孢子悬浮液，然后涂布在含甲霜灵的CA培养基上，筛选抗性突变体。

3.如权利要求1所述大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，其特征在于所述AFLP指纹图谱的构建按如下步骤进行：

1.提取抗性突变菌株DNA，制备高纯度DNA样品备用；

1)酶切连接：反应体系50μL：DNA50ng，EcoR I12U，Mse I10U，BSA1.2μg，NEB Buffer；加入10μL连接混合液：EcoR I接头5pmol和Mse I接头50pmol，ATP10pmol，T₄DNA连接酶3U，充分混匀离心，分别37℃水浴6h；

2)预扩和选扩：取5μL连接后的DNA样品，加入15μL预扩增混合液：EcoR I预扩引物和Mse I预扩引物各75ng，1×PCR Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混匀后，94℃30s，56℃30s，72℃60s，循环30个；取5μL预扩增稀释产物，加入15μL选择性扩增混合液：dNTP4nmol，引物混合液0.5μL，Taq酶0.5U，1×PCR Buffer，混匀后，94℃30s，65℃30s，72℃60s，12个循环后变为：94℃30s，56℃30s，72℃60s，23个循环；加入20μL Loading Buffer，混匀后，95℃变性5min，冰浴冷却，聚丙烯酰胺胶电泳、数据分析；其中所述的连接混合液指的是：EcoR I和Mse I接头各25pmol，ATP1nmol，T4DNA连接酶2U，1×Reaction Buffer；

所述预扩增混合液我：EcoR I预扩引物和Mse I预扩引物各75ng，1×PCR Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混匀；

所述选择性扩增混合液指的是：dNTP4nmol，引物混合液0.5μL，Taq酶0.5U，1×PCR Buffer；

所述预扩增稀释产物指的是：取5μL步骤(1)连接后的DNA样品，EcoR I预扩引物和Mse I预扩引物各75ng，1×PCR Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混匀后，94℃30s，56℃30s，72℃60s，循环30个，反应所得；

所述EcoR I预扩引物和Mse I预扩引物序列为：

EcoR I预扩引物序列：5′-CTCGTAGACTGCGTACCC-3′NO1

EcoR I预扩引物序列：5′-CATCTGACGCATGGTTAA-3′NO2

Mse I预扩引物序列：5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′NO3

Mse I预扩引物序列：5′-TACTCAGGACTCAT-3′NO4

引物混合液指的是EcoR I引物1μl，Mse I引物1μl；

ISSR反应体系20μl：10×Buffer2μl，20mM的dNTPs2μl，2U／μl的Taq酶1μl，模板DNA1μl，20mM的Mg²⁺3μl，4pmol／μl的引物1.25μl；94℃预变性5min；94℃1min，52℃1min，72℃1.5min40次循环，72℃5min，4℃保存，取8μl扩增产物于2.5％的琼脂糖凝胶上电泳、数据分析；

所述引物指的是下面任意一种：

其中的Y代表C或T；

2.SSR共显性标记：

反应体系25μl：ddH₂O12.5μl，10×Buffer2.5μl，2mM的dNTPs2.5μl，25mM的Mg²⁺1.75μl，2U／μl的Taq酶0.75μl，20ng的模版DNA1μl，上游引物2μl，8pmol／μl的下游引物2μl；94.0℃5min；94.0℃1min，58.0℃1min，72.0℃1min，35个循环，72.0℃5min，4℃保存，取8μl扩增产物于2.5％的琼脂糖凝胶上电泳、数据分析；

所述上游引物指的是NO13～20任意一个；下游引物指的是NO21～28任意一个，且上游引物与下游引物一一对应：