CN110051698A - 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法 - Google Patents
基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110051698A CN110051698A CN201910205083.0A CN201910205083A CN110051698A CN 110051698 A CN110051698 A CN 110051698A CN 201910205083 A CN201910205083 A CN 201910205083A CN 110051698 A CN110051698 A CN 110051698A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probiotics
- primary
- enteron aisle
- microencapsulation
- escherichia coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
- A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造方法,主要是利用合成生物学的方法将筛选出的肠道原生大肠杆菌基因改造后进行微囊化处理。本发明将生物安全的合成生物学技术与无创伤式光遗传技术相结合应用于肠道疾病的治疗,相对于传统的肠道疾病治疗的方法而言具有诸多优势:对肠道原生大肠杆菌进行基因改造,提高了后期微囊化原生菌的肠道定植顺应性。本文以原生大肠杆菌分泌单一功能性生物活性分子——转换生长因子(TGF‑β1)为例,研究其在炎症性肠病(IBD)治疗方法的应用。为研究肠道微生物与机体互作提供了一种新思路。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及临床治疗领域,具体涉及一种基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法。
背景技术
肠道作为生物体最大的器官,在消化吸收、免疫调节等方面发挥了重要作用。肠道内除了发挥消化吸收、免疫调节功能的上皮细胞、免疫细胞之外,还包含了许多微生物。其中大于99.9%的微生物都是细菌,它们统称为肠道菌群。
肠道菌群作为生物体肠道的“共生体”,参加了许多重要生命过程及疾病的调控。现有研究肠道微生物与机体关系的方法多为利用无菌小鼠或广泛的菌群移植,结合微生物组学与代谢组学等分析,找到肠道微生物对于疾病的调控并精确到分子或基因靶点。但是无菌小鼠价格高昂,并且由于基因敲除后存在一定的免疫缺陷,不能完全满足研究需要。菌群移植存在移植周期长,定植效率低等问题。
我们从合成生物学的角度出发,筛选出小鼠肠道共生菌E.coli NGF-1,利用“光感启动子+功能分子”模式(pDawn-RGF-TGF-β1),利用光遗传手段调控黏连蛋白及转换生长因子的表达,以实现对肠道菌群的快速、精确的定植,并以转换生长因子为例,探究肠道微生物分泌单一元素对机体的影响。为了更加适合活体使用,加入的上转换微球将组织穿透性强的近红外光转换为肠道内局部的可见光,对肠道菌群的定植,乃至微生物对机体生物功能的研究起到了促进作用。
发明内容
本发明为解决背景技术中提出的技术问题,提供一种基于微囊化的肠道原生菌基因改造的方法。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法,利用合成生物学的方法将筛选出的肠道原生大肠杆菌基因改造后进行微囊化处理;
具体步骤如下
1)C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的筛选;
2)利用合成生物学的手段对原生大肠杆菌进行基因改造
(1)利用合成生物学的手段合成质粒系统:pDawn-RFP-TGF-β1;其中pDawn是蓝光响应启动子,是一段DNA序列。在接收到蓝光信号后,会启动下游基因RFP-TGF-β1的转录;RFP在转录后翻译成红色荧光蛋白,充当报告基因的功能;TGF-β1是转化生长因子,一种蛋白类的生物活性功能分子;
(2)利用化学诱导-CaCl2法将筛选出的原生大肠杆菌诱导成感受态;
(3)进行质粒转化,将光控质粒系统转化到原生大肠杆菌感受态内,通过观察荧光标签的表达来证明功能分子TGF-β1的表达;
3)将改造后的原生菌进行微囊化处理。
所述步骤1)具体为:
(1)取C57BL/6小鼠新鲜肠道组织于无菌EP管中;
(2)用提前预冷的无菌PBS冲洗肠道内容物;
(3)将肠道壁剖开后,用无菌载玻片剐取肠道内壁,将肠道内壁物与无菌预冷PBS质量体积比m/v=1:10混合后,漩涡震荡15min;
(4)将混合物4℃,2000rpm离心5min,弃去沉淀,将上清于4℃,12000rpm离心20min,弃去上清,留沉淀;
(5)将沉淀用100μL PBS重悬后,取10μL涂布于用于蓝白板筛选的固体LB平板上,37℃,过夜培养;
(6)第二天根据平板的生长情况,挑取蓝色菌落用于菌落PCR(菌落PCR的两对引物分别LaZ-YZ-F:AACGGGGGTACTGACGAAAC;LaZ-YZ-R:GAACCATCCGCTGTGGTACA),根据菌落PCR的目的条带大小,筛选出C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌。其中菌落PCR条带见图1。
所述步骤3)具体为:
(1)将海藻酸钠配成质量分数1-10%的溶液后进行灭菌处理,将培养至对数生长中期的原生大肠杆菌加入到经过灭菌处理的海藻酸钠溶液中,进行搅拌处理,作为制备微胶囊的内液;
(2)将二甲基硅油与CaCl2粉末共混后作为外液;
内液注射泵的流速为10uL/min,外液注射泵的流速为200uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接,即搭建微流控平台,生成的液滴用CaCO3的醋酸溶液收集,此时生成的原生菌微胶囊粒径为500um。
本发明有如下有益效果:
1.本发明在肠道疾病治疗操作简单,适用性强,成本低。并将“合成生物学-纳米技术-光遗传学”有机融合,开发了一套可实现菌群高效便捷定植、并能精确控制微生物单一分泌元素的生物安全的纳米光遗传系统。相比于口服化学药物治疗,利用微生物治疗具有更高效,治疗效果更好,特别适用于半衰期短的多肽、蛋白类药物。
2.相对于传统治疗IBD的方法而言,将这种基于微囊化肠道原生菌的IBD治疗方法,具有诸多优势:对筛选的肠道原生大肠杆菌进行改造,提高了后期微囊化原生菌肠道定植的生物顺应性。将合成生物学技术与光遗传技术相结合,实现了对治疗肠道疾病的生物活性分子在时空上的精确调控。以原生大肠杆菌分泌单一功能性生物活性分子——转换生长因子(TGF-β1)为例,研究其在炎症性肠病(IBD)治疗方法的应用。为研究肠道微生物与机体疾病的互作提供了一种新思路。
3.创新性的将“合成生物学-纳米技术-光遗传学”有机融合,开发了一套可实现菌群高效便捷定植、并能精确控制微生物单一分泌元素的生物安全的纳米光遗传系统。
4.利用对冲式玻璃微流控装置,借助于后续搭建的微流控平台,能够实现对微囊化益生菌及上转换水凝胶微球的批量化制备。
5.利用了合成生物学的安全、高效性,利用了光遗传学在时空上的精准性。相对于传统的治疗IBD的方法而言,提高了患者治疗顺应性,降低传统药物给予的胃肠道刺激。
6.为研究微生物与机体互作提供了一种新思路。
附图说明
图1:根据设计的引物,筛选的肠道原生菌的菌落PCR条带;
图2:质粒图谱pDawn-RFP-TGF-β1;
(a)TGF-β1的质粒图谱
(b)RFP的质粒图谱
图3:上转换微球引导的可视化肠道共生菌定植效率。
具体实施方式
为进一步说明本发明,现通过具体实施实例对本发明进行详细阐述。
实施例1
1)C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的筛选
①取C57BL/6小鼠新鲜肠道组织于无菌EP管中;
②用提前预冷的无菌PBS冲洗肠道内容物;
③将肠道壁剖开后,用无菌载玻片剐取肠道内壁,将肠道内壁物与无菌预冷PBS质量体积比m/v=1:10混合后,漩涡震荡15min;
④将混合物4℃,2000rpm离心5min,弃去沉淀,将上清于4℃,12000rpm离心20min,弃去上清,留沉淀;
⑤将沉淀用100μL PBS重悬后,取10μL涂布于用于蓝白板筛选的固体LB平板上,37℃,过夜培养;
⑥第二天根据平板的生长情况,挑取蓝色菌落用于菌落PCR(菌落PCR的两对引物分别是LaZ-YZ-F:AACGGGGGTACTGACGAAAC;LaZ-YZ-R:GAACCATCCGCTGTGGTACA),根据菌落PCR目的条带的大小,筛选出C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌。其中菌落PCR条带见图1。
2)利用合成生物学的手段对原生大肠杆菌进行基因改造
①利用合成生物学的手段合成一套质粒系统:pDawn-RFP-TGF-β1,其质粒图谱如图2;
②利用化学诱导-CaCl2法将筛选出的原生大肠杆菌诱导成感受态;
③进行质粒转化,将pDawn-RFP-TGF-β1光控质粒转化到原生大肠杆菌感受态内,通过观察红色荧光标签的表达来证明功能分子(TGF-β1)的表达。
3)将改造后的原生菌进行微囊化处理
①将海藻酸钠配成质量分数1%的溶液后进行灭菌处理,将培养至对数生长中期的原生大肠杆菌加入到经过灭菌处理的海藻酸钠溶液中,进行搅拌处理,作为制备微胶囊的内液;
②将二甲基硅油与CaCl2粉末共混后作为外液;
③内液注射泵的流速为10uL/min,外液注射泵的流速为200uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接,即搭建微流控平台,生成的液滴用聚四氟乙烯培养皿收集,此时生成的原生菌微胶囊粒径为500um。
效果试验:
将制备得到的微囊化原生菌结合无创式光遗传技术应用于肠道疾病的治疗。
(1)上转换光遗传微米级水凝胶颗粒的制备
①以PEGDA为交联剂、HMPP为光引发剂、PEG和TE buffer为填孔剂,配置成预聚液,将蓝色上转换颗粒加入到预聚液中,进行搅拌处理,作为制备光遗传颗粒的内液。二甲基硅油作为外液;
②内液注射泵的流速为40uL/min,外液注射泵的流速为800uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接,即搭建微流控平台,生成的液滴用聚四氟乙烯培养皿收集,此时生成的上转换水凝胶颗粒粒径为500um。
(2)C57BL/6小鼠IBD模型的建立
C57BL/6小鼠IBD造模前禁食24h,不禁水,称重后。3%的戊巴比妥腹腔注射麻醉(或乙醚),5%2、4、6-三硝基苯磺酸按100mg/kg-150mg/kg的比例注入小鼠肠道。小鼠体位为头朝下,用聚丙烯管插入肛门上端4cm,注射器注入,倒立三分钟左右,以防药液溢出。每隔三天灌肠一次,4次后可制成IBD模型鼠。
(3)微囊化原生菌在C57BL/6小鼠肠道内的定植及结合无创式光遗传技术缓解IBD小鼠炎症
将微囊化原生菌与上转换水凝胶颗粒混匀后,采取灌胃的方式注入到IBD模型鼠的消化道内。四小时之后,将小鼠麻醉处理,用近红外光脉冲式照射小鼠腹腔,连续照射一小时。连续照射七天后原生大肠杆菌可在小鼠肠道内稳定定植,发挥其相应的功能。组织穿透性强的近红外光穿透小鼠腹腔后,会激发上转换颗粒发出蓝光,蓝光响应的启动子感受蓝光后,启动下游基因的表达,其中功能因子——转换生长因子TGF-β1用于IBD小鼠炎症的缓解与治疗。相对于传统的化学药物治疗方式而言,借助于功能因子——转换生长因子TGF-β1胞外表达,显著提高了患者生物顺应性。
实施例2
1)C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的筛选
①取C57BL/6小鼠新鲜肠道组织于无菌EP管中;
②用提前预冷的无菌PBS冲洗肠道内容物;
③将肠道壁剖开后,用无菌载玻片剐取肠道内壁,将肠道内壁物与无菌预冷PBS质量体积比m/v=1:10混合后,漩涡震荡15min;
④将混合物4℃,2000rpm离心5min,弃去沉淀,将上清于4℃,12000rpm离心20min,弃去上清,留沉淀;
⑤将沉淀用100μL PBS重悬后,取10μL涂布于用于蓝白板筛选的固体LB平板上,37℃,过夜培养;
⑥第二天根据平板的生长情况,挑取蓝色菌落用于菌落PCR(菌落PCR的两对引物分别是LaZ-YZ-F:AACGGGGGTACTGACGAAAC;LaZ-YZ-R:GAACCATCCGCTGTGGTACA),根据菌落PCR目的条带的大小,筛选出C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌。
2)利用合成生物学的手段对原生大肠杆菌进行基因改造
①利用合成生物学的手段合成质粒系统:pDawn-RFP-TGF-β1,其质粒图谱见图2;
②利用CaCl2法将筛选出的原生大肠杆菌诱导成感受态;
③进行质粒转化,将光控质粒转化到原生大肠杆菌感受态内,通过观察荧光标签的表达来证明功能分子TGF-β1的表达。
3)将改造后的原生菌进行微囊化处理
①将海藻酸钠配成质量分数10%的溶液后进行灭菌处理,将培养至对数生长中期的原生大肠杆菌加入到经过灭菌处理的海藻酸钠溶液中,进行搅拌处理,作为制备微胶囊的内液;
②利用化学诱导-CaCl2法将筛选出的原生大肠杆菌诱导成感受态;
③内液注射泵的流速为10uL/min,外液注射泵的流速为200uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接,即搭建微流控平台,生成的液滴用聚四氟乙烯培养皿收集,此时生成的原生菌微胶囊粒径为500um。
效果试验:
将制备得到的微囊化原生菌结合无创式光遗传技术应用于肠道疾病的治疗。
(1)上转换光遗传微米级水凝胶颗粒的制备
①以PEGDA为交联剂、HMPP为光引发剂、PEG和TE buffer为填孔剂,配置成预聚液,将蓝色上转换颗粒加入到预聚液中,进行搅拌处理,作为制备光遗传颗粒的内液。二甲基硅油作为外液;
②内液注射泵的流速为40uL/min,外液注射泵的流速为800uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接,即搭建微流控平台,生成的液滴用聚四氟乙烯培养皿收集,此时生成的上转换水凝胶颗粒粒径为500um。
(2)C57BL/6小鼠IBD模型的建立
C57BL/6小鼠IBD造模前禁食24h,不禁水。称重后,3%的戊巴比妥腹腔注射麻醉(或乙醚),5%2、4、6-三硝基苯磺酸按100mg/kg-150mg/kg的比例注入小鼠肠道。小鼠体位为头朝下,用聚丙烯管插入肛门上端4cm,注射器注入,倒立三分钟左右,以防药液溢出。每隔三天灌肠一次,4次后可制成IBD模型鼠。
(4)微囊化原生菌在C57BL/6小鼠肠道内的定植及结合无创式光遗传技术缓解IBD小鼠炎症
将微囊化原生菌与上转换水凝胶颗粒混匀后,采取灌胃的方式注入到IBD模型鼠的消化道内。四小时之后,将小鼠麻醉处理,用近红外光脉冲式照射小鼠腹腔,连续照射一小时。连续照射七天后原生大肠杆菌可在小鼠肠道内稳定定植,发挥其相应的功能。组织穿透性强的近红外光穿透小鼠腹腔后,会激发上转换颗粒发出蓝光,蓝光响应的启动子感受蓝光后,启动下游基因的表达,其中功能因子Ag43协助原生大肠杆菌在小鼠肠道内的定植,功能因子TGF-β1用于IBD小鼠炎症的缓解与治疗。
形态观察、粒径及其分布测定:
分别取微囊化原生菌和上转换水凝胶颗粒样品经离心洗涤后,
将颗粒放于液氮中速冻4h后,真空冷冻干燥过夜,去除微胶囊和水凝胶中水分,一部分用来观察形貌,一部分用OCT包埋剂固定颗粒后,冷冻切片,在扫描电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到微囊化原生菌和上转换水凝胶颗粒呈均匀规则的球形粒子,微囊化原生菌和上转换水凝胶颗粒内部结构疏松,能够明显的包埋菌和上转换颗粒。且通过注射泵的流速可以控制合成的二微囊化原生菌和上转换水凝胶颗粒的粒径。
将微囊化原生菌和上转换水凝胶颗粒混匀后通过灌胃的方式注入到小鼠消化系统内。实验组小鼠:四小时后将小鼠麻醉后,用脉冲式近红外光照射小鼠腹腔1小时,连续照射7天;对照组小鼠:灌胃后不做任何处理。七天后分批次解剖老鼠,取肠道内容物进行流式细胞仪检测。通过检测细菌团的分布,来确定定植到C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的数量。
上述实施例1-2所得产物上转换光遗传微米级水凝胶及微囊化原生菌,首先创新性的合成上转换光遗传微米级水凝胶,制备了粒径均一的上转换颗粒;其次创新性的合成微囊化原生菌,其中两种颗粒的制备室通过对冲式玻璃微流控装置进而搭建起的微流控平台,简化了制备两种颗粒的制备流程。最后为研究微生物在肠道内的定植,具有重大理论和现实意义。将合成生物学、光遗传学与纳米生物学相结合,设计构建了具有安全、准确、无创的纳米水凝胶系统,有效提高肠菌移植代谢可控性,最终为肠菌移植用于疾病防治,提供了一种新方法。
本发明同传统治疗肠道疾病的口服化学药物相比具有如下优势:
综上,本发明所述一种改造的微囊化原生菌及在肠道疾病治疗方面的应用包括以下几个方面:1)C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的筛选;2)利用合成生物学的手段对原生大肠杆菌进行基因改造;3)将改造后的原生菌进行微囊化处理;4)上转换光遗传微米级水凝胶颗粒的制备;5)C57BL/6小鼠IBD模型的建立;6)微囊化原生菌在C57BL/6小鼠肠道内的定植及结合无创式光遗传技术缓解IBD小鼠炎症。
图3中,在光遗传调控方法和传统方法中,通过细胞流式检测报告基因的表达,微生物都能实现在肠道内的定植,但是两种方法相比,光遗传学调控方法在提高微生物定植效率的同时,大大缩短了定植周期。是一种高效、快速、便捷的研究微生物与机体互作的新方法。
这种改造的微囊化原生菌在肠道疾病治疗领域,尤其是在肠道菌群与机体互作领域创新性应用原理为下:1)上转换光遗传微米级水凝胶联合微囊化原生菌,将合成生物学、光遗传学与纳米生物学相结合,设计构建了具有安全、准确、无创特性的纳米水凝胶系统。另外合成生物学改造的原生大肠杆菌具有灵敏的蓝光响应性,精确控制下游功能蛋白的表达;2)上转换光遗传微米级水凝胶联合微囊化原生菌应用于肠道疾病治疗,开创性的将光遗传技术运用于肠道疾病的治疗,为研究机体肠道菌群与疾病之间的关系,提供了一种全新的思路。
上转换光遗传微米级水凝胶及微囊化原生菌主要性能指标包括:a)粒径500nm的上转换光遗传微米级水凝胶及微囊化原生菌,粒径可根据制剂的组成成分,注射泵流速等进行调节,其粒径均一,形貌稳定且具有可视化的微米级结构;b)整个制备过程简单快捷,制备周期短,产率高,适合大批量生产;c)上转换光遗传微米级水凝胶联合微囊化原生菌应用于肠道疾病治疗,利用光遗传手段调控粘连蛋白的表达,以实现对肠道菌群的快速、精确定植,为探究肠道微生物分泌单一元素对机体的影响提供了一种新思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法,其特征在于:利用合成生物学的方法将筛选出的肠道原生大肠杆菌基因改造后进行微囊化处理;
具体步骤如下
1)C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌的筛选;
2)利用合成生物学的手段对原生大肠杆菌进行基因改造
(1)利用合成生物学的手段合成质粒系统:pDawn-RFP-TGF-β1,其中pDawn是蓝光响应启动子,在接收到蓝光信号后,会启动下游基因RFP-TGF-β1的转录;;
(2)利用化学诱导-CaCl2法将筛选出的原生大肠杆菌诱导成感受态;
(3)进行质粒转化,将光控质粒系统转化到原生大肠杆菌感受态内,通过观察荧光标签的表达来证明功能分子TGF-β1的表达;
3)将改造后的原生菌进行微囊化处理。
2.根据权利要求1所述的基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法,其特征在于:所述步骤1)具体为:
(1)取C57BL/6小鼠新鲜肠道组织于无菌EP管中;
(2)用提前预冷的无菌PBS冲洗肠道内容物;
(3)将肠道壁剖开后,用无菌载玻片剐取肠道内壁,将肠道内壁物与无菌预冷PBS质量体积比m/v=1:10混合后,漩涡震荡15min;
(4)将混合物4℃,2000rpm离心5min,弃去沉淀,将上清于4℃,12000rpm离心20min,弃去上清,留沉淀;
(5)将沉淀用100μL PBS重悬后,取10μL涂布于用于蓝白板筛选的固体LB平板上,37℃,过夜培养;
(6)第二天根据平板的生长情况,挑取蓝色菌落用于菌落PCR,菌落PCR的两对引物分别LaZ-YZ-F:AACGGGGGTACTGACGAAAC;LaZ-YZ-R:GAACCATCCGCTGTGGTACA,根据菌落PCR的目的条带大小,筛选出C57BL/6小鼠肠道原生大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法,其特征在于:所述步骤3)具体为:
(1)将海藻酸钠配成质量分数1-10%的溶液后进行灭菌处理,将培养至对数生长中期的原生大肠杆菌加入到经过灭菌处理的海藻酸钠溶液中,进行搅拌处理,作为制备微胶囊的内液;
(2)将二甲基硅油与CaCl2粉末共混后作为外液;
(3)内液注射泵的流速为10uL/min,外液注射泵的流速为200uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用EP管连接,即搭建微流控平台,生成的液滴用CaCO3的醋酸溶液收集,此时生成的原生菌微胶囊粒径为500um。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910205083.0A CN110051698A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910205083.0A CN110051698A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110051698A true CN110051698A (zh) | 2019-07-26 |
Family
ID=67316989
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910205083.0A Pending CN110051698A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110051698A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111269929A (zh) * | 2020-02-05 | 2020-06-12 | 天津大学 | 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法 |
CN111557918A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-08-21 | 天津大学 | 一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统及构建方法和应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1378458A (zh) * | 1999-10-06 | 2002-11-06 | 努特里奇亚有限公司 | TGF-β和生长因子在治疗和预防肠粘膜疾病中的用途 |
CN101252941A (zh) * | 2005-08-31 | 2008-08-27 | Ith免疫治疗控股股份公司 | 治疗炎性肠病 |
CN103409452A (zh) * | 2013-07-05 | 2013-11-27 | 新疆农业大学 | 一种耐胃酸egfp标记大肠杆菌bl21消化道示踪菌制备方法 |
CN105462906A (zh) * | 2014-09-11 | 2016-04-06 | 香港理工大学深圳研究院 | 可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌及其制备方法 |
CN107648278A (zh) * | 2017-08-30 | 2018-02-02 | 济南森康三峰生物工程有限公司 | 一种雏鸡专用肠道占位菌剂及其生产方法及与应用 |
CN108135240A (zh) * | 2015-05-11 | 2018-06-08 | 迈彼欧提克斯制药有限公司 | 用于使益生菌在使细菌于肠道中定植用途的固体颗粒上生长成益生菌生物膜的系统和方法 |
CN108289917A (zh) * | 2015-08-24 | 2018-07-17 | 努比约塔有限公司 | 使用粪源细菌群落来治疗微生态失衡的系统和方法 |
-
2019
- 2019-03-18 CN CN201910205083.0A patent/CN110051698A/zh active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1378458A (zh) * | 1999-10-06 | 2002-11-06 | 努特里奇亚有限公司 | TGF-β和生长因子在治疗和预防肠粘膜疾病中的用途 |
CN1626239A (zh) * | 1999-10-06 | 2005-06-15 | 努特里奇亚有限公司 | TGF-β和生长因子在治疗和预防肠粘膜疾病中的用途 |
CN101252941A (zh) * | 2005-08-31 | 2008-08-27 | Ith免疫治疗控股股份公司 | 治疗炎性肠病 |
CN103409452A (zh) * | 2013-07-05 | 2013-11-27 | 新疆农业大学 | 一种耐胃酸egfp标记大肠杆菌bl21消化道示踪菌制备方法 |
CN105462906A (zh) * | 2014-09-11 | 2016-04-06 | 香港理工大学深圳研究院 | 可定植动物肠道的荧光标记大肠杆菌及其制备方法 |
CN108135240A (zh) * | 2015-05-11 | 2018-06-08 | 迈彼欧提克斯制药有限公司 | 用于使益生菌在使细菌于肠道中定植用途的固体颗粒上生长成益生菌生物膜的系统和方法 |
CN108289917A (zh) * | 2015-08-24 | 2018-07-17 | 努比约塔有限公司 | 使用粪源细菌群落来治疗微生态失衡的系统和方法 |
CN107648278A (zh) * | 2017-08-30 | 2018-02-02 | 济南森康三峰生物工程有限公司 | 一种雏鸡专用肠道占位菌剂及其生产方法及与应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
XIAOFAN JIN等: ""High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43"", 《JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS》 * |
侯立凯: ""双乳液滴内核可控包裹与融合机制及实验研究"", 《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)基础科学辑》 * |
潘春梅: "《微生态制剂生产及应用》", 30 September 2014, 中国农业大学出版社 * |
王龙: ""猪肠道定植菌分离与转半纤维素酶大肠杆菌在肠道内表达"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)农业科技辑》 * |
肖敏等: ""促炎因子IL-1β和抑炎因子TGF-β1与急性高原反应的关联性研究"", 《西南国防医药》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111269929A (zh) * | 2020-02-05 | 2020-06-12 | 天津大学 | 一种蓝光响应的乳酸菌工程菌株的构建方法 |
CN111557918A (zh) * | 2020-04-22 | 2020-08-21 | 天津大学 | 一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统及构建方法和应用 |
CN111557918B (zh) * | 2020-04-22 | 2022-03-25 | 天津大学 | 一种光响应型工程菌肠道靶向光遗传载体系统及构建方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pan et al. | Light-sensitive Lactococcus lactis for microbe–gut–brain axis regulating via upconversion optogenetic micro-nano system | |
Kocak et al. | In-situ forming pH and thermosensitive injectable hydrogels to stimulate angiogenesis: potential candidates for fast bone regeneration applications | |
Cui et al. | NIR light-responsive bacteria with live bio-glue coatings for precise colonization in the gut | |
Chung et al. | Neovascularization in tissue engineering | |
CN113862193A (zh) | 一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN104531549B (zh) | 一种可调节肠道运动、预防便秘的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum strain Zhao及其用途 | |
CN102132771B (zh) | 一种有益于养殖动物肠道健康的鸡蛋粉及其制备方法 | |
CN110051698A (zh) | 基于微囊化处理的肠道原生菌基因改造的方法 | |
CN109735496A (zh) | 一种肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法 | |
Li et al. | Hydrogel-encapsulated engineered microbial consortium as a photoautotrophic “living material” for promoting skin wound healing | |
CN105154407A (zh) | 一种皮肤修复功能提高的人脂肪干细胞的制备方法及其应用 | |
Song et al. | In situ bioorthogonal conjugation of delivered bacteria with gut inhabitants for enhancing probiotics colonization | |
CN1769430A (zh) | 含有抑制癌细胞增殖的因子的条件培养基及其制备方法 | |
CN102743324A (zh) | 靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体 | |
CN109913442A (zh) | 一种肠道原生菌基因改造的方法 | |
Sun et al. | Mesenchymal stem cell-derived exosomes enhance 3D-printed scaffold functions and promote alveolar bone defect repair by enhancing angiogenesis | |
KR20090110102A (ko) | 마이크로 채널을 이용한 혈관 내 특정부위에 세포를유도·고정하기 위한 시뮬레이션 장치 및 이를 이용하는시뮬레이션 방법 | |
CN1495253A (zh) | 含有抑制癌细胞增殖的因子的条件培养基及其制备方法 | |
CN106011056A (zh) | 一种用于皮肤粉刺治疗的间充质干细胞的制备方法及其产品 | |
CN109402175A (zh) | 表达趋化因子受体ccr2b的脂肪干细胞及制备方法与应用 | |
CN106244419B (zh) | 一种中草药联合卵黄抗体提取副产物发酵制备微生态制剂的生产系统及工艺 | |
CN114376985B (zh) | 一种3d干细胞微球胶囊、其制备方法及在移植治疗领域的应用 | |
CN107250348A (zh) | 使用表达lgr4、lgr5和lgr6的上皮干细胞在组织应用中开发和使用最小极性化功能细胞微聚集体单元的方法 | |
CN102028958B (zh) | 以细菌纳米磁小体为载体的复合肿瘤基因疫苗及其制备方法 | |
US8748158B2 (en) | Microorganism having gastric-juice promoting activity, and its secretory product |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190726 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |