CN103409452A - 一种耐胃酸egfp标记大肠杆菌bl21消化道示踪菌制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种耐胃酸EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法，以EGFP作为荧光标记物标记，并用耐酸性材料海藻酸钙微囊化包被后，作为一种示踪剂，通过体外模拟消化道内环境，研究微囊化缓、控释制剂在体内的消化代谢规律。该示踪剂，尤其对兽类体内的消化代谢规律研究，具有重要的实践价值。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制剂，研制的EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌，对兽类消化道微生物代谢规律的研究起到示踪作用。
背景技术
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，最初是由Shimomure从多管水母属(Aequorea victoria)中分离出来的，由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构，由238个氨基酸组成，其特点是发色团为GFP蛋白质一级结构序列所固有，无需底物或辅因子就可在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，由于其检测方便，无种属特异性，且对活细胞无伤害，已被作为一种标记基因广泛应用于生物学的各个领域作为报告基因。虽然氯霉素转乙酰基酶（CAT）、β－半乳糖苷酶、碱性磷酸酶（AP）等标记物已得到广泛应用，但是这些标记物需要底物或辅助因子的作用才能显色，在标记研究中需要裂解或固定细胞，敏感性不高，不能在显微镜下直接进行活体细胞的研究，与其相比，EGFP克服了前述的诸多不足，因而被广泛应用于生物学标记领域。
EGFP标记系统和荧光显微镜的出现,使研究者能够对微生物和宿主相互作用过程进行长期的定位监测。有文献检索披露：①杨震元等利用草胺磷抗性和GFP双筛选标记，将重组质粒pbarGPEI－GFP，转入金龟子绿僵菌RCEF3377后，诱导表达。并将双标记的金龟子绿僵菌袍子粉配制成种衣剂，观察玉米苗期根部定殖情况，结果表明金龟子绿僵菌袍子在玉米根部活力和定殖力高。②彭祎等采用电转化法将绿色荧光标记的质粒导入pB-SVG101，将稳定表达的荧光标记多粘芽孢杆菌菌株，用于番茄根际土壤中的迁移和定殖规律的研究。发现该菌株能通过浸根的方式侵入番茄的维管组织和周围细胞。③李春强等利用荧光共聚焦显微镜观察转入绿色荧光蛋白基因的西瓜尖孢镰刀菌FON侵染西瓜的过程，结果发现在1/2MS培养的西瓜苗中，FON48h即可侵染进入西瓜的根维管束，第3d便可进入茎维管束，第4d进入叶维管束（包括叶柄和叶脉），而土壤盆栽条件下的西瓜苗，侵染后，每2d FON才进入西瓜的根维管束，9d进入茎维管束，第11d进入叶维管束，即与土壤盆栽相比，培养基培养栽培的西瓜苗，FON侵染的速度较快。
微胶囊技术是指利用天然或合成高分子材料，将分散的固体、液体，甚至是气体物质包裹起来，形成具有半透性或密封囊膜的微小粒子的技术，包囊的过程即为微胶囊化(microen-capsulation)。现代高分子材料研究和科学技术的发展，使微囊化技术的制备工艺、制备技术更加成熟、多样，现在微囊化的口服制剂的研发更加趋向于定时定点，定量，高效释放。影响微囊释放的因素较多，影响过程也比较复杂。文献披露：①吴菁菁等采用了高效液相色谱法测定壳聚糖-海藻酸钠黄芩微囊累积释放量。②李晔等以带有正电的罗丹明6G分子、带有负电荷荧光素分子、中性的尼罗红分子和生物分子R-藻红蛋白为模型分子。③孙梅等还发现，相比明胶和淀粉，海藻酸钠作为壁材的酪酸菌微胶囊在人工胃液中具有很好的耐胃酸性，而在人工肠液中，具有较好的溶出性。
本发明以EGFP作为荧光标记物标记，并将其用耐酸性材料海藻酸钙微囊化包被后，作为一种示踪剂，通过体外模拟消化道内环境，研究微囊化缓、控释制剂在体内的消化代谢规律。
发明内容
本发明的目的在于：以EGFP作为荧光标记物标记，并将其用耐酸性材料海藻酸钙微囊化包被后，作为一种示踪剂，对兽类体内的消化代谢规律研究，具有重要的实践价值。
本发明的目的是这样实现的：一种EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法，分步骤实施；
步骤1参照GenBank中EGFP序列，用Oligo6.0设计一对引物，由北京华大基因合成；其Sense：5＇-CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3＇，Anti-sense：5＇-GTCGTCGACGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3＇；
其中EGFP序列的PCR扩增
PCR反应体系：5.0μl10×PCR Buffer，4.0μl dNTP，1.0μl PEGFP-C1质粒模板，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，0.25μl Tap Polymerase，加ddH2O水至50μl，PCR仪中扩增；
扩增程序：94℃条件下预变性处理4min；然后分别在94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，最终72℃终延伸10min，整个PCR反应体系共进行35个循环，扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳验证后,用DNA纯化试剂盒回收后待用；
步骤2原核表达载体PET28a-EGFP的构建
其1EGFP片段和PET28a质粒经BamH I和Sal I双酶切后，切胶纯化回收目的基因和载体片段，用T4DNA Ligase16℃恒温过夜连接，转入BL21感受 态细胞中，涂布于LB固体培养基，即含Kan，50μg/ml，正置20min后，37℃培养12h；
其2EGFP扩增产物的双酶切反应体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamH Ⅰ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒5.0μl，加ddH2O补足至20.0μl；37℃水浴4h；
其3PET28a质粒双酶切体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamH Ⅰ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒7.0μl，加ddH2O补足至20μl；37℃水浴4h；
其4连接体系及反应条件：pGM-EGFP质粒双酶切纯化回收产物1.0μl，PET28a质粒双酶切纯化回收产物5.0μl，10×T4DNA Ligase Buffer1.0μl，T4DNA Ligase1.0μl，加ddH2O补足至10.0μl；混匀后16℃,水浴12h；
步骤3SDS-PAGE电泳蛋白诱导表达：SDS-PAGE电泳为诱导阳性，出现29.2KDa的His-tag-EGFP融合蛋白特异性条带；
步骤4显微镜检测EGFP基因表达：40倍暗视野UV激发下，平板上的菌落发绿色荧光；
步骤5GFP标记稳定性：30代次中菌体生长良好，仍能在12h内长出较大的菌落，其Kan抗性维持在50mg/L；
步骤6EGFP BL21重组菌微囊包被：将GFP标记的重组菌以2%接种到LB液体培养基内，37℃，150rpm振荡培养至OD=1.60，然后将菌液加至2-3%海藻酸钠溶液中，并加入6%吐温80，3000rpm，搅拌30min；将配制的海藻酸钠溶液、乳化剂、保护剂及灭活菌液依次加入组织捣碎机高速乳化10min，将乳化好的溶液置于高压均质机中10000rpm、50-60℃、均质30min，将脱气后的均匀乳状液通过内径约为0.8mm的硅胶管，连通蠕动泵以50-70ml/min的速度泵入喷雾干燥机内进行喷雾干燥。
所述的方法，选用2%和3%浓度的海藻酸钠作为壁材，具有良好的抗胃酸的效果。
本发明机理与作用：以原核生物E.coli BL21为表达宿主,利用PCR技术从模板EGFP C1中克隆得到EGFP片段,并EGFP片段与pET28a表达载体连接后得到重组质粒pET28a-EGFP并转化至E.coliBL21中,通过IPTG诱导可以高效表达。本发明以EGFP作为荧光标记物标记，并将其用耐酸性材料海藻酸钙微囊化包被后，作为一种示踪剂，通过体外模拟消化道内环境，研究微囊化缓、控释制剂在体内的消化代谢规律；本方法可操作性强，彰显技术进步。
附图说明
本发明结合附图作进一步说明。
附图1为pET28a-EGFP质粒PCR鉴定电泳图：
如图所示：1：D2000DNA Mark;2，3:为阴性对照；4，5:pET28a-EGFP质粒PCR；将重组Pet28a-EGFP质粒PCR扩增产物电泳，阳性泳道出现特异性条带，而阴性无条带出现，与预期结果相符。
附图2pGM-EGFP重组质粒酶切鉴定结果电泳图；
如图所示：1:D2000;2，3:双酶切；4:Pet28a-EGFP质粒；5，6:单酶切7.1000ladder；将Pet28a-EGFP质粒用单酶切、双酶切后，结果与预期相符，表明Pet28a-EGFP重组菌成功构建。
附图3为His-tag-EGFP SDS-PAGE鉴定结果电泳图；
如图所示：1：pET-28a诱导对照；2：pET-28a非诱导对照；3：蛋白Marker；4，5：诱导的pET-28a-EGFP；6：未诱导的pET-28a-EGFP；SDS-PAGE电泳可见到诱导阳性出现29.2KDa的His-tag-EGFP融合蛋白特异性条带，与预其结果相符，说明蛋白已成功诱导表达。
附图4为荧光显微镜下的pET28a-EGFP重组菌(40×)；
如图所示：40倍暗视野UV激发下，平板上的菌落可见发绿色荧光[55]，证明GFP基因成功实现表达。
附图5为荧光显微镜下的pET28a-EGFP重组菌第10代。
附图6为荧光显微镜下的pET28a-EGFP重组菌第20代。
附图7为荧光显微镜下的pET28a-EGFP重组菌第30代；
如图所示：30代次中菌体生长良好，荧光未发生消减，直至第30代仍能在12h内长出较大的菌落，荧光显微镜下可见菌落发现明亮的绿色荧光。Kan抗性维持在50mg/L。
附图8微囊包被显微镜下的EGFP重组菌；
如图所示：为2%海藻酸钠，芯壁比1/1包被工艺制作的微囊，镜检可见结构清晰，被包被的重组菌呈现杆状，与预期结果相符。
附图9为微囊包被的EGFP重组菌瘤胃释放率曲线；
如图所示：平均释放率为22.61±4.28%。
附图10为微囊包被的EGFP重组菌十二指肠释放率释放率曲线；
如图所示：平均释放率为2.21±0.8%。
附图11为空肠释放率瘤胃释放率曲线；
如图所示：平均释放率为45.27±6.30%。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步说明。
实施例1
1）引物设计与合成
参照GenBank中EGFP序列，用Oligo6.0设计一对引物，序列如下：
Sense(BamH I)：5＇-CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGC GAG-3＇Anti-sense(Sal I)：5＇-GTCGTCGACGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3＇,由北京华大基因合成。
2）EGFP序列的PCR扩增
PCR反应体系：5.0μl10×PCR Buffer（with Mg2+），4.0μl dNTP，1.0μl PEGFP-C1质粒模板，上游引物（10μmol/μl）1.0μl，下游引物（10μmol/μl）1.0μl，0.25μl Tap Polymerase(2.5U/μl)，加ddH2O水至50μl，PCR仪中扩增；
扩增程序：94℃条件下预变性处理4min；然后分别在94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，最终72℃终延伸10min，整个PCR反应体系共进行35个循环，扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳验证后,用DNA纯化试剂盒回收后待用。
3）原核表达载体pET28a-EGFP的构建
EGFP片段和pET28a质粒经BamH I和Sal I双酶切后，切胶纯化回收所需的目的基因和载体片段，用T4DNA Ligase16℃恒温过夜连接，转入BL21感受态细胞中，涂布于LB固体培养基（含Kan，50μg/ml），正置20min后，37℃培养12h。
EGFP扩增产物经双酶切反应体系及反应条件如下：10×H Buffer2.0μl，BamHⅠ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒5.0μl，加ddH2O补足至20.0μl；37℃水浴4h。
PET28a质粒双酶切体系及反应条件如下：10×H Buffer2.0μl，BamH Ⅰ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒7.0μl，加ddH2O补足至20μl；37℃水 浴4h。
连接体系及反应条件如下：pGM-EGFP质粒双酶切纯化回收产物1.0μl，PET28a质粒双酶切纯化回收产物5.0μl，10×T4DNA Ligase Buffer1.0μl，T4DNALigase1.0μl，加ddH2O补足至10.0μl；混匀后16℃,水浴12h。
4）重组Pet28a-EGFP质粒的PCR鉴定
PCR鉴定：50.0μlPCR反应体系：5.0μl10×PCR Buffer（with Mg2+），4.0μl dNTP，1.2μl重组质粒，上游引物（10μmol/μl）1.0μl，下游引物（10μmol/μl）1.0μl，0.25μl Tap Polymerase(2.5U/μl)，加ddH2O水至50.0μl；阴性体系不加重组质粒，其它试剂同上，加ddH2O水至50.0μl。PCR仪中扩增。
扩增程序：94℃预变性4min；变性94℃，30s，退火68℃，30s，延伸72℃，1min，30个循环；72℃修饰10min。
最后将PCR产物及阴性对照于1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将重组Pet28a-EGFP质粒PCR扩增产物电泳，阳性泳道出现特异性条带，而阴性无条带出现，与预期结果相符（图1）。
5）重组质粒Pet28a-EGFP酶切鉴定
双酶切体系及反应条件如下：10×H Buffer2.0μl，BamHⅠ 1.0μl，Sal Ⅰ酶1.0μl，pET28a-EGFP质粒5.0μl，37℃水浴4h。加ddH2O水至20.0μl。
单酶切体系及反应条件如下：10×H Buffer2.0μl,BamHⅠ1.0μl，pET28a-EGFP质粒5.0μl，加ddH2O水至20.0μl；37℃水浴4h。
阴性对照体系：pET28a-EGFP质粒5.0μl，加ddH2O水至20μl，37℃水浴4h。
最后将双酶切、单酶切产物及阴性对照于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果与预期相符，表明Pet28a-EGFP重组菌成功构建（图2）。
6）SDS-PAGE电泳鉴定
挑取含PET28a-EGFP重组质粒的表达性宿主菌BL21的单个菌落接种于含Kan（50μg/ml）的LB液体培养基上37℃，150rpm过夜摇菌，次日，取过夜培养物100μl接种于新鲜的含Kan（50μg/ml）的LB液体培养基上37℃，150rpm培养约4h，当OD值达到0.6时加IPTG至优化终浓度1.2mmol/l，另一管对照不加IPTG，同时在相同条件下作PET28a的诱导和非诱导对照，于37℃，150rpm震荡4h后，离心，收集菌体，用PBS漂洗两次后，加1/20体积PBS重悬菌体，再加1/20体积的BPB（2×）和终浓度0.1mol/l的DTT，混匀，沸水浴10min，冷却后1000rpm(93×g)离心5min，分别取上清及包涵体蛋白，于5%浓缩胶，12%分离胶的SDS-PAGE电泳蛋诱导为阳性，出现29.2KDa的 His-tag-EGFP融合蛋白特异性条带（图3）；
7）重组菌中EGPF基因表达：将PET28a-EGFP重组菌涂布于IPTG1.2mmol/l的LB固体培养基上，正置20min，37℃培养12h后，40倍暗视野并在UV激发下，平板上的菌落发绿色荧光（图4）；
8）GFP标记稳定性：将PET28a-EGFP重组菌在LB培养基（含Kan）连续诱导传代30次，仍能在12h内长出较大的菌落，其Kan抗性维持在50mg/L（图5、6、7）；
9)GFP标记菌的微囊包被：将GFP标记的重组菌接种到LB液体培养基内，37℃，150rpm振荡培养至OD=1.60，然后将菌液以3%加至6%的海藻酸钠溶液中，并加入6%吐温80，3000rpm，搅拌混匀30min，然后将混合液高压（10MP）喷雾至2%的CaCl2溶液中（图8）。
实施例2
体内消化代谢过程实验：
1）实验动物的预处理
本实验以两只5月龄的新疆细毛羊为对象，对其限水，禁食一天后，一只于瘤胃背囊、近幽门部十二指肠分别做一瘤胃瘘,两周护理后，拆线，待体症恢复正常时停药备用。
2)微囊在体内的释放率与释放数
将停药一周的两只羊分别灌服250ml新制的含2%，芯壁比1/1的微囊液，然后自灌服之时起，每隔0.5h经瘘管抽取一定量的食糜液，放入冰盒快速送回实验室测定结果：
释放数：吸取食糜液1ml,3000rpm离心4min后，然后吸取100ul上清，作适当倍数的稀释后，铺板(含Kan，IPTG)过夜培养，次日荧光显微镜下计数。
标记菌总数：吸取食糜液1000ul,4000rpm离心4min，弃去上清，加1ml破囊液破囊5min后，作适当倍数的稀释，吸取稀释后的液体100ul，铺板(含Kan,IPTG)过夜培养，次日荧光显微镜下计数。
释放率＝释放数÷标记菌总数×100%
芯壁比、海藻酸钠浓度可能对微囊在体内消化代谢规律的影响较大；暴露在模拟胃液中的重组菌无法耐受强酸的作用很快死亡；抗过模拟胃液而再次释放出的重组菌通过再次诱导仍可发出明亮的绿色荧光。
经计算得知，微囊包被的GFP重组菌在瘤胃内平均释放率为22.61±4.28，（图9）、十二指肠平均释放率为2.21±0.8%（图10）、而空肠内平均释放率为 45.27±6.30%（图11）。
本实验选用海藻酸钠溶液、pGM-EGFP质粒双酶切、PET28a质粒双酶切、T4DNA Ligase Buffer、BL21感受态细胞、LB固体培养基、SalⅠ酶，ddH2O0×H Buffer、BamHⅠ、SalⅠ酶、PBS、PBS、BPB、DTT的购自上海生工。
Claims (2)
1.一种EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法，参照GenBank中EGFP序列，用Oligo6.0设计一对引物，由北京华大基因合成如下：Sense：5＇-CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3＇，Anti-sense：5＇-GTCGTCGACGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3＇；经EGFP序列的PCR扩增，用DNA纯化试剂盒回收后待用；其特征在于：分步骤实施；
步骤1原核表达载体PET28a-EGFP的构建
其1EGFP片段和PET28a质粒经BamH I和Sal I双酶切后，切胶纯化回收目的基因和载体片段，用T4DNA Ligase16℃恒温过夜连接，转入BL21感受态细胞中，涂布于LB固体培养基，即含Kan，50μg/ml，正置20min后，37℃培养12h；
其2EGFP扩增产物的双酶切反应体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamHⅠ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒5.0μl，加ddH2O补足至20.0μl；37℃水浴4h；
其3PET28a质粒双酶切体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamH Ⅰ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒7.0μl，加ddH2O补足至20μl；37℃水浴4h；
其4连接体系及反应条件：pGM-EGFP质粒双酶切纯化回收产物1.0μl，PET28a质粒双酶切纯化回收产物5.0μl，10×T4DNA Ligase Buffer1.0μl，T4DNALigase1.0μl，加ddH2O补足至10.0μl；混匀后16℃,水浴12h；
步骤2SDS-PAGE电泳蛋白诱导表达：SDS-PAGE电泳为诱导阳性，出现29.2KDa的His-tag-EGFP融合蛋白特异性条带；
步骤3显微镜检测EGFP基因表达：40倍暗视野UV激发下，平板上的菌落发绿色荧光；
步骤4GFP标记稳定性：30代次中菌体生长良好，仍能在12h内长出较大的菌落，其Kan抗性维持在50mg/L；
步骤5EGFP BL21重组菌微囊包被：将GFP标记的重组菌以2%接种到LB液体培养基内，37℃，150rpm振荡培养至OD=1.60，然后将菌液加至2-3%海藻酸钠溶液中，并加入6%吐温80，3000rpm，搅拌30min；将配制的海藻酸钠溶液、乳化剂、保护剂及灭活菌液依次加入组织捣碎机高速乳化10min，将乳化好的溶液置于高压均质机中10000rpm、50-60℃、均质30min，将脱气后的均匀乳状液通过内径约为0.8mm的硅胶管，连通蠕动泵以50-70ml/min的速度泵入喷雾干燥机内进行喷雾干燥。
2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于：实验选用2%和3%浓度的海藻酸钠作为壁材，具有良好的抗胃酸的效果。
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| CN103409452B (zh) | 2015-06-24 |
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