CN116375519A - 一种大豆根瘤菌生物保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大豆根瘤菌生物保护剂及其制备方法和应用。本发明的大豆根瘤菌生物保护剂包括三种组分，其中：第一组分包括短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂，短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25787；第二组分包括根瘤菌胞外多糖粗液5‑10份，海藻糖5‑15份，麦芽糊精1‑2份，山梨醇0.5‑2份，大豆胚芽蛋白0.1‑1份和海藻精0.01‑0.05份；第三组分包括羧甲基纤维素钠0.2‑0.5份，黄原胶0.1‑0.2份，K‑卡拉胶0.01‑0.05份和刺槐豆胶0.01‑0.05份。本发明的大豆根瘤菌生物保护剂可用于根瘤菌拌植物裸种或包衣种子，能够明显提高种子包衣效率以及种子拌种与储存过程中根瘤菌的存活率。

Description

一种大豆根瘤菌生物保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及种子包衣技术领域，尤其是涉及一种大豆根瘤菌生物保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
根瘤菌可与豆科作物形成最有效的共生固氮系统，根瘤菌利用共生固氮特性为豆科作物的生命活动提供50-90％的氮素营养。在全球豆科植物种植中，根瘤菌每年在2.5亿公顷的土地上固定超过30×109kgN。根瘤菌在农业中的应用对提高农作物产量、降低化肥使用量、减少水土污染、实现农业可持续发展具有重要的作用。
根瘤菌的存活受干燥、土壤pH、温度、毒性等土壤和环境因素的影响，其中干旱胁迫因子对根瘤菌的生长和繁殖具有明显的抑制作用，使固氮效率明显降低。根瘤菌拌种在大豆种子表面，干燥环境条件导致其极易死亡，使得拌种后的大豆种子不能长时间储存和运输。因此，目前仍采用播前拌种的方式接种根瘤菌；然而，播前拌种费时费力、与大面积机械播种操作不配套，极大地制约了大豆根瘤菌的推广与应用。
随着豆科作物根腐病等病虫害发病率逐年增加，现在普遍采用杀菌杀虫类种衣剂进行包衣。种衣剂对根瘤菌具有明显的毒害作用，从而严重影响了根瘤菌的活性。因此，解决包衣种子储存过程中根瘤菌的存活是亟待解决的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种根瘤菌生物保护剂及其制备方法和应用，该保护剂可用于根瘤菌拌植物裸种或包衣种子，能够明显提高种子包衣效率以及种子拌种与储存过程中根瘤菌的存活率。
本发明提供一种大豆根瘤菌生物保护剂，其特征在于，包括第一组分、第二组分和第三组分：其中：
第一组分包括短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂，短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25787；
第二组分包括根瘤菌胞外多糖粗液5-10份，海藻糖5-15份，麦芽糊精1-2份，山梨醇0.5-2份，大豆胚芽蛋白0.1-1份和海藻精0.01-0.05份；
第三组分包括羧甲基纤维素钠0.2-0.5份，黄原胶0.1-0.2份，K-卡拉胶0.01-0.05份和刺槐豆胶0.01-0.05份。
本发明的第一组分包括短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂；其中，短小芽孢杆菌菌剂中的短小芽孢杆菌分离自大豆植株根瘤，为大豆根瘤菌的伴生菌，经16SrDNA测序表明与短小芽孢杆菌的同源性为99％，分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏编号为：CGMCC No.25787，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号楼中国科学院微生物研究所，保藏时间为：2022年09月23日。
短小芽孢杆菌菌剂可以通过对上述短小芽孢杆菌进行发酵制得；对短小芽孢杆菌的发酵培养基和发酵方法不作严格限制，可以采用本领域的常规培养基及培养条件进行发酵。在一实施方式中，发酵所采用的发酵培养基的组成为：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨1-3g/L，硫酸铵2-4g/L，磷酸氢二钾0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，pH值6.8-7.0；此外，短小芽孢杆菌的发酵条件如下：接种量4-6％，发酵温度为30-35℃，转速为180-200rpm，发酵时间为40-56h。此外，根瘤菌菌剂中根瘤菌可以选自大豆根瘤菌、花生根瘤菌和紫云英根瘤菌中的至少一种。更具体地，大豆根瘤菌可以采用大豆根瘤菌CGMCCNo.4346，花生根瘤菌可以采用花生根瘤菌CGMCC No.8386，紫云英根瘤菌可以采用紫云英根瘤菌CGMCC No.4347。
对上述短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂的剂型不作严格限制，可根据实际需要合理设置，例如可以采用液体菌剂；具体地，短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数可以为50-120亿/mL，根瘤菌菌剂中根瘤菌的有效活菌数可以为50-120亿/mL。
在本发明的大豆根瘤菌生物保护剂中，短小芽孢杆菌的有效活菌数0.05-0.5亿/mL，根瘤菌的有效活菌数为1.5-9.95亿/mL。
本发明的第二组分包括根瘤菌胞外多糖粗液、海藻糖、麦芽糊精、山梨醇、大豆胚芽蛋白和海藻精；其中，根瘤菌胞外多糖粗液中的多糖含量为19-22g/L，分子量为0.7×107-1.5×107Da。根瘤菌胞外多糖粗液多糖是共生固氮过程中的重要物质，本发明添加根瘤菌胞外多糖粗液能够提高根瘤菌活性，减缓种子表面根瘤菌的死亡，促进根瘤菌结瘤。
海藻精(也称为活性海藻肥)可以采用CN104892157A方法制备。海藻精中的海藻酸含量为6-10％，植物激素含量为1500-2000mg/kg；此外，海藻精含有5-20％的K2O，1-2％的P2O5，0.5-1.0％的N，30-40％的有机质、0.05-0.10％的Ca和0.2-0.3％的Mg。上述海藻精的活性成分及养分含量较高，除含有植物必需元素大中微量营养元素外，还含有植物可直接吸收利用的氨基酸、生长素、细胞分裂素、赤霉素、维生素、核苷酸、甘露醇、甜菜碱、壳聚糖、多酚等，既能提高根瘤菌的抗旱性，提高种子表面根瘤菌的存活，还能促进根瘤菌在土壤中大量繁殖，提高固氮活性，促进根瘤形成。
本发明的第三组分包括羧甲基纤维素钠、黄原胶、K-卡拉胶和刺槐豆胶，其为食品级原料并且相互作用，能够在溶液中形成稳定的胶体状态，既能在种子表面有效成膜以物理隔绝外界、降低根瘤菌细胞失水，同时膜的透气性好，对种子的安全性好。研究表明：在添加上述第三组分的大豆根瘤菌生物保护剂中无需添加分散剂，各原料经物理混拌后即可满足原料在水中的均匀分散，进而避免了分散剂对根瘤菌的杀伤作用。
在一实施方式中，本发明的大豆根瘤菌生物保护剂为液态制剂，该大豆根瘤菌生物保护剂中短小芽孢杆菌CGMCC No.25787的有效活菌数为0.05-0.5亿/mL，根瘤菌的有效活菌数为1.5-9.95亿/mL，同时该大豆根瘤菌生物保护剂含有根瘤菌胞外多糖粗液5-10g/100mL，海藻糖5-15g/100mL，麦芽糊精1-2g/100mL，山梨醇0.5-2g/100mL，大豆胚芽蛋白0.1-1g/100mL，海藻精0.01-0.05g/100mL，羧甲基纤维素钠0.2-0.5g/100mL，黄原胶0.1-0.2g/100mL，K-卡拉胶0.01-0.05g/100mL和刺槐豆胶0.01-0.05g/100mL。
进一步地，大豆根瘤菌生物保护剂中短小芽孢杆菌CGMCC No.25787的有效活菌数为0.05-0.3亿/mL，根瘤菌的有效活菌数为5.7-9.95亿/mL，同时该大豆根瘤菌生物保护剂含有根瘤菌胞外多糖粗液5-9g/100mL，海藻糖8-15g/100mL，麦芽糊精1-2g/100mL，山梨醇1-2g/100mL，大豆胚芽蛋白0.1-1g/100mL，海藻精0.01-0.03g/100mL，羧甲基纤维素钠0.35-0.5g/100mL，黄原胶0.1-0.15g/100mL，K-卡拉胶0.01-0.03g/100mL和刺槐豆胶0.01-0.03g/100mL。
本发明的大豆根瘤菌生物保护剂可延长根瘤菌在种子表面的存活时间以及根瘤菌在干旱种子表面的活性，例如裸种拌种根瘤菌使使用上述根瘤菌生物保护剂的种子在存放45天后，每粒大豆种子上能保证有104个活的根瘤菌数，固氮活性不降低；种衣剂包衣种子拌种根瘤菌时使用上述根瘤菌生物保护剂的种子在存放45天后，每粒大豆种子上能保证有103个活的根瘤菌数；使用上述大豆根瘤菌生物保护剂可实现播种前45天拌种而不影响根瘤菌结瘤，能够明显提高种子拌种效率，缩短种衣剂-根瘤菌二次包衣时间，省工省时，有利于推动根瘤菌的实际推广应用。
本发明还提供上述大豆根瘤菌生物保护剂的制备方法，包括如下步骤：
S1：按重量份将根瘤菌胞外多糖粗液、海藻糖、麦芽糊精、山梨醇、大豆胚芽蛋白、海藻精、羧甲基纤维素钠、黄原胶、K-卡拉胶和刺槐豆胶混合均匀，得到混合物；
S2：向发酵反应器中注入水，开启搅拌桨，向水中加入步骤S1的混合物，搅拌混匀后升温溶解，随后灭菌，待冷却后按重量份加入短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂，混匀后调节pH值，无菌灌装，制得大豆根瘤菌生物保护剂。
上述步骤S2中，控制水的温度为15-30℃；搅拌桨的搅拌速度为100-200r/min；灭菌温度为80-90℃，灭菌持续时间为25-35min；调节pH值为7.0-8.5。此外，调节pH值时可以选用KOH和H3PO4，加入的钾和磷有利于根瘤的发育和提高根瘤的固氮能力。
本发明还提供上述大豆根瘤菌生物保护剂在根瘤菌拌植物裸种或包衣种子中的应用。
本发明对植物种子不作严格限制，例如可以是大豆、花生、紫云英、苜蓿、绿豆、红小豆、豌豆、菜豆、黑豆等的种子。
具体地，根瘤菌拌种方法可以包括：将液体大豆根瘤菌生物保护剂与液体根瘤菌菌剂按体积比1：(1-5)混合均匀后对植物裸种或包衣种子进行拌种。进一步地，根瘤菌拌种方法还包括：在包衣机内对植物裸种进行种衣剂包衣，包衣均匀后继续转动3-5min，待种皮上的种衣剂干燥后，将液体大豆根瘤菌生物保护剂与液体根瘤菌菌剂按体积比1：(1-5)混合均匀后进行拌种，阴干备用。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明的大豆根瘤菌生物保护剂含有短小芽孢杆菌菌剂，短小芽孢杆菌为大豆根瘤菌的伴生菌，对根瘤菌具有明显的增效及保护作用，促进豆科作物结瘤，显著提高了根瘤菌的实际应用效果；
2、本发明的大豆根瘤菌生物保护剂还含有根瘤菌胞外多糖粗液、海藻糖、海藻精等多种活性物质，其与短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂具有良好的协同增效作用，能够提高根瘤菌活性，减缓种子表面根瘤菌的死亡，明显提升大豆根瘤菌生物保护剂的保护效果；
3、本发明的大豆根瘤菌生物保护剂含有羧甲基纤维素钠、黄原胶、K-卡拉胶、刺槐豆胶等成膜剂，其相互作用并在溶液中形成稳定的胶体状态，降低了根瘤菌的细胞失水问题，避免了使用分散剂导致的根瘤菌杀伤作用，有利于推动根瘤菌的实际推广应用。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、制备根瘤菌胞外多糖粗液
将大豆根瘤菌CGMCC No.4346(领先生物农业股份有限公司生产)进行常规活化、种子培养，得到种子培养液。
发酵培养基：将15g甘露醇、0.2g氯化钠、0.3g硫酸镁、0.1g硫酸钙、1.0g磷酸氢二钾、1.5g酵母膏溶于水中，用水补充达到总体积1000mL，调节pH值至6.8，121℃条件下灭菌30min。
按照发酵培养基体积的5％接种量，将种子培养得到的种子培养液转接至上述发酵培养基中，置于恒温培养箱中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养7d，发酵结束后得到含有胞外多糖的大豆根瘤菌发酵液；对大豆根瘤菌发酵液进行减压浓缩，制得根瘤菌胞外多糖粗液。
对上述根瘤菌胞外多糖粗液中的胞外多糖的分子量和含量采用凝胶过滤法和苯酚-硫酸法进行检测；结果表明，上述根瘤菌胞外多糖粗液中的胞外多糖的分子量为1.1×107Da，胞外多糖总含量为21.2g/L。
二、制备短小芽孢杆菌菌剂
对短小芽孢杆菌CGMCC No.25787进行常规活化、种子培养后，按发酵培养基体积的5％向发酵培养基中接入种子液，于32℃、200rpm恒温震荡培养2天，制得短小芽孢杆菌菌剂；经检测，该短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数为70亿/mL。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨3g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L。
三、制备海藻精
按照CN104892157A公开的实施例1方法制备海藻精；该海藻精以重量计含有海藻酸6％，植物激素1620mg/kg，K2O 6％，P2O5 1.4％，N 0.6％，有机质38％，Ca 0.05％，Mg0.3％。
四、制备根瘤菌生物保护剂
本实施例的根瘤菌菌剂采用大豆根瘤菌菌剂(大豆根瘤菌CGMCC No.4346)，由领先生物农业股份有限公司生产，有效活菌数为119亿/mL，生产符合登记证号微生物肥(2019)准字(6718)号。
本实施例的大豆根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.1亿/mL，大豆根瘤菌7.9亿/mL，根瘤菌胞外多糖粗液7.5g/100mL，海藻糖10g/100mL，麦芽糊精为1.5g/100mL，山梨醇1.25g/100mL，大豆胚芽蛋白0.55g/100mL，海藻精0.03g/100mL，羧甲基纤维素钠0.35g/100mL，黄原胶0.1g/100mL，K-卡拉胶0.03g/100mL和刺槐豆胶0.03g/100mL。
本实施例的大豆根瘤菌生物保护剂的制备方法如下：
S1：按上述组成将根瘤菌胞外多糖粗液、海藻糖、麦芽糊精、山梨醇、大豆胚芽蛋白、海藻精、羧甲基纤维素钠、黄原胶、K-卡拉胶和刺槐豆胶混合均匀，得到混合物；
S2：向发酵反应器中注入自来水，控制水温为25℃，开启搅拌桨，调节转速为170r/min，向水中加入步骤S1的混合物，搅拌混匀，边溶解边升温，升温至80℃，巴氏灭菌30min，自然冷却，再按上述组成加入短小芽孢杆菌菌剂和大豆根瘤菌菌剂，混匀后使用灭菌的KOH和H3PO4调节pH值为8.0左右，制得大豆根瘤菌生物保护剂。
实施例2
本实施例的大豆根瘤菌生物保护剂中，原料除根瘤菌菌剂和海藻精不同之外，其余与实施例1相同。
本实施例的根瘤菌菌剂采用紫云英根瘤菌菌剂(紫云英根瘤菌CGMCC No.4347)，由领先生物农业股份有限公司生产，有效活菌数为100亿/mL，生产符合登记证号微生物(2011)准字(0687)号。
本实施例的海藻精的制备方法如下：
按照CN104892157A公开的实施例3方法制备海藻精；该海藻精以重量计含有海藻酸10％，植物激素2000mg/kg，K2O 20％，P2O5 1.0％，N 1.0％，有机质40％，Ca 0.08％，Mg0.2％。
本实施例的大豆根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.05亿/mL，紫云英根瘤菌9.95亿/mL，根瘤菌胞外多糖粗液5g/100mL，海藻糖15g/100mL，麦芽糊精为1g/100mL，山梨醇2g/100mL，大豆胚芽蛋白1g/100mL，海藻精0.01g/100mL，羧甲基纤维素钠0.4g/100mL，黄原胶0.15g/100mL，K-卡拉胶0.02g/100mL和刺槐豆胶0.01g/100mL。
本实施例的大豆根瘤菌生物保护剂的制备方法如下：
S1：按上述组成将根瘤菌胞外多糖粗液、海藻糖、麦芽糊精、山梨醇、大豆胚芽蛋白、海藻精、羧甲基纤维素钠、黄原胶、K-卡拉胶和刺槐豆胶混合均匀，得到混合物；
S2：向发酵反应器中注入自来水，控制水温为20℃，开启搅拌桨，调节转速为200r/min，向水中加入步骤S1的混合物，搅拌混匀，边溶解边升温，升温至90℃，巴氏灭菌25min，自然冷却，再按上述组成加入短小芽孢杆菌菌剂和紫云英根瘤菌菌剂，混匀后使用灭菌的KOH和H3PO4调节pH值为7.0左右，制得大豆根瘤菌生物保护剂。
实施例3
本实施例的大豆根瘤菌生物保护剂中，原料除根瘤菌菌剂不同之外，其余与实施例1相同。
本实施例的根瘤菌菌剂采用花生根瘤菌菌剂(花生根瘤菌CGMCC No.8386)，由领先生物农业股份有限公司生产，有效活菌数为102亿/mL，生产符合登记证号微生物肥(2015)准字(1614)号。
本实施例的大豆根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.3亿/mL，花生根瘤菌5.7亿/mL，根瘤菌胞外多糖粗液9g/100mL，海藻糖8g/100mL，麦芽糊精为2g/100mL，山梨醇1g/100mL，大豆胚芽蛋白0.1g/100mL，海藻精0.02g/100mL，羧甲基纤维素钠0.5g/100mL，黄原胶0.1g/100mL，K-卡拉胶0.01g/100mL和刺槐豆胶0.02g/100mL。
对照例1
本对照例除大豆根瘤菌生物保护剂的组成中不添加短小芽孢杆菌菌剂之外，其余与实施例1相同。
对照例2
除采用标准短小芽孢杆菌(购自北京万佳标准物质研发中心，编号BWCC66005)替换实施例1的短小芽孢杆菌之外，其余与实施例1基本相同；本对照例的大豆根瘤菌生物保护剂中含上述标准短小芽孢杆菌0.1亿/mL。
对照例3
除采用短小芽孢杆菌菌剂(有效活菌数为50亿/mL，购自武汉科诺生物科技股份有限公司生产)替换实施例1的短小芽孢杆菌菌剂之外，其余与实施例1基本相同；本对照例的大豆根瘤菌生物保护剂中含上述短小芽孢杆菌0.1亿/mL。
对照例4
本对照例除大豆根瘤菌生物保护剂的组成不同之外(将根瘤菌胞外多糖粗液替换为海藻糖)，其余与实施例2基本相同。
本对照例的大豆根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.05亿/mL，紫云英根瘤菌9.95亿/mL，海藻糖20g/100mL，麦芽糊精为1g/100mL，山梨醇2g/100mL，大豆胚芽蛋白1g/100mL，海藻精0.01g/100mL，羧甲基纤维素钠0.4g/100mL，黄原胶0.15g/100mL，K-卡拉胶0.02g/100mL和刺槐豆胶0.01g/100mL。
对照例5
本对照例除大豆根瘤菌生物保护剂的组成不同之外(将海藻精替换为根瘤菌胞外多糖粗液)，其余与实施例2基本相同。
本对照例的大豆根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.05亿/mL，紫云英根瘤菌9.95亿/mL，根瘤菌胞外多糖粗液5.01g/100mL，海藻糖15g/100mL，麦芽糊精为1g/100mL，山梨醇2g/100mL，大豆胚芽蛋白1g/100mL，羧甲基纤维素钠0.4g/100mL，黄原胶0.15g/100mL，K-卡拉胶0.02g/100mL和刺槐豆胶0.01g/100mL。
对照例6
本对照例除大豆根瘤菌生物保护剂的组成不同之外(将刺槐豆胶替换为K-卡拉胶)，其余与实施例1基本相同。
本对照例的根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.1亿/mL，大豆根瘤菌7.9亿/mL，根瘤菌胞外多糖粗液7.5g/100mL，海藻糖10g/100mL，麦芽糊精为1.5g/100mL，山梨醇1.25g/100mL，大豆胚芽蛋白0.55g/100mL，海藻精0.03g/100mL，羧甲基纤维素钠0.35g/100mL，黄原胶0.1g/100mL和K-卡拉胶0.06g/100mL。
对照例7
本对照例除大豆根瘤菌生物保护剂的组成不同之外(将K-卡拉胶替换为刺槐豆胶)，其余与实施例1基本相同。
本对照例的根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.1亿/mL，大豆根瘤菌7.9亿/mL，根瘤菌胞外多糖粗液7.5g/100mL，海藻糖10g/100mL，麦芽糊精为1.5g/100mL，山梨醇1.25g/100mL，大豆胚芽蛋白0.55g/100mL，海藻精0.03g/100mL，羧甲基纤维素钠0.35g/100mL，黄原胶0.1g/100mL和刺槐豆胶0.06g/100mL。
对照例8
本对照例除大豆根瘤菌生物保护剂的组成不同之外(将刺槐豆胶替换为阿拉伯胶)，其余与实施例1基本相同。
本对照例的根瘤菌生物保护剂组成如下：短小芽孢杆菌0.1亿/mL，大豆根瘤菌7.9亿/mL，根瘤菌胞外多糖粗液7.5g/100mL，海藻糖10g/100mL，麦芽糊精为1.5g/100mL，山梨醇1.25g/100mL，大豆胚芽蛋白0.55g/100mL，海藻精0.03g/100mL，羧甲基纤维素钠0.35g/100mL，黄原胶0.1g/100mL，K-卡拉胶0.03g/100mL和阿拉伯胶0.03g/100mL。
试验例1
一、试验材料
大豆品种：黑河43号，包括裸种和包衣种子(使用亮盾对大豆种子进行包衣)；
拌种菌剂：富思德大豆根瘤菌菌剂(大豆根瘤菌CGMCC No.4346)，有效活菌数为119亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。
二、试验方法
设如下4个处理：
处理1：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为63.45亿/ml，用稀释后的菌剂5ml拌种1kg裸种(拌种菌剂大豆根瘤菌总菌数为317.25亿，与以下各处理大豆根瘤菌总菌数一致)。
处理2：将实施例1的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种。
处理3：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为63.45亿/ml，用稀释后的菌剂5ml拌种1kg包衣种子。
处理4：将对实施例1的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg包衣种子。
拌种后阴干，装入自封袋中，置于20℃环境下保存；分别在拌种后0天，3天，15天，30天，45天，60天对种子表面的根瘤菌数进行计数，计数方法参照GB20287-2006农用微生物菌剂中有效活菌数的测定方法，结果见表1。
表1拌种后放置不同时间大豆种子表面根瘤菌数
Figure BDA0004001898730000131
由表1可见：
未添加大豆根瘤菌生物保护剂的大豆裸种及包衣种子表面的根瘤菌数下降较快，而添加大豆根瘤菌生物保护剂能够明显提高裸种和包衣种子在拌种与储存过程中大豆根瘤菌的存活率。
试验例2
一、试验材料
紫云英品种：信紫1号，裸种；
拌种菌剂：紫云英根瘤菌菌剂，有效活菌数为100亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。
二、试验方法
设以下4个处理：
处理1：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为69.983亿/ml，用稀释后的菌剂15ml拌种1kg裸种(拌种菌剂紫云英根瘤菌总菌数为1049.75亿，与以下各处理紫云英根瘤菌总菌数一致)。
处理2：将对照例4的大豆根瘤菌生物保护剂5mL与拌种菌剂10mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理3：将对照例5的大豆根瘤菌生物保护剂5mL与拌种菌剂10mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理4：将实施例2的大豆根瘤菌生物保护剂5mL与拌种菌剂10mL混合均匀后拌种1kg裸种。
拌种后阴干，装入自封袋中，置于15℃环境下保存；分别在拌种后0天，30天，45天对种子表面的根瘤菌数进行计数，结果见表2。
表2使用不同大豆根瘤菌生物保护剂拌种后紫云英种子表面根瘤菌数
Figure BDA0004001898730000141
由表2种子表面计数结果可知：
与处理1相比，处理2、处理3虽能对根瘤菌起到一定的保护效果，但种子表面的根瘤菌存活率明显低于处理4；由此说明，本发明大豆根瘤菌生物保护剂中的根瘤菌胞外多糖粗液和海藻精具有明显的协同作用，能够明显地提升生物保护剂的保护效果。
试验例3
一、试验材料
黄豆品种：克山1号，裸种；
拌种菌剂：富思德大豆根瘤菌菌剂(大豆根瘤菌CGMCC No.4346)，有效活菌数为119亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。
二、试验方法
按下述处理方式进行处理：
处理1：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为63.45亿/ml，用稀释后的菌剂5ml拌种1kg裸种(拌种菌剂大豆根瘤菌总菌数为317.25亿，与以下各处理大豆根瘤菌总菌数一致)。
处理2：将对照例6的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理3：将对照例7的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理4：将对照例8的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理5：将实施例1的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种。
拌种后阴干，装入自封袋中，置于15℃环境下保存；分别在拌种后0天，30天，45天对种子表面的根瘤菌数进行计数，结果见表3。
表3使用不同大豆根瘤菌生物保护剂拌种后大豆种子表面根瘤菌数
Figure BDA0004001898730000161
由表3可见：
与处理5相比，处理2-4的大豆根瘤菌生物保护剂的保护效果都有不同程度的降低，说明大豆根瘤菌生物保护剂中的成膜剂(刺槐豆胶、K-卡拉胶、黄原胶和羧甲基纤维素钠)通过相互作用，发挥保护作用，降低根瘤菌的细胞失水问题，保护根瘤菌在大豆种子表面的存活。
试验例4
一、试验材料
大豆品种：黑河43号；
种衣剂：先正达亮盾种衣剂；
拌种菌剂：富思德大豆根瘤菌菌剂(大豆根瘤菌CGMCC No.4346)，有效活菌数为119亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。
二、试验方法
分别采用如下方法进行包衣，各处理大豆根瘤菌总菌数一致。
处理1：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为63.45亿/ml。在包衣机内对25kg豆种进行种衣剂包衣，包衣均匀后，倒出种子，放置24小时后，重新将种子倒入包衣机内，加入稀释后的拌种菌剂125ml进行根瘤菌拌种(拌种菌剂大豆根瘤菌的总菌数为7931.25亿，与以下各处理大豆根瘤菌总菌数一致)，拌种均匀后，将豆种阴干备用。
处理2：在包衣机内对25kg豆种进行种衣剂包衣，包衣均匀后，倒出种子，放置24小时后，重新将种子倒入包衣机内，加入实施例1的大豆根瘤菌生物保护剂与拌种菌剂的混合液(按体积比1：1混匀)125ml进行拌种，拌种均匀后，将豆种阴干备用。
处理3：在包衣机内对25kg豆种进行种衣剂包衣，包衣均匀后，继续转动3min，待种皮上的种衣剂干燥后，加入实施例1的大豆根瘤菌生物保护剂与拌种菌剂的混合液(按体积比1：1混匀)125ml进行拌种，拌种均匀后，将豆种阴干备用。
拌种后阴干，装入自封袋中，置于15℃环境下保存；分别在拌种0天，30天和45天测定上述3个处理的种子表面根瘤菌数，结果见表4。
表4不同包衣方式拌种后放置不同时间大豆种子表面根瘤菌数
Figure BDA0004001898730000171
由表4可见：
处理2与处理3大豆种子表面根瘤菌数基本相等，说明使用本发明的大豆根瘤菌生物保护剂可实现包种衣剂后立刻在包衣机内拌种根瘤菌，可明显缩短人工，提高包衣效率。
试验例5
一、试验材料
大豆品种：蒙豆48，采用亮盾进行包衣；
拌种菌剂：富思德大豆根瘤菌菌剂(大豆根瘤菌CGMCC No.4346)，有效活菌数为119亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。
二、试验方法
在领先生物农业股份有限公司的温室内进行大豆盆栽结瘤效果试验，试验设5个处理，各处理大豆根瘤菌总菌数保持一致。
处理1：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为63.45亿/ml，用稀释后的菌剂5ml拌种1kg裸种(拌种菌剂大豆根瘤菌总菌数为317.25亿，与以下各处理大豆根瘤菌总菌数一致)。
处理2：将实施例1的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理3：将对照例1的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理4：将对照例2的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种；
处理5：将对照例3的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5mL混合均匀后拌种1kg裸种；
拌种后阴干，装好后放置在15℃环境下。放置45天后，将种子播种在装有蛭石的盆钵中。播种前对蛭石及盆钵121℃灭菌30min。生长期内浇无氮营养液和无菌水。盛花期统计结瘤情况，结果见表5。
表5不同保护剂对大豆结瘤及生长的影响
Figure BDA0004001898730000181
注：表中不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)。
表5结果表明：
使用本发明的大豆根瘤菌生物保护剂后能使大豆根系的结瘤时间提前5天，并且显著地增加大豆有效结瘤数和根瘤重，主根根瘤明显增多。
与本发明的大豆根瘤菌生物保护剂处理相比，使用对照例1-3的保护剂明显降低了大豆有效根瘤数及根瘤重；由此说明，标准短小芽孢杆菌与其它普通市购短小芽孢杆菌对大豆根瘤菌的功效不具有明显的促进作用，而在大豆根瘤菌生物保护剂中添加本发明短小芽孢杆菌CGMCC No.25787的保护效果最佳，短小芽孢杆菌CGMCC No.25787与大豆根瘤菌同时使用时具有明显的增效作用。
试验例6
一、试验材料
大豆品种：克山1号，采用亮盾进行包衣；
拌种菌剂：富思德大豆根瘤菌菌剂(大豆根瘤菌CGMCC No.4346)，有效活菌数为119亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。
二、试验方法
在内蒙古阿荣旗某一田间进行大豆田间增产效果试验，试验设3个处理，各处理大豆根瘤菌总菌数保持一致。
处理1：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为63.45亿/ml，用稀释后的菌剂5ml拌种1kg裸种(拌种菌剂大豆根瘤菌总菌数为317.25亿，与以下各处理大豆根瘤菌总菌数一致)。播种前进行拌种。
处理2：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为63.45亿/ml，用稀释后的菌剂5ml拌种1kg裸种。播前45天进行拌种。
处理3：将实施例1的大豆根瘤菌生物保护剂2.5mL与拌种菌剂2.5混合均匀后拌种1kg裸种。播前45天进行拌种。
按照上述处理方式，根据田间实际播种量分别进行拌种。处理1的种子在播种前进行拌种；处理2、处理3播种前45天拌种，拌好的大豆种子放置在温度20℃的环境下45天后田间播种。在盛花期统计根瘤数及根瘤重，收获期测定大豆产量。结果见表6。
表6不同处理对大豆结瘤及产量的影响
Figure BDA0004001898730000201
表8中：不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)。
表6结果表明：
大豆根瘤菌与本发明的大豆根瘤菌生物保护剂配合使用后，拌种后的大豆种子放置45天后播种，较处理2的主根有效根瘤数，根瘤重，单株荚数，百粒重和产量显著提高，其中产量增幅为10.5％。
与处理1相比，处理3的有效根瘤数，根瘤重，单株荚数，百粒重和产量虽有小幅度的下降，但差异不显著；由此说明，使用本发明的大豆根瘤菌生物保护剂后播前45天拌种与未使用保护剂的播前拌种处理促生增产效果相当。
试验例7
一、试验材料
花生品种：冀花19，采用高巧进行包衣；
拌种菌剂：富思德花生根瘤菌菌剂(花生根瘤菌CGMCC No.8386)，有效活菌数为102亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。
二、试验方法
在秦皇岛昌黎县某一田间进行花生田间增产效果试验，试验设3个处理，各处理花生根瘤菌总菌数保持一致。
处理1：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为85.95亿/ml，稀释后的菌剂9.6ml拌种1kg裸种(拌种根瘤菌总菌数为825.12亿，以下各处理根瘤菌总菌数一致)。播种前进行拌种。
处理2：采用清水将拌种菌剂稀释至菌数为85.95亿/ml，稀释后的菌剂9.6ml拌种1kg裸种。播前45天进行拌种。
处理3：将实施例3的花生根瘤菌生物保护剂1.6mL与拌种菌剂8ml混合均匀后拌种1kg裸种。播前45天进行拌种。
按照上述处理方式，根据田间实际播种量分别进行拌种。其中，处理1的种子在播种前进行拌种；处理2、处理3播前30天拌种，拌好的花生种子放置在温度20℃的环境下30天后田间播种。在盛花期统计根瘤数及根瘤重，收获期测定花生产量，结果见表7。
表7不同处理对花生结瘤及产量的影响
Figure BDA0004001898730000211
表7结果表明：
花生根瘤菌与本发明的大豆根瘤菌生物保护剂配合使用后，拌种后的花生种子放置30天后播种，较处理2的有效根瘤数，单株果数、百果重、百仁重和产量显著提高，其中产量增幅为12.05％。
处理1与处理3的结瘤及产量均在同等水平，差异不显著；由此说明，花生根瘤菌与本发明的大豆根瘤菌生物保护剂配合使用后，拌种30天后播种与未使用保护剂播前拌种处理促生增产效果相当。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种大豆根瘤菌生物保护剂，其特征在于，包括第一组分、第二组分和第三组分：其中：
第一组分包括短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂，短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25787；
第二组分包括根瘤菌胞外多糖粗液5-10份，海藻糖5-15份，麦芽糊精1-2份，山梨醇0.5-2份，大豆胚芽蛋白0.1-1份和海藻精0.01-0.05份；
第三组分包括羧甲基纤维素钠0.2-0.5份，黄原胶0.1-0.2份，K-卡拉胶0.01-0.05份和刺槐豆胶0.01-0.05份。
2.根据权利要求1所述的大豆根瘤菌生物保护剂，其特征在于，根瘤菌菌剂中的根瘤菌选自大豆根瘤菌、花生根瘤菌、紫云英根瘤中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的大豆根瘤菌生物保护剂，其特征在于，该大豆根瘤菌生物保护剂中的有效活菌数为2-10亿/mL；
优选地，该大豆根瘤菌生物保护剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.05-0.5亿/mL，根瘤菌的有效活菌数为1.5-9.95亿/mL。
4.根据权利要求1所述的大豆根瘤菌生物保护剂，其特征在于，根瘤菌胞外多糖粗液中的多糖含量为19-22g/L，分子量为0.7×107-1.5×107Da；海藻精中的海藻酸含量为6-10％，植物激素含量为1500-2000mg/kg。
5.权利要求1-4任一所述的大豆根瘤菌生物保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：按重量份将根瘤菌胞外多糖粗液、海藻糖、麦芽糊精、山梨醇、大豆胚芽蛋白、海藻精、羧甲基纤维素钠、黄原胶、K-卡拉胶和刺槐豆胶混合均匀，得到混合物；
S2：向发酵反应器中注入水，开启搅拌桨，向水中加入步骤S1的混合物，搅拌混匀后升温溶解，随后灭菌，待冷却后按重量份加入短小芽孢杆菌菌剂和根瘤菌菌剂，混匀后调节pH值，无菌灌装，制得大豆根瘤菌生物保护剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，控制水的温度为15-30℃；搅拌桨的搅拌速度为100-200r/min；灭菌温度为80-90℃，灭菌持续时间为25-35min；调节pH值为7.0-8.5。
7.权利要求1-4任一所述的大豆根瘤菌生物保护剂在根瘤菌拌植物裸种或包衣种子中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，植物种子为大豆、花生、紫云英、苜蓿、绿豆、红小豆、豌豆、菜豆或黑豆的裸种或包衣种子。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，根瘤菌拌种方法包括：将液体大豆根瘤菌生物保护剂与液体根瘤菌菌剂按体积比1：(1-5)混合均匀后对植物裸种或包衣种子进行拌种。
10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，根瘤菌拌种方法还包括：在包衣机内对植物裸种进行种衣剂包衣，包衣均匀后继续转动3-5min，待种皮上的种衣剂干燥后，将液体大豆根瘤菌生物保护剂与液体根瘤菌菌剂按体积比1：(1-5)混合均匀后进行拌种，拌种均匀后阴干备用。
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