CN116948859B - 一种根瘤菌伴生菌剂及其在根瘤菌喷施中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种根瘤菌伴生菌剂及其在根瘤菌喷施中的应用。本发明的根瘤菌伴生菌剂包括短小芽孢杆菌、根瘤菌、豆芽提取物和海藻精；其中，短小芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25787，根瘤菌伴生菌剂的总有效活菌数为2‑25亿/mL，短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.05‑5亿/mL，豆芽提取物的含量为0.01‑0.05g/mL，海藻精的含量为0.01‑0.02g/mL。本发明的根瘤菌伴生菌剂在根瘤菌喷施过程中能增加根瘤菌在土壤中的活性，提高根瘤菌的侵染能力，进而提高作物的生物量，具有良好的促生及增产效果。

Description

一种根瘤菌伴生菌剂及其在根瘤菌喷施中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种根瘤菌伴生菌剂及其在根瘤菌喷施中的应用。

背景技术

豆科作物能够与根瘤菌共生固氮，满足自身生物固氮条件，且具有较高的固氮效率。根瘤菌-豆科作物共生体系在生物固氮中具有较强的固氮能力，充分发挥了根瘤菌在豆科作物中的固氮作用，不仅可以有效地减少化学氮肥的施用，也将促进大豆生产节本增效和产业的绿色发展。

目前，根瘤菌剂(液体)的接种方式多以播前拌种方式为主。然而，播前拌种方式存在费时费力、与大面积机械化播种操作不配套等问题，从而极大地制约了根瘤菌的推广与应用；同时，现有的机械化喷施方法不能达到有效、简便及精准等效果，这也限制了根瘤菌的应用。特别是，根瘤菌进入土壤后，受各方面环境条件的影响，并不能够保证其完全存活或者形成优势菌群，从而使其应用效果大大降低，因此提高根瘤菌在土壤中的活性及侵染能力具有显著意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种根瘤菌伴生菌剂及其在根瘤菌喷施中的应用，该根瘤菌伴生菌剂在根瘤菌喷施过程中可以增加根瘤菌在土壤中的活性，提高根瘤菌的侵染能力，进而提高作物的生物量。

本发明提供一种根瘤菌伴生菌剂，包括短小芽孢杆菌、根瘤菌、豆芽提取物和海藻精；其中，短小芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25787，根瘤菌伴生菌剂的总有效活菌数为2-25亿/mL，短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.05-5亿/mL，豆芽提取物的含量为0.01-0.05g/mL，海藻精的含量为0.01-0.02g/mL。

本发明的短小芽孢杆菌分离自大豆植株根瘤，为大豆根瘤菌的伴生菌，经16SrDNA测序表明与短小芽孢杆菌的同源性为99％，分类命名为：短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，保藏编号为：CGMCC No.25787，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号楼中国科学院微生物研究所，保藏时间为：2022年09月23日。

本发明的短小芽孢杆菌具有广谱性，能与根瘤菌共同生长，相互没有拮抗作用，在与根瘤菌同时施用时具有明显的增效作用，不仅能够促进结瘤并显著提高植株的生物量，还能够明显增强植株的抗性，有利于提高根瘤菌的实际应用效果。

本发明对短小芽孢杆菌的发酵培养基和发酵方法不作严格限制，可以采用本领域的常规培养基及培养条件进行发酵。在一实施方式中，短小芽孢杆菌发酵所采用的发酵培养基的组成为：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨1-3g/L，硫酸铵2-4g/L，磷酸氢二钾0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，pH值6.8-7.0；此外，短小芽孢杆菌的发酵条件如下：接种量4-6％，发酵温度为30-35℃，转速为180-200rpm，发酵时间为40-56h。

本发明对所采用的根瘤菌不作严格限制，例如可以选自大豆根瘤菌、花生根瘤菌、紫云英根瘤菌和苜蓿根瘤菌中的至少一种；其中，大豆根瘤菌包括慢生型大豆根瘤菌和快生型大豆根瘤菌中的至少一种。具体地，大豆根瘤菌可以采用大豆根瘤菌CGMCC No.4346，花生根瘤菌可以采用花生根瘤菌CGMCC No.8386，紫云英根瘤菌可以采用紫云英根瘤菌CGMCC No.4347，苜蓿根瘤菌可以采用登记证号为微生物肥(2005)准字(0154)号产品的生产菌株。

在本发明中，豆芽提取物可以选自黄豆芽提取物、黑豆芽提取物、绿豆芽提取物和红豆芽提取物中的至少一种，优选为黄豆芽提取物，黄豆芽提取物购自宁夏香草生物技术有限公司。研究表明：豆芽提取物含有丰富的多糖、脂类、维生素、蛋白质、多酚及黄酮类物质，可以促进种子萌发及生长，特别是黄酮类物质作为结瘤的初始信号，在豆科作物结瘤过程中具有关键作用。

在本发明中，海藻精(也称为活性海藻肥)可以采用CN104892157A方法制备。具体地，海藻精中的海藻酸含量为6-10％，植物激素含量为1500-2000mg/kg；此外，海藻精含有5-20％的K₂O，1-2％的P₂O₅，0.5-1.0％的N，30-40％的有机质、0.05-0.10％的Ca和0.2-0.3％的Mg。上述海藻精的活性成分及养分含量较高，既能提高根瘤菌的抗旱性，促进根瘤菌在土壤中大量繁殖，形成优势菌群，同时还能提高根瘤菌的侵染能力。

进一步地，在本发明的根瘤菌伴生菌剂中，根瘤菌的有效活菌数为2.5-17亿/mL，短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.5-3亿/mL；根瘤菌伴生菌剂的总有效活菌数为3-20亿/mL。

本发明还提供上述根瘤菌伴生菌剂在根瘤菌喷施中的应用。

本发明还提供一种根瘤菌喷施方法，将上述根瘤菌伴生菌剂与根瘤菌剂混合、稀释后进行喷施。

本发明的根瘤菌喷施方法可以采用喷施系统进行，对喷施系统的结构不作严格限制，可根据实际需要合理设置。在一实施方式中，喷施系统可以包括喷淋系统、搅拌系统和控制系统，喷淋系统包括液箱和喷淋头，液箱与喷淋头通过送液管道连通，在送液管道上设有喷淋泵、比例阀、分配器、电磁阀和流量传感器，搅拌系统包括搅拌浆和用于驱动搅拌浆的驱动电机，搅拌浆安装在液箱上以对液箱中的喷施液进行搅拌，控制系统包括可编程控制器和计数装置，计数装置采集喷吐种子次数以及每次喷吐种子数量，流量传感器采集喷施液流量信号传输给可编程控制器，可编程控制器根据喷吐种子次数信号对电磁阀的开关进行控制以对每次喷吐种子定点喷施，可编程控制器根据每次喷吐种子数量信号对喷淋泵的转速和/或比例阀的开度进行控制以调节喷施液流量。

具体地，本发明的根瘤菌喷施方法可以包括如下步骤：

S1：设定喷施系统参数；

S2：将根瘤菌伴生菌剂和根瘤菌剂加入喷施系统的液箱中，加水稀释后，混合均匀；

S3：启动喷施系统，可编程控制器通过计数装置收集并反馈的喷吐种子次数和每次喷吐种子数量信号控制喷施系统对种子进行定点、定量喷施。

进一步地，步骤S1中，设定喷施系统参数包括：以种子落点为圆心的喷施直径和/或单位时间的喷施量；步骤S2中，控制根瘤菌伴生菌剂和根瘤菌剂的体积比1：(1-10)；稀释倍数为20-300倍；步骤S3中，定点、定量喷施使每粒种子表面短小芽孢杆菌的有效活菌数为10²-10⁴cfu。

本发明对喷施用的根瘤菌不作严格限制，例如可以采用大豆根瘤菌、花生根瘤菌、黑豆根瘤菌、豌豆根瘤菌、紫云英根瘤菌、苜蓿根瘤菌等。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明的根瘤菌伴生菌剂中含有短小芽孢杆菌CGMCC No.25787，该短小芽孢杆菌对根瘤菌的施用具有明显的增效作用，显著提高了根瘤菌的实际应用效果；

2、本发明的根瘤菌伴生菌剂还含有豆芽提取物和海藻精，其与短小芽孢杆菌CGMCC No.25787具有良好的协同增效作用，在根瘤菌喷施过程中能增加根瘤菌在土壤中的活性，提高根瘤菌的侵染能力和作物的生物量，具有良好的促生及增产效果，对根瘤菌的实际推广和应用意义显著；

3、本发明的根瘤菌喷施方法能够实现对根瘤菌定点、定量喷施，提高了喷施的精准度，减少不必要的浪费，降低成本。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、制备短小芽孢杆菌剂

对短小芽孢杆菌CGMCC No.25787进行常规活化、种子培养后，按发酵培养基体积的5％向发酵培养基中接入种子培养后的种子液，发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨3g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L；于32℃、200rpm恒温震荡培养2天，制得短小芽孢杆菌菌剂；经检测，该短小芽孢杆菌菌剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数为70亿/mL。

二、制备海藻精

按照CN104892157A公开的实施例1方法制备海藻精；该海藻精以重量计含有海藻酸6％，植物激素1620mg/kg，K₂O 6％，P₂O₅ 1.4％，N 0.6％，有机质38％，Ca 0.05％，Mg0.3％。

三、制备根瘤菌伴生菌剂

本实施例的根瘤菌剂采用大豆根瘤菌CGMCC No.4346，由领先生物农业股份有限公司生产，有效活菌数为114亿/mL，生产符合登记证号微生物肥(2019)准字(6718)号；豆芽提取物为黄豆芽提取物，购自宁夏香草生物技术有限公司。

将短小芽孢杆菌剂、根瘤菌剂、豆芽提取物、海藻精和水混合均匀，制得根瘤菌伴生菌剂；本实施例的根瘤菌伴生菌剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数为3亿/mL，大豆根瘤菌的有效活菌数为17亿/mL，豆芽提取物的含量为0.03g/mL，海藻精的含量为0.02g/mL。

实施例2

一、制备海藻精

按照CN104892157A公开的实施例3方法制备海藻精；该海藻精以重量计含有海藻酸10％，植物激素2000mg/kg，K₂O 20％，P₂O₅ 1.0％，N 1.0％，有机质40％，Ca 0.08％，Mg0.2％。

二、制备根瘤菌伴生菌剂

本实施例的短小芽孢杆菌剂的制备方法同实施例1；根瘤菌剂采用花生根瘤菌CGMCC No.8386，由领先生物农业股份有限公司生产，有效活菌数为102亿/mL，生产符合登记证号微生物肥(2015)准字(1614)号；豆芽提取物为黄豆芽提取物，购自宁夏香草生物技术有限公司。

将短小芽孢杆菌剂、根瘤菌剂、豆芽提取物、海藻精和水混合均匀，制得根瘤菌伴生菌剂；本实施例的根瘤菌伴生菌剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数为2亿/mL，花生根瘤菌的有效活菌数为10亿/mL，豆芽提取物的含量为0.01g/mL，海藻精的含量为0.01g/mL。

实施例3

本实施例的短小芽孢杆菌剂和海藻精的制备方法同实施例1；根瘤菌剂采用紫云英根瘤菌CGMCC No.4347，由领先生物农业股份有限公司生产，有效活菌数为96亿/mL，生产符合登记证号微生物(2011)准字(0687)号；豆芽提取物为黄豆芽提取物，购自宁夏香草生物技术有限公司。

将短小芽孢杆菌剂、根瘤菌剂、豆芽提取物、海藻精和水混合均匀，制得根瘤菌伴生菌剂；本实施例的根瘤菌伴生菌剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.5亿/mL，紫云英根瘤菌的有效活菌数为2.5亿/mL，豆芽提取物的含量为0.05g/mL，海藻精的含量为0.01g/mL。

实施例4

本实施例的短小芽孢杆菌剂和海藻精的制备方法同实施例1；根瘤菌剂采用苜蓿根瘤菌，登记证号：微生物肥(2005)准字(0154)号产品的生产菌株，有效活菌数为58亿/mL，由领先生物农业股份有限公司生产；豆芽提取物为黄豆芽提取物，购自宁夏香草生物技术有限公司。

将短小芽孢杆菌剂、根瘤菌剂、豆芽提取物、海藻精和水混合均匀，制得根瘤菌伴生菌剂；本实施例的根瘤菌伴生菌剂中短小芽孢杆菌的有效活菌数为1亿/mL，苜蓿根瘤菌的有效活菌数为5亿/mL，豆芽提取物的含量为0.02g/mL，海藻精的含量为0.02g/mL。

对照例1

除根瘤菌伴生菌剂中不添加短小芽孢杆菌之外，其余与实施例1相同。

对照例2

除采用普通市售短小芽孢杆菌剂(有效活菌数为68亿/mL，购自武汉科诺生物科技股份有限公司)替换实施例1的短小芽孢杆菌剂之外，其余与实施例1相同；本对照例的根瘤菌伴生菌剂中上述普通市售短小芽孢杆菌的有效活菌数为3亿/mL。

对照例3

除采用普通市售短小芽孢杆菌剂(有效活菌数为60亿/mL，购自江苏天象生物科技有限公司)替换实施例1的短小芽孢杆菌剂之外，其余与实施例1相同；本对照例的根瘤菌伴生菌剂中上述普通市售短小芽孢杆菌的有效活菌数为3亿/mL。

对照例4

除采用标准短小芽孢杆菌剂(有效活菌数为50亿/mL，购自北京万佳标准物质研发中心，编号BWCC66005)替换实施例1的短小芽孢杆菌剂之外，其余与实施例1相同；本对照例的根瘤菌伴生菌剂中上述标准短小芽孢杆菌的有效活菌数为3亿/mL。

对照例5

本对照例除根瘤菌伴生菌剂的组成不同之外(将海藻精替换为豆芽提取物)，其余与实施例2基本相同。

本对照例的根瘤菌伴生菌剂组成如下：短小芽孢杆菌的有效活菌数为2亿/mL，花生根瘤菌的有效活菌数为10亿/mL，豆芽提取物的含量为0.02g/mL。

对照例6

本对照例除根瘤菌伴生菌剂的组成不同之外(将豆芽提取物替换为海藻精)，其余与实施例2基本相同。

本对照例的根瘤菌伴生菌剂组成如下：短小芽孢杆菌的有效活菌数为2亿/mL，花生根瘤菌的有效活菌数为10亿/mL，海藻精的含量为0.02g/mL。

对照例7

除根瘤菌伴生菌剂中不添加短小芽孢杆菌之外，其余与实施例3相同。

对照例8

本对照例除根瘤菌伴生菌剂的组成不同之外(将海藻精替换为豆芽提取物)，其余与实施例3基本相同。

本对照例的根瘤菌伴生菌剂组成如下：短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.5亿/mL，紫云英根瘤菌的有效活菌数为2.5亿/mL，豆芽提取物的含量为0.06g/mL。

对照例9

本对照例除根瘤菌伴生菌剂的组成不同之外(将豆芽提取物替换为海藻精)，其余与实施例3基本相同。

本对照例的根瘤菌伴生菌剂组成如下：短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.5亿/mL，紫云英根瘤菌的有效活菌数为2.5亿/mL，海藻精的含量为0.06g/mL。

对照例10

除采用普通市售短小芽孢杆菌剂(有效活菌数为53亿/mL，河北中保绿农作物科技有限公司)替换实施例4的短小芽孢杆菌剂之外，其余与实施例4相同；本对照例的根瘤菌伴生菌剂中上述普通市售短小芽孢杆菌的有效活菌数为1亿/mL。

对照例11

除采用普通市售短小芽孢杆菌剂(有效活菌数为61亿/mL，购自广西东园生态农业科技有限公司)替换实施例4的短小芽孢杆菌剂之外，其余与实施例4相同；本对照例的根瘤菌伴生菌剂中上述普通市售短小芽孢杆菌的有效活菌数为1亿/mL。

试验例1

一、试验材料

大豆品种：黑河43号；

喷施菌剂：富思德大豆根瘤菌菌剂(大豆根瘤菌CGMCC No.4346)，有效活菌数为114亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。

二、试验方法

设置七个处理组：

处理1：喷施清水(20mL/亩)；

处理2：用清水将喷施菌剂稀释至有效活菌数65.5亿/mL，稀释后的菌剂用量为20mL/亩(大豆根瘤菌总菌数1310亿，与其他处理总菌数一致)；

处理3：喷施菌剂(10mL/亩)和实施例1的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂；

处理4：喷施菌剂(10mL/亩)和对照例1的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂；

处理5：喷施菌剂(10mL/亩)和对照例2的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂；

处理6：喷施菌剂(10mL/亩)和对照例3的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂；

处理7：喷施菌剂(10mL/亩)和对照例4的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂。

本试验的7个处理采用以下方法进行喷施：

S1：设定喷施系统参数，其中以种子落点为圆心的喷施直径为30mm、单位时间的喷施量3L/min。

S2：将不同处理的清水、喷施菌剂或混合菌剂加入喷施系统的液箱中，加水150倍稀释后，混合均匀。

S3：启动喷施系统进行喷施。

于盛花期调查各处理的大豆有效结瘤数、根瘤重及地上部生物量鲜重，于收获期进行测产，结果见表1。

表1不同处理对大豆结瘤及产量的影响

注：不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)。

表1结果表明：

1、使用本发明的根瘤菌伴生菌剂(处理3)后能显著地增加大豆的有效根瘤数、根瘤重，主根瘤明显增多，产量较单独喷施菌剂处理(处理2)增加5.4％；

2、使用对照例2-4的根瘤菌伴生菌剂(处理5-7)与使用对照例1的根瘤菌伴生菌剂(处理4)综合效果持平，说明标准短小芽孢杆菌及其它普通市售短小芽孢杆菌剂对大豆根瘤菌并无明显的协同增效作用；

3、与处理4-7相比，处理3大豆的有效结瘤数、根瘤重及产量明显增加，说明本发明的根瘤菌伴生菌剂中使用的短小芽孢杆菌CGMCC No.25787可提高根瘤菌的侵染能力，进而提高作物的生物量，具有良好的增产效果。

试验例2

一、试验材料

花生品种：冀花19号；

喷施菌剂：花生根瘤菌剂(CGMCC No.8346)，有效活菌数为102亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。

二、试验方法

设置五个处理组：

处理1：喷施清水；

处理2：用清水将喷施菌剂稀释至有效活菌数86.6亿/mL，稀释后的菌剂用量为180mL/亩(花生根瘤菌总菌数15600亿，与其他处理总菌数一致)；

处理3：喷施菌剂(150mL/亩)和实施例2的根瘤菌伴生菌剂(30mL/亩)的混合菌剂；

处理4：喷施菌剂(150mL/亩)和对照例5的根瘤菌伴生菌剂(30mL/亩)的混合菌剂；

处理5：喷施菌剂(150mL/亩)和对照例6的根瘤菌伴生菌剂(30mL/亩)的混合菌剂。

本试验的5个处理采用以下方法进行喷施：

S1：设定喷施系统参数，其中以种子落点为圆心的喷施直径为50mm、单位时间的喷施量1L/min。

S2：将不同处理的清水、喷施菌剂或混合菌剂加入喷施系统的液箱中，加水稀释20倍后，混合均匀。

S3：启动喷施系统进行喷施。

于盛花期调查花生有效根瘤数、下针数及地上部生物量鲜重，于收获期进行测产，结果见表2。

表2不同处理对花生结瘤及产量的影响

注：不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)。

表2结果表明：

1、采用本发明的根瘤菌伴生菌剂和喷施菌剂的混合菌剂对花生喷施(处理3)，产量较单独喷施菌剂处理(处理2)增加6.3％，说明使用本发明的根瘤菌伴生菌剂后能显著地增加花生的根瘤数、下针数、单株荚果数和百果重；

2、与单独喷施菌剂处理(处理2)相比，使用对照例5、6(处理4、处理5)的根瘤菌伴生菌剂虽能在一定程度上促进花生结瘤和产量；但与本发明的根瘤菌伴生菌剂处理(处理3)相比，花生的根瘤数、下针数，植株鲜重，单株荚果数、百粒重和产量明显降低；由此表明，本发明根瘤菌伴生菌剂中的豆芽提取物和海藻精具有明显的协同增效作用，能明显地促进花生花生生长，提高产量。

试验例3

一、试验材料

紫云英品种：信紫1号；

喷施菌剂：紫云英大豆根瘤菌(CGMCC No.4347)，有效活菌数为96亿/mL，由领先生物农业股份有限公司生产。

二、试验方法

按下述方式设置六个处理组：

处理1：喷施清水；

处理2：用清水将喷施菌剂稀释至有效活菌数72.6亿/mL，稀释后的菌剂用量为40mL/亩(紫云英大豆根瘤菌总菌数2905亿，与其他处理总菌数一致)；

处理3：喷施菌剂(30mL/亩)和实施例3的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂；

处理4：喷施菌剂(30mL/亩)和对照例7的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂；

处理5：喷施菌剂(30mL/亩)和对照例8的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂；

处理6：喷施菌剂(30mL/亩)和对照例9的根瘤菌伴生菌剂(10mL/亩)的混合菌剂。

本试验的6个处理采用以下方法进行喷施：

S1：设定喷施系统参数，其中以种子落点为圆心的喷施直径为15mm、单位时间的喷施量1L/min。

S2：将不同处理的清水、喷施菌剂或混合菌剂加入喷施系统的液箱中，加水稀释100倍后，混合均匀。

S3：启动喷施系统进行喷施。

于初花期调查紫云英有效根瘤数量、根瘤重及地上部生物量鲜重，于盛花期调查单株分枝数、株高、鲜草产量，结果见表3。

表3不同处理对紫云英结瘤及产量的影响

注：不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)。

表3结果表明：

1、使用本发明的根瘤菌伴生菌剂(处理3)后能显著地增加紫云英的根瘤数、根瘤重、及产量，其中鲜重产量较单独喷施菌剂处理(处理2)增加6.6％。

2、当根瘤菌伴生菌剂中不添加短小芽孢杆菌(处理4)、不添加海藻精(处理5)、不添加豆芽提取物(处理6)时，其较处理2虽有一定的促生和增产作用，但效果明显不及本发明的根瘤菌伴生菌剂；由此表明，本发明根瘤菌伴生菌剂中的短小芽孢杆菌、海藻精和豆芽提取物对根瘤菌具有显著的协同增效作用，能够明显地提升喷施菌剂的效果。

试验例4

一、试验材料

苜蓿品种：公农1号；

喷施菌剂：苜蓿根瘤菌，登记证号：微生物肥(2005)准字(0154)号产品的生产菌株，有效活菌数为58亿/mL，领先生物农业股份有限公司生产。

二、试验方法

设置五个处理组：

处理1：喷施清水；

处理2：用清水将喷施菌剂稀释至有效活菌数40.3亿/mL，稀释后的菌剂用量为15mL/亩(苜蓿根瘤菌总菌数605亿，与其他处理总菌数一致)；

处理3：喷施菌剂(10mL/亩)和实施例4的根瘤菌伴生菌剂(5mL/亩)的混合液；

处理4：喷施菌剂(10mL/亩)和对照例10的根瘤菌伴生菌剂(5mL/亩)的混合液；

处理5：喷施菌剂(10mL/亩)和对照例11的根瘤菌伴生菌剂(5mL/亩)的混合液。

本试验的5个处理采用以下方法进行喷施：

S1：设定喷施系统参数，其中以种子落点为圆心的喷施直径为10mm、单位时间的喷施量1L/min。

S2：将不同处理的清水、喷施菌剂或混合液加入喷施系统的液箱中，加水稀释200倍后，混合均匀。

S3：启动喷施系统进行喷施。

于开花期调查苜蓿有效根瘤数量、根瘤重及结瘤率，于盛花期调查分枝数、株高、产量，结果见表4。

表4不同处理对苜蓿结瘤及产量的影响

注：不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)。

表4结果表明：

1、使用本发明的根瘤菌伴生菌剂(处理3)后能显著地增加苜蓿的根瘤数、根瘤重及结瘤率，进而促进苜蓿生长，提高干草产量，产量较单独喷施菌剂处理(处理2)增加5.4％；

2、与处理2相比，处理4和处理5的伴生菌剂并未明显地促进结瘤并增加产量，由此说明常规市售短小芽孢杆菌基本不具有根瘤菌协同增效作用；而本发明根瘤菌伴生菌剂中加入的短小芽孢杆菌CGMCC No.25787具有很好的伴生促生效果，增效明显。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种根瘤菌伴生菌剂，其特征在于，包括短小芽孢杆菌、根瘤菌、豆芽提取物和海藻精；其中，短小芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25787，根瘤菌伴生菌剂的总有效活菌数为2-25亿/mL，短小芽孢杆菌的有效活菌数为0.05-5亿/mL，豆芽提取物的含量为0.01-0.05g/mL，海藻精的含量为0.01-0.02g/mL，根瘤菌选自大豆根瘤菌、花生根瘤菌、紫云英根瘤菌和苜蓿根瘤菌中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的根瘤菌伴生菌剂，其特征在于，豆芽提取物选自黄豆芽提取物、黑豆芽提取物、绿豆芽提取物和红豆芽提取物中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的根瘤菌伴生菌剂，其特征在于，海藻精中的海藻酸含量为6-10％，植物激素含量为1500-2000mg/kg。

4.权利要求1-3任一所述的根瘤菌伴生菌剂在根瘤菌喷施中的应用。

5.一种根瘤菌伴生菌剂的喷施方法，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的根瘤菌伴生菌剂与根瘤菌剂混合、稀释后进行喷施。

6.根据权利要求5所述的喷施方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：设定喷施系统参数；

S2：将根瘤菌伴生菌剂和根瘤菌剂加入喷施系统的液箱中，加水稀释后，混合均匀；

S3：启动喷施系统，可编程控制器通过计数装置收集并反馈的喷吐种子次数和每次喷吐种子数量信号控制喷施系统对种子进行定点、定量喷施。

7.根据权利要求6所述的喷施方法，其特征在于，步骤S1中，喷施系统参数包括：以种子落点为圆心的喷施直径和/或单位时间的喷施量。

8.根据权利要求6所述的喷施方法，其特征在于，步骤S2中，控制根瘤菌伴生菌剂和根瘤菌剂的体积比1：(1-10)；稀释倍数为20-300倍。

9.根据权利要求6所述的喷施方法，其特征在于，步骤S3中，定点、定量喷施使每粒种子表面短小芽孢杆菌的有效活菌数为10²-10⁴cfu。