CN109679944B - 一株高产细菌素乳酸菌的选育方法及其应用 - Google Patents

一株高产细菌素乳酸菌的选育方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，属于生物工程技术领域，该乳酸菌的选育是通过对乳酸菌进行诱变处理，然后进行筛选及抑菌物质测定，最终得到产细菌素的乳酸菌；上述诱变处理采用紫外‑微波复合诱变的方法；上述紫外诱变用菌株培养液中含有复硝酚钠和二甘醇。本发明提供的高产细菌素乳酸菌的选育方法能延长乳酸菌的生长期，提高合成细菌素效率，诱变致死率低，代谢产物多，所产细菌素能耐低温、高温环境，酸碱稳定性能强，具有广谱抑菌能力，生产成本低。本发明提供的高产细菌素乳酸菌可适用于规模化食品、医疗、饲料及发酵工业的保鲜防腐以及生物防治领域，用于减少或抑制细菌的定植或生长。

Description

一株高产细菌素乳酸菌的选育方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产细菌素乳酸菌的选育方法及其应用。
背景技术
乳酸菌是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌，是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、德国酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌渍食品和其他发酵食品。其形态特征为乳酸链球菌族，菌体球状，通常成对或成链。
细菌素是由细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，抑菌范围不仅仅局限于同源细菌，产生菌对其细菌素有自身免疫性。大多数乳酸菌在代谢过程中都能合成这种物质，通称为乳酸菌素，它具有抑制和杀死食品中多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌的作用，少数乳酸菌对革兰氏阴性菌有效，并具有分子热稳定性高和安企性高的优点，被公认为天然的食品防腐剂。细菌素对一定范围的微生物有抑杀作用，通过抑制芽孢萌发，在细菌细胞膜上形成亲水孔道等方式，导致细胞自溶而死亡。
乳酸菌细菌素的功效丰富，包括改善胃肠道功能，维持肠道菌群平衡；提供营养物质，促进机体生长乳酸菌；改善免疫能力；帮助吸收营养成分；对一些腐败菌和低温细菌有较好的抑制作用。我国是一个乳酸菌资源非常丰富的国家，但是对乳酸菌细菌素的研究起步较晚，目前乳酸菌细菌素已经引起广大从事乳酸菌、食品添加剂、益生素及开发新药等领域研究人员的极大兴趣，出现了研究热潮，近年来新的乳酸菌细菌素不断出现，报道乳酸菌细菌素的文献资料和专利数量也越来越多，目前的研究主要集中于新菌株和高产菌株的筛选以及对已知乳酸菌细菌素遗传因子的鉴定及结构基因的克隆和排序上。
乳酸菌细菌素作为一种安全、无毒、天然的食品防腐剂和抗菌添加剂，为食品加工和食品保藏提供了一个新的方法，细菌素也可以作为发酵剂发酵的副产物存在于成熟奶酪、酸奶、腊肠、泡菜等食品中。但随着其应用的推广以及不同行业对细菌素性质要求的不断提高，在细菌素的研究中还存在许多有待解决的问题，主要有:(1)细菌素的产量普遍较低，产量不稳定；(2)细菌素的抑菌谱较窄，大部分细菌素只对革兰氏阳性菌有作用，而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌没有抑制作用；(3)细菌素在不同食品介质中的溶解性和稳定性各异，而且只有在偏酸的环境中才有活性。因此，利用分子生物学和生物技术的发展，不断研究和培育新的细菌素及菌体，以及在实际生产生活中的应用，都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生长期延长，代谢产物多，合成细菌素效率高，诱变致死率低的高产细菌素乳酸菌的选育方法，所产细菌素能耐低温、高温环境，酸碱稳定性能强，具有广谱抑菌能力，生产成本低，适用于规模化食品、医疗、饲料及发酵工业的保鲜防腐以及生物防治领域，用于减少或抑制细菌的定植或生长。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，是通过对乳酸菌进行诱变处理，然后进行筛选及抑菌物质测定，最终得到产细菌素的乳酸菌；上述诱变处理采用紫外-微波复合诱变的方法；上述紫外诱变用菌株培养液中含有复硝酚钠和二甘醇。该方法得到的乳酸菌可提前进入对数生长期，代谢产物增多，且耐低温、高温环境，所产细菌素具有广谱抑菌能力，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和霉菌均有一定的抑制作用，且可被动物体内的蛋白酶降解，节能环保，成本低，适用于规模化食品、药物、饲料等保鲜防腐以及生物防治领域。
作为优选，紫外-微波复合诱变条件如下：紫外灯功率为20~30W，照射时间为60~120s，微波功率为500~700W，辐照时间为3~5min，期间每隔5~10s取出置于冰浴中3~5s，直至辐照结束。采用紫外-微波复合诱变得到的突变菌株，其抑菌效价显著提高，菌株的生长能力和抑菌性能均增强，同时增强其对高温、低温环境的耐受性能，具有稳定的遗传性，实用价值显著提升。
作为优选，诱变用菌株为对数生长中后期的菌株；上述紫外诱变用菌株培养液为MRS液体培养基；上述复硝酚钠和二甘醇在液体培养基中的含量分别为0.005~0.015g/L和0.003~0.007g/L。在紫外线照射下，乳酸菌细胞内的有机物质发生化学变化，在产生有益诱变的同时，也会使细菌致死，培养基中的复硝酸钠和二甘醇在加入乳酸菌细胞后，利用亲和性能强的醇羟基、酚羟基与细胞质中有机物共同作用，保护和促进细胞的原生质流动，提高细胞活力，降低细菌的致死率，将体系转向有益诱变的方向推进，同时在紫外光能辅助下，使得乳酸菌增殖速度和生长能力增强，且耐低温能力提升，在低温下可长时间保持抑菌活性而不失活，显著增加了乳酸菌的适用范围和实用价值。
进一步优选，诱变用原始菌株分离自酸奶、泡菜或酸菜中。
作为优选，紫外诱变完成后，需筛选优势较好的菌株作为微波诱变的出发菌株；紫外诱变和微波诱变的出发菌株活菌浓度为107~108cfu/mL。紫外线照射产生诱变的同时，细胞也会部分发生死亡，因此紫外诱变后，筛选出生长优势较明显的菌株，可增加后续诱变的成功率。
作为优选，筛选是将诱变后的菌株以3~5%的接种量接入MRS液体培养基，于25~39℃条件下培养至对数生长中后期后，离心取上清液，采用牛津杯法进行抑菌试验，选出抑菌圈直径大于出发菌株的，进入下一轮诱变或为诱变完成菌株。抑菌圈直径大于出发菌株抑菌圈直径的菌株，说明诱变后的菌株抑菌能力增强了，完成了有益诱变。
进一步优选，牛津杯法采用的指示菌为革兰氏阳性菌或阴性菌，选自金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、李斯特菌、大肠杆菌、变形杆菌中的至少一种。
作为优选，抑菌物质测定包括硫酸铵沉淀法和酶解试验；测定对象为培养诱变完成菌株的发酵液经离心后的上清液。
进一步优选，硫酸铵沉淀法步骤如下：取上清液加入饱和度为40~90%的硫酸铵，混匀后于0~5℃保存12~16h，然后经8000~10000r/min离心10~20min，取沉淀溶解后，放入500~5000Da透析袋中，透析12~24h，再一次通过牛津杯法作抑菌试验。
进一步优选，酶解试验步骤为：取经硫酸铵沉淀后的抑菌液体，使用蛋白酶进行酶解试验1~3h，然后取酶解液通过牛津杯法作抑菌试验，无抑菌圈则表明菌株所产抑菌物质是细菌素；上述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K中的任意一种。
再进一步优选，牛津杯法步骤为：将指示菌接种于LB液体培养基中，于35~37℃培养5~10h，取指示菌菌液0.2~0.5mL，与5~10mL经融化后保持在50℃的LB半固体培养基混匀，立即倒在无菌琼脂平板上，待凝固后，放上牛津杯，每隔平板放置3~6个，并分别向牛津杯中加入乳酸菌发酵液所产上清液0.1~1mL，将平板放于4℃冰箱中静置4~6h，然后在25~35℃下培养6~18h，观察牛津杯周围是否有抑菌圈形成，以此筛选产抑菌物质的菌株。
一种上述的选育方法得到的高产细菌素乳酸菌的应用，该乳酸菌在饲料、医疗、生物防治、食品和发酵工业中的用途，用于减少或抑制细菌的定植或生长。
本发明的有益效果为：
1）本发明中利用紫外-微波复合诱变技术，对乳酸菌进行有益诱变，细菌致死率低，细菌素合成效率高，能显著提高菌株的抑菌效价，菌株的增殖速度和生长能力均得到提升，同时增强其对高温、低温环境的耐受性能，具有稳定遗传性，实用价值显著提升；
2）本发明所制乳酸菌生长期延长，代谢产物增多，且耐低温、高温环境，耐碱性能显著增加，酸碱稳定性能增强，所产细菌素具有广谱抑菌能力，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和霉菌均有一定的抑制作用，且可被动物体内的蛋白酶降解，节能环保，生产成本低；
3）本发明所制乳酸菌在高温、低温、酸性、碱性环境下均能保持良好的抑菌活性，在极端环境下耐受性良好，扩宽了乳酸菌的适用范围，显著增加其实用性和经济性，适用于规模化食品、医疗、饲料及发酵工业的保鲜防腐以及生物防治领域，减少或抑制细菌的定植或生长。
本发明采用了上述技术方案提供一株高产细菌素乳酸菌的选育及其应用，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为试验例1中的乳酸菌生长曲线示意图；
图2为试验例2中的pH值敏感性试验结果示意图；
图3为试验例2中的温度敏感性试验结果示意图；
图4为试验例2中的冷藏对抑菌效果的影响结果示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，若制固体培养基，则加入琼脂18.0g，加入蒸馏水配至1000mL，于115℃湿热灭菌20min，4℃保存。
LB液体培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，若制半固体培养基，则加入琼脂18.0g，于121℃高压灭菌20min，4℃保存。
实施例1：
一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，是通过对乳酸菌进行诱变处理，然后进行筛选及抑菌物质测定，最终得到产细菌素的乳酸菌；上述诱变处理采用紫外-微波复合诱变的方法；上述紫外诱变用菌株培养液中含有复硝酚钠和二甘醇。该方法得到的乳酸菌可提前进入对数生长期，代谢产物增多，且耐低温、高温环境，所产细菌素具有广谱抑菌能力，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和霉菌均有一定的抑制作用，且可被动物体内的蛋白酶降解，节能环保，成本低，适用于规模化食品、药物、饲料等保鲜防腐以及生物防治领域。
紫外-微波复合诱变条件如下：紫外灯功率为20W，照射时间为60s，微波功率为500W，辐照时间为5min，期间每隔10s取出置于冰浴中5s，直至辐照结束。采用紫外-微波复合诱变得到的突变菌株，其抑菌效价显著提高，菌株的生长能力和抑菌性能均增强，同时增强其对高温、低温环境的耐受性能，具有稳定的遗传性，实用价值显著提升。
诱变用菌株为对数生长中后期的菌株；上述紫外诱变用菌株培养液为MRS液体培养基；上述复硝酚钠和二甘醇在液体培养基中的含量分别为0.007g/L和0.003g/L。在紫外线照射下，乳酸菌细胞内的有机物质发生化学变化，在产生有益诱变的同时，也会使细菌致死，培养基中的复硝酸钠和二甘醇在加入乳酸菌细胞后，利用亲和性能强的醇羟基、酚羟基与细胞质中有机物共同作用，保护和促进细胞的原生质流动，提高细胞活力，降低细菌的致死率，将体系转向有益诱变的方向推进，同时在紫外光能辅助下，使得乳酸菌增殖速度和生长能力增强，且耐低温能力提升，在低温下可长时间保持抑菌活性而不失活，显著增加了乳酸菌的适用范围和实用价值。
诱变用原始菌株分离自酸奶中。
紫外诱变完成后，需筛选优势较好的菌株作为微波诱变的出发菌株；紫外诱变和微波诱变的出发菌株活菌浓度为107cfu/mL。紫外线照射产生诱变的同时，细胞也会部分发生死亡，因此紫外诱变后，筛选出生长优势较明显的菌株，可增加后续诱变的成功率。
筛选是将诱变后的菌株以3%的接种量接入MRS液体培养基，于28℃条件下培养至对数生长中后期后，离心取上清液，采用牛津杯法进行抑菌试验，选出抑菌圈直径大于出发菌株的，进入下一轮诱变或为诱变完成菌株。抑菌圈直径大于出发菌株抑菌圈直径的菌株，说明诱变后的菌株抑菌能力增强了，完成了有益诱变。
牛津杯法采用的指示菌为革兰氏阳性菌或阴性菌，选自金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、李斯特菌、大肠杆菌、变形杆菌中的至少一种，本实施例采用金黄色葡萄球菌。
抑菌物质测定包括硫酸铵沉淀法和酶解试验；测定对象为培养诱变完成菌株的发酵液经离心后的上清液。
硫酸铵沉淀法步骤如下：取上清液加入饱和度为70%的硫酸铵，混匀后于0℃保存12h，然后经8000r/min离心20min，取沉淀溶解后，放1000Da透析袋中，透析24h，再一次通过牛津杯法作抑菌试验。
酶解试验步骤为：取经硫酸铵沉淀后的抑菌液体，使用蛋白酶进行酶解试验1h，然后取酶解液通过牛津杯法作抑菌试验，无抑菌圈则表明菌株所产抑菌物质是细菌素；上述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K中的任意一种，本实施例选用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等比例混合使用。
牛津杯法步骤为：将指示菌接种于LB液体培养基中，于35℃培养6h，取指示菌菌液0.2mL，与10mL经融化后保持在50℃的LB半固体培养基混匀，立即倒在无菌琼脂平板上，待凝固后，放上牛津杯，每隔平板放置3个，并分别向牛津杯中加入乳酸菌发酵液所产上清液0.2mL，将平板放于4℃冰箱中静置4h，然后在30℃下培养6h，观察牛津杯周围是否有抑菌圈形成，以此筛选产抑菌物质的菌株。
一种上述的选育方法得到的高产细菌素乳酸菌的应用，该乳酸菌在饲料、医疗、生物防治、食品和发酵工业中的用途，用于减少或抑制细菌的定植或生长。
实施例2：
一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，其具体步骤如下：
1）从酸菜中分离出诱变用原始菌株，并培养至对数生长中后期，然后置于含有复硝酚钠和二甘醇的MRS液体培养基中，复硝酚钠和二甘醇的含量分别为0.012g/L和0.006g/L，然后培养并配制成活菌浓度为108cfu/mL的出发菌株悬浮液，置于功率为30W的紫外灯下照射100s后，完成紫外诱变；
2）取紫外诱变后的菌株以5%的接种量接入MRS液体培养基，于35℃条件下培养至对数生长中后期后，离心取上清液，采用牛津杯法进行抑菌试验，选出抑菌圈直径大于出发菌株的，进入下一轮诱变；
3）将筛选出的菌株置于MRS液体培养基中，然后培养并配制成活菌浓度为108cfu/mL的出发菌株悬浮液，置于功率为700W的微波中辐照4min，期间每隔8s取出置于冰浴中4s，直至辐照结束；
4）取微波诱变后的菌株以5%的接种量接入MRS液体培养基，于35℃条件下培养至对数生长中后期后，离心取上清液，采用牛津杯法进行抑菌试验，选出抑菌圈直径大于出发菌株的，即为诱变完成菌株；
5）取诱变完成菌株于35℃条件下培养6h后，将发酵液离心取上清液，加入饱和度为75%的硫酸铵，混匀后于5℃保存12h，然后经10000r/min离心10min，取沉淀溶解后，放入3000Da透析袋中，透析12h，再一次通过牛津杯法作抑菌试验；
6）取经硫酸铵沉淀后的抑菌液体，使用蛋白酶进行酶解试验3h，然后取酶解液通过牛津杯法作抑菌试验，无抑菌圈则表明菌株所产抑菌物质是细菌素；上述蛋白酶为木瓜蛋白酶；
上述步骤中的牛津杯法具体步骤为：将指示菌金黄色葡萄球菌接种于LB液体培养基中，于37℃培养7h，取指示菌菌液0.5mL，与10mL经融化后保持在50℃的LB半固体培养基混匀，立即倒在无菌琼脂平板上，待凝固后，放上牛津杯，每隔平板放置6个，并分别向牛津杯中加入乳酸菌发酵液所产上清液0.3mL，将平板放于4℃冰箱中静置4h，然后在35℃下培养10h，观察牛津杯周围是否有抑菌圈形成，以此筛选产抑菌物质的菌株。
实施例3：
一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，其中微波诱变步骤如下：将筛选出的菌株置于含有0.05mM四甲基胍和0.02mM马尿酸的MRS液体培养基中，然后培养并配制成活菌浓度为108cfu/mL的出发菌株悬浮液，置于功率为700W的微波中辐照4min，期间每隔8s取出置于冰浴中4s，直至辐照结束；取微波诱变后的菌株以5%的接种量接入MRS液体培养基，于35℃条件下培养至对数生长中后期后，离心取上清液，采用牛津杯法进行抑菌试验，选出抑菌圈直径大于出发菌株的，即为诱变完成菌株；上述微波诱变用培养基中加入的四甲基胍和马尿酸，两者在微波作用下，作为催化因子进入细菌细胞内，利用分子结构中的氨基和羧基加强和促进细菌素合成调控基因表达蛋白的合成，以增加合成细菌素的效率，并能在催化因子和微波的刺激下，诱发乳酸菌对碱性环境的应激拮抗反应，从而产生碱适应能力，在碱性环境也能保持抑菌活性，增加了菌株的酸碱稳定性。
对比例1：
一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，其中紫外诱变用菌株培养液中未添加复硝酚钠和二甘醇。
本对比例在实施例2的基础上进行对比试验，其他制备步骤与实施例2中一致，制得产细菌素的乳酸菌。
对比例2：
一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，其中只采用紫外诱变，不采用微波诱变。
本对比例在实施例2的基础上进行对比试验，其他制备步骤与实施例2中一致，制得产细菌素的乳酸菌。
对比例3：
一株高产细菌素乳酸菌的选育方法，其中只采用微波诱变，不采用紫外诱变。
本对比例在实施例2的基础上进行对比试验，其他制备步骤与实施例2中一致，制得产细菌素的乳酸菌。
试验例1：
乳酸菌生长曲线测定试验
分别取实施例2、实施例3所得菌株设为试验组1、试验组2，对比例1~3所得菌株设为对比组1~3，取分离出的原始菌株设为空白组，将菌株在相同条件下扩大培养后，以3%的接种量接种在MRS液体培养基上，于37℃下培养，然后分别测定OD值，以在波长600nm的OD值作为纵坐标，以时间为横坐标，测定生长曲线，如附图1。
从附图1中，可以明显得出，试验1和2组的菌株比对比组和空白组更早进入对数期，而对比1组较其它对比组和空白组也优先进入对数期，对比2和3组与空白组的差异不大，说明完成紫外-微波复合诱变才能使得新的菌株生长增殖能力增强，对数期延长，导致最终菌体密度升高，代谢产物尤其是细菌素的积累量和产量才能达到最高。
试验例2：
乳酸菌生物学特性研究
分别取实施例2、实施例3所得菌株设为试验组1、试验组2，对比例1所得菌株设为对比组1，取分离出的原始菌株设为空白组，进行生物学试验。
1）紫外线照射致死率试验
在实施例2和对比例1进行乳酸菌选育过程中，完成紫外诱变后，分别进行菌株致死率计算，结果如下表1。
表1紫外线照射致死率试验结果
实施例2 对比例1
致死率% 87.9 93.6
由上表可知，实施例2中菌株的致死率不足88%，较对比例1低，说明在紫外诱变用培养基中添加的复硝酸钠和二甘醇保护了细胞，并将体系向诱变方向推进，增加诱变成功率和产率。
2）pH值敏感性试验
取试验组1、试验组2、对比组1、空白组菌株，在相同条件下培养12h，然后分别取等量的14份发酵上清液，用HCl、NaOH调pH值分别为1~14，于37℃下温育2h，做抑菌实验，重复3次取平均值做分析。结果见附图2。
由附图2可知，试验组2对酸碱的适应能力最强，酸碱稳定范围最广，而其它组别之间的差异不显著，都是在偏酸性环境下适应力更好，中性或碱性环境下就容易失活，说明微波诱变时添加的四甲基胍和马尿酸对乳酸菌所产细菌素的酸碱稳定性有显著的增益作用。
3）温度敏感性试验
取试验组1、试验组2、对比组1、空白组菌株，在相同条件下培养12h，然后分别取等量的发酵上清液，分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃和120℃条件下保持30min，冷却后做抑菌实验，重复3次取平均值做分析。结果见附图3。
由附图3可知，乳酸菌细菌素的热稳定性较好，各组别间差异不大，随着温度的继续升高和加热时间的延长，在较高温度下抑菌活性成明显下降趋势，但仍能保持部分抑菌活性，说明乳酸菌产生的细菌素均表现出良好的热稳定性，具有成为加热食品防腐剂的潜力。
4）冷藏对抑菌效果的影响
取试验组1、试验组2、对比组1、空白组菌株，在相同条件下培养12h，然后分别取等量的发酵上清液，置于-20℃条件下处理5、10、15、20、25、30天，将处理完毕的细菌素样取出恢复至室温。测定其抑菌圈直径。结果见附图4。
由附图4可知，试验组1和试验组2在长时间的低温保藏中，仍能保持抑菌活性而不失活，对比例和空白组则随着时间延长，抑菌活性显著降低，接近失活，说明紫外诱变培养基中添加复硝酸钠和二甘醇，能显著增加低温环境下的抑菌活性稳定性，有利于细菌素应用到食品整个生产和保藏、销售环节中。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (3)

1.一种高产细菌素乳酸菌的液体培养基，所述液体培养基为含有复硝酚钠和二甘醇的MRS液体培养基；所述复硝酚钠和二甘醇在液体培养基中的含量分别为0.005~0.015g/L和0.003~0.007g/L；
所述液体培养基用于乳酸菌的紫外诱变处理。
2.如权利要求1所述的一种高产细菌素乳酸菌的液体培养基，其特征在于：所述液体培养基具有如1）和/或2）的特征：
1）降低菌株的紫外诱变致死率，所述致死率不高于88%；
2）增加菌株在低温环境下的抑菌活性稳定性，在-20℃条件下保持抑菌活性而不失活。
3. 如权利要求1所述的一种高产细菌素乳酸菌的液体培养基，其特征在于：所述液体培养基的成分及其含量如下：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，复硝酚钠0.005~0.015g和二甘醇0.003~0.007g，加入蒸馏水配至1000mL。
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