CN115820432B - 一株产香云芝栓孔菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产香云芝栓孔菌及其应用。本发明首先从天然野生蝉花子实体部位分离获得一株产香云芝栓孔菌(Trametes versicolor)C4，菌株保藏编号为CGMCC NO.20264。该菌在液体发酵培养基发酵4～7d能嗅闻到浓郁花果甜香，经GC‑MS分析该菌株能够产生正己醇、苯甲醛、芳樟醇、异戊醛等芳香物质。该菌株可以发酵燕麦等食品，从而为赋予食品发酵特殊风味或替代植物原料生产香料提供了一种新的微生物资源。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵食品和生物香料生产技术领域，具体而言，涉及一株产香云芝栓孔菌及其应用。
背景技术
云芝(Trametes versicolor)又称云芝栓孔菌、彩绒革盖菌，是一类具有药用价值的多孔菌科真菌，以其干燥子实体入药，收载于《中国药典》。现代药理研究表明，云芝含有丰富的多糖、糖肽、氨基酸和多种无机盐等物质，其中多糖对于治疗肝炎疗效显著。因野生云芝资源有限，目前除了采用野生和人工栽培的云芝外，还可采用液态深层发酵培养菌丝体来研制营养丰富、风味独特的食品和保健饮料。据研究报道，云芝被视为生产新型非酒精发酵谷物饮料的候选菌，具备多种胞外和胞内酶，其发酵麦汁38小时能散发果味、甜味和花香等令人愉悦的香气，跟乳酸菌、醋酸菌、酵母菌和低等真菌生产传统饮料的酸味显著不同。
目前，香料和香精生产方法主要有化学合成、动植物提取以及微生物发酵法。由于天然动植物香料来源短缺、生产周期长、价格昂贵，目前85％左右的芳香化合物均由化学合成法生产。近年来，人们发现合成香料可能含有有毒杂质甚至致癌成分，由此加速了微生物发酵法生产天然香料香精的研究与开发。微生物发酵法通过生物转化或生物合成生产天然挥发性香气物，具有周期短、规模化、安全的特点。筛选生产性能好的菌株是微生物发酵生产天然香料化合物的关键。云芝具有良好的微生物稳定性，发酵周期远小于天然动植物培育采集，安全性较化学合成更高，有待于进一步拓宽在香料生产的应用。
在产香微生物的筛选方面，如CN202111365158.5公开了一株高产香气物质的扣囊复膜酵母cx-3菌株及其应用，该菌株能够产出32种挥发性香气化合物，主要以醇类和酯类为主，能高产43.43％具有玫瑰花香气的β-苯乙醇。CN202110108011.1公开了一株高产香气物质的酵母菌株QTX11及其应用，该菌株发酵葡萄汁生成的正己醇产量高达257.93μg/L，2,3-丁二酮的产量高达1562μg/L，乙酸乙酯的产量高达169.74μg/L。CN202110090700.4公开了一株高产香气物质的美极梅奇酵母菌株YC15及其应用，该菌株发酵葡萄汁生成的正己醇产量高达312.53μg/L，丙酸乙酯的产量高达102.2μg/L。CN201910198664.6公开了一株能够增加酱类食品香气的鲁氏酵母菌株，在麦汁发酵中产生的醇酯类含量较高，其可以直接添加到酱类产品中，增加酱类产品中的香气。CN202010663247.7公开了一株产香红曲霉菌株及其应用，具有较高酯化能力，发酵时可产生β-苯乙醇，使发酵产物具有浓郁玫瑰花香气。可见，现有的产香菌多集中在酵母菌上，未见产香云芝栓孔菌的报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一株云芝栓孔菌及其应用。本发明首先从天然野生蝉花子实体部位分离获得一株产香云芝栓孔菌(Trametes versicolor)C4，该菌在液体发酵培养基发酵4～7d能嗅闻到浓郁花果甜香，可以发酵燕麦等食品，从而为赋予食品发酵特殊风味或替代植物原料生产香料提供了一种新的微生物资源。
本发明的技术方案是：一株产香真菌T.versicolor C4，所述产香真菌为栓孔菌属，于2020年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.20264。所述产香云芝栓孔菌筛选于野生蝉花子实体，形态特征包括：在PDA培养基上28℃恒温培养4～5d，菌落直径可达65～70mm，菌落扁平质密，外观为米白色毡状，边缘均匀，带有明显的菌菇香味。切片显微观察到菌丝体长约0.230mm，宽0.004mm；菌丝无隔，简单独立分枝，顶端膨大，分枝常单侧生出，显微镜下呈紫绿色，分生孢子球型，紫色。云芝栓孔菌T.versicolor C4在液体发酵培养基上发酵能产浓郁花果甜香。
上述产香云芝栓孔菌T.versicolor C4的发酵方法，其特征是，在发酵培养基中28℃±2℃培养4-7d后可嗅闻到浓郁花果型的香气，所述发酵培养基为(wt％)：葡萄糖1-2％，酵母提取物0.2-0.5％，蛋白胨0.2-0.5％，MgSO4 0.05-0.1％，K2HPO4 0.1-0.5％。
上述发酵方法获得的挥发性物质，共鉴定出40种化合物，挥发性成分含量依次为醇类、羰基化合物(酮、醛类)、烷烃类、酸类化合物、酯类、芳香化合物。其中，醇类物质共12种，含量最高是乙醇(1200.97μg/kg)及2-甲基-1-丁醇(795.59μg/kg)。羰基化合物(酮、醛类)共计9种，含量最高的分别为异戊醛(232.86μg/kg)、苯甲醛(176.47μg/kg)和(E)-2-甲基-2-丁烯醛(127.83μg/kg)。烷烃类共计9种，以2-氨基丁烷(331.33μg/kg)含量为最高。酸类化合物共6种，其中主要是苯甲酸(47.09μg/kg)和异戊醛(31.11μg/kg)。酯类共2种，其中醋酸-2-乙基己酯(85.22μg/kg)含量最高。芳香化合物共2种，以吡嗪(21.54μg/kg)为主。
上述40种挥发性化合物通过检索香气属性，结合含量及OAV值进行香气物质成分分析。发酵液中含有15个关键香气化合物、6个修饰性香气化合物和1个潜在香气化合物。关键香气化合物主要是果香型和青香型对香气轮廓有直接影响，依次是异戊醛、己醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、异戊醇、正己醇、苯甲醛、芳樟醇、2-甲基-1-丁醇、1-戊醇、异丁醛、醋酸-2-乙基己酯、环己醇、2-辛酮、苯乙酮和2-氨基丁烷。修饰性香气化合物对香气轮廓有修饰作用，分别为异丁醇、正丁醇、反式-橙花叔醇、3-辛酮、2,6-二甲基吡嗪和苯乙烯。潜在型香气化合物为花香型的苄醇。这些物质所产生的香气相互综合，赋予T.versicolor C4液态发酵后发酵液浓郁的青香、花香、果香等特征。
上述产香云芝栓孔菌T.versicolor C4在生产香气物质方面的应用，尤其是应用于食品、化妆品领域中。
上述产香云芝栓孔菌T.versicolor C4在发酵生产燕麦饮料方面的应用。
本发明还公开了一种燕麦饮料的生产方法，其特征是，将云芝栓孔菌T.versicolor C4种子液，按照质量比5-10％添加到燕麦酵母培养基，置于28℃±2℃发酵4-5d得到燕麦饮料，能嗅闻到淡淡的青草香气，所述燕麦酵母培养基为(wt％)：酵母提取物0.1-0.3％、燕麦粉2-4％、MgSO4 0.03-0.1％、K2HPO4 0.05-0.5％。
本发明的技术效果是：本发明从天然野生蝉花子实体部位分离获得一菌株T.versicolor C4。该菌在液体发酵培养基发酵4-7d能嗅闻到浓郁花果甜香，第5天香气浓度达到最大，发酵液经固相微萃取-GC-MS检测的挥发性物质中含有异戊醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、异戊醇、正己醇、苯甲醛、芳樟醇、苄醇等多种芳香物质，在食品、化妆品领域中具有重要应用。采用T.versicolor C4发酵燕麦可以产生淡淡的青草香气，可用于食品发酵，从而在微生物发酵法生产天然香精、香料的研究开发方面具有潜在价值。
附图说明：
图1为T.versicolor C4的菌落形态；
图2为T.versicolor C4在光学显微镜下的形态；a.菌丝(40×)；b.孢子(40×)；
图3为实施例2的GC-MS分析的总离子流色谱图；
图4为实施例3的GC-MS分析的总离子流色谱图。
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：云芝栓孔菌T.versicolor C4的筛选和鉴定
1.菌株筛选
1.1菌株获得
供试菌株由本实验室从蝉花的子实体分离得到，液体发酵后具有浓郁花香。
1.2菌株的分离纯化
分离培养基(wt％)：20％马铃薯，5％蔗糖，0.2％ KH2PO4，0.1％ MgSO4·7H2O，10mg/L的维生素B1，调节pH为6.0，2％琼脂，121℃灭菌20min，倒平板之前加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素。
固体斜面及平板培养基(wt％)：20％马铃薯，5％蔗糖，0.2％ KH2PO4，0.1％MgSO4·7H2O，调节pH为6.0，2％琼脂，121℃灭菌20min。
发酵培养基(wt％)：2％葡萄糖，0.2％酵母提取物，0.2％蛋白胨，0.1％ MgSO4·7H2O，0.2％ KH2PO4，pH自然，121℃灭菌20min。
对采集于浙江天目山竹林的天然野生蝉花，通过观察蝉花的子实体花头部分的产孢量、孢梗束长短、密集程度等初步选取长势良好的株，将孢子轻轻弹至无菌水中，震荡混合均匀后吸取混合液于分离培养基中，放到28℃培养箱中培养。待孢子萌发长出后，划线分离得到单菌落，继续分离，待分离后的菌落长出短绒毛菌丝后，取菌落边缘的菌丝，继续分离，将最终得到的菌株转接到固体斜面培养基，保存于4℃。
将分离纯化的菌株挑取菌丝转接至已灭菌装液量为70mL/250mL三角瓶的发酵培养基中打散，28℃，160r/min摇瓶培养4～7d后可嗅闻到浓郁花果型的香气。
2.产香菌株的鉴定
2.1形态学鉴定
将产香菌接种于平板培养基，28℃恒温培养4～5d，可见菌落直径可达65～70mm，菌落扁平质密，外观为米白色毡状，边缘均匀，带有明显的菌菇香味(图1)。使用插片培养法在显微镜下观察到菌丝体长约0.230mm，宽0.004mm；菌丝无隔，简单独立分枝，顶端膨大，分枝常单侧生出，显微镜下呈紫绿色(图2a)，分生孢子球型，紫色(图2b)。
2.2分子生物学鉴定
2.2.1基因组DNA提取
取纯化后菌种按SK8259(真菌)试剂盒操作。
2.2.2ITS部分基因序列的PCR扩增
引物序列：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，由上海生工生物工程股份有限公司合成。以提取的基因组DNA为模板，用ITS1/ITS2引物进行PCR扩增。PCR反应体系见表1。
表1PCR反应体系
PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；最后末端72℃延伸10min，可见表2。反应结束后取PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测并送往上海生工生物有限公司进行测序，测序结果在GenBank(http://www.ncbi.nih.gov)中进行BLAST比对分析。
表2PCR循环条件
菌株T.versicolor C4的ITS基因序列如下：
TGCGGAAGGATCATTAACGAGTTTTGAAACGAGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGT
GCACGCTCTGCTCATCCACTCTACCCCTGTGCACTTATTGTAGGTTGGCGTGGGCTCCTT
AGCGGGAGCATTCTGCCGGCCTATGTATACTACAAACACTTTAAAGTATCAGAATGTA
AACGCGTCTAACGCATCTATAATACAACTTTTAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATC
GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCAT
CGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTG
TCATGGAATTCTCAACTTATAAATCCTTGTGATCTATAAGCTTGGACTTGGAGGCTTGC
TGGCCCTTGTTGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTAGCTCGATTCCGTACGGATCGGCTC
TCAGTGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGTGTTTTGGCGAGCTTCTAACCGTC
CATTAGGACAACTTTTTAACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTA
AGCATATCATA。
登录NCBI数据库经BLAST序列比对，结果表明，该扩增的片段与GenBank中发表的同源性最高的10个序列均为Trametes versicolor，相似性达到99.66％。结合形态学鉴定结果进行综合分析，表明该真菌为云芝栓孔菌属，命名为Trametes versicolor C4。该菌株于2020年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.20264。实施例2：T.versicolor C4发酵产香成分提取与分析
2.1香气成分提取
将5mL液体培养基装入固相微萃取瓶中。将平衡后的DVB/CAR/PDMS固相微萃取头插入萃取瓶中，压下活塞使纤维头伸出，暴露于样品上层空气中，50℃条件下固相微萃取40min。
2.2挥发性物质GC-MS分析条件
色谱条件：色谱柱为安捷伦HP-Innowax极性柱(60m×0.25mm×0.25μm)，程序升温，柱初温40℃，保持6min，以3℃的升温速率升至100℃，再以5℃的升温速率升至230℃，保持20min；载气为氮气，流速为1mL/min。进样模式为分流进样，分流比为10:1；质谱条件：四极杆温度为150℃，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，MS传输线温度为280℃，采用EI电离源，电子能量为70ev。全扫描：扫描范围30-450amu。
2.3产香真菌挥发性物质GC-MS分析结果
2.3.1挥发性成分总离子流图
产香真菌在发酵培养基上第5天产香浓度最大，利用GC-MS技术对发酵液的挥发性成分进行检测，获得其总离子流图(图3)
2.3.2挥发性成分分析
经GC-MS鉴定挥发性成分种类、成分及含量见表3。由图3和表3可知，共鉴定出40种化合物，挥发性成分含量依次为醇类、羰基化合物(酮、醛类)、烷烃类、酸类化合物、酯类、芳香化合物。其中，醇类物质共12种，含量最高是乙醇(1200.97μg/kg)及2-甲基-1-丁醇(795.59μg/kg)。羰基化合物(酮、醛类)共计9种，含量最高的分别为异戊醛(232.86μg/kg)、苯甲醛(176.47μg/kg)和(E)-2-甲基-2-丁烯醛(127.83μg/kg)。烷烃类共计9种，以2-氨基丁烷(331.33μg/kg)含量为最高。酸类化合物共6种，其中主要是苯甲酸(47.09μg/kg)和异戊醛(31.11μg/kg)。酯类共2种，其中醋酸-2-乙基己酯(85.22μg/kg)含量最高。芳香化合物共2种，以吡嗪(21.54μg/kg)为主。
表3T.versicolor C4发酵液的GC-MS分析结果表
2.3.3香气成分分析
通过在线数据库“Flavornet”和“Perflavory Information System”检索这40种挥发性化合物的香气属性，再结合含量及OAV值进行香气成分分析。结果如表4所示，发酵液中含有15个关键香气化合物、6个修饰性香气化合物和1个潜在香气化合物。关键香气化合物(OVA>1)主要是果香型和青香型对香气轮廓有直接影响，依次是异戊醛、己醛、(E)-2-甲基-2-丁烯醛、异戊醇、正己醇、苯甲醛、芳樟醇、2-甲基-1-丁醇、1-戊醇、异丁醛、醋酸-2-乙基己酯、环己醇、2-辛酮、苯乙酮和2-氨基丁烷。修饰性香气化合物(0.1<OVA<1)对香气轮廓有修饰作用，分别为异丁醇、正丁醇、反式-橙花叔醇、3-辛酮、2,6-二甲基吡嗪和苯乙烯。潜在型香气化合物(OVA<0.1))为花香型的苄醇。上述这些物质所产生的香气相互综合，符合C4液态发酵后发酵液浓郁的青香、花香、果香等特征。
表4香气成分分析结果
实施例3：云芝栓孔菌C4发酵燕麦
种子培养基(wt％)：葡萄糖2％，酵母提取物0.2％，蛋白胨0.2％，MgSO4 0.05％，K2HPO40.1％。
燕麦酵母培养基(wt％)：酵母提取物0.2％、燕麦粉3％、MgSO4 0.05％、K2HPO40.1％。
取保藏于斜面培养基上的C4菌丝于种子培养基，28℃，150r/min，摇瓶培养3d得到一级种子液。按照质量比8％接种量转接到二级种子培养基中，置于摇床28℃，150r/min，培养2d。最后，以质量比6％接种量添加到燕麦酵母培养基，置于28℃，160r/min摇床中发酵4-5d，不同于传统饮料的酸味，能嗅闻到淡淡的青草香气，可用于生产新型非酒精发酵谷类饮料，改善风味。燕麦发酵挥发性成分析见表5和图4，分析方法同实施例2。
表5燕麦基发酵挥发性成分分析
以上所述，仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一株产香云芝栓孔菌（Trametes versicolor）C4，菌株的保藏编号为 CGMCCNO.20264。
2.权利要求1所述的产香云芝栓孔菌（Trametes versicolor）C4的发酵方法，其特征是，在发酵培养基中28℃±2℃培养4-7 d，所述发酵培养基为：葡萄糖1-2%，酵母提取物0.2-0.5%，蛋白胨0.2-0.5%，MgSO4 0.05-0.1%，K2HPO4 0.1-0.5%。
3.权利要求1所述的产香云芝栓孔菌（Trametes versicolor）C4在生产香气物质方面的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征是，应用于食品或者化妆品领域中。
5.权利要求1所述的产香云芝栓孔菌（Trametes versicolor）C4在发酵生产燕麦饮料方面的应用。
6.一种燕麦饮料的生产方法，其特征是，将权利要求1所述的产香云芝栓孔菌（Trametes versicolor）C4的种子液，按照质量比5-10%添加到燕麦酵母培养基，置于28℃±2℃发酵4-5d得到燕麦饮料，所述燕麦酵母培养基为：酵母提取物0.1-0.3%、燕麦粉2-4%、MgSO4 0.03-0.1%、K2HPO4 0.05-0.5%。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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