CN113115893A - 食品抗菌添加剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品抗菌添加剂，其以黑茶冠突散囊菌发酵物为主要活性物质，同时添加乳酸链球菌素、茶多酚、竹叶抗氧化物、植酸钠四种活性物质的一种或多种，该食品抗菌添加剂的各组分可以起到协同增效效果。该组合物的主要活性物质黑茶冠突散囊菌发酵物来自于黑茶的固态或液态发酵。该以黑茶冠突散囊菌发酵物为主要活性物质的食品抗菌添加剂具有生理功效、广谱抑菌、安全稳定的功效。本发明还公开了该食品抗菌添加剂的制备方法与应用。

Description

食品抗菌添加剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种食品添加剂，具体涉及一种食品抗菌添加剂。

背景技术

食品在保存过程中，易受到细菌、霉菌、酵母菌等微生物的侵染而导致腐败， 腐败变质不仅会导致食品失去本身价值，而且还会造成中毒。为达到防腐作用， 通常会加入化学防腐剂，比较典型化学防腐剂主要有苯甲酸及其盐类、山梨酸及 其盐类、对羟基苯甲酸酯、硝酸盐，但经过科学研究及试验表明，化学合成防腐 剂的安全性不高，并有严格的添加限量要求。

为解决化学防腐剂存在的问题，寻找天然的防腐剂代替是目前开发防腐剂的 主要方向之一。现有技术中也报道了一些天然防腐成分，例如，丁香、肉桂、迷 迭香、芦荟提取物等，大量开发植物源和生物源防腐剂有许多优点，但是其抑菌 谱较低或者存在一定提取物溶剂的残余，目前市场主要还是化学防腐剂。

发明内容

为解决现有食品抗菌添加剂的效果不理想，抑菌谱较窄等不足，本发明第一 目的在于，提供了一种全新的食品抗菌添加剂，旨在通过所述的成分的创新地协 同联合，拓宽抗菌谱，实现广谱高效抗菌作用。

本发明第二目的在于，提供了一种所述的食品抗菌添加剂在抑制革兰氏阳 性菌、革兰氏阴性菌、酵母、霉菌中的至少一种微生物中的应用。

本发明第三目的在于，提供了一种添加有所述的食品抗菌添加剂的食品。

一种食品抗菌添加剂，包括A组分和B组分；所述的A组分为黑茶冠突散 囊菌发酵物；所述的B组分为乳酸链球菌素、茶多酚、植酸钠、竹叶抗氧化物 中的至少一种。

本发明创新地发现，将A组分和B组分联合，能够产生协同性，能够意外 地显著改善抗菌谱，提高抗菌活性。研究发现，通过所述的成分的协同，其防腐 效果优于化学防腐剂，且无毒副作用，该食品抗菌添加剂的各组成成分具有药理 活性、抑菌谱广、抑菌效果好且稳定。

本研究发现，A组分单独使用，对细菌例如革兰氏阴性、阳性菌具有一定的 抑菌效果，对霉菌基本没有抑菌活性；此外，乳酸链球菌素对酵母和霉菌无效， 但将A组分和乳酸链球菌素联合使用，能够对革兰氏阴性、阳性菌，酵母和霉 菌均有抑菌效果且培养96h后，不见细菌和霉菌的菌落生长，也即是，A组分和 乳酸链球菌素的联合使用，除能够显著改善单独使用的已有抗菌谱的抗菌活性， 还能够意外地对单独使用无抗菌活性的微生物具有良好的协同抗菌活性。可见， 将A组分和乳酸链球菌素联用，不仅扩大乳酸链球菌素的抑菌谱，对革兰氏阳 性菌、革兰氏阴性菌、酵母和霉菌均有抑菌效果，而且使黑茶冠突散囊菌发酵物 抑菌效果增强。

另外，将A组分和茶多酚联合使用，能够协同增加对细菌、酵母和霉菌的 抑菌效果，使大肠杆菌菌培养48h之后可见菌落生成，其它供试菌培养72h后不 见菌落生成。

再有，植酸钠对供试菌菌物无抑菌效果，将A组分和植酸钠联合使细菌除 大肠杆菌外，培养72h不见菌生长，协同增加对细菌的抑菌效果。

将竹叶抗氧化物和A组分联用，竹叶抗氧化物对细菌、酵母和霉菌具有抑 菌效果但培养48h可见菌生长。与植酸钠、A组分联合使用后，培养72h之后， 不见菌生长。协同增加对细菌、酵母和霉菌的抑菌效果。

作为优选，A组分的制备过程包括：

步骤(1)：黑茶茶叶杀青、捻揉、灭菌：

步骤(2)：向步骤(1)的黑茶中接种冠突散囊菌、发酵；

步骤(3)：对步骤(2)发酵后的黑茶进行水提，浓缩干燥获得所述的发酵物。

作为优选，步骤(2)中，冠突散囊菌接种量为5～10％(以黑茶茶叶干重为基 准)。

所述的发酵是固体发酵或液态发酵。

所述的固体发酵为直接在灭菌的黑茶中接种所述的冠突散囊菌，进行发酵。 固体发酵后，将干燥后的发酵黑茶进行粉碎，获得40～80目颗粒。随后再加水进 行水提。水提过程中，对固体发酵物中添加水进行水提；且茶水重量比(黑茶鲜 叶：水重量比)为1:10～20。

优选的固体发酵步骤为：新鲜的黑茶茶叶→杀青，捻揉→添加茶水比为 1:2～1:5→推开厚度5-10cm→灭菌→冷却接冠突散囊菌发花→干燥，粉碎机充分 粉碎，过40～80目→按茶水比1:10～20稀释→在沸水浸提1～2h→减压抽滤→黑 茶冠突散囊菌发酵物液产品。

所述的液态发酵为预先将黑茶和水混合，随后一并灭菌，灭菌冷却后在接种 所述的冠突散囊菌进行液态发酵。发酵前，茶水比(黑茶鲜叶：水重量比)为 1:10～20。发酵完成后水提。优选的液态发酵步骤为：新鲜的黑茶茶叶→杀青， 捻揉→干燥，粉碎机充分粉碎，过40～80目→按茶水比1:10～20→蒸汽灭菌→冷 却接冠突散囊菌发花→在沸水中浸提1～2h→减压抽滤→黑茶冠突散囊菌发酵物 液产品。

水提为沸水提取。

作为优选，水提时间为1～2h。

将水提的溶液进行过滤、浓缩干燥，得到所述的发酵物。

所述的水提液进行浓缩干燥得固体成分即A组分。

按重量百分数计，A组分的干重含量为30～80％(该比例指发酵物的干重)。

该食品抗菌添加剂组合物的剂型可以是粉剂、片剂、胶囊、液体及其他方便 使用并储存的剂型。

本发明还记载了所述的食品抗菌添加剂的应用，将其添加在食品中，将其用 作革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、霉菌中的至少一种微生物的抑菌添加剂。 研究发现，本方所述的食品抗菌添加剂，通过成分的协同，能够改善抗菌谱，且 抗菌活性强，特别是对现有技术效果不佳的酵母、霉菌，仍能表现出优异的抑菌 活性。

优选的应用，将其用作大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色萄球菌、荧光 假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、黄曲霉中的至少一种微生物的 抑菌添加剂。

优选地，本发明所述的食品抗菌添加剂，安全有效，可以作为食品添加剂 添加在食品中，用于预防因革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、霉菌所致的 食品腐败。

本发明所述的应用，可以将所述的食品抗菌添加剂应用在食品的储存、包 装中。

进一步优选，所述的食品包括但不限于普通食品、饮料类、功能性食品、特 殊营养食品。

优选的应用，所述的食品抗菌添加剂的添加量为0.01～0.08wt.％；优选为 0.03～0.04wt.％。本发明所述的食品抗菌添加剂，其具有优异的广谱性和优异的 抗菌活性，能够在较少的添加量下，即可达到良好的抑菌效果。

本发明还提供了一种食品，其添加有所述的食品抗菌添加剂；优选的添加量 为0.01～0.08wt.％；优选为0.03～0.04wt.％。例如，每kg食品添加0.1～0.8g所述 的食品抗菌添加剂。

有益效果

本发明创新地发现，将A组分和B组分联合，能够产生协同性，能够意外 地显著改善抗菌谱，改善抗菌活性。研究发现，通过所述的成分的协同，其防腐 效果优于化学防腐剂，且无毒副作用，该食品抗菌添加剂的各组成成分具有药理 活性、抑菌谱广、抑菌效果好且稳定。

附图说明

图1为实施例2不同成分抑菌圈图；

图2～8分别为实施例3黑茶冠突散囊菌发酵溶液的不同稀释倍数对大肠埃希 菌(1#)、枯草芽孢杆菌(2#)、金黄色萄球菌(3#)、荧光假单胞菌(4#)、 蜡样芽孢杆菌(5#)、黑曲霉(7#)、黄曲霉(8#)的MIC测定菌落图；

具体的实施方式

以下结合附图实施例对本发明进行进一步详细描述。

主要采用的菌种和器材

本试验供试菌种均为外购菌种，例如：大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色 萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、黄曲霉均在第三方 机构长沙亦顺生物科技有限公司购买，其在本实验室的编号分别为1#、2#、3#、 3#、4#、5#、6#、7#、8#。

器材：

设备	厂家	型号
			恒温摇床培养箱	上海博迅	BSD-YF2200
霉菌培养箱	上海博迅	BMJ-250C
			生化培养箱	上海博迅	BSP-250

黑茶：湖南安化新鲜黑茶

实施例一黑茶冠突散囊菌发酵物的制备

1、冠突散囊菌菌种制备

将冠突散囊菌接种于PDA培养基上，25～30℃恒温培养箱中培养3～5d至 冠突散囊菌产生大量金黄色闭囊壳孢子，用灭菌无菌水将孢子刮下，转移至离心 管中，加入玻璃珠，震荡10-20min，用灭菌的脱脂棉过滤。分光光度计测OD600 值，用无菌水调整至OD600值至1.8～2.0(1ⅹ10⁸个孢子/m L)，即得冠突散 囊菌孢子悬液。

2、固体发酵

挑选新鲜的黑茶茶叶，去杂质、对茶叶180℃杀青，捻揉30min～45min，添 加水分，按茶水比(黑茶新鲜茶叶：水重量比)为1:2～1:5，然后将茶叶推开厚 度5～10cm，灭菌，按8％接种量(按黑茶干重计)将冠突散囊菌孢子悬液接种到 已经堆好的黑茶叶中，发酵温度控制在25～30℃，控制湿度60％～70％，发酵15d 后，将发酵的黑茶50℃烘干4～5d后用粉碎机充分粉碎，过40～80目，按茶水比 (黑茶新鲜茶叶：水重量比)1:20，在沸水中浸提1～2h，然后减压抽滤得到的溶 液浓缩后50℃烘干4～5d得干燥物。

3、液体发酵

挑选新鲜的黑茶茶叶，去杂质、对茶叶180℃杀青，捻揉30min～45min，50℃ 烘干4～5d后，用粉碎机充分粉碎，过40～80目，然后按一定的茶水比(黑茶新 鲜茶叶：水重量比)1:20加入适量的蒸馏水，然后蒸汽灭菌，冷却后按8％接种 量(按黑茶干重计)将冠突散囊菌孢子悬液接种到黑茶叶中，发酵温度控制在 25～28℃，发酵5d后，在沸水中浸提2h，然后减压抽滤，得到的溶液浓缩后50℃ 烘干4～5d得干燥物。

实施例二黑茶冠突散囊菌发酵物溶液抑菌效果评价(牛津杯法)

1、黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的制备

见实施例一的液体发酵提取液的干燥物用25倍重量的水溶解所得到的的溶 液；以下所有实施案例，除特别声明外，所用的发酵物溶液均为该溶液。

2、菌种的活化

无菌操作条件下，将供试菌种移接入相对应的试管斜面培养基上，细菌在 30～37℃恒温培养箱内培养，酵母和霉菌在25～30℃培养，然后置于0～4℃下冷 藏备用。大肠杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄 球菌、黄曲霉、黑曲霉、酿酒啤酒酵母，以上菌种均在在菌种保存机构购买。

3、指示菌的菌悬液制备

细菌、酵母菌菌悬液：采用平板菌落计数法与分光光度法结合的方法，用生 理盐水将初始菌液配成浓度为10⁷cfu/mL的菌悬液。

孢子菌悬液：用无菌生理盐水将霉菌产生大量的孢子从斜面洗下，转移至离 心管中，加入玻璃珠，震荡10-20min，用灭菌的脱脂棉过滤，平板菌落计数法 与分光光度法结合的方法，用生理盐水将滤液配成浓度为10⁷cfu/mL的孢子悬液。

4、菌固体平板制备

将取配置好的浓度为1×10⁷cfu/mL的菌悬液加入融化后温度为50℃固体肉 汤培养基(酵母和霉菌为固体PDA培养基)中混匀，使培养基中菌浓度为1× 10⁵cfu/mL，室温冷却凝固，得到指示菌平板。用灭菌的5mm打孔器打孔，用灭 菌牙签将琼脂块挑出，向孔内加入待测抑菌剂。

5、抑菌圈的测定

待测抑菌剂分别测定2g/L山梨酸钾、2g/L苯甲酸钠、0.7g/L茶多酚、0.7g/L 乳酸链球菌素、黑茶冠突散囊菌发酵物溶液(本案例步骤1的溶液，也即是实施 例1的液体发酵物的25倍水溶液)、0.9％生理盐水、20g/L山梨酸钾、20g/L苯 甲酸钠、7g/L茶多酚、7g/L乳酸链球菌素的大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄 色萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、黄曲霉的抑菌性 能。

抑菌效果见表1和图1

表1抑菌圈结果(mm)

注：1#、2#、3#、3#、4#、5#、6#、7#、8#分别为大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、 黄曲霉；a、b、c、d、e、f、a+、b+、c+、d+分别为2g/L山梨酸钾、2g/L苯甲酸钠、0.7g/L茶多酚、0.7g/L乳酸链球菌素、黑茶冠突散囊菌发酵 物溶液、0.9％生理盐水、20g/L山梨酸钾、20g/L苯甲酸钠、7g/L茶多酚、7g/L乳酸链球菌素。“+”表示微弱抑菌作用；“-”表示无抑菌作用； “++++”表示很强抑菌作用，无法测定抑菌圈。以上数据为四个平行试验的结果。

由表1可见，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对典型的G⁺、G^-、致病菌---大肠 埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌具有一定 的抑制作用，但对真菌基本无抑菌活性。

实施例三黑茶冠突散囊菌发酵物溶液最小抑菌浓度MIC测定

1、菌悬液的制备

细菌、酵母菌菌悬液：采用平板菌落计数法与分光光度法结合的方法，用生 理盐水将初始菌液配成浓度为10⁷cfu/mL的菌悬液。

孢子菌悬液：用无菌生理盐水将霉菌产生大量的孢子从斜面洗下，转移至离 心管中，加入玻璃珠，震荡10-20min，用灭菌的脱脂棉过滤，平板菌落计数法 与分光光度法结合的方法，用生理盐水将滤液配成浓度为10⁷cfu/mL的孢子悬液。

2、菌液体培养基制备

将取配置好的浓度为1×10⁷cfu/mL的菌悬液加入肉汤液体培养基(酵母和 霉菌为PDA液体培养基)中混匀，使培养基中菌浓度为1×10⁵cfu/mL，室温冷 却凝固，得到指示菌液体培养基。

3、最小抑菌浓度(MIC)测定

本实验以大肠埃希菌(1#)、枯草芽孢杆菌(2#)、金黄色萄球菌(3#)、 荧光假单胞菌(4#)、蜡样芽孢杆菌(5#)、酿酒酵母(6#)、黑曲霉(7#)、 黄曲霉(8#)为指示菌，采用稀释法对黑茶冠突散囊菌发酵物溶液(也为实施案 例一中液体发酵干燥物用25倍重量的水溶解所得到的的溶液)的MIC值进行测 定。将原液制备呈一系列不同浓度稀释液，细菌置于30～37℃培养24h左右，霉 菌和酵母置于25～30℃培养48h左右。以不见菌生长的最低浓度作为最低浓度 MIC值。

实验结果见表2～9和图2～8

4.1发酵物溶液对1#的MIC；结果如表2所示：

表2黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对1#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；7、8分别为 20g/L苯甲酸钠、5g/L乳酸链球菌素；9为阳性对照；10、11为阴性对照。“+”表示可见 菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表2可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对1#的MIC浓度为其稀释9倍。

4.2发酵物溶液对2#的MIC；结果如表3所示：

表3黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对2#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；7、8分 别为20g/L苯甲酸钠、5g/L乳酸链球菌素；9为阳性对照；10、11为阴性对照。“+”表示 可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表3可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对2#(枯草芽孢杆菌)的MIC为 其稀释30倍。

4.3发酵物溶液对3#的MIC；结果如表4所示：

表4黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对3#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释倍数；7、8 分别为20g/L苯甲酸钠、5g/L乳酸链球菌素；9为阳性对照；10、11为阴性对照。“+”表 示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表4可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对3#(金黄色葡萄球菌)的MIC 浓度为其稀释25倍

4.4发酵物溶液对4#的MIC；结果如表5所示：

表5黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对4#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6、7分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；8、9 分别为20g/L苯甲酸钠、5g/L乳酸链球菌素；10为阳性对照；11、12为阴性对照。“+” 表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表5可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对4#(荧光假单胞菌)的MIC浓 度为21倍。

4.5发酵物溶液对5#的MIC；结果如表6所示：

表6黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对5#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6、7分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；8、9 分别为20g/L苯甲酸钠、5g/L乳酸链球菌素；10为阳性对照；11、12为阴性对照。“+” 表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表6可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对5#(蜡样芽孢杆菌)的MIC浓 度为其稀释50倍。

4.6发酵物溶液对6#的MIC；结果如表7所示：

表7黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对6#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6、7分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；8为 阳性对照；9为20g/L苯甲酸钠、10为阴性对照。“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不 见菌生长。

由表7可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对6#(酿酒酵母)的MIC浓度为 其稀释16倍

4.7发酵物溶液对7#的MIC；结果如表8所示：

表8黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对7#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6、7分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；8为 阳性对照；9为20g/L苯甲酸钠、10为阴性对照。“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不 见菌生长。

由表8可知，对7#(黑曲霉)的MIC浓度为其稀释10倍

4.8发酵物溶液对8#的MIC；结果如表9所示：

表9黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对8#的MIC实验结果

注：1、2、3、4、5、6、7分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；8为 阳性对照；9为20g/L苯甲酸钠、10为阴性对照。“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不 见菌生长。

由表9可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液对8#(黄曲霉)的MIC浓度为其 稀释10倍。

实施例四黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同pH稳定性

本实验以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样 芽孢杆菌为指示菌，采用稀释法检测黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同pH的抑 菌稳定性。将原液制备呈一系列不同浓度的稀释液，细菌置于30～37℃培养24h 左右，霉菌和酵母置于25～30℃培养48h左右。以不见菌生长为判定标准。

食品抗菌添加剂在不同pH稳定性的实验结果

实验结果见表10～14。

4.1：发酵物溶液在不同pH条件下对1#的抑菌结果见表10。

表10黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同pH条件下对1#抑菌实验结果

注：横排的1、2、3、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的6、7分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同pH的 肉汤培养基，pH分别2.88、3.88、4.88、5.88、6.88、7.88、8.88。为“+”表示可见菌生 长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表10可见，若pH≦4.88时，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的抑菌效果增强； 抑菌稳定性好。

4.2：发酵物溶液在不同pH条件下对2#的抑菌结果见表11。

表11黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同pH条件下对2#抑菌实验结果

注：横排的1、2、3、4分别黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的6、7分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同pH的肉 汤培养基，pH分别2.88、3.88、4.88、5.88、6.88、7.88、8.88。为“+”表示可见菌生长； “-”表示肉眼不见菌生长。

由表11可知，若pH≦5.88时，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的抑菌效果增强， 抑菌稳定性好。

4.3：发酵物溶液在不同pH条件下对3#的抑菌结果见表12。

表12黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同pH条件下对3#抑菌实验结果

注：横排的1、2、3、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的6、7分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同pH的 肉汤培养基，pH分别2.88、3.88、4.88、5.88、6.88、7.88、8.88。为“+”表示可见菌生 长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表12可知，若pH≦5.88时，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的抑菌效果增强， 抑菌稳定性好。

4.4：发酵物溶液在不同pH条件下对4#的抑菌结果见表13。

表13黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同pH条件下对4#抑菌实验结果

注：横排的1、2、3、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的6、7分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同pH的肉 汤培养基，pH分别2.88、3.88、4.88、5.88、6.88、7.88、8.88。为“+”表示可见菌生长； “-”表示肉眼不见菌生长。

由表13可知，若pH≦5.88时，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的抑菌效果增强， 抑菌稳定性好。

4.5：发酵物溶液在不同pH条件下对5#的抑菌结果见表14。

表14黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同pH条件下对5#抑菌实验结果

注：横排的1、2、3、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的6、7分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同pH的 肉汤培养基，pH分别2.88、3.88、4.88、5.88、6.88、7.88、8.88。为“+”表示可见菌生 长；“-”表示肉眼不见菌生长

由表14可知，若pH≦5.88时，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的抑菌效果增强， 抑菌稳定性好。

实施例五不同温度处理的发酵物溶液的抑菌效果稳定性

本实验以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样 芽孢杆菌为指示菌，采用稀释法，测定不同温度处理的发酵物溶液对指示菌的抑 菌效果的稳定性。将溶液制备呈一系列不同浓度的稀释液，细菌置于30～37℃培 养24h左右，霉菌和酵母置于25～30℃培养48h左右。以不见菌生长为判定标准。

不同温度处理的黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的抑菌效果稳定性的实验结果 实验结果见表15～19。

5.1：发酵物溶液在被不同温度处理后对1#的抑菌结果见表15。

表15黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度条件下对1#抑菌实验结果

注：横排的1、2、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的5、6分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同温度处 理的发酵物溶液；“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表15可知，黑茶冠突散囊菌发酵物在不同温度处理下，对1#抑菌效果稳 定

5.2：发酵物溶液在被不同温度处理后对2#的抑菌结果见表16。

表16黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度条件下对2#抑菌实验结果

注：横排的1、2、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的5、6分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同温度处 理的发酵物溶液；“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表16可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在温度处理下，对2#抑菌效果稳 定

5.3：发酵物溶液在被不同温度处理后对3#的抑菌结果见表16。

表17黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度条件下对3#抑菌实验结果

注：横排的1、2、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的5、6分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同温度处 理的发酵物溶液；“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表17可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度处理下，对3#抑菌效 果较稳定

5.4：发酵物溶液在被不同温度处理后对4#的抑菌结果见表18。

表18黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度条件下对4#抑菌实验结果

注：横排的1、2、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的5、6分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同温度处 理的发酵物溶液；“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表18可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度处理下，对4#抑菌效 果较稳定

5.5：发酵物溶液在被不同温度处理后对5#的抑菌结果见表19。

表19黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度条件下对5#抑菌实验结果

注：横排的1、2、4分别为黑茶冠突散囊菌发酵物溶液的不同倍数稀释液；横排的5为阳性对照；横排的5、6分别为阴性对照。竖排的1、2、3、4、5、6、7代表不同温度处 理的发酵物溶液；“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表19可知，黑茶冠突散囊菌发酵物溶液在不同温度处理下，对5#抑菌效 果较稳定

实施例六

1.组合物1：黑茶冠突散囊菌发酵干燥物(A组分)20份、茶多酚10份；

2.组合物2：黑茶冠突散囊菌发酵干燥物(A组分)30份、乳酸链球菌素10 份；

3.组合物3：黑茶冠突散囊菌发酵干燥物(A组分)50份、茶多酚6份、竹 叶抗氧化物5份、植酸钠5份；

4.组合物4：黑茶冠突散囊菌发酵干燥物(A组分)25份、植酸钠10份；

本实验以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样 芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、黄曲霉为指示菌，采用液体培养法((液体指示菌 浓度为10⁵cfu/mL))比较上述组合物各成分，实施案例六中所有组合物按比例混 合后再稀释250倍使用、并和5g/L茶多酚、乳酸链球菌素、竹叶抗氧化物，2g/L 植酸钠等(成分见表20)进行抑菌比较抑菌效果，细菌置于30～37℃培养24h 左右，霉菌和酵母置于25～28℃培养48h左右(细菌的抑菌的pH为6.88，霉菌 的pH为5.88，接种量为8％，各成分在相同的接种量下测定)。以不见菌生长 为判定标准。

与常用的化学食品食品抗菌添加剂比较结果

结果见表20～21

表20天然防腐组分与常用化学食品抗菌添加剂比较结果

注：山梨酸钾、苯甲酸钠：10g/L；茶多酚、乳酸链球菌素、竹叶抗氧化物：5g/L；植酸钠：2g/L；A组分稀释液为250倍稀释液“+”表示可见菌生长；“-”表示肉眼不见菌生长。

由表20可知，食品抗菌添加剂防腐强弱是：组合物1≈组合物2≈组合物3 ≈组合物4＞A组分稀释液＞苯甲酸钠＞山梨酸钾＞茶多酚＞竹叶抗氧化剂＞乳 酸链球菌素＞植酸钠

由上可知，本研究发现，A组分单独使用，对革兰氏阴性、阳性菌，酵母和 霉菌均有抑菌效果，但只能抑制细菌、霉菌培养24h～48h，之后肉眼可见菌落生 成；乳酸链球菌素对酵母和霉菌无效，但将A组分和乳酸链球菌素联合使用， 能够对革兰氏阴性、阳性菌，酵母和霉菌均有抑菌效果且培养96h后，不见细菌 和霉菌的菌落生长。不仅扩大乳酸链球菌素的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌、酵母和霉菌均有抑菌效果，而且使黑茶冠突散囊菌发酵物抑菌效果增强；

另外，将A组分和茶多酚联合使用，茶多酚能对细菌、酵母和霉菌均有抑 菌效果，但菌培养24h之后可见菌落生成，A组分和茶多酚联合使用能够协同增 加对细菌、酵母和霉菌的抑菌效果，使大肠杆菌菌培养48h之后可见菌落生成， 其它供试菌培养72h后不见菌落生成。

再有，植酸钠对供试菌菌物无抑菌效果，将A组分和植酸钠联合使细菌除 大肠杆菌外，培养72h不见菌生长，协同增加对细菌的抑菌效果。

将植酸钠、竹叶抗氧化物和A组分联用，竹叶抗氧化物对细菌、酵母和霉 菌具有抑菌效果但培养48h可见菌生长。与植酸钠、A组分联合使用后，培养 72h之后，不见菌生长。协同增加对细菌、酵母和霉菌的抑菌效果。

实施例七

以黑茶冠突散囊菌发酵物为主要活性物质添加其他辅助活性物质的食品抗 菌添加剂组分，在普通食品中的应用

组合物1黑茶冠突散囊菌发酵干燥物20份、茶多酚10份，混合的抑菌添加 剂，随后将其加入到奶茶中。混合抑菌添加剂用量范围为0.4g/kg，产品置于25℃ 恒温保存，参照我国的《食品安全国家标准食品微生物学》检验产品是否符合 国家标准，检测项目包括菌落总数测定、霉菌和酵母计数、大肠菌群计数、金黄 色葡萄球菌检验、沙门氏菌检测。产品保存0-12个月微生物含量在合格范围。

实施例八以黑茶冠突散囊菌发酵物为主要活性物质添加其他辅助活性物 质的食品抗菌添加剂组方，在食品中的应用

组合物2黑茶冠突散囊菌发酵干燥物30份、乳酸链球菌素10份，混合抑菌 添加剂，随后按照用量0.3g/kg加入到公司内部植物饮料(如植物醋饮)中，产 品置于25℃恒温保存，参照我国的《食品安全国家标准食品微生物学》检验产 品是否符合国家标准，检测项目包括菌落总数测定、霉菌和酵母计数、大肠菌群 计数、金黄色葡萄球菌检验、沙门氏菌检测。产品保存0-12个月微生物含量在 合格范围。

实施例九以黑茶冠突散囊菌发酵物为主要活性物质添加其他辅助活性物质 的防腐组方，在功能性食品中的应用

组合物3黑茶冠突散囊菌发酵干燥物50份、茶多酚6份、竹叶抗氧化物5 份、植酸钠5份，混合抑菌添加剂，随后按照用量0.35g/kg加入到浦公仁固体 饮料中，产品置于25℃恒温保存，参照我国的《食品安全国家标准食品微生物 学》检验产品是否符合国家标准，检测项目包括菌落总数测定、霉菌和酵母计数、 大肠菌群计数、金黄色葡萄球菌检验、沙门氏菌检测。产品保存0-12个月微生 物含量在合格范围。

实施例十以黑茶冠突散囊菌发酵物为主要活性物质添加其他辅助活性物质 的防腐组方，在特殊营养食品中的应用

组合物4黑茶冠突散囊菌发酵干燥物25份、植酸钠10份，混合抑菌添加 剂，随后加入到特医食品中(如糖尿病全营养配方食品，添加的具体量 0.4kg/kg)，产品置于25℃恒温保存，参照我国的《食品安全国家标准食品 微生物学》检验产品是否符合国家标准，检测项目包括菌落总数测定、霉菌和酵 母计数、大肠菌群计数、金黄色葡萄球菌检验、沙门氏菌检测。产品保存0-12 个月微生物含量在合格范围。

所述的一种以黑茶冠突散囊菌发酵干燥物(A组分)为主要活性物质的新的 防腐方法中，A组分是固液发酵黑茶的发酵提取液的浓缩干燥物，具有生理功能； 黑茶冠突散囊菌发酵干燥物抑菌谱广、抑菌效果强，稳定性好，天然安全；茶多 酚、乳酸链球菌素均具有较强的抑菌能力且是国家认可的食品添加剂，广泛应用 到食品中；植酸钠、竹叶抗氧化物、迷迭香提取物来自于天然植物，且为食品添 加剂，可以应用到食品中。以黑茶冠突散囊菌发酵干燥物为主要活性物质的食品 抗菌添加剂成分全部为天然成分、安全无害；以黑茶冠突散囊菌发酵干燥物为主 要活性物质的食品抗菌添加剂主要适应于普通食品、饮料类、功能性食品、特殊 营养食品，添加重量为0.03～0.04wt.％。

Claims (10)

1.一种食品抗菌添加剂，其特征在于，包括A组分和B组分；所述的A组分为黑茶冠突散囊菌发酵物；所述的B组分为乳酸链球菌素、茶多酚、植酸钠、竹叶抗氧化物中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的食品抗菌添加剂中，其特征在于，A组分的制备过程包括：

步骤(1)：黑茶茶叶杀青、捻揉、灭菌：

步骤(2)：向步骤(1)的黑茶中接种冠突散囊菌、发酵；

步骤(3)：对步骤(2)发酵后的黑茶进行水提，获得发酵物。

3.根据权利要求1所述的食品抗菌添加剂中，其特征在于，步骤(2)中，冠突散囊菌接种量为5～10％。

4.根据权利要求1所述的食品抗菌添加剂中，其特征在于，

所述的发酵是固体发酵或液态发酵；

所述的固体发酵为直接在灭菌的黑茶中接种所述的冠突散囊菌，进行发酵；固体发酵后，将干燥后的发酵黑茶进行粉碎，获得颗粒；随后再加水进行水提；

所述的液态发酵为预先将黑茶和水混合，随后一并灭菌，灭菌冷却后在接种所述的冠突散囊菌进行液态发酵；发酵完成后水提；

将水提的溶液进行过滤、浓缩干燥，得到所述的发酵物。

5.根据权利要求1所述的食品抗菌添加剂，其特征在于，按重量百分数计，A组分的干重含量为30～80％。

6.一种权利要求1～5任一项所述的食品抗菌添加剂的应用，其特征在于，将其添加在食品中，用作革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、霉菌中的至少一种微生物的抑菌添加剂。

7.如权利要求6所述的食品抗菌添加剂的应用，其特征在于，将其用作大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色萄球菌、荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、黄曲霉中的至少一种微生物的抑菌添加剂。

8.如权利要求6所述的食品抗菌添加剂的应用，其特征在于，所述的食品为普通食品、饮料类、功能性食品、特殊营养食品。

9.如权利要求6～8任一项所述的食品抗菌添加剂的应用，其特征在于，添加重量为0.01～0.08wt.％。

10.一种食品，其特征在于，添加有权利要求1～5任一项所述的食品抗菌添加剂；

优选地，添加重量为0.01～0.08wt.％。

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