CN107686855B - 一种抗菌蛋白的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌蛋白分离纯化的方法，解决了现有蛋白质的分离纯化方法无法获得B.amyloliquefaciensF1高纯度的抗菌蛋白、杂质蛋白多和抗菌蛋白收率低的问题，对其稳定性研究，为开发抗菌蛋白的应用前景奠定了基础。本发明通过超滤浓缩、硫酸铵沉淀的方法获得抗菌粗蛋白；离子交换对抗菌粗蛋白进行初步纯化；凝胶层析纯化后获得较纯的抗菌蛋白。本发明的B.amyloliquefaciensF1抗菌蛋白在100℃处理30min时抑菌活性保留率在80%以上；在pH为5.0‑9.0范围内其抑菌活性仍然在70%以上；对胰蛋白酶较为敏感；经紫外线照射与反复冻融后仍然具有良好的抑菌活性；一价金属离子对抗真菌蛋白的抑菌活性没有显著性影响，表现出较好的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于微生物及生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌是与枯草芽孢杆菌相似，可产芽孢、革兰阳性(G+)、具有 生防活性的益生细菌。解淀粉芽胞杆菌在生长过程中可以产生一系列抑制真菌和 细菌活性的代谢物，已证实的抑菌物质包括抑菌蛋白类、脂肽类抗生素、大环类 酯类、肽类、聚酮化合物等，在抑制病原菌、环境保护、动物生产等方面已显示出益生菌的用途。抗菌蛋白大多是具有热稳定性，一般能耐受121℃高温而不失活，酸碱范围广，对紫外线有耐受性等特点。
从微生物发酵液中分离抗菌蛋白，目前，关于分离、纯化抗菌物质的主要方 法包括大孔树脂法、酸碱沉淀法、硫酸铵沉淀法、色谱法等方法。虽然许多生防 微生物都能分泌抗菌蛋白，而且蛋白质的分离纯化方法也已经发展得较为完善， 但由于菌株不同，其抗菌蛋白的性质迥异，纯化方法也各有差异。
B.amyloliquefaciens F1属于芽孢杆菌属，其保藏号为CGMCC No.10942， 保藏日期为2015年6月1日，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。B.amyloliquefaciens F1已在中国发明专利申请“一株具有高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用”(专利公开号为CN 102153618A，公开日为2015年10月21日)中公布。B.amyloliquefaciens F1可产生抗真菌蛋白，对多种真菌都有抑制作用，但采用现有蛋白质的分离纯化方法无法获得高纯度的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白，杂质蛋白多，而且抗菌蛋白收率低。
发明内容
本发明要解决现有蛋白质的分离纯化方法无法获得高纯度的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白、杂质蛋白多和抗菌蛋白收率低的问题，而提供的 一种解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，所述B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化：
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2-6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的 试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液，吸取B.amyloliquefaciens F1 种子液，以2-6％的接种量添加到装载量20-40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发 酵得B.amyloliquefaciens F1发酵液；
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液。 在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，4℃静置过夜，之后 8000-10000r/min离心20-30min，收集沉淀。用原液1/10-1/20体积PBS缓冲液溶 解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品；
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
采用NGC层析系统进行初步纯化。透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于离子交换柱，用缓冲液平衡，洗脱液进行线性梯度洗脱。以洗 脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，收集主要分离组分； 收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶 过滤层析柱，进行洗脱。以洗脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，并收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。
本发明所述B.amyloliquefaciens F1菌株具有高真菌抑制活性，由扬州大学 食品发酵实验室从香辛料中筛选、鉴定，并申请了专利，专利名称为“一株具有 高真菌抑制活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用”，且专利公开号为CN 102153618 A，公开日为2015年10月21日。B.amyloliquefaciens F1现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏号为 CGMCCNo.10942，保藏日期为2015年6月1日。
进一步地，所述B.amyloliquefaciens F1种子液制备条件为30-37℃摇床振荡 培养18-24h；所述摇瓶发酵条件为30-37℃发酵48-72h。
所述发酵培养基为：蛋白胨10.0g，牛肉浸出粉3.0g，NaCl 5.0g，2g柠檬酸 铵，4g蔗糖，0.2g硝酸钾(1000mL水)。
进一步地，所述超滤浓缩所用的超滤膜截留分子量为3-30kDa，硫酸铵饱和 度为40-60％；PBS浓度为10mmol/L、pH 8.0；透析袋孔径为3-30kDa，透析 48-60h，每12-24h更换一次透析液。
进一步地，所述抗菌蛋白的分离纯化，离子交换层析条件为：离子交换柱为 阴离子交换柱或阳离子交换柱或两类柱子组合使用；平衡缓冲液为10mmol/L、 pH5.0-10.0的PBS，洗脱液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS(含1mol/LNaCl)， 上样量为5.0-20mg/g柱填料。
更进一步地，所述凝胶过滤层析的条件为：洗脱液为10mmol/L、pH6.0-9.0 的PBS，上样体积为柱体积的0.5％-5％。
本发明还研究了分离纯化后B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的稳定性，主要研究温度、pH、蛋白酶、金属离子、反复冻融、紫外线对其抑菌稳定的影响。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、采用本发明解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白的分离纯化方法可以得到高纯度的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白，无杂质蛋白，该抗菌蛋白分子量为42.9kDa，对 黑曲霉、白曲霉和寄生曲霉、黄曲霉均有高抑菌活性。
2、采用本发明纯化出的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白对热不敏感；具有较宽的酸碱范围；对胰蛋白酶较为敏感，经紫外线照射与反复冻融后仍然具有良好的抑菌活性；一价金属离子对抗真菌蛋白的抑菌活性没有显著性影响。说明抗菌蛋白是一种结构非常稳定的蛋白质，对热、酸碱、蛋白酶、紫外线、反复冻融以及金属离子处理均显示出较强的稳定性。
附图说明
图1为实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白离子交换层析图，由图可知，抗菌粗蛋白杯分离成4个组分。经SDS-PAGE检测，结果如图1中泳道 2所示，条带较多，需进一步分离。
图2为实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白Superdex 75凝胶过滤层析图。由图可知，抗菌蛋白被分离成一个组分，收集峰尖部位，经SDS-PAGE检测，结果如图1中泳道3所示，出现单一条带，说明本发明能有效地将抗菌蛋 白分离纯化出来。
图3为实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白SDS-PAGE电泳检测结 果图。由图可以看出，出现单一条带，说明得到的抗菌蛋白为纯物质，分离纯化 效果较好。
图4为温度对实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白抑菌活性的影响。
图5为pH对实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白抑菌活性的影响。
图6为蛋白酶对实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白抑菌活性的影 响。
图7为金属离子对实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白抑菌活性的 影响。
图8为紫外线对实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白抑菌活性的影 响。
图9为反复冻融对实施例2中B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白抑菌活性的 影响。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的 阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围，其中实施例2为最优实施例。
实施例1
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按1％接种量接种于含5mL营养肉汤的试管 中，33℃摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1 种子液，以2％的接种量添加到装载量40％发酵培养基的锥形瓶中，33℃、摇床 培养48h，获得B.amyloliquefaciens F1发酵液。
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液，采用截留分子量为15kDa 的超滤膜进行超滤，即得超滤浓缩液。然后向超滤浓缩液中缓慢加入硫酸铵，使 其饱和度达到0％，4℃静置过夜，之后8000r/min离心30min，收集沉淀。用原液1/10体积10mmol/L、pH8.0PBS缓冲液溶解沉淀，装入截留分子量为14kDa透析袋中，采用浓度相同的缓冲液透析，并且每12h时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品。
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于HiTrapTM HP-Q，上样量为10mg/g柱填料，用10mmol/L、pH 7.0PBS缓冲液平衡，10mmol/L、 pH7.0的PBS(含1mol/L氯化钠)进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，上样体积为柱体积的2％，以10mmol/L、 pH7.0PBS缓冲液进行洗脱， 收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。,
实施例2
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2％接种量接种于含5mL营养肉汤的试管 中，30℃摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1 种子液，以2％的接种量添加到装载量20％发酵培养基的锥形瓶中，32℃、摇床 培养72h，获得B.amyloliquefaciens F1发酵液。
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液，采用截留分子量为8kDa的 超滤膜进行超滤，即得超滤浓缩液。然后向超滤浓缩液中缓慢加入硫酸铵，使其 饱和度达到50％，4℃静置过夜，之后10000r/min离心20min，收集沉淀。用原 液1/10体积10mmol/L、pH8.0PBS缓冲液溶解沉淀，装入截留分子量为30kDa 透析袋中，采用浓度相同的缓冲液透析，并且每20h时间换一次透析液，即得抗 菌蛋白粗品。
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于HiTrapTMHP-Q， 上样量为15mg/g柱填料，用10mmol/L、pH 8.0PBS缓冲液平衡，10mmol/L、pH 8.0的PBS(含1mol/L氯化钠)进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集 离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤 层析柱，上样体积为柱体积的2％，以10mmol/L、pH 8.0PBS缓冲液进行洗脱， 收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。
对上述抗菌蛋白的抑菌稳定性测试，测试结果如图1～图9所示。
温度：将抗菌蛋白纯溶于10mmol/LpH8.0的PBS缓冲液中，分别在40℃、 60℃、80℃、100℃条件下水浴热处理30min，121℃条件下热处理15min，未处 理的样品作对照，测定抑菌活性。
pH：将抗菌蛋白溶于10mmol/LpH 8.0的PBS缓冲液中，置于10mL离心管 中，每管6mL，用1mol/LHCl和1mol/LNaOH调其pH分别为2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11，最终容积保持10mL，以加等量PBS稀释的菌液作为对照， 然后37℃温浴30min，后分别调至初始pH，测抑菌活性。
蛋白酶：将抗菌蛋白溶于10mmol/LpH 8.0的PBS缓冲液中，分别加入蛋白 酶k、胰蛋白酶、胃蛋白酶，终浓度为1mg/mL，37℃水浴恒温1h，以未添加蛋 白酶处理的样品作为对照，测抑菌活性。
金属离子：称取不同质量氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、氯化铜、氯化 铁、氯化锰，溶于水中，分装灭菌。在抗菌蛋白中分别加入上述不同的金属离子， 其终浓度调为10mmol/L，静置1h，以不添加金属离子为对照，测抑菌活性。
反复冻融：将抗菌蛋白在-20℃冰箱与室温下交替进行，每次处理10min。 经过反复冻融5、10、15、20、25、30次后，以未经处理的抗菌蛋白作为对照， 测抑菌活性。
紫外线：将抗菌蛋白放置于超净工作台距紫外灯5cm处，分别照射0.5h、 1h、1.5h、2h、2.5h、3h，以未经处理的抑菌活性物质为对照，测抑菌活性。
实施例3
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2％接种量接种于含5mL营养肉汤的试管 中，30℃摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1 种子液，以2％的接种量添加到装载量30％发酵培养基的锥形瓶中，37℃、摇床 培养70h，获得B.amyloliquefaciens F1发酵液。
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取
首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液，采用截留分子量为15kDa的 超滤膜进行超滤，即得超滤浓缩液。然后向超滤浓缩液中缓慢加入硫酸铵，使其 饱和度达到60％，4℃静置过夜，之后9000r/min离心20min，收集沉淀。用原液1/20体积10mmol/L、pH7.5.0PBS缓冲液溶解沉淀，装入截留分子量为14kDa 透析袋中，采用浓度相同的缓冲液透析，并且每20h时间换一次透析液，即得抗 菌蛋白粗品。
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于HiTrapTM HP-SP，上样量为20mg/g柱填料，用10mmol/L、pH 7.5PBS缓冲液平衡，10mmol/L、pH 7.5的PBS(含1mol/L氯化钠)进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，上样体积为柱体积的1％，以10mmol/ L、pH 7.5PBS缓冲液进行洗脱，收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。
Claims (6)
1.B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述
B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白按以下步骤进行分离纯化：
(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备
将B.amyloliquefaciens F1菌株按2-6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液，吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2-6％的接种量添加到装载量20-40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发酵得B.amyloliquefaciensF1发酵液；所述B.amyloliquefaciens F1现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10942，保藏日期为2015年6月1日；
(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的提取
首先将步骤(1)所得B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液，在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，静置过夜，之后离心，收集沉淀，用原液1/10-1/20体积PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品；所述超滤浓缩所用的超滤膜截留分子量为3-30kDa，硫酸铵饱和度为40-60％；PBS浓度为10mmol/L，pH 8.0；透析袋孔径为3-30kDa；
(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化
采用NGC层析系统进行初步纯化，透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于离子交换柱，用缓冲液平衡，洗脱液进行线性梯度洗脱；以洗脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，进行洗脱，以洗脱体积为横坐标，以280nm吸收值为纵坐标得洗脱图谱，并收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得较纯的抗菌蛋白。
2.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述B.amyloliquefaciens F1种子液制备过程为30-37℃摇床振荡培养18-24h；所述摇瓶发酵条件为30-37℃发酵48-72h。
3.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述发酵培养基为：蛋白胨10.0g，牛肉浸出粉3.0g，NaCl 5.0g，2g柠檬酸铵，4g蔗糖，0.2g硝酸钾，1000mL水。
4.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，透析48-60h，每12-24h更换一次透析液。
5.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述离子交换层析的条件为：离子交换柱为HiTrapTMHP-Q或者HiTrapTMHP-SP；平衡缓冲液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，洗脱液为10mmol/L、pH5.0-10.0的PBS，上样量为5.0-20mg/g填料。
6.根据权利要求1所述的B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述凝胶过滤层的条件为：洗脱液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，上样体积为柱体积的0.5％-5％。
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| 一株黄曲霉拮抗细菌F1 的筛选、鉴定及其抑菌特性;饶胜其等;《现代食品科技》;20151118;第31卷(第12期);摘要，第100页第2段，第102页第3段，第104页第1段 * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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