CN110343644A - 一种菌剂及其培养方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，本发明提供了一种菌剂，主要包括以下菌株中的一种或两种：a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18029；保藏时间为：2019年6月26日；b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18030；保藏时间为：2019年6月26日。本发明的菌剂在抑菌方面具有优异的效果，尤其在抗桃褐腐病、抗桃流胶病、生菜培育方面均具有很广泛的应用。

Description

一种菌剂及其培养方法、应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种菌剂及其培养方法、应用。
背景技术
桃原产于中国，至今3000多年的历史，是世界性大宗水果，中国是桃栽培历史最久的国家，也是世界桃生产第一大国。据统计我国保存有1500余份桃资源，包含光核桃、山桃、普通桃、新疆桃、陕甘山桃和甘肃桃6个种。近十年来随着生产技术的提升，桃产业也在迅速发展，种植面积逐年递增，大桃产量随之升高，但中国桃产业依然存在一些问题，如中、短需冷量的桃品种不足，流胶病、褐腐病等病害发生严重，储运保鲜能力弱等问题，依然是制约大桃经济发展的重要因素，研究工作者越来越注重桃果实的品质、储存条件以及病害预防的研究。
桃园中发现的主要病害有桃褐腐病、细菌性穿孔病、桃流胶病和桃疮痂等，目前抑制病害主要采用物理防治的方法，比如在春季花期前及时清除树上、树下的病果、病叶和病枝等，集中烧毁，减少初侵染源，在生长季节及时剪除病叶、病枝和病果等，带出园地销毁，减少再侵染源，或采用除病块，树干涂抹，喷施保护剂等方法进行防治。常用的化学药剂有石硫合剂、多菌灵和丙环唑等杀菌剂。
但是上述防治措施均存在防治成本高、耗时长、污染环境等问题，而且防治抑菌效果不佳，对于潜伏于树皮下的病害不易清除，不能达到较好的控制病害的效果。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种菌剂，该菌剂为两种菌株复合或单一使用的微生物菌剂，比传统防治措施成本低、效率高、绿色环保，同时增加了植物体内的营养物质的含量，增加了植物的抗性和适应环境的能力。
本发明的第二目的在于提供上述菌剂的培养方法，该培养方法简单、易于操作、操作条件温和。
本发明的第三目的在于提供上述菌剂的进一步应用，应用广泛，可以广泛的应用在植物的抗病以及促生等方面，尤其对于桃树抑制病害的效果较好。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种菌剂，主要包括以下菌株中的一种或两种：
a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18029；保藏时间为：2019年6月26日；
b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18030；保藏时间为：2019年6月26日。
其中，甲基营养芽孢杆菌(以下简称菌株A)为土壤中分离出的菌株，其菌落形态描述特征为：白色，不透明，表面中央部分褶皱，周围光滑。
枯草芽孢杆菌(以下简称菌株B)为从桃树根部组织分离出的内生菌，菌落形态描述特征为：菌落呈奶白色、不透明、表面隆起且褶皱干燥。
本发明的上述两种菌株均保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏地址均为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
采用上述菌剂时，在一些具体实施方式中，所述菌剂中，甲基营养芽孢杆菌(菌株A)与所述枯草芽孢杆菌(菌株B)的活菌数比为(0.5-2):1，优选为1:1。
该菌剂的类型可以为固体或液体，当两个菌株复合使用时，菌株A与菌株B的活菌数比可以为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1等，两种菌株主要起抑菌作用的为菌株A，当两者的活菌数比1:1的条件下其抑菌效果最为优异。
采用上述菌剂时，在一些具体实施方式中，主要由甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液组成，甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均在0.6-0.8之间，且所述甲基营养芽孢杆菌液与所述枯草芽孢杆菌液的体积比为(0.5-2):1，优选为1:1；
优选地，所述甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均为0.6，因为当两种菌株OD600在这个数值时，其菌落呈对数增长，活菌数基本相同。
所以实际操作时，最优的操作方式为：先将两种菌株在基础培养基中培养后形成种子液，再在OD600都达到0.6时，将种子液各取相同的体积接种于发酵培养基上进行复合培养。
在实际操作中，可通过比浊法确定两种菌液浓度为1:1进行混合培养，然后取出一定体积的复合菌剂梯度稀释在平板上进行涂布，经约12h，在平板上数单菌落，确定活菌数基本相同。
采用上述菌剂时，在一些具体实施方式中，所述菌剂无论是液体菌剂或固体菌剂，其总活菌数为1×107CFU/mL以上，比如为1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、4×108CFU/mL、5×108CFU/mL、6×108CFU/mL、7×108CFU/mL、8×108CFU/mL、9×108CFU/mL、1×109CFU/mL、2×109CFU/mL、3×109CFU/mL、4×109CFU/mL、5×109CFU/mL、6×109CFU/mL、7×109CFU/mL、8×109CFU/mL、9×109CFU/mL、1×1010CFU/mL等等。
最优地，所述菌剂的总活菌数为1×109CFU/mL以上，后续试验证明在该总活菌数下其抑菌效果最为优异。
本发明还提供了上述菌剂的培养方法，包括如下步骤：
将由所述甲基营养芽孢杆菌与所述枯草芽孢杆菌组成的种子液接种于发酵培养基中，25℃-35℃培养40h以上，优选地30℃培养42h；
优选地，所述发酵培养基的组成为：硫酸镁0.3-1g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，酵母浸粉14-16g/L，维生素B1 8-12mg/L，葡萄糖18-22g/L；
优选地，所述发酵培养基的组成为：硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，酵母浸粉15g/L，维生素B1 10mg/L，葡萄糖20g/L。
优选地，所述发酵培养基的pH为5-7之间，优选为pH5.5，pH还可以为6、6.5等等。
优选地，所述种子液的接种量为1-9v/v％之间，优选地为3v/v％，接种量还可以为5％、7％等等。
通过对复合后菌株发酵的各个操作条件进行优化后，使得菌株能够保证良好的生长，并提高活性物质的产量。
本发明还提供了上述菌剂在抑制桃树病害以及促桃树生长方面的应用以及在生菜培育方面的应用，比如对于生菜的促生以及抑菌效果方面，对于其他植物也同样具有良好的抑菌、促生效果，当然重要的还是体现在抑菌方面。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的菌剂比传统防治措施成本低、效率高、绿色环保，同时增加了植物体内的营养物质的含量，增加了植物的抗性和适应环境的能力；
(2)本发明的菌剂的发酵方法简单、易于操作、操作条件温和；
(3)本发明的菌剂在植物的抗病以及促成方面具有很广泛的应用，尤其在桃树的抑制病害方面应用较优异。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例3中不同浓度葡萄糖构成的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；
图2为本发明实验例3中不同浓度条件下的酵母浸粉复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；
图3为本发明实验例3中不同接种量条件下的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；
图4为本发明实验例3中不同容量条件下的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；
图5为本发明实验例3中不同pH条件下的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；
图6为本发明实验例3中不同温度条件下的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果的试验结果图；
图7为本发明实验例3中不同培养时间下的复合菌剂发酵液的菌液浓度的试验结果图。
本申请提供的菌剂中的两个菌株：
a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)T1，保藏编号为：CGMCCNo.18029；保藏时间为：2019年6月26日；
b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2，保藏编号为：CGMCC No.18030；保藏时间为：2019年6月26日；
均保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；经保藏中心于2019年6月26日检测为存活菌株并保藏。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
菌剂的发酵培养方法按照如下步骤进行：
1)使用无菌白色枪头挑取菌株A(T1)和菌株B(T2)牛肉膏蛋白胨固体培养基上单菌落接种于基础液体培养基中，37℃培养24h作为种子液，当OD600达到0.6时，将种子液各取相同的体积(体积比1:1)接种于1L的最适发酵液体培养基中，30℃培养42h，pH5.5，装液量为80mL/250mL，接种量3％，浓度为1×109CFU/mL的复合菌剂发酵液；
基础液体培养基(g/L)：硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，胰蛋白胨2g，维生素B1 10mg，葡萄糖20g，121℃灭菌20min；
发酵液体培养基(g/L)：硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，酵母浸粉15g，维生素B110mg，葡萄糖20g，121℃灭菌20min。
实验例1
菌株之间的最适比例筛选过程：
使用牛津杯法进行菌株间拮抗实验，将接种于牛肉膏培养基上的菌株放入装有无菌水的三角瓶中，制成发酵液，将浓度相同的发酵液作为本底菌加入40℃左右的相应无菌液体培养基中，摇匀倒入无菌一次培养皿中。待培养基冷却凝固后，用高压灭菌后的镊子将无菌牛津杯置于培养基上，接着吸取等量的其他菌株发酵液于牛津杯中，每组实验重复3次，同时以无菌水作为空白对照。在培养箱中培养2d后，观察牛津杯周围有无抑菌圈出现，如果没有出现抑菌圈说明混入平板的菌株与接入牛津杯的菌株无明显拮抗作用；反之，则说明二种菌株之间存在拮抗作用。之后将牛津杯中相应菌株的量加大到混入平板的菌株发酵液体积的0.5，1.0，1.5和2.0倍重复上述实验，从中选出不出现抑菌圈或者抑菌圈大小可以忽略不记的菌株间比例，每组3个，重复3组。
通过试验发现，菌株A和菌株B在体积比为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1的情况下均未出现拮抗作用。
下表1-3列出了不同体积比的菌株A和菌株B对桃树病的抑菌效果。
表1复合菌剂对桃褐腐病的抑菌效果
菌株 体积比 抑菌半径(mm) 抑菌率(％)
菌株A：菌株B 1:1 12.54±0.09<sup>a</sup> 54.92
菌株A：菌株B 2:1 12.43±0.13<sup>a</sup> 54.12
菌株A：菌株B 1:2 12.37±0.03<sup>a</sup> 53.18
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
表2复合菌剂对桃流胶病的抑菌效果
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
表3复合菌剂对桃桃细菌性穿孔病的抑菌效果
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
从上述表1-表3的数据可知，虽然对于桃不同病害，其抑菌效果最优的复合菌剂单菌株组成和比例也不尽相同，综合考虑单菌株的稳定性，以及桃树主要病害之一桃褐腐病的抑菌活性，体积比最优为1:1。
实验例2
复合菌剂体外抑菌效果测试：
通过培养基将复合菌剂发酵液制成浓度分别稀释为1×107CFU/mL，1×108CFU/mL和1×109CFU/mL三个浓度梯度的复合菌剂发酵液。
取新鲜无明显病害的果实用无菌水进行清洗，去除果实表面尘土，将果实放于1％的NaClO溶液中消毒2min，然后使用无菌水漂洗3次，在超净工作台中用75％的酒精进行表面消毒，无菌水再次漂洗3次，待用。用无菌打孔器对桃果实中部进行伤害处理，将伤口分别放入盛有浓度分别为1×107CFU/mL，1×108CFU/mL和1×109CFU/mL三个浓度梯度的复合菌剂发酵液中，以无菌培养基为对照，浸泡15min，然后将果实移入新的无菌的培养皿中，在伤口处接种桃褐腐病菌饼和桃流胶病菌饼，28℃，培养3d，观察复合菌剂发酵液对桃褐腐病和桃流胶病的拮抗效果，每组重复3次。
取新鲜无明显病害的桃叶片用无菌水进行清洗，去除桃叶片表面尘土，将桃叶片放于1％的NaClO溶液中消毒2min，然后使用无菌水漂洗3次，在超净工作台中用75％的酒精进行表面消毒，无菌水再次漂洗3次，待用。用无菌手术刀对桃叶片中部进行创口伤害处理，每个叶片包含2处创口，将伤口分别放入盛有浓度分别为1×107CFU/mL，1×108CFU/mL和1×109CFU/mL三个浓度梯度的复合菌剂发酵液中，以无菌培养基为对照，浸泡15min，然后将桃叶片移入新的无菌的培养皿中，在伤口处接种桃褐腐病菌饼和桃流胶病菌饼，28℃，培养3d，观察复合菌剂发酵液对桃褐腐病和桃流胶病的拮抗效果，每组重复3次，每次实验重复3组。
取新鲜无明显病害的桃树枝条用无菌水进行清洗，去除桃树枝条表面尘土，将桃树枝条放于1％的NaClO溶液中消毒2min，然后使用无菌水漂洗3次，在超净工作台中用75％的酒精进行表面消毒，无菌水再次漂洗3次，待用。用无菌手术刀对桃树枝条前后处进行伤害处理，每个枝条人为制造2处伤口，将伤口分别放入盛有浓度分别为1×107CFU/mL，1×108CFU/mL和1×109CFU/mL三个浓度梯度的复合菌剂发酵液中，以无菌培养基为对照，浸泡15min，然后将桃树枝条移入新的无菌的培养皿中，在伤口处接种桃褐腐病菌饼和桃流胶病菌饼，28℃，培养3d，观察复合菌剂发酵液对桃褐腐病和桃流胶病的拮抗效果，每组重复3次，每次实验重复3组，具体结果见下表4-5。
表4不同浓度复合菌剂发酵液对侵染离体桃果实、叶片和枝条褐腐病的抑制作用
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
表5不同浓度复合菌剂发酵液对侵染离体桃果实、叶片和枝条流胶病的抑制作用
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
由上述表4的结果可知，不同浓度的发酵液对桃褐腐病的生长均有抑制作用，随着复合菌剂发酵液浓度的升高，桃褐腐病发病率降低，病斑面积小，拮抗作用明显。当复合菌剂发酵液浓度为1×109CFU/mL时，复合菌剂的抑菌效果最为显著，对桃果实、叶和枝条的抑菌率分别为73.80％、83.33％和90.4％。
由上述表5的结果可知，不同浓度的发酵液对桃流胶病的生长均有抑制作用，随着复合菌剂发酵液浓度的升高，桃褐腐病发病率降低，病斑面积小，拮抗作用明显。当复合菌剂发酵液浓度为1×109CFU/mL时，复合菌剂的抑菌效果最为显著，对桃果实、叶和枝条的抑菌率分别为75.95％、94.93％和88.71％。
实验例3
复合菌剂培养条件的优化：
将复合菌剂菌株接种于250mL的基础液体培养基(硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，胰蛋白胨2g，维生素B1 10mg，葡萄糖20g，121℃灭菌20min)中，37℃培养24h作为种子液。
最适碳源：以基础培养基作为优化的基础，分别选取葡萄糖、蔗糖、果糖和可溶性淀粉为碳源，其它条件不变进行复合菌剂发酵液抑菌效果的检测，确定最适碳源。
葡萄糖：将1％的种子液1mL接种于100mL的葡萄糖浓度为25、50、75、100、125和150g/L的基础培养基中，37℃培养42h，取各不同浓度葡萄糖条件下的发酵液10mL于离心管中，使用打孔法分别在中央接种桃褐腐病菌饼的PDA固体培养基上，距离菌饼2cm处打孔，每孔接种1mL复合菌剂发酵液，且每组重复3次，28℃培养7d，观察抑菌效果，计算抑菌率，使用紫外分光光度计在OD600下测量吸光度值。
最适氮源：以基础培养基作为优化的基础，分别选取胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、硫酸铵和尿素为氮源，其它条件不变进行复合菌剂发酵液抑菌效果的检测，确定最适氮源。
酵母浸粉：将1％的种子液1mL接种于100mL的酵母浸粉浓度为5、10、15、20、25、30和35g/L的基础培养基中，37℃培养42h，取各不同浓度酵母浸粉条件下的发酵液10mL于离心管中，使用打孔法分别在中央接种桃褐腐病菌饼的PDA固体培养基上，距离菌饼2cm处打孔，每孔接种1mL复合菌剂发酵液，且每组重复3次，28℃培养7d，观察抑菌效果，计算抑菌率，使用紫外分光光度计在OD600下测量吸光度值。
接种量：将1％、3％、5％、7％和9％的种子液1mL接种于100mL的基础培养基中，37℃培养42h，取各不同接种量条件下的发酵液10mL于离心管中，使用打孔法分别在中央接种桃褐腐病菌饼的PDA固体培养基上，距离菌饼2cm处打孔，每孔接种1mL复合菌剂发酵液，且每组重复3次，28℃培养7d，观察抑菌效果，计算抑菌率，使用紫外分光光度计在OD600下测量吸光度值。
容积：将1％的种子液1mL接种于40mL、60mL、80mL、100mL、120mL的基础培养基中，37℃培养42h，取各不同容积条件下的发酵液10mL于离心管中，使用打孔法分别在中央接种桃褐腐病菌饼的PDA固体培养基上，距离菌饼2cm处打孔，每孔接种1mL复合菌剂发酵液，且每组重复3次，28℃培养7d，观察抑菌效果，计算抑菌率，使用紫外分光光度计在OD600下测量吸光度值。
pH：将1％的种子液1mL接种于100mL的pH分别为5、5.5、6、6.5和7的基础培养基中，37℃培养42h，取各pH条件下的发酵液10mL于离心管中，使用打孔法分别在中央接种桃褐腐病菌饼的PDA固体培养基上，距离菌饼2cm处打孔，每孔接种1mL复合菌剂发酵液，每组重复3次，28℃培养7d，观察抑菌效果，计算抑菌率，使用紫外分光光度计在OD600下测量吸光度值。
温度：将1％的种子液1mL接种于100mL的温度分别为25℃、30℃和35℃的基础培养基中，37℃培养42h，取各不同温度条件下的发酵液10mL于离心管中，使用打孔法分别在中央接种桃褐腐病菌饼的PDA固体培养基上，距离菌饼2cm处打孔，每孔接种1mL复合菌剂发酵液，且每组重复3次，28℃培养7d，观察抑菌效果，计算抑菌率，使用紫外分光光度计在OD600下测量吸光度值。
培养时间：将1％的种子液1mL接种于100mL的基础培养基中，37℃培养48h，每隔两个小时取发酵液10mL于离心管中，使用打孔法分别在中央接种桃褐腐病菌饼的PDA固体培养基上，距离菌饼2cm处打孔，每孔接种1mL复合菌剂发酵液，且每组重复3次，28℃培养7d，观察抑菌效果，计算抑菌率，使用紫外分光光度计在OD600下测量吸光度值。
表6不同碳源的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
表7不同氮源的复合菌剂发酵液对桃褐腐病的抑菌效果
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
具体结果见表6-7和附图1-7，结果表明在不同条件下，复合菌剂发酵液的菌种浓度与发酵液的抑菌活性呈正相关，经优化后，复合菌剂发酵培养的最适碳源为葡萄糖，最适氮源酵母浸粉，在pH5.5，装液量为80mL/250mL，接种量3％，温度30℃的条件，培养时间42h后，发酵液的抑菌率达到71％。与单菌株的发酵条件对比，复合菌剂在培养时间较短，接种量较小的条件下，发酵液的抑菌活性达到了较高的水平，这有利于生产实践的应用。
细菌T2抑菌效果测试：
检测细菌T2的防治效果使用创伤侵染法。自北京平谷区10年生‘大久保’品系桃园中，随机选取8个生长健康、发育成熟期的桃果实(280±10g)，采后置于4℃保存，带回实验室后立即用沾有75％酒精的棉球轻轻擦拭果实表面，继而用沾有无菌水的棉球重复擦拭果实3次。在无菌环境下选取两点，用直径0.5cm的打孔器打孔0.5cm深，造成人工创口。3株内生拮抗细菌分别以1％的接种量在35℃、150r/min条件下摇瓶培养48h制成菌液。将桃果实的创口分别浸泡在细菌T2菌液中5min，再将桃褐腐病原菌块放入创口作为实验组，以创口中只放入桃褐腐病原菌块的桃果实作为对照组，每组重复4个果。把处理后的8个桃果实放置在31℃，湿度60％的环境下暗培养5d，记录结果。
在31℃、湿度60％的环境下暗培养3d，对照组发病率达100％，同时接种T2和桃褐腐病菌的桃果实发病率为75.0％，病斑平均面积减少；实验组果实创口附近桃褐腐病菌丝及分生孢子均不明显，详见表8。
表8离体桃果实接种内生细菌T2对桃褐腐病生长的抑制效果
表中“±”表示病斑面积的标准偏差，不同字母代表同列数据的显著性差异(Duncan-test,P＜0.05)
细菌T1的抑菌效果试验：
用白色枪头挑取细菌菌株T1接种于75mL的LB液体培养基中，37℃，150rpm，培养12小时，制成种子液，用移液枪吸取种子液750μL接种于75mL的LB液体培养基中，37℃，150rpm，培养48h，将发酵液8000rpm离心10min，弃去上清液，用无菌水将沉淀制成浓度分别为1×107cfu/mL，1×108cfu/mL和1×109cfu/mL三个浓度梯度的菌悬液。
取新鲜无病害的果实用无菌水进行清洗，去除果实表面的灰尘，将果实放于1％的NaClO中消毒2min，无菌水漂洗3次，然后在超净工作台中用75％的酒精进行表面消毒，无菌水漂洗3次，待用。用无菌打孔器对桃果实进行伤害处理，将伤口浸于浓度分别为1×107cFU/ml，1×108cFU/ml，1×109cFU/mL的生防细菌菌悬液中，以无菌水作为对照，浸泡4h，然后将果实移入新的盛放装置中，在伤口处接种桃褐腐病病原菌，28℃，培养4天，观察生防细菌菌株对桃褐腐病的拮抗效果，每组重复三次。
取新鲜无病害的桃叶片用无菌水进行清洗，去除叶片表面的灰尘，将叶片放于1％的NaClO中消毒2min，无菌水漂洗3次，然后在超净工作台中用75％的酒精进行表面消毒，无菌水漂洗3次，待用。用无菌手术刀对叶片进行伤害处理，每片叶片包含6处伤口，将伤口浸于浓度分别为1×107cFU/mL，1×108cFU/mL，1×109cFU/mL的生防细菌菌悬液中，以无菌水作为对照，浸泡4h，然后将叶片移入放有无菌滤纸的培养皿中，用移液枪在滤纸上加入1mL无菌水，保持湿润环境，在伤口处接种桃褐腐病病原菌，28℃，培养4天，观察生防细菌菌株对桃褐腐病的拮抗效果，每组重复三次。
取新鲜无病害的桃枝条用无菌水进行清洗，去除枝条表面的灰尘，将枝条放于1％的NaClO中消毒2min，无菌水漂洗3次，然后在超净工作台中用75％的酒精进行表面消毒，无菌水漂洗3次，待用。用无菌手术刀对枝条进行伤害处理，每个枝条包含1处伤口，将伤口浸于浓度分别为1×107cFU/mL，1×108cFU/mL，1×109cFU/mL的细菌菌悬液中，以无菌水作为对照，浸泡4h，然后将枝条移入放有无菌滤纸的培养皿中，用移液枪在滤纸上加入1mL无菌水，保持湿润环境，在伤口处接种桃褐腐病病原菌，28℃，培养4天，观察细菌菌株对桃褐腐病的拮抗效果，每组重复三次。
经过菌株T1处理4h后的桃树果实、叶和枝条感染桃褐腐病的情况如表9所示，由表9可知菌株T1的菌悬液浓度为1×107cFU/mL，1×108cFU/mL，1×109cFU/mL时均可抑制桃褐腐病的生长。随着菌株T1菌悬液浓度的升高，桃褐腐病的发病率降低，病斑面积减少，同时对各个组织的疾病控制效果增加。值得注意的是当菌悬液浓度为1×109cFU/mL时，菌株T1的抑菌效果显著，对桃果实、叶和枝条的抑菌率分别为64.31％，97.34％和64.28％。
表9不同浓度的T1处理的桃果实、叶片和枝条能力对褐腐病的抑制作用
注：根据Duncann-test在P<0.05的情况下，同一字母表示同列数据差异不大。
复合菌剂(菌株A与菌株B的体积比为1:1)的抑菌广谱性测试
采用平板对峙实验法在无菌操作台里将桃褐腐病、桃流胶病、葡萄灰霉病、苹果腐烂病、棉花红点病和黄瓜枯萎病的病原菌菌饼用无菌接菌钩接种于PDA平板培养基中央，在距离病原菌3cm的三个位置接种复合菌剂，28℃条件下培养5d后观察复合菌剂的抑菌效果，每组3个，重复3组。
抑菌率％＝[菌落直径(CK)-菌落直径(处理)]/菌落直径(CK)×100％
表10复合菌剂的抑菌广谱性
注：表中“±”表示菌落直径平均值的标准偏差
通过平板对峙法分析了1:1的T1与T2配成的复合菌剂对桃流胶病、葡萄灰霉病、棉花红点病、黄瓜靶斑病、瓜果腐霉病和苹果腐烂病的抑菌活性，获得结果如表10所示，复合菌剂对这6种病原菌均有一定的抑制活性，其中对葡萄灰霉病和黄瓜靶斑病效果最好，抑菌率分别为70.97％和61.66％，同时复合菌剂抑菌作用持续时间远高于单一菌株，在同时培养33d时，复合菌剂对接种的6种病原菌依然存在抑菌活性，而单一菌株已完全没有抑菌作用。
实施例2
其他操作步骤与实施例1一致，只是发酵液体培养基(g/L)：硫酸镁1g，磷酸二氢钾0.5g，酵母浸粉16g，维生素B1 8mg，葡萄糖22g，121℃灭菌20min。
实施例3
其他操作步骤与实施例1一致，只是发酵液体培养基(g/L)：硫酸镁0.3g，磷酸二氢钾2g，酵母浸粉14g，维生素B1 12mg，葡萄糖18g，121℃灭菌20min。
实施例4
其他操作步骤与实施例1一致，只是选择为单一的菌株A。
实施例5
其他操作步骤与实施例1一致，只是选择为单一的菌株B。
实验例4
使用无菌白色枪头挑取菌株A和菌株B牛肉膏蛋白胨固体培养基上单菌落接种于基础液体培养基中，37℃培养24h作为种子液，当OD600达到0.6时，将种子液各取1.5mL接种于1L的最适发酵液体培养基中，30℃培养42h，在无菌操作台中分装成2瓶500mL的液体培养基，一瓶待用，一瓶用高温高压灭菌锅121℃，灭菌20min，待用，在无菌操作台中将两瓶培养基分别稀释50倍、100倍(使用无菌培养基)。最终获得6个处理溶液，分别是复合菌剂发酵液、稀释50倍复合菌剂发酵液、稀释100倍复合菌剂发酵液、高温高压灭菌液、稀释50倍高温高压灭菌液、稀释100倍高温高压灭菌液。
将供试生菜种子‘北散生2号’先放入4℃冰箱冻种，然后在玻璃培养皿中放上滤纸，将种子置于滤纸上喷施无菌水，保持滤纸湿润，培养1d后，种子开始萌发，当种子出现白胚时，选择长势相同的15粒种子置于8个装有滤纸的玻璃培养皿中，在玻璃培养皿中先加入25mL的超纯水，接着加入表11中所示的不同的复合菌剂溶液，最适发酵液和超纯水各5mL，每个处理重复三次，每次重复10粒种子，培养过程中使用超纯水保持滤纸的湿润，5d后，测量种子的胚根长、胚芽长、干重和鲜重的增加量，具体结果见下表8。
表11不同处理的复合菌剂发酵液对生菜种子发芽的影响
注：表中不同字母代表同列数据的显著性差异(P＜0.05)
可见，本发明的复合菌剂除了对桃树具有优异的抗病效果，对生菜种子发芽有一定的促进作用。
这是因为复合菌剂中的菌株A是根际土壤菌，土壤根际菌可以在根际，根表和根直接或间接促进植物生长，同时为植物提供由细菌合成的植物生长促进物质或者促进植物对生长环境中磷矿物的溶解和营养物质的吸收，也可以防止一种或多种植物病害，也可以防止一种或多种植物病害。
总之，本发明的菌剂对其他植物的抑菌以及促生效果也有很积极的应用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种菌剂，其特征在于，主要包括以下菌株中的一种或两种：
a)甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18029；保藏时间为：2019年6月26日；
b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18030；保藏时间为：2019年6月26日。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，所述甲基营养芽孢杆菌与所述枯草芽孢杆菌的活菌数比为(0.5-2):1，优选为1:1。
3.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，主要由甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液组成，甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均在0.6-0.8之间，且所述甲基营养芽孢杆菌液与所述枯草芽孢杆菌液的体积比为(0.5-2):1，优选为1:1；
优选地，所述甲基营养芽孢杆菌液和枯草芽孢杆菌液的OD600均为0.6。
4.根据权利要求1-3任一项所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液体菌剂，总活菌数为1×107CFU/mL以上，优选1×109CFU/mL以上。
5.根据权利要求1或2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂，总活菌数为1×107CFU/mL以上，优选1×109CFU/mL以上。
6.权利要求1-5任一项所述菌剂的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
将由所述甲基营养芽孢杆菌与所述枯草芽孢杆菌组成的种子液接种于发酵培养基中，25℃-35℃培养40h以上，优选地30℃培养42h；
优选地，所述发酵培养基的组成为：硫酸镁0.3-1g/L，磷酸二氢钾0.5-2g/L，酵母浸粉14-16g/L，维生素B1 8-12mg/L，葡萄糖18-22g/L；
优选地，所述发酵培养基的组成为：硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，酵母浸粉15g/L，维生素B1 10mg/L，葡萄糖20g/L。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为5-7之间，优选为pH5.5。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述种子液的接种量为1-9v/v％之间，优选地为3v/v％。
9.权利要求1-5任一项所述的菌剂或权利要求6-8任一项所述的培养方法得到的菌剂在抑制桃树病害以及促桃树生长方面的应用；
桃树病害优选包括桃褐腐病以及桃流胶病。
10.权利要求1-5任一项所述的菌剂或权利要求6-8任一项所述的培养方法得到的菌剂在生菜培育方面的应用。
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