CN112998259A - 一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺，属于蓝莓酵素制备领域。本申请研究了用五种不同的菌种包括植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、戴式乳杆菌(接种比例为5：10：4：4：1)发酵的蓝莓酵素，最佳发酵工艺为发酵时间35h，发酵温度38℃，初始接种量调整为5×10⁵CFU/mL，初始总可溶性固形物含量调为15°Brix。总酚含量最高为153.22mg/L，花青素含量156.18mg/L。发酵后不同浓度下的蓝莓酵素的SOD活力最高达到141.96U/g，DPPH自由基清除能力为79.25％、超氧阴离子(O₂.‑)自由基清除能力为170.56U/L、羟自由基清除能力为89.13U/mL。这五种菌种发酵的蓝莓酵素无任何额外添加剂，与前人发酵工艺相比，多菌种发酵、发酵周期短、售价成本低以及抗氧化性良好。

Description

一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺

技术领域

本发明属于蓝莓酵素制备技术领域，具体涉及一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺。

背景技术

蓝莓(Vaccinium spp.)又名越橘、笃斯、都柿等，属杜鹃花科越橘属多年灌木果树。原产于北美洲与东亚，主要分布于朝鲜、日本等国家，在我国主要分布在黑龙江、安徽怀宁县、吉林长白山等地区。蓝莓果实呈小而圆的颗粒状，果皮为蓝紫色，果味酸甜可口，香味独特。果实中富含花青素、SOD(超氧化物歧化酶)活力、各种维生素、蛋白质以及糖类等。

目前蓝莓产品在国内市场主要以果汁饮料、乳制品、果酱、果酒、果冻、糖果、干果、烘焙食品、保健品等进行生产和销售。由于蓝莓具有保健作用，导致其鲜果和加工品的市场需求越来越大。蓝莓深加工产品的开发市场广阔，今后深加工也将成为蓝莓的重点发展方向，即果汁、果酒、酵素、花青素提取等。蓝莓中含有丰富的维生素C，能够预防很多疾病，例如预防心脏病和预防癌症等，对感冒和腹泻的预防也有一定的改善作用。

蓝莓酵素中有保健功能的成分主要是花青素、果胶、类黄酮、维生素等。蓝莓中花青素含量很高，既可促进视网膜细胞中视紫质的再生来抵抗视力减轻眼部疲劳，又可抑制血管紧张肽素转换酶的活性从而降低血压，还可延缓衰老、抗癌，保护脑神经不被氧化提高记忆力，增强人体兔疫力。

目前蓝莓酵素在国内市场的发展还存在一定问题。本蓝莓发酵工艺与传统发酵相比，首先，解决了发酵周期长的问题，其次，解决了酵素产品售价高的问题，降低了酵素的成本随着经济快速发展。最后，人们的消费水平也随之提高，且人们在讲究养生讲究健康的观念影响下，对蓝莓酵素的保健功能的开发也逐步增多，蓝莓酵素的需求量也将逐渐增大，因此蓝莓酵素产品存在着巨大的发展潜力。

发明内容

本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺，包括如下步骤：

(1)将冻蓝莓解冻后用高端破碎料理机破碎；

(2)在45℃-55℃下加酶酶解2-3h；

(3)酶解后在90℃下杀菌15-30min；

(4)杀菌后待温度降至30-42℃，将菌种接入蓝莓果汁中进行发酵20-48h；

(5)最后用棉花将瓶口塞紧后在30-42℃恒温培养箱中进行静态厌氧发酵。

进一步地，步骤(2)中所述的酶为果胶酶，果胶酶的添加量为0.1-1.5％。

进一步地，步骤(4)中所述的菌种为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、戴式乳杆菌。

进一步地，步骤(4)中所述的植物乳杆菌的添加比例为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、戴式乳杆菌(接种比例为5：10：4：4：1)。

本发明相比现有技术具有以下优点：

A、发酵周期短，仅仅20-48h；

B、成本低；

C、抗氧化活性高，抗氧化活力与传统发酵相比提高，总酚含量最高为153.22mg/L，花青素含量156.18mg/L，发酵后不同浓度下的蓝莓酵素的SOD活力最高达到141.96U/g，DPPH自由基清除能力为79.25％、超氧阴离子(O₂.-)自由基清除能力为170.56U/L、羟自由基清除能力为89.13U/mL。

D、多种菌种进行发酵，共5种，无任何添加；

E、本发明所制备的蓝莓酵素是对蓝莓进行全利用，酵素花青素与总酚含量高；

F、本发明所制备的蓝莓酵素口感香醇，酸甜可口，又有着蓝莓本身的香味。

附图说明

图1为本申请高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺流程图

具体实施方式

接下来将结合本发明实施例中的一些附图，对本发明的技术方案进行具体、清楚的描述，首先声明下面的实施例不是本发明中的全部实施例。有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、试验材料

蓝莓，购自安徽怀宁县；SOD试剂盒，南京建成有限公司；乙醇、DPPH(二苯代苦味酰肼)、没食子酸、福林酚、碳酸钠、冰乙酸(均为分析纯)，天津市盛奥化学试剂；MRS肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限公司；果胶酶(500u/mg)，诺维信有限公司；植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、戴式乳杆菌，中国微生物菌种保藏中心。

二、仪器与设备

高端破碎料理机，中山市韩菱电器有限公司；分析天平，上海越平科学仪器有限公司；光照培养箱，宁波市科技园区新江南仪器有限公司；可见分光光度计；电热恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；酸度计，上海杲森仪器设备有限公司；高精度手持式色差仪，致芯电子五金工具。

三、主要指标测定方法

(1)菌种培养

乳酸菌冻干粉溶解在1mL的MRS肉汤培养基后，倒入30mL的MRS肉汤培养基中，在37℃下活化，直到培养基中的菌密度达到8.00-9.00log CFU/mL。然后将活化后的菌种进一步培养至2～3代后用于接种。

(2)菌种生长情况分析

将发酵液的菌浓度每隔4h使用血球计数法进行测量。计数过程中，细胞数以logCFU/mL表示。所有检测均为一式三份。

25格x 16格的血球计数板计算公式:

CFU/mL＝80小格内细胞总数/80×400×10⁴×稀释倍数 (1)

(3)总酚含量的检测

移取1mL的样品液用蒸馏水稀释定容至46mL。接着加入1mL的福林酚试剂摇匀后反应3min，再加入20％的NaCO₃ 3mL，于25℃水浴锅中恒温震荡2h后，以蒸馏水为空白对照，用可见光分光光度计于650nm处测量吸光度值A。总酚含量以没食子酸等价物表示。所有检测均为一式三份。

(4)花色苷含量的测定

采用pH示差法。取两个10mL容量瓶，各加入1mL的蓝莓酵素样，分别用pH1.0的缓冲液(0.2mol/L KCl:0.2mol/L HCl＝25:67(V/V))和pH4.5的缓冲液(1mol/L NaAc:1mol/LHCl:H₂O＝100:60:90(V/V/V))定容后混匀，在冰箱中(4℃)静置2h，分别测定pH1.0和pH4.5缓冲液中样品在510nm和700nm波长下的吸光度，按式(2)计算花色苷含量:

注：A＝(A₅₁₀-A₇₁₀)pH1.0-(A₅₁₀-A₇₁₀)pH4.5，Df为稀释倍数，ε为摩尔吸光度(26900L/mol·cm)，L为比色皿的光程长度(1.0cm)，Mw为分子量(以矢车菊-3-葡萄糖苷计算，Mw＝449.2g/mol。

(5)SOD(超氧化物歧化酶)、羟基自由基、超氧阴离子(O₂.-)自由基清除能力的检测

利用SOD活性、羟、超氧阴离子(O₂.-)检测试剂盒进行检测。所有检测均为一式三份。

(6)DPPH自由基清除作用的测定

移取2mL 0.2mmol/L的DPPH溶液与2mL的样品混匀于棕色容量瓶中，在25℃水浴锅中反应30min后，在517nm处测其吸光度值(A₁)；取2mL无水乙醇与等体积样品液混匀于棕色容量瓶中，在25℃水浴锅中反应30min，517nm波长处测得其吸光度值(A₂)；取2mL 0.2mmol/L的DPPH溶液与等体积无水乙醇混匀于棕色容量瓶中，与25℃水浴锅中反应30min，在517nm波长处测其吸光度值(A₀)。以蒸馏水作为空白对照，所有检测均为一式三份。

样品对DPPH自由基清除率(％)的计算公式为：

DPPH·自由基清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100 (3)

式中：A₁为2mL 0.2mmol/L的DPPH溶液和2mL样品液的吸光度；A₂为2mL样品液与2mL无水乙醇溶液的吸光度；A₀为2mL的0.2mmol/L的DPPH溶液和2mL无水乙醇混合溶液的吸光度。

实施例1

初始菌密度为10⁵CFU/mL(五种菌的接种比例为5：10：4：4：1)、将样品汁在38℃下以及初始可溶性固形物含量控制在15°Brix，分别发酵25、29、34、35、41h，测定每组发酵液的SOD活力。

实施例2

初始可溶性固形物含量为15°Brix、将样品汁初始菌密度控制在10⁵CFU/mL(五种菌的接种比例为5：10：4：4：1)，将蓝莓发酵液在24、31、38、45、52℃下发酵35h，测定每组发酵液的SOD活力。

实施例3

将样品汁初始可溶性固形物含量控制为15°Brix，将蓝莓汁的初始菌密度分别控制为5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶CFU/mL(五种菌的接种比例为5：10：4：4：1)，在38℃下发酵35h，测定每组发酵液的SOD活力。

实施例4

将样品汁的初始菌密度控制为10⁵CFU/mL(五种菌的接种比例为5：10：4：4：1)。初始可溶性固形物含量为11°Brix，在此基础上将发酵液初始TSS含量调整为11、13、15、17、19°Brix，在38℃下发酵35h，测定每组发酵液的SOD活力。

通过以上实施例可以得出最优发酵工艺

(1)将SOD活力作为主要指标。当发酵到35h时，SOD活力达到最高为136.67U/g。因而，发酵到36h时可以停止发酵。

(2)将SOD活力作为主要指标。当发酵温度为38℃时，SOD活性达到最高为142U/g。因而38℃最适合发酵蓝莓酵素。

(3)将SOD活力作为主要指标。当发酵液中菌密度为5×10⁵CFU/mL时，SOD活性最高达到124.67U/g。因而可以将发酵液中的初始菌密度调整为5×10⁵CFU/mL。

(4)将SOD活力作为主要指标。当发酵液的初始可溶性固形物含量为15°Brix时，SOD活性达到最高为146.2U/g，因而将发酵液中的初始TSS含量调为15°Brix。

(7)抗氧化活性

通过最优工艺发酵出的蓝莓酵素不同浓度下的抗氧化活性

表1不同浓度蓝莓酵素的抗氧化能力

由上表1可以看出，本申请研究了用五种不同的菌种包括植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、戴式乳杆菌(接种比例为5：10：4：4：1)发酵的蓝莓酵素，最佳发酵工艺为发酵时间35h，发酵温度38℃，初始接种量调整为5×10⁵CFU/mL，初始总可溶性固形物含量调为15°Brix。总酚含量最高为153.22mg/L，花青素含量156.18mg/L。发酵后不同浓度下的蓝莓酵素的SOD活力最高达到141.96U/g，DPPH自由基清除能力为79.25％、超氧阴离子(O₂.-)自由基清除能力为170.56U/L、羟自由基清除能力为89.13U/mL。

Claims (4)

1.一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将冻蓝莓解冻后用高端破碎料理机破碎；

(2)在45℃-55℃下加酶酶解2-3h；

(3)酶解后在90℃下杀菌15-30min；

(4)杀菌后待温度降至30-42℃，将菌种接入蓝莓果汁中进行发酵20-48h；

(5)最后用棉花将瓶口塞紧后在30-42℃恒温培养箱中进行静态厌氧发酵。

2.根据权利要求1所述一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中所述的酶为果胶酶，果胶酶的添加量为0.1-1.5％。

3.根据权利要求1所述一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺，其特征在于，步骤(4)中所述的菌种为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、戴式乳杆菌。

4.根据权利要求1所述一种高抗氧化活性的蓝莓酵素的制备工艺，其特征在于，步骤(4)中所述的植物乳杆菌的添加比例为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、戴式乳杆菌(接种比例为5：10：4：4：1)。

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