CN102283282B - 牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法，属于水果采后病害控制领域。将胶红酵母活化，接种到添加有0.04%-0.64%牛蒡低聚果糖的NYDB培养基中进行诱导培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1×108个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡1min后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。本发明使用牛蒡低聚果糖诱导培养提高胶红酵母防治水果采后病害的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。诱导培养后的胶红酵母可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法

技术领域

本发明涉及利用牛蒡低聚果糖(Burdock Fructooligosaccharide, 简称BFO)诱导培养提高胶红酵母菌种（Rhodotorula mucilaginosa）对水果采后病害防治效力的方法，属于水果采后病害控制领域。

背景技术

水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，已成为全球关注的问题。据报道，发达国家由此造成的损失为 10%-25%, 而在缺乏冷藏设施的发展中国家则高达40%-50%，我国水果采后损失为20％-25％左右。2007年3月国家统计局发布的《中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报》显示，2006年我国水果总产量达17050万吨。据此估算，我国水果采后的损失每年将达到数百亿元人民币的水平。

导致水果采后损失的因素很多，由于病原菌侵染造成的腐烂是造成水果采后损失的主要原因。其中霉菌是水果采后主要病原菌。引起水果贮藏期间腐烂的霉菌种类很多，主要有灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、葡枝根霉（Rhizopus stoloniger）、青霉（Penicillium spp.）、毛霉（Mucor spp.）、链格孢（Alternaria spp.）和曲霉（Aspergillus spp.）等。病原微生物对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如扩展青霉（P. expansum）产生的棒曲霉素（patulin）、灰葡萄孢（B. cinerea）产生的葡双醛霉素（botrydial）等。

目前最常用的控制水果采后腐烂的方法是低温贮藏和化学杀菌剂处理。近年来低温贮藏技术在我国得到了广泛的发展和应用，但已有的冷藏设备往往不能满足大多数水果的需要。同时，在低温条件下仍有相当数量的致病菌能够在水果上生长，并造成水果腐烂。而那些对低温敏感的水果只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏。

长期以来，控制水果采后病害的主要措施是使用杀菌剂。化学杀菌剂对防治病害可以起到立竿见影的效果，但是，长期和大量的使用，不仅导致病原微生物产生抗药性, 同时严重污染环境，有损于人类健康。美国国家科学院（National Academy of Scinces）的一份报告显示，在用于处理食品的全部农药中，杀菌剂构成60％的致瘤危险。

随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的日益增强，目前多种化学杀菌剂（如Captan、Benomyl等）已被明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用，其直接的后果是目前许多水果采后病害已经没有杀菌剂能予以控制。因此，各国科学家都在积极地探索能代替化学杀菌剂的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。当前国际上对用拮抗微生物进行水果采后病害的生物防治的研究已经取得了阶段性的成果，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一。

随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对果蔬贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。国外方面, Sansone等从苹果表面分离得到的粘红酵母对由Botrytis cinerea引起的灰霉病有显著的防治效果, 在实验室条件下, 其腐烂率与对照相比降低了 54%。Calvente 等的研究也发现粘红酵母对水果采后青霉病害有显著的抑制效果。

我国水果采后病害生物防治研究起步较晚， 郑晓冬等在体外和体内抑菌试验中研究了粘红酵母对由指状青霉引起的柑桔青霉腐烂的抑制效果, 发现粘红酵母在控制由指状青霉引起的柑桔腐烂中显示出了很高的抑菌活性, 在 25℃条件下, 对照的发病率为 100%, 而使用 1× 10⁸个/mL的菌悬液的发病率仅为 45 %, 而且随着酵母浓度的提高, 发病率也有逐渐下降的趋势。张红印等研究了粘红酵母对草莓采后灰霉病的抑制效果, 对草莓进行了前期的预处理后, 接种 1×10⁹个/mL的菌悬液和 1×10⁵个/mL的病原菌孢子菌悬液分别在 4℃下贮藏 7天 和 20℃下贮藏 2天 后, 发现接种粘红酵母的草莓，其腐烂率与对照相比分别降低了 95%和 94.7 %。范青(2001)等对果实病害生物防治拮抗菌进行了筛选和分离，结果表明：季也蒙假丝酵母(Candida guiliermondii)、柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)对甜樱桃褐腐病都表现出显著的抑制效果，季也蒙假丝酵母和柠檬形克勒克酵母能有效地防治核果类果实软腐病；Tian (2004)等研究，在甜樱桃采前喷洒1×10⁸CFU（菌落形成单位）/mL的丝孢酵母(Trichosporon pullulans)，罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)和红酵母(Rhodotorula glutinis)，分别在25℃，0℃以及气调贮藏下，丝孢酵母在果实上繁殖数量最高，抑菌效果最好；张红印等(2005)研究了不同温度下，罗伦隐球酵母对灰霉病的防治效果，结果表明，25℃下，梨灰霉病的发病率为16.7%，结合CaCl₂使用效果更显著。

从国内外文献中可知当前以有效微生物取代化学杀菌剂用于采后水果病害的防治已显示出巨大的应用前景，水果采后病害的生物防治成为一个新的研究热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多,只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。为了尽快地将拮抗微生物应用于水果贮藏保鲜实际生产上，还需进一步筛选拮抗效果好、抗病谱广的微生物，并进一步提高拮抗酵母的拮抗效力，从而将其应用于水果贮藏保鲜。

中国专利CN201010240638公开了一种提高粘红酵母对水果采后病害的生物防治效力的方法，该方法利用壳聚糖诱导培养粘红酵母，提高粘红酵母的生物防治效力，从而达到保鲜水果的目的。本发明利用牛蒡低聚果糖诱导培养胶红酵母，提高胶红酵母的生物防治效力，与壳聚糖相比，牛蒡低聚果糖价格低廉，处理方法简单，且具有更好的生物防治效果。

牛蒡低聚果糖(Burdock Fructooligosaccharide,简称BFO)是山东大学生命科学院陈靠山教授课题组近年来从耐盐植物牛蒡（Arctium lappa L.）根中提取的一种果糖低聚糖，由12个呋喃型果糖和一个吡喃型葡萄糖组成。陈靠山课题组实验证实BFO能促进植物的生长，是一种植物抗病诱导子，能显著地诱导西红柿大量的病程相关蛋白（Pathogenesis-related proteins,Prs），从而诱导西红柿系统抗性，提高了西红柿对灰霉病的抵抗能力。

本发明用含不同浓度牛蒡低聚果糖（以质量计）的培养基诱导培养胶红酵母，并将胶红酵母用于防治水果的采后防治。

发明内容

本发明在培养基中添加不同浓度的牛蒡低聚果糖，对胶红酵母进行诱导培养，提供了一种提高胶红酵母生物防治效力的方法。经牛蒡低聚果糖诱导培养的胶红酵母，可以明显地抑制水果病原菌，防止水果采后腐烂。本发明具有安全、高效、成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的损失。

本发明同时提供了牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法，按照下述步骤进行：将胶红酵母活化，接种到添加有以牛蒡低聚果糖的NYDB培养基中进行诱导培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1×10⁸ 个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡1min后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。

其中所述的NYDB培养基为酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH自然。

其中所述的NYDB培养基中牛蒡低聚果糖的添加量以质量计为0.04% - 0.064%。

其中所述的胶红酵母（R. mucilaginosa），保藏编号为CGMCC No.3617。

其中所述的水果优选桃或草莓。

本发明的优点：

（1）本发明所使用的胶红酵母（R. mucilaginosa）为本实验室筛选，其拮抗效力强，对人体无害。

（2）本发明使用牛蒡低聚果糖诱导培养胶红酵母，与传统的葡萄糖培养基相比较，可以显著提高胶红酵母（R. mucilaginosa）的拮抗活性，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。

（3）本发明使用牛蒡低聚果糖诱导培养后的胶红酵母可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为不同浓度牛蒡低聚果糖诱导后的胶红酵母对草莓灰霉病的抑制效果；注：CK: 对照; 0: NYDB; 0.04-0.64:添加0.04%-0.64%牛蒡低聚果糖的培养基。发病率是20℃ 放置3 d后测定的结果。不同字母代表差异显著性（p=0.05）。

图2为不同浓度牛蒡低聚果糖诱导后的胶红酵母对草莓根霉病的抑制效果；注：CK: 对照; 0: NYDB; 0.04-0.64:添加0.04%-0.64%牛蒡低聚果糖的培养基。发病率是20℃ 放置3d后测定的结果。不同字母代表差异显著性（p=0.05）。

图3为不同浓度牛蒡低聚果糖诱导后的胶红酵母对桃果青霉病的抑制效果；注：CK: 对照; 0: NYDB; 0.04-0.64:添加0.04%-0.64%牛蒡低聚果糖的培养基。发病率是25℃ 放置5d后测定的结果。不同字母代表差异显著性（p=0.05）。

图4为不同浓度牛蒡低聚果糖诱导后的胶红酵母对桃果根霉病的抑制效果；：CK: 对照; 0: NYDB; 0.04-0.64:添加0.04%-0.64%牛蒡低聚果糖的培养基。发病率是25℃ 放置5d后测定的结果。不同字母代表差异显著性（p=0.05）。

具体实施方式

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施实例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

胶红酵母（R. mucilaginosa）系本实验室筛选得到，现保存于位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.3617，于NYDA（NYDB培养基的基础上添加2%的琼脂（质量计））培养基4℃低温保存。培养程序为：（1）固体活化：将胶红酵母接种于 NYDA培养基中，在28℃培养48h；（2）液体培养：在250 m1的三角瓶中装入50 ml的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的胶红酵母，在200 rpm，28℃条件下培养20h；（3）诱导培养：将上述培养混合物7000×g条件下离心10min，无菌蒸馏水洗涤两次，以去除培养介质，并用无菌蒸馏水重新悬浮酵母细胞，血球记数板调节细胞浓度为5×10⁸ 个/mL。 在250m1的三角瓶中分别装入50ml NYDB培养基或牛蒡低聚果糖补充培养基（在NYDB中添加0.04%、0.08%、0.16%、0.32%及0.64%牛蒡低聚果糖），并加入上述浓度的酵母细胞培养液1ml，然后在200 rpm，28℃条件下培养24h；（4）离心分离再悬浮：上述不同处理酵母培养混合物在7000×g条件下，离心10-15min，并用无菌蒸馏水洗涤2次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板调节酵母细胞浓度为1×10⁸ 个/mL。

实施例 1 ：牛蒡低聚果糖培养胶红酵母对水果病害的抑制效果

一、试验方案

水果处理后，用消过毒的打孔器在每个果实表面赤道部位形成统一大小和深度的伤口。其中草莓的表面伤口为3 mm（直径）×3 mm（深），桃果的表面伤口为5mm（直径）×3mm（深）。每个伤口处等量加入30 μl（1）经NYDB培养基培养的酵母悬浮液；（2）经牛蒡低聚果糖补充培养基（NYDB+BFO）培养的酵母悬浮液；（3）无菌水（作为对照）。2h后，在每个伤口处加入等量30μl的病原菌孢子（B. cinerea浓度为1×10⁵ spores ml^-1；P. expansum浓度为5 ×10⁴ spores/ mL, R. stolonifer浓度为1×10⁴ spores/ mL）（spores/ mL表示1ml中霉菌孢子的个数）。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养（湿度 95%），草莓置于20℃，桃果置于25℃。

每处理重复3次，每次重复18个果实。整个试验重复2次。经过若干天的培养，记录果实发病率，以此评价R. mucilaginosa的抑菌效果。发病率的计算公式如下：

发病率(%)= 发病的果实/接种病原菌的果实总数×100%

二、试验结果

按照上述步骤试验，统计水果的腐烂率结果如下：

1.1 对草莓灰霉病及根霉病的抑制效果

胶红酵母经牛蒡低聚果糖诱导培养后，其对灰葡萄孢在草莓伤口处的侵染抑制作用显著增强（图1），尤其当诱导量为0.32%时，酵母菌悬液处理草莓后其灰霉病的发病率仅为24%，显著低于对照草莓及不经牛蒡低聚果糖诱导培养的胶红酵母处理的草莓的灰霉病的发病率。胶红酵母对葡枝根霉在草莓伤口处的侵染抑制作用也出现了类似的结果（图2）。

对桃果青霉病及根霉病的抑制效果

从图3可以看出，添加0.32%牛蒡低聚果糖诱导培养后的胶红酵母，对桃果伤口青霉病侵染的抑制效力显著增强，在对桃果伤口根霉病的抑制作用上也出现了类似的结果（图4）。试验结果表明胶红酵母经牛蒡低聚果糖诱导培养后，其对桃果青霉和根霉的发病率显著降低，特别是当添加0.32%牛蒡低聚果糖时，其青霉和根霉的发病率仅为26.65%和25%，显著地低于对照桃果及不经牛蒡低聚果糖诱导培养的胶红酵母处理的桃果的青霉和根霉病的发病率。　

实施例 2 ：牛蒡低聚果糖诱导培养胶红酵母对水果自然腐烂及贮藏品质的影响

一、试验方案

试验水果采摘后直接用以下处理浸泡果实1min：（1）NYDB培养基培养的胶红酵母悬浮液；（2）牛蒡低聚果糖补充培养基（NYDB+BFO）培养的的酵母悬浮液；（3）无菌水（作为对照）。然后将果实放在塑料筐内，风干后用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养（湿度 95%），草莓置于20℃，桃果置于25℃，一段时间后进行贮藏品质分析。每处理重复3次，每次重复10个果实，整个试验重复2次。

贮藏品质分析方法如下：

（1）失重率：称重法。失重率=（处理前质量-储藏后质量）/处理前质量×100%

（2）硬度：采用TA-XT2i质构分析仪测试，探头直径为5mm，探头测试前、测试中、测试后的运行速度分别为4.0mm s⁻¹、1.0mm s⁻¹、5.0mm s⁻¹，草莓测试深度为6mm，桃果测试深度为10mm，探头插入水果时所受的最大阻力（单位为牛顿）就被定义为水果的硬度。每个水果绕赤道处每120°测定3次。

（3）总可溶性固形物：采用WYT（0-80%）手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。

（4）可滴定酸度（%）：采用滴定法，从6个水果上取 20 g 果肉, 加蒸馏水20ml匀浆，用40ml蒸馏水洗入100ml容量瓶。置于80℃水浴浸提30min，每隔5min搅拌一次，取出冷却，定容至刻度。过滤, 取20 ml滤液置于100ml小烧杯中，测定草莓及桃果时投入一片红色石蕊试纸，用0.1 mol l⁻¹ NaOH进行滴定。当石蕊试纸变蓝时为滴定终点。结果草莓以含柠檬酸百分含量表示，桃果以含苹果酸的百分含量表示。每处理3次重复。

（5）维生素C含量的测定：紫外快速测定法。从6个水果上取20g果肉，样品加20ml 1%盐酸匀浆，50ml容量瓶定容至刻度。10000×g，4℃条件下离心10mim，上清用于测定。取0.4ml提取液，放入盛有0.8ml 10%HCl的10ml刻度试管中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。另吸取0.4ml提取液，分别加入4ml蒸馏水和1.6 ml 1moll⁻¹ NaOH溶液至10ml至刻度试管，摇匀，静置15min后。加入1.6 ml 10%HCl，混匀，加蒸馏水定容至刻度。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。由待测液及碱处理待测液的A₂₄₃值之差，查标准曲线，计算样品中维生素C的含量。每处理3次重复。

二、试验结果

按照上述步骤试验，统计草莓及桃果的自然腐烂率及贮藏品质的影响结果如下：

表1牛蒡低聚果糖诱导后的胶红酵母对草莓自然腐烂率及储藏品质的影响

备注：0：NYDB培养基培养的胶红酵母；0.32：添加0.32%的牛蒡低聚果糖诱导培养的胶红酵母。上述表中的品质测定是20℃ 放置10d后测定的结果。不同字母代表差异显著性（p=0.05）。

如表1所示, 胶红酵母经0.32%牛蒡低聚果糖诱导培养后，对草莓自然腐烂的抑制作用显著，草莓的腐烂率仅为16.7%，而对照为73.3%，且显著地低于未经诱导培养的胶红酵母处理的草莓的腐烂率。与未诱导培养的粘红酵母及对照相比，经0.32%牛蒡低聚果糖诱导培养的胶红酵母对草莓的失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸度及Vc含量均不产生有害影响。

表2牛蒡低聚果糖诱导后的胶红酵母对桃果自然腐烂率及储藏品质的影响

备注：0：NYDB培养基培养的胶红酵母；0.32：添加0.32%的牛蒡低聚果糖诱导培养的胶红酵母。上述表中的品质测定是20℃ 放置30d后测定的结果。不同字母代表差异显著性（p=0.05）。

0.32%牛蒡低聚果糖诱导培养胶红酵母，对桃果自然腐烂的抑制作用显著。同时，经0.32%牛蒡低聚果糖诱导培养胶红酵母处理的桃果，其硬度、可溶性固形物、可滴定酸度及Vc含量等各项品质指标均不产生有害影响（表2）。

以上试验结果表明牛蒡低聚果糖诱导培养后胶红酵母对草莓及桃果自然腐烂病害的发生有显著的抑制作用，并且对水果贮藏品质没有产生不利影响。

对比例：利用牛蒡低聚果糖诱导培养的胶红酵母和壳聚糖诱导培养的粘红酵母对草莓根霉病的对比抑制效果

一、试验方案

具体试验方案同实施例1中的试验方案，所不同处为选择最佳的诱导参数，即在培养基中添加0.32%的牛蒡低聚果糖和0.5%的壳聚糖分别诱导培养胶红酵母和粘红酵母做对比试验。

其中所选水果为草莓，致病菌为草莓根霉（R. stolonifer）。

二、试验结果

按照上述步骤试验，统计水果的腐烂率结果如下：

从图2可以看出，添加0.32%牛蒡低聚果糖诱导培养后的胶红酵母，对草莓伤口根霉病侵染的抑制效力显著增强，其腐烂率仅为33.3%；而公开的专利CN201010240638的图2中，其最佳诱导量，当在培养基中添加0.5%的壳聚糖诱导培养粘红酵母时，其草莓根霉的腐烂率为66.7%，结果表明，利用牛蒡低聚果糖诱导培养后的胶红酵母具有较好的生物防治效果。

Claims (4)

1.牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法，其特征在于按照下述步骤进行：将胶红酵母（R. mucilaginosa）活化，接种到添加有牛蒡低聚果糖的NYDB培养基中进行诱导培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1×10⁸ 个/mL的菌悬液；将水果放入菌悬液中，浸泡1min后马上取出，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放；所述的牛蒡低聚果糖的添加量以质量计为0.04% - 0.064%；所述的诱导培养条件为在200 rpm，28℃条件下培养24h。

2.根据权利要求1所述的牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法，其特征在于其中所述的NYDB培养基为酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH自然。

3.根据权利要求1所述的牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法，其特征在于其中所述的胶红酵母（R. mucilaginosa），保藏编号为CGMCC No.3617。

4.根据权利要求1所述的牛蒡低聚果糖提高胶红酵母对水果采后病害防治力的方法，其特征在于其中所述的水果为桃或草莓。

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