CN114209678B - 厚朴酚在缓解伏马毒素b1诱导细胞毒性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了厚朴酚在缓解伏马毒素B1诱导细胞毒性中的应用，属于生物医药技术领域。将厚朴酚用于制备缓解伏马毒素B1诱导细胞毒性的药物，可有效缓解FB1引起的细胞活性降低、细胞凋亡，缓解FB1对细胞线粒体形态、跨膜电位、细胞内Ca²⁺水平、ROS水平、CAT及GSH活性的影响。

Description

厚朴酚在缓解伏马毒素B1诱导细胞毒性中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及厚朴酚在缓解伏马毒素B1诱导细胞毒性中的应用。

背景技术

伏马毒素(Fumonisins,F)主要污染玉米、小麦、高粱、水稻等粮食作物，并通过食物链对人和畜禽造成巨大威胁。在已经发现的28种伏马毒素中，伏马毒素B1(FB1)的毒性作用最强，污染也最为广泛。伏马毒素对动物神经系统具有毒害作用，主要表现为脑白质的不同程度损伤。神经系统也是FB1的主要作用靶点之一，因此，通过体外神经细胞模型探索FB1的毒性效应，对于探索FB1的神经毒性作用机制具有重要的意义。

星形胶质细胞对于维持神经元正常功能具有重要作用，同时在保护神经元免受氧化应激损伤的过程中发挥重要功能。大鼠C6神经胶质瘤细胞(简称C6细胞)被认为是显示星形胶质细胞典型特性的良好模型，且比星形胶质细胞更易于培养，因此在化合物神经毒性的体外研究中广泛应用。

伏马毒素B1产生细胞毒性的过程中会引起细胞活性降低，对细胞膜、细胞器的结构产生破坏作用，影响细胞信号转导，导致细胞内氧化还原状态失衡，甚至诱导细胞凋亡。

因此，如何缓解伏马毒素B1诱导的细胞毒性是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了厚朴酚在缓解伏马毒素B1诱导细胞毒性中的应用。

厚朴酚(MAG)是中药厚朴中提取得到的木质素类化合物，属于含酚羟基的活性物质，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、松弛肌肉等作用。目前还未见MAG在缓解FB1诱导的细胞毒性方面的报道。本发明将其用于制备缓解伏马毒素B1诱导细胞毒性的药物，可有效缓解FB1引起的细胞活性降低、细胞凋亡，缓解FB1对细胞线粒体形态、跨膜电位、细胞内Ca²⁺水平、ROS水平、CAT及GSH活性的影响。

进一步地，一种缓解伏马毒素B1诱导细胞毒性的药物，包括厚朴酚和一个或多个药学上可接受的药物载体。

上述药物载体包括：稀释剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂。

上述药物的剂型为片剂、胶囊、口服液、注射剂、粉剂或膏剂。

综上所述，本发明MAG对FB1诱导的细胞毒性具有缓解作用，在FB1诱导的动物神经系统损害治疗方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为FB1和不同浓度MAG处理对C6细胞活性的影响；

图2为经FB1和不同浓度MAG处理后对C6细胞形态影响的扫描电镜图片；

图3为FB1染毒对C6细胞凋亡产生的影响，以及不同浓度MAG对细胞凋亡的抑制作用；

图4为FB1染毒导致的线粒体碎片化现象，以及不同浓度MAG对线粒体形态的修复作用；

图5为FB1染毒对C6细胞线粒体膜电位的影响，以及不同浓度MAG对FB1引起的线粒体膜电位破坏的抑制作用；

其中，左图为各组荧光强度，右图为对应的统计数据；

图6为FB1染毒对C6细胞内Ca²⁺水平升高的促进作用，以及不同浓度MAG对该过程的恢复作用；

其中，左图为各组荧光强度，右图为对应的统计数据；

图7为FB1染毒对C6细胞ROS生成量的影响，以及不同浓度MAG对氧化损伤的保护作用；

其中，左图为各组荧光强度，右图为对应的统计数据；

图8为FB1染毒对C6细胞内抗氧化酶的影响，以及不同浓度MAG的修复作用。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，试验中每种处理均进行3次重复实验，所有数据均以平均值±标准差的方式表示，所有数据均采用SPSS软件进行单因素方差分析，P<0.05代表差异显著，P>0.05代表差异不显著。

实施例1：细胞活性的测定

取对数生长期的大鼠C6神经胶质瘤细胞(C6细胞)进行传代后，调整细胞密度为7×10⁴cells/mL接种到96孔板中，待细胞生长24h后，进行不同染毒处理：

空白对照组(Control)；

FB1染毒组：15μM FB1；

40μM MAG处理组：15μM FB1+40μM MAG；

80μM MAG处理组：15μM FB1+80μM MAG；

160μM MAG处理组：15μM FB1+160μM MAG；

处理24h后在避光条件下每孔加入20μL的5mg/mL的MTT溶液，置于细胞培养箱(条件为37℃，5％CO₂)中继续培养4h。加入二甲基亚砜溶液，于570nm下测定其吸光度值并求得各组的细胞活性。以空白对照组细胞吸光度为100％，计算各组细胞活性。

由图1可知，FB1染毒后的细胞存活率明显低于对照组，当加入不同浓度的MAG之后，细胞存活率明显上升，与FB1染毒组差异显著，其中80μM(中浓度)厚朴酚对细胞的保护效果最佳。

实施例2：FB1染毒对细胞形态的影响以及不同浓度MAG的修复作用

按照实施例1染毒处理方法进行C6细胞处理；采用扫描电镜对不同组别中C6细胞的形态进行观察。

如图2所示，在扫描电镜下，对照组细胞形态正常，细胞呈梭形，细胞膜平滑，边界清晰。经15μM FB1染毒24h后，细胞突触回缩甚至消失，细胞体积变小，细胞膜表面粗糙，呈现不规则的突起，呈现凋亡形态。经过不同浓度的MAG处理后，细胞突触重新延伸，细胞膜表面趋于平滑。其中经过80μMMAG处理后的细胞体积形态较对照组差异最小。

上述结果表明，FB1染毒导致C6细胞出现凋亡，而加入不同浓度MAG之后，细胞形态逐渐恢复并趋于正常，凋亡现象得到缓解，其中以80μM MAG进行处理产生的保护效果最佳，这与细胞活性结果一致。

实施例3：FB1染毒对细胞凋亡的影响以及不同浓度MAG的修复作用

按照实施例1染毒处理方法进行C6细胞处理；对细胞进行DAPI染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化，从而判断细胞凋亡情况。

如图3所示，对照组中，细胞核呈圆形，染色质分布均匀，未见明显凋亡相关的形态学改变。FB1染毒组中细胞核排列紧密，伴有典型的凋亡病理改变，并伴有凋亡小体的出现。经不同浓度的MAG处理后，细胞核固缩、凋亡小体数量明显减少，染色质大部分呈均匀蓝色。

DAPI染色结果显示，MAG能抑制FB1诱导的C6细胞凋亡，其中80μMMAG处理组与对照组相比，差异无统计学意义，说明中浓度的MAG对FB1诱导的C6细胞凋亡的抑制作用最为显著。

实施例4：FB1染毒对细胞线粒体形态的破坏以及不同浓度MAG的修复作用

取对数生长期的C6细胞，调整细胞密度为5×10⁴cells/mL接种到含有爬片的六孔板中。待细胞生长24h后，按照实施例1染毒处理方法对细胞进行染毒实验，染毒结束后，弃去旧培养基，并用PBS清洗3次。随后使用无血清培养基配制Mito-Tracker Green溶液(终浓度为1μM)，重新加入至六孔板中，于培养箱中(条件为37℃，5％CO₂)避光孵育20min。孵育结束后，弃去含有探针的培养基，并用PBS清洗细胞3遍。使用荧光显微镜观察绿色荧光并拍照。

如图4所示，FB1染毒C6细胞24h后，线粒体发生了显著的碎片化现象，这是由于线粒体分裂水平过高导致其形态异常，从而降低了线粒体的自我修复能力，诱发了不可逆的细胞活性降低甚至凋亡。加入不同浓度的MAG之后，FB1引起的线粒体碎片化得到改善，80μMMAG处理后的细胞线粒体形态趋于正常。

实施例5：FB1染毒对细胞线粒体跨膜电位的影响以及不同浓度MAG的修复作用

取对数生长期的C6细胞，调整细胞密度为5×10⁴cells/mL接种到25cm²培养瓶中。待细胞生长24h后，按照实施例1染毒处理方法对细胞进行染毒实验，染毒结束后，弃去旧培养基，并用PBS清洗3次。随后加入罗丹明123缓冲液，于培养箱中(条件为37℃，5％CO₂)避光孵育30min，然后去除罗丹明123缓冲液，用PBS洗涤3次，然后用荧光分光光度计检测其荧光强度。

由图5可知，FB1染毒组的荧光强度最高，对照组的荧光强度最低，因此表明，FB1染毒后引起了细胞线粒体跨膜电位的崩溃，经过不同浓度的MAG处理后，跨膜电位丢失情况得到改善，因此证明MAG对由FB1引起的线粒体膜电位的破坏具有抑制作用。

实施例6：FB1染毒对细胞内Ca²⁺的影响以及不同浓度MAG的修复作用

按照实施例1染毒处理方法对C6细胞进行染毒实验，选用Ca²⁺荧光探针Fluo-3 AM对不同处理组细胞内的Ca²⁺水平进行测定。

结果如图6所示，FB1染毒能够显著提高C6细胞内的Ca²⁺水平，加入不同浓度的MAG之后，Ca²⁺水平得到恢复，说明了MAG的修复作用。

实施例7：FB1染毒对细胞内氧化还原水平的影响以及不同浓度MAG的保护作用

通过测定不同组别中细胞内ROS水平、CAT活性、GSH活性判定FB1染毒对细胞内氧化还原水平的影响以及不同浓度MAG的保护作用。

细胞内ROS水平测定选择对数生长期的C6细胞，按照实施例1染毒处理方法对C6细胞进行染毒实验，染毒结束后，弃去旧培养基，用细胞刮刀将细胞收集到离心管中，PBS清洗3次，制成密度为1×10⁶cells/mL的细胞悬液。加入终浓度10μM的DCFH-DA探针，于培养箱中(条件为37℃，5％CO₂)避光孵育30min，随后用PBS冲洗3次，用荧光分光光度计测定DCF的荧光强度(激发波长488nm，发射波长525nm)。由图7可知，对照组中，细胞内ROS水平较低，染毒FB1后，细胞内生成大量的ROS，经过不同浓度的MAG处理后，细胞内ROS的生成量减少，其中80μM MAG处理后，细胞内ROS生成量接近于损伤前的水平，说明此剂量MAG对细胞的保护作用最为显著。

细胞内过氧化氢酶(CAT)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性通过相关市售试剂盒进行测定。图8A结果显示，对照组细胞中CAT活力明显高于FB1染毒组，随着不同浓度MAG的加入，细胞内CAT水平有上升趋势，其中80μMMAG处理后的细胞中CAT含量趋于正常水平。说明FB1会诱导细胞内氧化还原体系失衡，促使氧化自由基增加，刺激细胞提高抗氧化酶活力以清除因FB1的作用所产生的自由基，而MAG的加入可以促使细胞内的氧化还原体系趋于平衡。由图8B可知，FB1染毒后，细胞内GSH水平明显下降，加入不同浓度的MAG之后，FB1诱导细胞GSH下降程度减弱，说明了MAG的修复作用，其中80μM MAG处理后的细胞GSH水平上升程度最为明显。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.厚朴酚在制备缓解伏马毒素B1诱导的脑白质损伤药物中的应用。

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