CN106399197B - 一株唾液乳杆菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株唾液乳杆菌及其用途。本发明所提供的唾液乳杆菌为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12857。实验证明，本发明提供的唾液乳杆菌LJ在预防龋病和/或抑制链球菌和/或减少口腔中有害菌和/或增加口腔中有益菌中起至关重要的作用，具有重要的应用价值。

Description

一株唾液乳杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株唾液乳杆菌及其用途。
背景技术
乳酸杆菌是公认的益生菌，其具有广谱的抗菌性，对常见的有害菌具有一定的抑制效果。唾液乳杆菌是乳酸杆菌家族的一员，常存在于人体的消化道(如口腔)中。
龋病是危害人类口腔健康的常见病，其继发感染可以形成牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。目前，对于龋齿的治疗最常见的是填充术，然而这种治疗方式只能作为一种修复手段，并不能完全的还原牙齿本身的状态，所以龋病治疗的关键在于提早预防。龋病是一种细菌性疾病，主要的致龋菌是变异链球菌。因此，抑制变异链球菌在口腔中的繁殖或降低变异链球菌在口腔菌群中的百分比，可以有效的预防龋病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预防龋病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株可以预防龋病的唾液乳杆菌。
本发明所提供的唾液乳杆菌是唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ，该菌株已于2016年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12857。唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ CGMCC No.12857简称唾液乳杆菌LJ。
为解决上述技术问题，本发明还提供了菌剂。
本发明所提供的菌剂，其活性成分为唾液乳杆菌LJ。
所述菌剂的用途可为a1)或a2)或b1)或b2)或c1)或c2)或d1)或d2)：a1)制备预防龋病的产品；a2)预防龋病；b1)制备抑制链球菌的产品；b2)抑制链球菌；c1)制备减少口腔中有害菌的产品；c2)减少口腔中有害菌；d1)制备增加口腔中有益菌的产品；d2)增加口腔中有益菌。
本发明所提供的菌剂，具体可为菌剂甲或菌剂乙。
所述菌剂甲的制备方法可包括如下步骤：将唾液乳杆菌LJ接种至乳酸菌培养基并进行培养，获得菌液，即为所述菌剂甲。
所述菌液的OD600nm值具体可为0.5。
所述乳酸菌培养基可为MRS液体培养基。所述MRS液体培养基的制备方法具体可如下：将蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、乙酸钠5.00g、葡萄糖20.00g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2.00g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.28g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.4；然后121℃灭菌15min。
所述菌剂甲的制备方法中，所述培养具体可为置于二氧化碳培养箱培养。所述培养的具体条件可为：37℃静置培养24h。
除了活性成分，所述菌剂甲还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂甲中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂甲中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
所述菌剂乙的制备方法可包括如下步骤：
(1)将唾液乳杆菌LJ接种至乳酸菌培养基并进行培养，获得菌液；
(2)将所述菌液接种至乳酸菌培养基并进行培养，获得发酵液；
(3)将所述发酵液离心，收集菌体；
(4)取所述菌体，用保护剂重悬，冻干，得到冻干活性菌粉；
(5)取所述冻干活性菌粉，加入配方成分(常规药片生产时添加的，如淀粉、可可粉、调味剂等)，即为所述菌剂乙。
所述步骤(1)中，所述菌液的OD600nm值具体可为0.5。
所述步骤(1)和所述步骤(2)中，所述乳酸菌培养基可为MRS液体培养基。所述MRS液体培养基的制备方法具体可如下：将蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、乙酸钠5.00g、葡萄糖20.00g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2.00g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.28g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.4；然后121℃灭菌15min。
所述步骤(1)和所述步骤(2)中，所述培养具体可为置于二氧化碳培养箱培养。所述培养的具体条件可为：37℃静置培养24h。
所述步骤(2)中，所述菌液和所述乳酸菌培养基的体积比具体可为1:500。
所述步骤(3)中，还可包括如下步骤(A)：将所述菌体用缓冲液重悬，然后离心。
所述步骤(3)和步骤(A)中，所述离心具体可为4000rpm离心20min。
所述步骤(A)中，所述缓冲液具体可为pH7.0、20mM的PB缓冲液。
所述步骤(4)中，所述菌体和所述保护剂的配比具体可为25g：150mL；所述保护剂具体可为含10％(质量百分比)脱脂奶粉的pH7.0、20mM的PB缓冲液。
所述菌剂乙中，所述冻干活性菌粉和所述配方成分的质量比具体可为1:9。
所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ CGMCC No.12857或上述任一所述菌剂在a1)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围：a1)制备预防龋病的产品；a2)预防龋病。
所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ CGMCC No.12857或上述任一所述菌剂在b1)或b2)中的应用也属于本发明的保护范围：b1)制备抑制链球菌的产品；b2)抑制链球菌。
所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ CGMCC No.12857或上述任一所述菌剂在c1)或c2)中的应用也属于本发明的保护范围：c1)制备减少口腔中有害菌的产品；c2)减少口腔中有害菌。
所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ CGMCC No.12857或上述任一所述菌剂在d1)或d2)中的应用也属于本发明的保护范围：d1)制备增加口腔中有益菌的产品；d2)增加口腔中有益菌。
上述应用中，所述有害菌具体可为链球菌和/或普雷沃菌和/或兼性双球菌和/或放线菌和/或纤毛菌。
上述应用中，所述链球菌具体可为变异链球菌。所述变异链球菌具体可为变异链球菌(Streptococcus mutans)CGMCC No.1.2500。
上述应用中，所述有益菌具体可为唾液乳杆菌。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品。
本发明所提供的产品，其含有所述唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJCGMCC No.12857；所述产品的功能为a2)或b2)或c2)或d2)：a2)预防龋病；b2)抑制链球菌；c2)减少口腔中有害菌；d2)增加口腔中有益菌。
上述产品中，所述有害菌具体可为链球菌和/或普雷沃菌和/或兼性双球菌和/或放线菌和/或纤毛菌。
上述产品中，所述链球菌具体可为变异链球菌。所述变异链球菌具体可为变异链球菌(Streptococcus mutans)CGMCC No.1.2500。
上述产品中，所述有益菌具体可为唾液乳杆菌。
实验证明，本发明提供的唾液乳杆菌LJ在预防龋病和/或抑制链球菌和/或减少口腔中有害菌和/或增加口腔中有益菌中起至关重要的作用，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例2的实验结果。
保藏说明
菌种名称：唾液乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus salivarius
菌株编号：LJ
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年08月16日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12857
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MRS液体培养基：将蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、乙酸钠5.00g、葡萄糖20.00g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2.00g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.28g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.4；然后121℃灭菌15min。
MRS固体培养基：将蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、乙酸钠5.00g、葡萄糖20.00g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2.00g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.28g和琼脂15.00g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.4；然后121℃灭菌15min。
MRS固体平板：将20mL温度为55℃左右的MRS固体培养基倒入培养皿，冷却后即为MRS固体平板。
变异链球菌(Streptococcus mutans)CGMCC No.1.2500保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编：100101)，公众可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得该菌株。变异链球菌(Streptococcus mutans)CGMCC No.1.2500在下文中简称变异链球菌。
BHI液体培养基：将37g Brain Heart infusion溶解于1L无菌水中，调节pH值至7.4，然后121℃高压灭菌15min；其中，Brain Heart infusion为美国BD公司的产品。
BHI固体培养基：将37g Brain Heart infusion和15g琼脂溶解于1L无菌水中，调节pH值至7.4，然后121℃高压灭菌15min；其中，Brain Heart infusion为美国BD公司的产品。
保护剂为含10％(质量百分比)脱脂奶粉的pH7.0、20mM的PB缓冲液。
API 50CH生化板条为梅里埃公司的产品。Gentra Puregene Buccal Cell Kit为QIAGEN公司的产品。
下述实施例中的二氧化碳培养箱均设置二氧化碳的水平为5％。
实施例1、唾液乳杆菌的分离和鉴定
一、分离
取三名学龄前儿童(均为对试验内容知情同意的志愿者)的唾液，分别均匀涂布于MRS固体平板，然后置于二氧化碳培养箱，37℃静置培养。培养至第2d，产生单菌落。挑取单菌落，反复纯化三次以上。将其中分离到的三株细菌分别命名为细菌LJ、细菌甲和细菌乙。
二、鉴定
1、形态学鉴定
将步骤一分离的细菌(细菌LJ、细菌甲或细菌乙)接种于MRS固体平板上，然后置于二氧化碳培养箱，37℃培养，2d后观察单菌落的形态。
细菌LJ、细菌甲和细菌乙分别经革兰氏染色后，通过光学显微镜观察，均鉴定为革兰氏阳性菌，短杆形，单独存在。
细菌LJ、细菌甲和细菌乙的形态学鉴定的结果均如下：菌落圆形，表面凸起，分布较为分散，边缘整齐，呈乳白色，表面光滑水润，菌落与MRS固体平板连接较为松散，菌落直径为1-2mm。
2、16S rDNA序列同源性分析
对步骤一分离的细菌(细菌LJ、细菌甲或细菌乙)的16S rDNA序列进行同源性分析。结果表明，细菌LJ、细菌甲和细菌乙均与唾液乳杆菌的同源性最高。细菌LJ与唾液乳杆菌的同源性达到99％。
细菌LJ的16S rDNA如序列表中的序列1所示。
3、API生化板条检测
取API 50CH生化板条，然后按照API 50CH生化板条的说明书步骤对步骤一分离的细菌(细菌LJ、细菌甲或细菌乙)进行检测。
检测结果表明，细菌LJ、细菌甲和细菌乙均为唾液乳杆菌。
综合上述各个鉴定结果，步骤一分离的细菌LJ、细菌甲和细菌乙均为唾液乳杆菌。将细菌LJ命名为唾液乳杆菌LJ。将细菌甲命名为唾液乳杆菌甲。将细菌乙命名为唾液乳杆菌乙。
实施例2、唾液乳杆菌对变异链球菌的抑制效果
实验重复三次，取平均值。每次实验的具体步骤如下：
1、将唾液乳杆菌LJ的单菌落接种于装有10mL MRS液体培养基的试管中，然后置于二氧化碳培养箱。37℃静置培养24h后，得到唾液乳杆菌LJ的菌液(OD600nm值约为0.5)。
按照上述方法，将唾液乳杆菌LJ的单菌落替换为唾液乳杆菌甲的单菌落，其它步骤均不变，得到唾液乳杆菌甲的菌液(OD600nm值约为0.5)。
按照上述方法，将唾液乳杆菌LJ的单菌落替换为唾液乳杆菌乙的单菌落，其它步骤均不变，得到唾液乳杆菌乙的菌液(OD600nm值约为0.5)。
2、取变异链球菌的单菌落，接种于BHI液体培养基，置于二氧化碳培养箱，37℃静置培养24h，得到变异链球菌的菌液(OD600nm值约为0.5)。
3、取20mL BHI固体培养基(温度约40-45℃，即BHI固体培养基为融化状态)，加入10μL步骤2制备的变异链球菌的菌液，混合均匀，获得混合液。
4、取4个牛津杯置于培养皿，各牛津杯心之间相距25mm以上，与培养皿的周缘相距15mm以上，且各距离均匀；然后向牛津杯外的平皿中倒入步骤3制备的混合液，冷却，待培养基凝固。
5、完成步骤4后，移除4个牛津杯，形成4个杯孔。向第1个杯孔中加入200μL唾液乳杆菌LJ的菌液，向第2个杯孔中加入200μL唾液乳杆菌甲的菌液，向第3个杯孔中加入200μL唾液乳杆菌乙的菌液，向第4个杯孔中加入200μL无菌水(作为阴性对照)。
6、完成步骤5后，将所述培养皿置于二氧化碳培养箱，37℃静置培养24h，然后用游标卡尺测量抑菌环的直径。
实验结果判断：
(1)抑菌环直径大于8mm者，判断为有抑菌效果；抑菌环直径为8mm以下者，判断为无抑菌效果。
(2)三次重复试验均有抑菌作用结果者，判断为有抑菌效果。
(3)阴性对照应无抑菌环产生，否则实验无效。
实验结果见图1(A为唾液乳杆菌LJ的菌液，B为唾液乳杆菌甲的菌液，C为唾液乳杆菌乙的菌液，D为无菌水)和表2。结果表明，唾液乳杆菌LJ、唾液乳杆菌甲和唾液乳杆菌乙对变异链球菌均有一定的抑制效果，且唾液乳杆菌LJ对变异链球菌的抑制效果最好。因此，唾液乳杆菌LJ可预防龋病。
表2
注：“/”表示不存在。
实施例3、唾液乳杆菌LJ对口腔菌群中各个菌属的试验效果
本实施例中的试验均是在志愿者的知情同意的前提下进行的，且均签署知情同意书。口腔中存在多种有害菌，部分有害菌的名称和与疾病的关系见表3。
表3
有害菌名称 与疾病的关系
变异链球菌 引起龋齿
普雷沃菌 与龋齿、牙周病，牙髓炎的发生发展有关
兼性双球菌 引起感染性心内膜炎
放线菌 与龋齿、牙周病的发生发展有关
纤毛菌 引起牙根部肉芽肿和纤毛菌性脓毒症
一、片剂的制备
1、片剂甲的制备
(1)将唾液乳杆菌LJ的单菌落接种于装有10mL MRS液体培养基的试管中，然后置于二氧化碳培养箱。37℃静置培养24h后，得到唾液乳杆菌LJ的菌液(OD600nm值约为0.5)。
(2)完成步骤(1)后，将10mL唾液乳杆菌LJ的菌液接种于5L MRS液体培养基，然后置于二氧化碳培养箱。37℃静置培养24h后，得到唾液乳杆菌LJ的发酵液。
(3)完成步骤(2)后，取唾液乳杆菌LJ的发酵液，4000rpm离心20min，收集菌体1；将所述菌体1用pH7.0、20mM的PB缓冲液重悬，然后4000rpm离心20min，收集菌体2。
(4)完成步骤(3)后，取25g所述菌体2，用150mL保护剂重悬，然后冻干，得到冻干活性菌粉。
由北京鑫福瑞康生物医药有限公司将所述冻干活性菌粉进行压片，得到片剂甲；压片过程中，需加入配方成分(常规药片生产时添加的，如淀粉、可可粉、调味剂等)。每片片剂甲由50mg冻干活性菌粉(约含107cfu唾液乳杆菌LJ)和450mg配方成分组成。
2、片剂乙的制备
取片剂甲的配方成分，由北京鑫福瑞康生物医药有限公司进行压片，得到片剂乙。每片片剂乙由500mg片剂甲的配方成分组成。
二、唾液乳杆菌LJ对口腔菌群中各个菌属的试验效果
现有技术不能对口腔菌群中的各个菌属进行定量分析，因此通常通过各个菌属在口腔菌群中的百分比含量来判断是否发生了改变。口腔菌群中某菌属的百分比含量(％)＝某菌属的OTU值/口腔菌群总OTU值×100％。
1、取50名志愿者服用片剂前的唾液样本，然后用Gentra Puregene Buccal CellKit分别提取总核酸，得到各个志愿者服用片剂前的唾液样本的总核酸，并放置于-20℃保存。
2、完成步骤1后，将50名志愿者随机分成试验组和对照组(每组25名)，然后进行如下试验：
试验组：每个志愿者每天服用步骤1制备的片剂甲，一天2次(分别为早和晚)，一次1片，连续服用30天；
对照组：每个志愿者每天服用步骤1制备的片剂乙，一天2次(分别为早和晚)，一次1片，连续服用30天。
3、完成步骤2后，取50名志愿者服用片剂30天后的唾液样本，然后用GentraPuregene Buccal Cell Kit分别提取总核酸，得到各个志愿者服用片剂30天后的唾液样本的总核酸，并放置于-20℃保存。
4、完成步骤3后，由上海博豪生物技术有限公司分别对各个志愿者服用片剂前的唾液样本的总核酸和各个志愿者服用片剂30天后的唾液样本的总核酸进行二代高通量测序和数据分析，从而得到各个志愿者口腔菌群总OTU值、各个菌属的OTU值、试验组口腔菌群中各个菌属的平均百分比含量(％)和对照组口腔菌群中各个菌属的平均百分比含量(％)。
结果表明，服用片剂前和服用片剂30天后，试验组口腔菌群中唾液乳杆菌、链球菌、普雷沃菌、兼性双球菌、放线菌和纤毛菌的变化有统计学意义，具体结果见表5：与服用片剂前相比，服用片剂30天后，试验组口腔菌群中唾液乳杆菌的平均百分比含量显著增加、试验组口腔菌群中链球菌的平均百分比含量显著减少、试验组口腔菌群中普雷沃菌的平均百分比含量显著减少、试验组口腔菌群中兼性双球菌的平均百分比含量显著减少、试验组口腔菌群中放线菌的平均百分比含量显著减少和试验组口腔菌群中纤毛菌的平均百分比含量显著减少；与服用片剂前相比，服用片剂30天后，对照组口腔菌群中唾液乳杆菌、链球菌、普雷沃菌、兼性双球菌、放线菌和纤毛菌的平均百分比含量无显著差异。
因此，唾液乳杆菌LJ可增加口腔菌群中有益菌(如唾液乳杆菌)的百分比含量，降低口腔菌群中有害菌(如链球菌和/或普雷沃菌和/或兼性双球菌和/或放线菌和/或纤毛菌)的百分比含量。
表5
乳酸菌LJ已于2016年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.12857。乳酸菌LJ的全称为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LJ CGMCCNo.12857。
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caaactatct gtcaccttag acggctggct ccttgcggtt accccaccgg ctttgggtgt 60
tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcga 120
catgctgatt cgcgattact agcgattccg acttcatgta ggcgagttgc agcctacaat 180
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ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tcgccagagt gcccaactta atgctggcaa 360
ctgacaacaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420
cgacagccat gcaccacctg tcactttgtc cccgaaggga aagcctaatc tcttaggtgg 480
tcaaaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540
caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc 600
aggcggaatg cttattgcgt tagctgcggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag 660
cattcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgcta cccacgcttt 720
cgaacctcag cgtcagttac agaccagaga gccgctttcg ccactggtgt tcttccatat 780
atctacgcat ttcaccgcta cacatggagt tccactctcc tcttctgcac tcaagtcttc 840
cagtttccaa tgcactactc cggttaagcc gaaaggcttt cacatcagac ttaaaagacc 900
gcctgcgttc cctttacgcc caataaatcc gggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg 960
cggctgctgg cacgtagtta gccgtgactt gctggttaga taccgtcatc gaatgaacag 1020
ttactctcac tcgtgttctt cctctaacaa cagagtttta cgatccgaag acttcttcac 1080
ctcacgcgcg tgctcaatca gactgcgtca tgtgagatcc tactgctgcc ctccgtagag 1140
ttggccc 1147

Claims (2)

1. 一种菌剂，其含有唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）LJ CGMCC No.12857；所述菌剂的功能为a2）或b2）或c2）或d2）：a2）预防龋病； b2）抑制链球菌；c2）减少口腔中有害菌；d2）增加口腔中有益菌；所述链球菌为变异链球菌；所述有害菌为链球菌和/或普雷沃菌和/或兼性双球菌和/或放线菌和/或纤毛菌；所述有益菌为唾液乳杆菌；唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）菌粉的质量百分含量为10%；
所述菌剂的制备方法包括如下步骤：
（1）将唾液乳杆菌LJ CGMCC No.12857接种至乳酸菌培养基并进行培养，获得菌液；所述菌液的OD600nm值为0.5；
（2）将所述菌液接种至乳酸菌培养基并进行培养，获得发酵液；所述菌液和所述乳酸菌培养基的体积比为1:500；
（3）将所述发酵液离心，收集菌体；
（4）取所述菌体，用保护剂重悬，冻干，得到冻干活性菌粉；所述菌体和所述保护剂的配比为25g：150mL；所述保护剂为含质量百分比为10%脱脂奶粉的pH7.0、20mM的PB缓冲液；
（5）取所述冻干活性菌粉，加入配方成分，即为所述菌剂；所述冻干活性菌粉和所述配方成分的质量比为1:9。
2.根据权利要求1所述菌剂，其特征在于：所述步骤（1）和所述步骤（2）中，所述乳酸菌培养基为MRS液体培养基；所述MRS液体培养基的制备方法如下：将蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、乙酸钠 5.00g、葡萄糖20.00g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2.00g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.28g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.4；然后121℃灭菌15min；
所述步骤（1）和所述步骤（2）中，所述培养为置于二氧化碳培养箱培养，所述培养的条件为：37℃静置培养24h；
所述步骤（3）中，所述离心为4000rpm离心20min。
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