CN117247976B

CN117247976B - 一种苦参发酵提取物的制作及其在功效型口腔护理产品中的应用

Info

Publication number: CN117247976B
Application number: CN202311343502.XA
Authority: CN
Inventors: 程捷瑶
Original assignee: Guangzhou Wanqian Vermicelli Cosmetics Co ltd
Current assignee: Guangzhou Wanqian Vermicelli Cosmetics Co ltd
Priority date: 2023-10-17
Filing date: 2023-10-17
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2043-10-17
Also published as: CN117247976A

Abstract

本发明公开了一种苦参发酵提取物的制作及其在功效型口腔护理产品中的应用，其包括：红色红曲霉菌Fen1和解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716对苦参进行协同发酵，制备的苦参发酵提取物可制成牙膏、漱口水等口腔护理产品。本苦参发酵提取物抑制牙周炎致病菌，并减少局部炎症反应效果好，有一定的治疗作用。

Description

一种苦参发酵提取物的制作及其在功效型口腔护理产品中的应用

技术领域

本发明涉及一种含有苦参发酵提取物的制作方法，属于微生物技术领域。

背景技术

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持组织的慢性炎症。由于牙周炎早期多无明显自觉症状而易被忽视，是导致牙齿缺失的主要原因。患者牙周炎时会发生牙齿松动、牙齿疼痛、牙齿肿胀、牙龈肿胀、牙周溢脓出脓流脓或者流血，会对患者进食和生活造成极大影响。

苦参，原产于中国，除青海、新疆外，国内各地均有分布。常见于山坡、沙地草坡灌木林中或田野附近。苦参喜温暖燥热气候，耐寒耐高温，喜肥怕涝耐盐碱沙质土壤。主要繁殖方式为播种和分根繁殖。苦参作为中国古代著名的一味中药材，在《神农本草经》、《本草纲目》等医书中皆有记载。苦参性寒、味苦，有去热解毒，除热燥湿，杀虫驱虫等功效。现代研究发现，苦参主要活性成分为生物碱类和黄酮类化合物。包括氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、三叶豆紫、檀苷、苦参酮等，具有较好的镇痛、抗肿瘤、抗菌活性。

苦参广泛的应用于医药、保健品中，目前在口腔护理产品中的应用不多，随着国人对口腔健康卫生要求的提高，功效型口腔产品也日益受消费者青睐。。而市面上含有苦参成分的口腔护理产品非常少，本发明旨在提供一种含有苦参提取物的的制作方法，并将其应用于的功效型口腔产品。通过使用微生物制作苦参发酵提取物。含有苦参发酵提取物制备的功效型口腔产品，有助于抑制牙周炎致病菌，并减少局部炎症反应，提高机体免疫力，起到一定的治疗作用。

发明内容

本发明旨在提供一种含有苦参提取物的的制作方法，并将其应用于的功效型口腔产品，属于微生物技术领域。通过使用微生物制作苦参发酵提取物制备的口腔护理产品会有助于抑制牙周炎致病菌，改善局部炎症反应，起到一定的治疗作用。

苦参广泛的应用于医药、保健品中，目前在口腔护理产品中的应用不多，随着国人对口腔健康卫生要求的提高，功效型口腔产品也日益受消费者青睐。而市面上含有苦参成分的口腔护理产品非常少，本发明旨在提供一种含有苦参提取物的的制作方法，并将其应用于的功效型口腔产品。

中国专利2020106632477公开了一株产香红色红曲霉菌株Fen1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 19636。该菌株具有较高酯化能力，发酵时可产生β-苯乙醇，使发酵产物具有浓郁玫瑰花香气，已知用途为应用于酿酒、酿醋产业中，可增加白酒或醋的风味，提高其品质。本发明用到的红曲霉菌株Fen1为山西农业大学研究人员赠送得到。

所述红色红曲霉(Monascus ruber)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 3.15741。

所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.8716。

本发明团队在研究和实践过程中，发现红色红曲霉菌株Fen1和解淀粉芽孢杆菌联用能够产生协同作用，提高苦参发酵提取物抑制牙周炎致病菌的能力，并可以减少局部炎症反应。考虑红色红曲霉菌株Fen1和解淀粉芽孢杆菌的加入改变了苦参发酵的过程，令制备的苦参发酵提取物具有更多的生物碱类和黄酮类化合物等物质，能够明显提升抑菌能力，降低炎症反应，提升机体免疫力。可用该苦参发酵提取物来制备牙膏等功效型口腔护理产品。

本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。

一种苦参发酵提取物的制备：

菌种种子液制备(本发明所述接种量均为v/v)

红色红曲霉菌Fen1：取保藏的Fen1菌株解冻，划线于YPD固体培养基上培养，30℃条件下培养24小时使其复活，在YPD固体培养基上挑取菌落特征明显的红色红曲霉菌株接种于YPD液体培养基中，120r/分钟、25℃培养24小时，调整菌液浓度为1*107CFU/ml红色红曲霉菌Fen1种子液。

解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716：取保藏的解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716解冻，接种到LB固体培养基中划线，37℃培养24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至LB液体培养基中活化，120r/分钟、37℃培养48小时，培养成1*107CFU/ml解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716种子液。

红色红曲霉CGMCC 3.15741：红色红曲霉菌种子液制备方法同Fen1菌株。

苦参发酵提取物制备过程：

(1)取适量苦参干燥后，将其磨碎过60目筛，4℃密封保存。取磨碎后的苦参1重量份，加入5重量份蒸馏水，接种红色红曲霉菌Fen1种子液1％，接种解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716种子液1％，30℃发酵48小时。

(2)再加入5重量份蒸馏水，放置于超声震荡仪40分钟，85℃，100W，滤液倒出。再次加入5重量份蒸馏水，放置于超声震荡仪40分钟，85℃，100W，滤液倒出。

(3)合并2次的滤液，旋转蒸发至浓稠状后于-80℃真空下冷冻干燥，得到黄白色粉末。取出在4℃密闭保存。

所述的苦参发酵提取物在牙膏、漱口水等功效型口腔护理产品中的应用。

所述的苦参发酵提取物在制备预防或治疗牙周炎产品中的应用。

本发明的优点：

本发明制备的苦参发酵提取物对牙周炎致病菌的抑菌能力强，可明显降低局部炎症反应，对牙周炎疾病一定的治疗作用。牙周炎是导致牙齿缺失的主要原因，将其制备成功效型口腔护理产品可较好保护牙齿，也可将其制备成治疗和预防牙周炎疾病的产品。

附图说明

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的具体实施例如以下说明。

实施例1

菌种种子液制备(本发明所述接种量均为v/v)：

红色红曲霉菌Fen1：取保藏的Fen1菌株解冻，划线于YPD固体培养基上培养，30℃条件下培养24小时使其复活，在YPD固体培养基上挑取菌落特征明显的红色红曲霉菌株接种于YPD液体培养基中，120r/分钟、25℃培养24小时，调整菌液浓度为1*10⁷CFU/ml红色红曲霉菌Fen1种子液。

解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716：取保藏的解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716解冻，接种到LB固体培养基中划线，37℃培养24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至LB液体培养基中活化，120r/分钟、37℃培养48小时，培养成1*10⁷CFU/ml解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716种子液。

苦参发酵提取物制备：

实施例2

对比例1

菌种种子液制备和苦参的制备方法同实施例1，但只加入红色红曲霉菌株Fen1。

苦参发酵提取物制备：

(1)取适量苦参干燥后，将其磨碎过60目筛，4℃密封保存。取磨碎后的苦参1重量份，加入5重量份蒸馏水，接种红色红曲霉菌Fen1种子液2％，30℃发酵48小时。

(3)合并2次的滤液，旋转蒸发至浓稠状后于真空下冷冻干燥(-80℃)，得到黄白色粉末。取出在4℃密闭保存。

对比例2

菌种种子液制备和苦参的制备方法同实施例1，但只加入解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716。

苦参发酵提取物制备：

(1)取适量苦参干燥后，将其磨碎过60目筛，4℃密封保存。取磨碎后的苦参1重量份，加入5重量份蒸馏水，接种解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716种子液2％，30℃发酵48小时。

对比例3

菌种种子液制备和苦参的制备方法同实施例1，但将红色红曲霉菌Fen1替换为红色红曲霉CGMCC 3.15741，红色红曲霉CGMCC 3.15741种子液制备方法同Fen1菌株。

苦参发酵提取物制备：

(1)取适量苦参干燥后，将其磨碎过60目筛，4℃密封保存。取磨碎后的苦参1重量份，加入5重量份蒸馏水，接种红色红曲霉CGMCC 3.15741种子液1％，接种解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716种子液1％，30℃发酵48小时。

未发酵组：

苦参的制备方法同实施例1，但不添加任何菌液。

苦参提取物制备：

(1)取适量苦参干燥后，将其磨碎过60目筛，4℃密封保存。取磨碎后的苦参1重量份，加入5重量份蒸馏水，30℃，48小时。

实施例3

抑菌实验

牙龈卟啉单胞菌是牙周炎最常见的致病菌，牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277作为检验菌株，来评估苦参发酵提取物的抑菌能力。

致病菌培养：牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277接种于市购的血琼脂平板37℃厌氧培养24小时进行活化，显微镜鉴别并挑取典型菌落使用TBS培养基液体厌氧培养48小时，然后使用TBS培养基稀释将其配置成1*10⁶CFU/ml的种子液。

取100uL制备得到的牙龈卟啉单胞菌种子液分别均匀涂布在TSB琼脂培养基中，待菌液充分吸收后，使用3mm的打孔器在培养皿上打孔后，实施例1和实施例2所得到的苦参发酵提取物20ul接种于孔中，阳性对照组为抗生素亚胺培南100ug/L。厌氧培养24小时，游标卡尺测定抑菌圈直径，重复5次，以抑菌圈直径进行敏感性判断。结果如表1所示。

表1苦参提取物抑菌活性检测

	牙龈卟啉单胞菌抑菌圈直径(mm)
		阳性对照组	22.35±0.80
实施例1组	21.25±0.15¹
		对比例1组	14.12±0.32^1，2
对比例2组	10.04±0.35²
		对比例3组	13.34±0.50^1,2
未发酵组	9.96±0.22

注：t检验,l：P<0.05(与未发酵组比较)；2：P<0.05(和阳性对照组比较)

结果显示：苦参发酵液均有较明确的抑菌功能，这和之前的研究是类似的，苦参含有包括氧化苦参碱、氧化槐果碱等多种物质能够多种细菌起到抑制作用。

对比例1组单独添加红色红曲霉菌株Fen1进行发酵，相对于未发酵组有统计学差异(p<0.05)，说明红色红曲霉菌株Fen1在发酵过程中，能够产生更多抑菌物。对比例2组显示解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716进行苦参发酵和未发酵组类似，说明其发酵无效，显微镜+涂片也显示解淀粉芽孢杆菌在苦参提取物中未生长，其未发酵。而实施例1组显示同时使用红色红曲霉菌株Fen1+解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716发酵苦参，和抗生素组无统计学差异，推测两者联用能够出乎预料的产生协同作用，大大增加苦参发酵的抑菌物质产生。显微镜+涂片也显示同时添加红色红曲霉菌株Fen1+解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716发酵苦参时候，解淀粉芽孢杆菌会发生细菌数量增殖，考虑只有红色红曲霉菌株Fen1发酵苦参的过程可能会产生某些特殊物质，才能够促进解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716的生长，这两种菌联合发酵促进苦参变性，可明显增强苦参发酵提取物的抑菌功能。

但是使用其他红色红曲霉菌株+解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716组(对比例3)和单使用红色红曲霉菌株Fen1组比较，两组抑菌效果类似，说明只有红色红曲霉菌株Fen1的加入，才会与解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.871有协同作用，可明显改变苦参发酵过程，发挥更高效的抑菌功能。我们还使用红色红曲霉Fen1与其他解淀粉芽孢杆菌作用，其作用均明显不如红色红曲霉Fen1+解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716组。说明只有红色红曲霉Fen1+解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716联合发酵促进苦参变性，方可大大增强苦参发酵提取物的抑菌功能。

实施例4

小鼠牙周炎模型建立：

使用12周KM小鼠，使用10％水合氯醛麻醉小鼠，固定、消毒，分离上颌第一磨牙龈组织，使用非吸收医用丝线嵌入第一磨牙颈部于近中牙龈处缝合结扎，结扎线置于龈沟内。增殖牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277种子液方法同实施例3，配置成1*10⁸CFU/ml的牙龈卟啉单胞菌悬液。结扎当天每只小鼠结扎部位滴加0.1ml菌悬液，每24小时追加1次，共5次。4周后，小鼠第一磨牙牙周均出现深牙周袋，牙槽骨吸收，可见牙周炎症破坏表现，镜下可见大量炎症细胞浸润及牙槽骨的破坏，牙周炎模型建立成功。

建模成功后，于第5周起对建模小鼠进行灌胃，实施例1和实施例2的苦参发酵提取物(30mg/kg)为处理组；抗生素治疗组使用亚胺培南灌胃(50mg/kg)；牙周炎小鼠组使用生理盐水灌胃；正常组为正常小鼠普通饮食,生理盐水灌胃，每组3只小鼠。各组分别在第8周对小鼠眼眶静脉取血，收集血液于EP管中，室温静置2小时离心，取上层血清，按照检测试剂盒所述的Elisa法检验白介素6(IL－6)、小鼠血清中的降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)。结果如表2所示。

表2炎症因子检测结果

	IL－6(pg/mL)	PCT(ng/mL)	CRP(ng/mL)
				实施例1组	17.03±1.91^1，2，4	62.88±11.26^1，2，4	79.97±12.83^1，2，4
对比例1组	21.66±2.43^{1，2，3，4}	150.35±24.09^{1，2，3，4}	268.54±16.24^{1，2，3，4}
				对比例2组	23.39±3.32^1，2，3	211.47±21.28^1，2，3	369.86±32.87^1，2，3
对比例3组	22.09±2.19^{1，2，3，4}	157.33±20.54^{1，2，3，4}	277.32±28.55^{1，2，3，4}
				未发酵组	24.12±2.67^1，2，3	225.46±18.68^1，2，3	389.75±26.17^1，2，3
抗生素治疗组(阳性组)	16.44±2.24	59.32±6.18	69.97±12.32
				牙周炎小鼠组(阴性组)	28.22±3.44	334.77±25.88	634.44±30.29
正常组(空白组)	14.66±2.51	37.34±7.29	50.33±10.11

注：t检验,l：P<0.05(与空白组比较)；2：P<0.05(与阴性组比较)；3：P<0.05(与阳性组比较)；4：P<0.05(与未发酵组比较)

结果显示实施例1(红色红曲霉菌株Fen1+解淀粉芽孢杆菌组)小鼠的白介素6(IL－6)、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)含量最低,抗炎效果最好，相对于未发酵组具有显著性差异(<0.05)，抗炎效果接近于抗生素治疗组。单独使用解淀粉芽孢杆菌组发酵和阴性对照组无明显差异，说明单独解淀粉芽孢杆菌组对苦参发酵效果差。我们发现菌株Fen1(实施例1)和其他红色红曲霉菌株发酵(对比例3)比较有统计学差异，我们还使用红色红曲霉Fen1与其他解淀粉芽孢杆菌作用，其作用均明显不如红色红曲霉Fen1+解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716组。考虑只有红色红曲霉菌株Fen1的特殊发酵可以和解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716产生协同作用，从而改变了红色红曲霉对苦参发酵过程，发挥更高效的减轻炎症反应的功能。考虑产香红色红曲霉菌株Fen1，该菌株具有较高酯化能力，发酵时可产生β-苯乙醇等物质，改变了苦参发酵环境，方使得解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716能够在苦参发酵过程中起作用，从而提升了苦参发酵液的发酵品质。

实施例5

将实施例1和实施例2所制备的苦参发酵提取物在牙膏、漱口水等功效型口腔护理产品中的应用。

将实施例1和实施例2所制备的苦参发酵提取物在制备预防或治疗牙周炎疾病产品中的应用。

综上所述，本发明团队在研究和实践过程中，发现红色红曲霉菌株Fen1+解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716联合发酵得到的苦参提取物能够更好的抑制牙周炎常见致病菌，并且可以明显减少炎症因子。而单独解淀粉芽孢杆菌发酵苦参效果差。其他红色红曲霉菌株和解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716组并没有明显协同作用，考虑只有红色红曲霉菌株Fen1发酵可以和解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716可产生协同作用，从而改变了红色红曲霉对苦参发酵过程，发挥更高效的减轻炎症反应的功能。考虑产香红色红曲霉菌株Fen1本身特点相关，该菌株具有较高酯化能力，发酵时可产生β-苯乙醇等物质，能苦参发酵环境，使得解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716能够在苦参发酵过程中起作用，从而提升了苦参发酵液的发酵品质。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种苦参发酵提取物，其特征在于：

将苦参作为底物，用红色红曲霉菌Fen1和解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716进行发酵获得。

2.权利要求1所述的苦参发酵提取物，其特征在于制备方法如下：

（1）取适量苦参干燥后，将其磨碎过60目筛，4℃密封保存；取磨碎后的苦参1重量份，加入5重量份蒸馏水，接种红色红曲霉菌Fen1种子液1%，接种解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716种子液1%，30℃发酵48小时；

（2）再加入5重量份蒸馏水，放置于超声震荡仪40分钟， 85℃，100W，滤液倒出；再次加入5重量份蒸馏水，放置于超声震荡仪40分钟， 85℃，100W，滤液倒出；

(3)合并2次的滤液，旋转蒸发至浓稠状后于-80℃真空下冷冻干燥，得到粉末， 4℃密闭保存。

3.权利要求1-2任一项所述的苦参发酵提取物，其红色红曲霉菌Fen1种子液制备如下：

取保藏的红色红曲霉菌Fen1菌株解冻，划线于YPD固体培养基上培养， 30℃条件下培养24小时使其复活，在YPD固体培养基上挑取菌落特征明显的红色红曲霉菌株接种于YPD液体培养基中，120 r/分钟、25℃培养24小时，调整菌液浓度为1*10⁷ CFU/ml红色红曲霉菌Fen1种子液。

4.权利要求1-2任一项所述的苦参发酵提取物，其解淀粉芽孢杆菌CGMCC1.8716种子液制备如下：

取保藏的解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716解冻，接种到 LB固体培养基中划线，37℃培养24小时；挑取平板中长势较好的单菌落接种至LB液体培养基中活化，120 r/分钟、37℃培养48小时，培养成1*10⁷ CFU/ml解淀粉芽孢杆菌CGMCC 1.8716种子液。

5.权利要求1-4任一项所述的苦参发酵提取物，其在牙膏、漱口水功效型口腔护理产品制备中的应用。

6.权利要求1-4任一项所述的苦参发酵提取物，其在制备预防或治疗牙周炎疾病产品中的应用。