JP5428004B2 - 消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキット - Google Patents
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Description
〔1.サンプル〕
(1−1.手術検体)
手術検体を研究に使用することについて文章による同意を得た消化管間質腫瘍を患う患者から得られた手術検体を使用した。消化管間質腫瘍症例の手術検体の使用について、本研究は国立がんセンターの遺伝子倫理委員会の審査および承認を受けた。
症例の手術検体から腫瘍組織を回収し、液体窒素で凍らせた。凍らせた腫瘍組織をマルチビーズショッカー(安井機器、大阪)にて破砕して粉末状にした。粉末状にした組織にタンパク質抽出バッファー(6M ウレア、2M チオウレア、3% CHAPS、1% TritonX-100)を加えてタンパク質を抽出した。
(2−1.サンプル調整)
抽出したタンパク質を15000回転で遠心し、上精を回収した。上精に含まれるタンパク質をタンパク質定量キット(DCプロテインアッセイキット、Bio-Rad社、米国)にて定量した。抽出したタンパク質5μgを蛍光色素(サチュレーションダイCy5、GE Healthcare Biosciences社)で標識した。標識は以下のように行った。(1)終濃度30mMとなるようにpH8.0のトリスバッファーを加え、次に(2)1nmolのTECP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロライド,Sigma社)を加え、(3)37度で60分間処理した。次に、(4)Cy5蛍光色素を4nmol加えて、37度で60分間処理した。今回の実験に用いたタンパク質サンプルから等量ずつタンパク質サンプルを集めて混合し、内部標準サンプルとした。内部標準サンプルの5μgを蛍光色素(サチュレーションダイCy3、GE Healthcare Biosciences社)で上記と同様に標識した。Cy5で標識した個別のサンプルとCy3で標識した内部標準サンプルを混合し、ウレア可溶化液で最終容量420μlとした。その際、終濃度が65mMとなるようにDTTを、2%となるようにとアンフォライン(GE Healthcare Biosciences社)を加えた。Cy5で標識した個別サンプルとCy3で標識した内部標準サンプルを混合したサンプルを一枚の二次元電気泳動ゲルで泳動した。
まず、一次元目の泳動はイモビラインゲル(24cm、pI4−7、GE Healthcare Biosciences社)と、Multiphor II(GE Healthcare Biosciences社)を使用した。泳動するタンパク質サンプルでイモビラインゲルを室温にて一晩膨潤させた。泳動は40000Vh行った。二次元目の泳動は9−15%のポリアクリルアミドのグラジエントゲルと、GiantGelRunner(バイオクラフト社)を使用した。泳動は泳動装置一台につき18Wで17時間、20度で行った。
泳動終了後は、タンパク質を検出する目的で、ガラス板に挟んだままの状態のゲルをレーザースキャナー(Typhoon Trio、GE Healthcare Biosciences社)に載せスキャンした。
読み込んだ画像は画像解析ソフトProgenesis(Non-linear Dynamic社)で解析した。
(3−1.ゲル内消化法)
全自動スポット回収装置ProHunter(AsOne社)を用いて、ゲルから96穴プレートにスポットを回収した。ゲルをメタノールで十分洗浄し、タンパク質分解酵素(トリプシン)で37度にて一晩処理した。この処理によってタンパク質はペプチド化される。得られたペプチドは、60%アセトニトリルにてゲルを洗浄することで回収した。
ペプチドの質量を測定するためにLTQ(サーモ社)を使用した。タンパク質同定のためのデータベース検索にはMasCotを使用した。
前述の方法により手術検体より抽出したタンパク質10μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。抗体は抗DDX39抗体(Gene way社)を用いた。抗体の希釈濃度は1000倍とし、検出にはECLキット(GE Healthcare Biosciences社)を使用した。
(6−1.転移の有無)
外来経過観察中の診察所見および定期的画像検査(CT,MRI,単純X線写真)により、肺、リンパ節、腹腔など全身のいずれの場所にも明らかな病変の出現がない場合に転移なしと判断した。
非特許文献1(Hasegawa H et al.(2002))に記載の方法に準じて、表1およびこれに関連した上記記載の通りに病理学的悪性度を判断した。腫瘍分化度、腫瘍壊死およびMIB−1のそれぞれについて病理医がスコアを決定した。
消化管間質腫瘍の手術検体からタンパク質を抽出し、蛍光二次元電気泳動法と質量分析装置にて転移、予後に関係するタンパク質を解析した。1)術後1年以内に転移を来しかつ病理学的悪性度(リスク分類)が高度であった9症例、2)術後3年間、転移がなくかつ病理学的悪性度が中等度あるいは低度であった8症例の手術検体を用いた。約5000個のタンパク質スポットから、両群の間で濃度が異なるタンパク質スポット38個を選別した(Wilcoxon検定のP値が0.01以下で平均値が2倍以上)。
Claims (1)
- 消化管間質腫瘍を患う患者の予後を予測するためのキットであって、
前記患者から得られた腫瘍組織試料におけるDDX39のタンパク質を検出または定量する抗DDX39抗体を含み、前記DDX39のタンパク質の発現レベルがコントロールサンプルの発現レベルより高い場合に前記患者の予後が不良であると予測する、キット。
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