JP4454986B2

JP4454986B2 - タウ遺伝子中の遺伝子多型を利用したアルツハイマー病の発症リスクの予測法およびこれに用いるための核酸分子

Info

Publication number: JP4454986B2
Application number: JP2003299939A
Authority: JP
Inventors: 橋浩棚; 村英雄木; 平武田; 田隆朝
Original assignee: National Institute of Biomedical Innovation NIBIO
Current assignee: National Institute of Biomedical Innovation NIBIO
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2003-08-25
Publication date: 2010-04-21
Anticipated expiration: 2023-08-25
Also published as: JP2005065594A

Description

発明の背景

発明の分野
本発明は、ヒトタウ遺伝子の変異を検出することによるアルツハイマー病の発症リスクの予測およびこれに用いるための核酸分子に関する。

背景技術
６５歳未満で発症する若年性アルツハイマー病の病因遺伝子として、アミロイド前駆体遺伝子、プレセニリン１遺伝子、およびプレセニリン２遺伝子が知られている。しかし、常染色体優性型の若年性アルツハイマー病のうち、これら病因遺伝子の変異によるものは１０〜５０％に過ぎず、また、若年性アルツハイマー病患者の約９割はこれら病因遺伝子の変異を有さず、かつ常染色体優性遺伝形式を持たないことが知られている（St. George-Hyslop P. H., Semin. Neurol. 19, 371-383, 1999；Campion D. et al., Am. J. Hum. Genet. 65, 664-670, 1999；Cruts M. et al., Hum. Mol. Genet. 7, 43-51, 1998；Forsell C. et al., Neurosci. Lett. 234, 3-6, 1997）。さらに、日本人におけるこれら病因遺伝子の変異に関し、常染色体優性型若年性アルツハイマー病患者２５家系のうちの５家系、および弧発性の若年性アルツハイマー病患者３４例のうちの１例のみにプレセニリン１遺伝子の変異が認められただけで、他の遺伝子の変異は認められなかったことが報告されている（Tanahashi H. et al., Neurosci. Lett. 207, 139-141, 1996；Kamimura K. et al., J. Neurol. Sci. 160, 76-81, 1998）。

また、アルツハイマー病のリスクファクターとして、アポリポプロテインＥ遺伝子のε４アレルが知られている。しかしながら、アルツハイマー病患者の半数以上はε４アレルを持たないことが報告されている（Farrier L.A. et al., JAMA, 278, 1349-1356, 1997）。

従って、若年性アルツハイマー病を高い確率で検出しうるリスクファクターが、依然として必要とされている。

一方で、タウは微小管結合タンパク質の一つであり、チューブリン重合促進因子として機能する。タウ遺伝子は、その一次転写産物の構造から、１６個のエクソン（エクソン０〜１４）を含むことが分かっている。中枢神経系では、エクソン４Ａ、エクソン６およびエクソン８は使用されず、エクソン２、エクソン３およびエクソン１０の選択的スプライシングにより、タウは６種のアイソフォームを生じる。

タウ遺伝子の変異は、いくつかの疾患に関連することが知られている。例えば、タウの遺伝子変異により、第１７番染色体に連鎖する前頭側頭型痴呆パーキンソニズム（frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17）が起こることが知られている（非特許文献１：Poorkaj P. et al., Ann. Neurol. 43, 815-825, 1998；非特許文献２：Hutton M. et al., Nature 393, 702-705, 1998）。また、タウの遺伝子多型として、９種の連鎖不平衡な一塩基多型からなるＨ１およびＨ２ハプロタイプが知られているが、そのうちのＨ１が進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）の患者に多く見られると報告されている（非特許文献３：Baker M. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 711-715, 1999）。

さらに、タウ遺伝子の変異とアルツハイマー病との相関も研究の対象となっている。アルツハイマー病は、老人斑の蓄積および神経原繊維変化（神経細胞内における繊維状封入体の蓄積）により特徴づけられる。この神経原繊維変化において蓄積される繊維状封入体は、ペアードヘリカルフィラメント（paired helical filament，ＰＨＦ）と呼ばれる特殊な繊維を含んでおり、ＰＨＦの基本骨格は過度にリン酸化されたタウにより構成されている。このことから、タウの遺伝子変異または遺伝子多型とアルツハイマー病との相関が研究の対象とされており、その成果について報告されている。

Lilius L.らは、タウ遺伝子のＡおよびＢハプロタイプ（これは上記のＨ１およびＨ２ハプロタイプを拡張したものであり、１１種の連鎖不平衡な一塩基多型からなる）とアルツハイマー病との関連について報告している（非特許文献４：Lilius L. et al., Neurosci. lett. 277, 29-32, 1999）。この報告では、ＡＡハプロタイプは単独ではアルツハイマー病のリスクとはならないが、アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）のε４型と相乗的に働くことによってアルツハイマー病のリスクとなると結論づけられている。

また、Bullido M. J.らは、タウ遺伝子のＩＶＳ１１＋３４Ｇ／Ａ多型（第１１イントロンの第３４ヌクレオチドにおけるＧ／Ａ多型）とアルツハイマー病との関連について報告している（非特許文献５：Bullido M. J. et al., Neurosci. Lett. 298, 49-52, 2000）。この報告では、前記多型におけるＧアレル（ＧＧ型またはＧＡ型）は単独ではアルツハイマー病のリスクとはならないが、アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）のε４型と相乗的に働くことによってアルツハイマー病のリスクとなると結論づけられている。

しかし、他のグループにより、ＡＡハプロタイプおよびＩＶＳ１１＋３４Ｇアレルに関する上述の結果は、コホート研究によっては再現されないことが報告されている（非特許文献６：Crawford F. et al., Neurosci. Lett. 266, 193-196, 1999；非特許文献７：Roks G. et al., Neurosci. Lett. 277, 137-139, 1999；非特許文献８：Kwon J. M. et al., Neurosci. Lett. 284, 77-80, 2000；非特許文献９：Baker M. et al., Neurosci. Lett. 285, 147-149, 2000）。

さらに、Conrad C.らは、タウ遺伝子の第９イントロン内に新規な遺伝子であるSaitohin遺伝子が存在することを報告し、さらには、Saitohin遺伝子中のＱ７Ｒ多型（第７アミノ酸残基におけるグルタミン／アルギニン多型）が晩期発症型アルツハイマー病と相関すると報告している（非特許文献１０：Conrad C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7751-7756, 2002）。

しかし、他のグループにより、上述のSaitohin遺伝子中のＱ７Ｒ多型とアルツハイマー病とは相関しないことが報告されている（非特許文献１１：Cook L. et al., Ann. Neurol. 52, 690-691, 2002；非特許文献１２：Verpillat P. et al., Ann. Neurol. 52, 829-832, 2002）。

Poorkaj P. et al., Ann. Neurol. 43, 815-825, 1998 Hutton M. et al., Nature 393, 702-705, 1998 Baker M. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 711-715, 1999 Lilius L. et al., Neurosci. lett. 277, 29-32, 1999 Bullido M. J. et al., Neurosci. Lett. 298, 49-52, 2000 Crawford F. et al., Neurosci. Lett. 266, 193-196, 1999 Roks G. et al., Neurosci. Lett. 277, 137-139, 1999 Kwon J. M. et al., Neurosci. Lett. 284, 77-80, 2000 Baker M. et al., Neurosci. Lett. 285, 147-149, 2000 Conrad C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7751-7756, 2002 Cook L. et al., Ann. Neurol. 52, 690-691, 2002 Verpillat P. et al., Ann. Neurol. 52, 829-832, 2002

発明の概要

本発明者らは、ヒトタウ遺伝子において、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を見出し、さらにこの変異が男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクに関連することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

従って、本発明は、上記の変異を有する変異型ポリヌクレオチド、該変異を検出しうる核酸分子およびプライマーペア、男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクの予測方法、ならびに診断用キットの提供を目的とする。

そして、本発明による変異型ポリヌクレオチドは、ヒトタウ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を有してなるものである。

さらに、本発明による核酸分子は、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出しうる核酸分子であって、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。

さらに、本発明によるプライマーペアは、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出しうるプライマーペアであって、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。

さらに、本発明によるアルツハイマー病の発症リスクの予測方法は、ヒトタウ遺伝子の変異を検出することにより、男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測する方法であって、本発明による核酸分子、および／または本発明によるプライマーペアを用いて、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出する工程を含んでなるものである。

さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測するためのキットである。

本発明によれば、ヒトタウ遺伝子における変異を検出することにより、男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測することが可能となる。

発明の具体的説明

本発明により検出されるタウ遺伝子中の変異は、その第１１イントロン（第１１エクソンと第１２エクソンに挟まれた領域）の第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異（本明細書において「ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異」という）である。

タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異は、男性における若年性アルツハイマー病、すなわち６５歳未満で発症するアルツハイマー病、好ましくは６０歳未満で発症するアルツハイマー病、のリスクファクターとして使用できる。従って、男性においてＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することにより、前記若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測することが可能となる。

変異型ポリヌクレオチド
ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出するためには、この変異を有するタウ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを標的とすることができる。すなわち、このような変異型ポリヌクレオチドの存在を確認することにより、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができる。

従って、本発明によれば、ヒトタウ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を有してなるポリヌクレオチドが提供される。前記タウ遺伝子は、好ましくは配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードするものとされ、これをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号２で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。また、前記タウ遺伝子の第１１イントロンは、好ましくは配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものとされ、その場合には、上記の変異により、配列番号１に示される第９０番目のグアニン（Ｇ）残基がアデニン（Ａ）残基に置換される。前記タウ遺伝子の全エクソンを含むヒト１７番染色体genomic contigとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号：ＮＴ＿０１０７４８．１２として登録されているヌクレオチド配列の第２６２５９０８〜２７５９８２８残基が挙げられる。

本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。

本発明による変異型ポリヌクレオチドは、既述の通り、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する際の標的として有用であるが、さらには、タウタンパク質の活性または発現量に影響を与え、これによりアルツハイマー病の発症を抑制することのできる化合物をスクリーニングするためにも有用である。

核酸分子およびこれを用いたアルツハイマー病発症予測方法
本発明による核酸分子は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出しうる核酸分子である。この核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。

本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。

本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。

本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。

本発明による核酸分子は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異の検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。

本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。

また、本発明による核酸分子は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異の検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。

本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。

本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する上で好ましいものである。

核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出しうるプライマーペアが提供される。このプライマーペアは、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１１イントロンの第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応するアデニン（Ａ）残基を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。

本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができ、これにより、男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクを予測することができる。上記の検出の結果、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異が検出された場合には、若年性アルツハイマー病発症のリスクが高いものと判断することができる。

また、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を有する場合の変異部位における遺伝子型としてはＧ／ＡおよびＡ／Ａが考えられる。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病の発症リスクを予測する方法が提供される。

具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する工程を含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病発症のリスクの予測法が提供される。

この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができる。核酸増幅法およびこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。

核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。

上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマー：
T810F：5'-GCTCCCGCAAGTTTCACACTCAAC-3'（配列番号１２）；
T920：5'-GCTGGAACTGCTCCAGACTTC-3'（配列番号１３）
を用いて核酸増幅法を行ない、これらのいずれかのプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。

また、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異において、この変異により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の変異を検出することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。前記タウ遺伝子の第１１イントロンが配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含んでなる場合には、例えば、上記T810F（配列番号１２）およびT920（配列番号１３）をプライマーとして用い、得られた増幅産物を制限酵素MboIIで消化すればよい。その結果、３５ｂｐおよび５８ｂｐの２個の断片が得られた場合には上記の変異が検出されたと判断することができる。

本発明による予測法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを変異部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを変異部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記変異にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。

本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるタウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異の検出にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病発症のリスクの予測法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。

この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出することができる。核酸試料は、必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる変異の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。

タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。

ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法においては、変異部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記変異部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の変異部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、変異部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。

Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔ^ＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。

タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。

ＴａｑＭａｎＰＣＲ法においては、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＧアレルおよびＡアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ａ、またはＡ／Ａ）が容易に決定される。

本発明による予測法において、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異が検出されたと評価された男性被験者由来のサンプルは、若年性アルツハイマー病が発症する可能性が高いものと判断され、従って、そのリスクがあるものと予測される。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。

以上のようなアルツハイマー病の発症のリスクの予測のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、タウ遺伝子におけるＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ変異を検出するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。

例１：タウ遺伝子中の多型の探索およびその多型とアルツハイマー病との関連
本研究では、アルツハイマー病患者８７４人（発症年齢幅：４２〜９１歳、発症年齢平均±ＳＤ：７０．０±８．８歳、日本人、性別：男性３０５人；女性５６９人）および健常対照６７８人（年齢幅：３３〜９１歳、年齢平均±ＳＤ：６７．０±１０．１歳、日本人、性別：男性２７４人；女性４０４人）を調査の対象とした。アルツハイマー病患者は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ診断基準に従ってアルツハイマー病と診断された患者である。健常対照は患者の配偶者であり、ＭＭＳＥ（Mini-Mental State Examination）により知的正常であることを確かめられた健常者である（スコア＞２５）。研究に先立ち、上記の患者および健常者の全員からインフォームドコンセントを書面で取得し、さらに、これらの患者および健常者から得た試料を匿名化した。

まず、タウ遺伝子中の多型を同定するため、２５人のアルツハイマー患者および２５人の健常対照についてタウ遺伝子の配列決定を行なったところ、次の５つの一塩基多型が見出された：ｃ．８５５Ｃ＞Ｔ（最長のタウアイソフォームのコード配列を示す配列番号２において、第８５５番に位置するヌクレオチド）；ｃ．１３２１Ｃ＞Ｔ（同第１３２１番のヌクレオチド）；ｃ．１７６１Ｇ＞Ａ（同第１７６１番のヌクレオチド）；ｃ．２１８１Ｔ＞Ｃ（同第２１８１番のヌクレオチド）；およびＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ（第１１イントロンのヌクレオチド配列を示す配列番号１において、第９０番に位置するヌクレオチド）。これらの一塩基多型のうち、ｃ．２１８１Ｔ＞ＣおよびＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａは公共のデータベース（ＮＣＢＩｄｂＳＮＰおよびＩＭＳ−ＪＳＴＪＳＮＰ）には登録されておらず、新規な多型と考えられた。

なお、タウ遺伝子中における他の多型は見出されなかった。また、タウ遺伝子の第９イントロン中に存在するSaitohin遺伝子についても多型の探索を行なったが、アルツハイマー病患者１５人および健常対照１５人からの試料においては多型は検出されず、さらに、アルツハイマー病患者１３２人および健常対照１１６人からの試料においてＱ７Ｒ多型は検出されなかった。

次いで、１３４人のアルツハイマー病患者および１５８人の健常対照からの試料について、上記多型のタイピングを行なった。タイピングは、以下のプライマーおよび制限酵素を用いる制限断片長多型の検出法に従って行なった。ここで、ｃ．８５５Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３２１Ｃ＞Ｔおよびｃ．２１８１Ｔ＞Ｃは制限酵素認識配列の変更を伴わないため、これらのタイピングには人為的に制限酵素認識配列を作出するためのプライマーを用いた。

タイピングに用いたプライマーおよび制限酵素：
（１）ｃ．８５５Ｃ＞Ｔ：
T809B：5'-AGAGATCCCAGCCTCAGAGCCCCA-3'（配列番号４）；
T809A：5'-CTCCTTCTGCACGTTGGGTGTGA-3'（配列番号５）；
制限酵素：NcoI、
（２）ｃ．１３２１Ｃ＞Ｔ：
T810C：5'-CTCCTGGTAGCTCAGACCCTCTG-3'（配列番号６）；
T810D：5'-TGCCAGTTCGGGAAGTGACAGAAGATACGT-3'（配列番号７）；
制限酵素：SnaBI、
（３）ｃ．１７６１Ｇ＞Ａ：
T11U1：5'-CCACCTGCCTAACCCAGTG-3'（配列番号８）；
T828：5'-CTTCCAGGCACAGCCCTAC-3'（配列番号９）；
制限酵素：MvaI、
（４）ｃ．２１８１Ｔ＞Ｃ：
T810G：5'-ACACGTCTCCACGGCATCTCAGCCA-3'（配列番号１０）；
T810H：5'-AGGGAGGCAGACACCTCGTCAG-3'（配列番号１１）；
制限酵素：MvaI、
（５）ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ：
T810F：5'-GCTCCCGCAAGTTTCACACTCAAC-3'（配列番号１２）；
T920：5'-GCTGGAACTGCTCCAGACTTC-3'（配列番号１３）；
制限酵素：MboII。

その結果、ｃ．１３２１Ｃ＞ＴにおけるＴアレルの比率は、健常対照では０．４０であり、アルツハイマー病患者では０．４２であった。ｃ．８５５Ｃ＞ＴにおけるＴアレルの比率は、健常対照では０．１８であり、アルツハイマー病患者では０．１６であった。ｃ．１７６１Ｇ＞ＡにおけるＡアレルは、１例の健常対照および４例のアルツハイマー病患者でしか見られなかった。また、ｃ．２１８１Ｔ＞ＣにおけるＣアレルは、１例のアルツハイマー病患者でしか見られなかった。一方で、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａについてはアルツハイマー病との相関が見られた。

従って、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａに関し、本研究における調査対象者全員の試料についてタイピングを行なった。また、文献（Wenham P. R. et al., Lancet 337, 1158-1159, 1991）に記載の方法に従って、アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）の遺伝子型を調べた。ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａ多型の遺伝子型分布を、ＧＧ型に対するＡアレル（ＡＡ＋ＧＡ対ＧＧ）のχ^２Ｐ値およびオッズ比（ＯＲ）とともに以下の表１〜３に示す。

発症年齢が６５歳未満（若年性アルツハイマー病）の男性患者におけるＩＶＳ１１＋９０Ａアレルの頻度は、年齢および性別を一致させた健常対照に比べて有意に高く（ＯＲ＝２．６５、９５％ＣＩ：１．３０−５．４２）、特に、発症年齢が６０歳未満の男性患者においては、その有意差がさらに顕著であった（ＯＲ＝３．４３、９５％ＣＩ：１．３１−８．９８）。

次いで、これらのアレルの発症年齢に対する影響を調べたところ、若年性アルツハイマー病男性患者において、ＧＧ型とＡＡ型との間で、発症年齢に有意差が認められた（ＧＧ型：５９．５±３．８歳、ＡＡ型：５５．１±３．８歳、ｔ検定Ｐ＝０．０２１）。

さらに、若年性アルツハイマー病男性患者におけるＡアレルの頻度は、老年性アルツハイマー病（６５歳以上で発症）の男性患者に比べて有意に高かった（χ^２Ｐ＝０．０２５）。一方で、６５歳未満の男性健常対照と６５歳以上の男性健常対照との間では、このような有意差は見られなかった（χ^２Ｐ＝０．２９９）。

以上の結果から、ＩＶＳ１１＋９０Ａアレルは、男性の若年性アルツハイマー病についてのリスクファクター（危険因子）であることが明らかとなった。

また、ＡｐｏＥ遺伝子型について分析したところ、ε４アレルの有無に関するオッズ比（ＯＲ）は、全試料においては３．５３（９５％ＣＩ：２．８０−４．４３）、若年性アルツハイマー病の男性患者においては２．６３（９５％ＣＩ：１．２６−５．５０）であり、予想通りの結果となった。さらに、若年性アルツハイマー病の男性患者を、ε４アレルの有無に関して二つの群に分けた場合（ε４アレルを有する３３人の患者と、これを有さない５３人の患者）、両群の間でＩＶＳ１１＋９０Ａアレルの頻度に有意差は見られなかった（χ^２＝１．１３、Ｐ＝０．２８８）。従って、ＩＶＳ１１＋９０Ｇ＞Ａの効果は、ＡｐｏＥの状態とは関連しないものと考えられる。

以上のように、ＩＶＳ１１＋９０Ａアレルは、男性の若年性アルツハイマー病についてのリスクファクターであることが明らかとなったが、アルツハイマー病と同様にタウ蛋白の異常蓄積を伴う疾患、例えば、石灰沈着を伴うびまん性神経原繊維変化病（diffuse neurofibrillary tangles with calcification）、辺緑系神経原繊維変化痴呆（limbic neurofibrillary tangle dementia）、パーキンソン痴呆コンプレックス（Parkinson-dementia complex）等の神経原繊維変化型痴呆（dementia with neurofibrillary tangles）、および進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）、皮質基底核変性症（corticobasal degeneration）、第１７番染色体に連鎖する前頭側頭型痴呆パーキンソニズム（frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17）等のグリアタングル型痴呆（dementias with glial tangles）など、についてのリスクファクターとして使用できる可能性も高いものと考えられる。

Claims

ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出しうる核酸分子であって、
配列番号１で表わされるヌクレオチド配列において第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を有する配列、またはこれに相補的な配列の、配列番号１中の第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応する残基を含む領域のヌクレオチド配列を含んでなり、
１５〜５０ヌクレオチドの鎖長を有する、核酸分子。
配列番号１で表わされるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を有するポリヌクレオチドの、配列番号１中の第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応する残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１に記載の核酸分子。
男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクの予測に用いるための、請求項１または２に記載の核酸分子。
ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出しうるプライマーペアであって、
配列番号１で表わされるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を有するポリヌクレオチドの、配列番号１中の第９０番目に位置するヌクレオチド残基に対応する残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができ、
一方のプライマーが、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとされ、他方のプライマーが、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとされ、
各プライマーが１５〜５０ヌクレオチドの鎖長を有し、
一方のプライマーが請求項１に記載の核酸分子である、プライマーペア。
男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクの予測に用いるための、請求項４に記載のプライマーペア。
男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測するために、ヒトタウ遺伝子の変異を検出する方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項４もしくは５に記載のプライマーペアを用いて、ヒトタウ遺伝子における、第１１イントロンの第９０番目に位置するグアニン（Ｇ）残基のアデニン（Ａ）残基への変異を検出する工程を含んでなる、方法。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項４もしくは５に記載のプライマーペアを含んでなる、男性における若年性アルツハイマー病の発症のリスクを予測するためのキット。