KR102249878B1 - 과립형 각막이상증 진단용 조성물 - Google Patents

과립형 각막이상증 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과립형 각막이상증 진단용 키트 및 이를 이용하여 과립형 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 정상인과 과립형 각막이상증 환자, 보다 구체적으로는 아벨리노 각막이상증 환자의 대립 유전자형을 현저한 정확도와 낮은 비용으로 판별할 수 있는 실시간 진단 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

과립형 각막이상증 진단용 조성물{A Composition for Diagnosing Granular Corneal Dystrophy}
본 발명은 βIG-H3 유전자의 변이를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 포함하는 과립형 각막이상증 진단용 조성물에 관한 것이다.
각막이상증(corneal dystrophy)은 각막 중심에 혼탁이 발생하여 나이가 듦에 따라 점차 혼탁이 많아져서 시력이 감소하는 상염색체 우성 유전질환으로, βIG-H3(TGFBI) 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의하여 발생한다.
βIG-H3 유전자는 분비 신호부위와 인테그린의 리간드 인식 부위인 Arg-Gly-Asp(RGD) 모티브를 포함하는 683개 아미노산으로 이루어진 단백질을 인코딩하는 유전자이다. βIG-H3 단백질은 인테그린과 상호작용하여 세포 부착 및 이동을 매개하는 세포 외 기질(ECM) 요소이다. 지금까지 각막이상증과 관련하여, 38 개의 상이한 βIG-H3 유전자 변이가 보고되었다. 각각의 다른 변이는 독특한 각막이상증 표현형을 나타내는데, 예를 들면 R124H 변이는 제2형 과립형 각막이상증, R124C 변이는 제1형 격자형 각막이상증을, R555W 변이는 제1형 과립형 각막이상증을, 그리고 R555Q 변이는 티엘-벵케(Thiel-Behnke) 각막이상증을 나타낸다.
현재 각막이상증의 진단을 위해 현미경 검사로 안구 내 단백질의 침착 정도를 육안으로 확인하고 있으나, 병변이 진행되지 않은 환자에 대해서는 육안검사만을 통해서는 확인할 수 없어, 증상의 급진전에 의한 실명을 막기 위해 필요한 조기 진단에 어려움을 겪고 있다. 분자생물학적인 아벨리노 검사 방법으로는, DNA 칩을 이용한 염기서열 분석을 통해 변이부위를 확인하는 방법이 행해지고 있으나, 정확도가 낮고 고가의 시약을 필요로하여 비용면에서 효용성이 떨어지며, 무엇보다도 6시간 이상의 시간이 소요된다는 단점이 있다. 이에, 단일염기 변이를 오차없이 검출할 수 있는 정확도를 가지면서도 실시간으로 신속하게 검출이 가능한 새로운 진단 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 한국 등록특허공보 제10-1251538호
본 발명자들은 과립형 각막이상증의 원인이 되는 βIG-H3 유전자의 엑손 4, 124번 코돈의 단일염기 변이를 신속하고 정확하게 검출함으로써 과립형 각막이상증을 높은 신뢰도로 진단할 수 있는 분자생물학적 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 단일염기다형성을 효율적으로 증폭할 수 있는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드를 프라이머로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우 정상인과 제1형/제2형 과립형 각막이상증 환자의 대립유전자형을 현저한 정확도로 판별할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 과립형 각막이상증 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 과립형 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 과립형 각막이상증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 과립형 각막이상증의 원인이 되는 βIG-H3 유전자의 엑손 4, 124번 코돈의 단일염기 변이를 신속하고 정확하게 검출함으로써 과립형 각막이상증을 높은 신뢰도로 진단할 수 있는 분자생물학적 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 단일염기다형성을 효율적으로 증폭할 수 있는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드를 프라이머로 중합효소연쇄반응을 수행할 경우 정상인과 제1형/제2형 과립형 각막이상증 환자의 대립유전자형을 현저한 정확도로 실시간 판별할 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“과립형 각막이상증”은 염색체 5q31에 위치한 βIG-H3 유전자의 124번 코돈에서 발생하는 돌연변이에 의해 염증 없이 각막에 혼탁이 발생하여 시력이 저하되는 질환으로, 상염색체 우위의 방식으로 유전되는 유전질환을 의미한다. 과립형 각막이상증에는 R124H 변이에 의한 제2형 과립형 각막이상증과 R124C 변이에 의한 제1형 과립형 각막이상증이 있으며, 본 발명의 프라이머는 124번 코돈 부위를 효율적으로 증폭함으로써 제1형 및 제2형 과립형 각막이상증의 유전자형을 모두 높은 신뢰도로 검출할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명에서 진단하고자 하는 과립형 각막이상증은 제2형 과립형 각막이상증(아벨리노 각막이상증)이다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정 및 현재 질환이 없는 개체가 향후 특정 질환에 걸릴 위험성의 판정을 포함한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의“진단”은 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부 및 향후 특정 질환에 걸릴 유전적 위험성이 있는지 여부를 유전 정보에 기반하여 판정하는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 βIG-H3 유전자 엑손 4 부위의 코돈 124번의 변이를 유발하는 단일염기 변이를 높은 정확도와 민감도로 검출하는 최적의 프라이머 세트를 발굴하였으며, 이를 이용하여 R124H 변이를 가지는 제2형 과립형 각막이상증 및 R124C 변이를 가지는 제1형 격자형 각막이상증의 각 유전자형을 효율적으로 검출할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 용어“과립형 각막이상증 진단”은 “과립형 각막이상증 유전자형의 검출”로 표현될 수도 있다.
본 명세서에서 용어“뉴클레오타이드”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명에서 발현량을 측정하고자 하는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. 뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있는데, 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈, 코돈의 축퇴성에 의해 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 가지는 핵산분자를 모두 포괄한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 발현량을 측정하고자 하는 뉴클레오타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 쌍이다.
본 명세서에서 사용되는 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.
본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산, 예를 들어 βIG-H3 유전자의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머 쌍(primer pair)"은 상술한 프라이머로서 주형의 5＇말단 서열에 결합하는 정방향 프라이머(forward primer)와 3＇말단 서열에 결합하는 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성되는 쌍을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 서열목록 제6서열 내지 서열목록 제10서열의 뉴클레오타이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하며, 보다 구체적으로는, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프로브이다.
본 명세서에서 용어“프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 βIG-H3 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3’-말단 또는 5’-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 말단에 형광물질이 결합되어 있다. 본 발명의 프로브는 타겟 서열에 대한 혼성화 특이성이 손상되지 않는 한도 내에서 리포터-형광물질이 태깅되는 변형이 이루어질 수 있다. 보다 구체적으로는, 정상형 염기에 결합하는 프로브의 5'-말단에 태깅되는 리포터 형광물질과 변이형 염기에 결합하는 프로브의 5'-말단에 태깅되는 리포터 형광물질은 서로 다른 파장의 범위를 갖는 물질일 수 있다.
보다 더 구체적으로는, 상기 형광물질은 VIC 또는 FAM이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 과립형 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계;
(b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 프라이머 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 βIG-H3 유전자 엑손 4의 124번 코돈의 변이 여부를 판별하는 단계.
본 발명에서 유전자형을 검출하고자 하는 과립형 각막이상증에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
이하에서 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 보다 상세히 설명한다.
단계 (a): 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계
본 명세서에서 용어“대상체”는 βIG-H3 유전자의 염기서열을 조사하기 위한 시료를 제공하고, 궁극적으로 과립형 각막이상증 발병 여부의 분석 대상이 되는 개체를 의미한다. 개체는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함하며, 구체적으로는 인간이다. 본 발명의 방법은 과립형 각막이상증의 유전적 위험성을 예측하고자 하는 것이므로, 본 발명의 개체는 과립형 각막이상증 환자일 수도 있고 아직 과립형 각막이상증으로 확진되지 않은 정상개체(healthy subject)일 수도 있다.
본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 대상체, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, 지놈 DNA를 추출할 수 있는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 생물학적 시료로부터 지놈 DNA의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 통상적인 방법, 예컨대 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform) 추출 방법에 따라 실시될 수 있다(Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p1215. 1998). 지놈 핵산의 분리 및 정제에 대한 구체적인 내용은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있다.
단계 (b): 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 프라이머 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계;
상기 단계 (a)에서 분리한 지놈 DNA를 주형으로 하고, 과립형 각막이상증의 원인인 βIG-H3 유전자 엑손 4, 코돈 124의 유전자 변이 "CGC -> CAC" 또는 “CGC -> TGC”를 포함하는 영역을 증폭하도록 디자인된 프라이머 쌍으로 실시간 중합효소연쇄반응을 행한다.
본 발명의 방법에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 구체적으로는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소를 이용할 수 있다. 이들의 예로는 Taq(Thermus aquaticus), Tth(Thermus thermophilus), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 및 Pfu(Pyrococcus furiosus)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ)초기 변성(pre-denaturation), (ⅱ)어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클 프로그램을 통해 행한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 서열목록 제6서열 내지 서열목록 제10서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브, 보다 구체적으로는 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브를 추가적으로 이용하여 수행될 수 있다. 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브는 βIG-H3 유전자 코돈 124의 "CGC -> CAC" 변이를 검출하기 위한 프로브이므로, 이를 통해 제2형 과립형 각막이상증(아벨리노 각막이상증)을 판별할 수 있다.
단계 (c): 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 βIG-H3 유전자 엑손 4의 124번 코돈의 변이 여부를 판별하는 단계.
상기 단계 (b)에서 행한 실시간 중합효소연쇄반응의 형광 방출을 분석하여 βIG-H3 유전자 엑손 4, 코돈 124의 정상형 및 변이형 여부를 판단한다. 이러한 분석 및 판단은 실시간 중합효소연쇄반응에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 상술된 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브에 의해 PCR 증폭되는 산물은 유전자형에 따라 고유의 형광값을 수치화한다. PCR 증폭된 DNA 증폭산물은 당업계의 공지된 방법, 예를 들어 실시간 DNA 증폭 장치에 의해 시각화된 결과를 관찰할 수 있다. 정상형 염기를 검출하는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 βIG-H3의 정상 유전자형을 갖는 것으로 판단하고, 변이형 염기를 검출하는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 βIG-H3의 변이 유전자형을 갖는 것으로 판단한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 과립형 각막이상증 진단용 키트 및 이를 이용하여 과립형 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 정상인과 과립형 각막이상증 환자, 보다 구체적으로는 아벨리노 각막이상증 환자의 대립 유전자형을 현저한 정확도와 낮은 비용으로 판별할 수 있는 실시간 진단 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 βIG-H3 유전자 엑손 4 부위에 대한 정상인 및 R124H 변이를 가지는 아벨리노 각막이상증 환자의 유전자 서열을 나타낸 그림이다. 124번 코돈의 G(붉은색)를 가지는 정상인에 비해 변이 βIG-H3 단백질을 코딩하는 아벨리노 각막이상증 환자는 A(파란색)을 가진다.
도 2는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 프라이머 쌍과, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브 쌍을 사용하여 R124H 유전자형 판별을 수행한 결과를 나타낸다. 도 2a는 대립유전자 판별 플롯(Allelic Discrimination Plot)을 나타내며, 붉은색 점은 정상 유전자형(G/G)을, 초록색 점은 R124H 이형접합 유전자형(G/A)을, 파란색 점은 R124H 동형접합 유전자형(A/A)을 각각 의미한다. 도 2b-2e는 음성 대조군(도 2b), VIC-GG 유전자형(도 2c), VIC,FAM-GA 유전자형(도 2d) 및 FAM-AA 유전자형(도 2e)에 대한 다중성분 플롯(Multicomponent Plot)을 각각 나타낸다. 각각 실험의 형광발현의 보정을 위해 ROX 형광을 사용했다.
도 3은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제8서열의 프로브 쌍(도 3a), 서열목록 제1서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제8서열의 프로브 쌍(도 3b), 서열목록 제2서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제8서열의 프로브 쌍(도 3c), 서열목록 제2서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브 쌍(도 3d), 서열목록 제2서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 프로브 쌍(도 3e), 서열목록 제1서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 프로브 쌍(도 3f)을 이용한 실험 결과를 각각 보여준다. 붉은색 점은 정상 유전자형(G/G)을, 초록색의 점은 R124H 이형접합 유전자형(G/A)을, 파란색 점은 R124H 동형접합 유전자형(A/A)을 각각 의미하고, X는 판독 불가능한 결과를 나타낸다.
도 4는 서열목록 제2서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 프로브 쌍을 사용하여 R124H 유전자형을 판별한 실험결과를 보여주는 그림으로, 음성 대조군(도 4a), VIC-GG 유전자형(도 4b), VIC,FAM-GA 유전자형(도 4d) 및 FAM-AA 유전자형(도 4d)에 대한 다중성분 플롯을 각각 나타낸다. 각각 실험의 형광발현의 보정을 위해 ROX 형광을 사용했다.
도 5는 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 프라이머 쌍과 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브 쌍과; 서열목록 제2서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 쌍과 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 프로브 쌍을 사용하여 R124H 유전자형 판별을 비교한 결과이다. 붉은색 점은 정상 유전자형(G/G type)을 표현하며, 초록색 점은 R124H 이형접합 유전자형(G/A type)을 나타내고, 파란색 점은 R124H 동형접합 유전자형(A/A type)을 의미한다.
도 6은 아벨리노 각막이상증 유전자형 판별을 위한 프라이머와 프로브간 모든 조합의 실험 데이터를 통합한 결과를 나타낸다(도 2 및 도 3 통합).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
실시간 PCR 용 프라이머 쌍의 제작
실시간 PCR을 통해 유전자 증폭 시 βIG-H3 유전자의 엑손 4 부위의 코돈 124번을 코딩하는 염기가 포함되도록 서열목록 제1서열 내지 제5서열의 프라이머를 Primer Express 3.0.1 소프트웨어(Applied Biosystems, U.S.A)를 사용하여 디자인하였다(표 1).
실시간 PCR 용 프라이머 서열
서열번호 서열 (5’→3’) 크기(bp)
정방향 1 GCT CCT GCA GCC CTA CCA 18
2 TCC ACC ACC ACT CAG CTG TA 20
역방향 3 CAT CTC AGG CCT CAG CTT C 19
4 CCA TCT CAG GCC TCA GCT T 19
5 CGG GCC CCT CCA TCT C 16
프로브 6 VIC - CTG TAC ACG GAC CGC A - MGB 16
7 FAM - CTG TAC ACG GAC CAC A - MGB 16
8 FAM - TAC ACG GAC CAC ACG - MGB 15
9 VIC - CAC GGA CCG CAC GGA - MGB 15
10 FAM - CAC GGA CCA CAC GGA - MGB 15
βIG-H3 유전자 엑손 4 코돈 124번 변이 판별용 프로브 디자인
βIG-H3 유전자 엑손 4 부위의 코돈 124번의 변이(R124H)를 유발하는 단일염기 변이(CGC->CAC) 검출용 프로브를 Primer Express 3.0.1 소프트웨어(Applied Biosystems, U.S.A)를 사용하여 디자인하였다. 정상 유전자를 검출하는 프로브의 5’말단에는 VIC 형광을 표지하였고, R124H 변이 유전자를 검출하는 프로브의 5’말단에는 FAM 형광을 표지하였다. 각 프로브의 3’말단에는 MGB(minor groove binder)를 부착하여 프로브의 특이도를 높였다(표 1).
시료
실시간 PCR 분석에 사용한 시료는 NCBI에 등록되어 있는 βIG-H3(TGFBI) 유전자 염기서열(NCBI Gene ID:7045) 중 βIG-H3 유전자 엑손 4 부위의 R124H 변이 유발 단일염기 변이(CGC->CAC) 및 서열목록 제1서열 내지 제5서열 모두가 포함되도록 구성된 이중가닥의 합성 DNA이다. 정상 유전자형과 R124H 유전자형 두 가지의 합성 DNA를 실시간 PCR 실험의 시료로 사용하였다. 정상 유전자 시료로 사용하는 합성 DNA는 βIG-H3 유전자 엑손 4 부위의 코돈 124번이“C G C”이고, R124H 유전자형 시료로 사용하는 합성 DNA는“C A C”로 구성되어 있다.
프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR 실험
실시간 PCR 실험에 주형 DNA(105copy/㎕)는 총 2 ㎕를 사용하였으며, 실험에 사용한 프라이머(10pmol/㎕)는 2.25 ㎕, 프로브(10pmol/㎕)는 0.5 ㎕, 2X TaqMan Genotyping Master Mix(Applied Biosystems, U.S.A) 12.5 ㎕를 첨가하고 최종 25 ㎕ 가 되도록 증류수를 추가하여 반응액을 제조하였다. 실시간 PCR 반응은 95℃ 에서 10분간 초기 변성(pre-denaturation)을 실시한 후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 반응을 1 사이클로 하여 총 40 사이클을 수행하였으며, 각 사이클마다 FAM 및 VIC 형광을 측정하였다. 모든 실시간 PCR 실험은 QuantStudio 12K (Applied Biosystems, U.S.A) 장비에서 수행하였다. 주형으로 사용한 DNA는 상술한 바와 같이 합성 DNA이며, 정상 동형접합 유전자형(G/G) 반응에는 정상 유전자형 합성 DNA를 2 ㎕, R124H 동형접합 유전자형(A/A) 반응에는 R124H 유전자형 합성 DNA 2 ㎕, R124H 이형접합 유전자형(G/A) 반응에는 정상 유전자형 합성 DNA와 R124H 유전자형 합성 DNA를 각각 1 ㎕씩 사용하였다. 매 실험에는 시료 대신 증류수를 사용하여 음성 대조군(negative control)으로 사용하였다. 반응 결과는 Applied Biosystems에서 제공하는 프로그램 내에서 대립유전자 판별 플롯(Allelic Discrimination Plot)과 다중성분 플롯(Multicomponent Plot)을 분석하여 확인하였다.
실험결과
아래 표 2와 같은 다양한 프라이머/프로브 조합을 이용하여 R124H의 변이를 가지는 아벨리노 각막이상증 유전자형의 검출을 수행하였다.
사용된 프로브 및 프라이머 조합
정방향 프라이머 역방향 프라이머 프로브 결과 도면
조합 1 제1서열 제3서열 제6서열/ 제7서열 도 2a
조합 2 제1서열 제4서열 제6서열/ 제8서열 도 3a
조합 3 제1서열 제5서열 제6서열/ 제8서열 도 3b
조합 4 제2서열 제5서열 제6서열/ 제8서열 도 3c
조합 5 제2서열 제5서열 제6서열/ 제7서열 도 3d
조합 6 제2서열 제4서열 제9서열/ 제10서열 도 3e
조합 7 제1서열 제5서열 제9서열/ 제10서열 도 3f
서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 프라이머 쌍과, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브 쌍(조합 1)을 사용하여 R124H 변이 유전자형 판별을 수행한 결과, 대립유전자 판별 플롯에서 높은 분별력을 보이고 다중성분 플롯에서 높은 형광 측정량을 보임으로써 조합 1의 프라이머/프로브 세트가 아벨리노 각막이상증 유전자형을 높은 민감도로 정확하고 효율적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 2). 각각의 실험에서의 형광발현 보정을 위해 ROX 형광을 사용했다.
반면, 서열목록 제1서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제8서열의 프로브 쌍(조합 2), 서열목록 제1서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제8서열의 프로브 쌍(조합 3), 서열목록 제2서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제8서열의 프로브 쌍(조합 4), 서열목록 제2서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브 쌍(조합 5), 서열목록 제2서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 프로브 쌍(조합 6), 서열목록 제1서열 및 서열목록 제5서열의 프라이머 쌍에 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 프로브 쌍(조합 7)을 이용하여 실험을 진행한 결과, 조합 6을 제외한 다른 조합의 결과들에서는 판독 불가 또는 잘못된 유전자형이 표시된 결과가 나타난 반면, 조합 6을 이용한 경우 아벨리노 각막이상증 유전자형이 명확하게 판별되었다.
그러나, 조합 6은 대립유전자 판별 플롯에서 유의한 분별력을 보인 반면 다중성분 플롯에서는 형광 측정량이 높지 않아, 민감도가 조합 1에 비해 낮은 것으로 나타났다(도 4). 각각 실험의 형광발현의 보정을 위해 ROX 형광을 사용했다.
조합 1과 조합 6의 변별력과 민감도를 직접적으로 비교하기 위해 두 조합을 이용한 경우의 대립유전자 판별 플롯을 비교한 결과, 조합 1의 아벨리노 각막이상증 유전자형 검출에 있어 조합 1이 보다 우수한 변별력과 민감도를 가진다(도 5).
본 발명의 모든 실험결과를 한눈에 비교하기 위해 사용된 모든 조합의 대립유전자 판별 플롯을 통합한 결과(도 6), 조합 1(빨간 원)을 이용한 경우 아벨리노 각막이상증 유전자형이 가장 변별력 있게 검출되는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AMS corporation <120> A Composition for Diagnosing Granular Corneal Dystrophy <130> HPC-8925 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 <400> 1 gctcctgcag ccctacca 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 2 <400> 2 tccaccacca ctcagctgta 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 1 <400> 3 catctcaggc ctcagcttc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 2 <400> 4 ccatctcagg cctcagctt 19 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 3 <400> 5 cgggcccctc catctc 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 1 <400> 6 ctgtacacgg accgca 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 2 <400> 7 ctgtacacgg accaca 16 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 3 <400> 8 tacacggacc acacg 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 4 <400> 9 cacggaccgc acgga 15 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 5 <400> 10 cacggaccac acgga 15 <210> 11 <211> 825 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gtttcaataa acaggtaaat ctgtaagact agtttgtaat taggatatct gtttccagtg 60 tccattcctg cctctgttat ctaaatgtct gggaacaaga gctgtgctct gctgtgttta 120 aaatgattaa aaatcaccaa ttagttgagt tcacgtagac aggcatttga cttattgagt 180 tgttttaaga agactataac aagccttaag ccccccagaa acagcctgtc tttgggcttt 240 cccacatgcc tcctcgtcct ctccacctgt agatgtaccg tgctctctgt cagagaaggg 300 agggtgtggt tgggctggac ccccagaggc catccctcct tctgtcttct gctcctgcag 360 ccctaccact ctcaaacctt tacgagaccc tgggagtcgt tggatccacc accactcagc 420 tgtacacgga ccgcacggag aagctgaggc ctgagatgga ggggcccggc agcttcacca 480 tcttcgcccc tagcaacgag gcctgggcct ccttgccagc tgtgagatga cctccgtctg 540 cccgggggac tcttatgggg aactgcctta cttccccgag gggtgggcat gatgaatggg 600 agtctgcagt catttcctac tgtttcagga agctttctcc ttaacccctt agaaaaggct 660 gtggaacttg agctaaaata tgtcttacca ggttgcgtct aatgcccccc gttccctact 720 gggcagaaag acttgggtgc ttcctgagga gggatccttg gcagaagaga ggcctgggct 780 cacgagggct gagaacatgt ttcccagagt tgcaaggacc catct 825 <210> 12 <211> 825 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gtttcaataa acaggtaaat ctgtaagact agtttgtaat taggatatct gtttccagtg 60 tccattcctg cctctgttat ctaaatgtct gggaacaaga gctgtgctct gctgtgttta 120 aaatgattaa aaatcaccaa ttagttgagt tcacgtagac aggcatttga cttattgagt 180 tgttttaaga agactataac aagccttaag ccccccagaa acagcctgtc tttgggcttt 240 cccacatgcc tcctcgtcct ctccacctgt agatgtaccg tgctctctgt cagagaaggg 300 agggtgtggt tgggctggac ccccagaggc catccctcct tctgtcttct gctcctgcag 360 ccctaccact ctcaaacctt tacgagaccc tgggagtcgt tggatccacc accactcagc 420 tgtacacgga ccacacggag aagctgaggc ctgagatgga ggggcccggc agcttcacca 480 tcttcgcccc tagcaacgag gcctgggcct ccttgccagc tgtgagatga cctccgtctg 540 cccgggggac tcttatgggg aactgcctta cttccccgag gggtgggcat gatgaatggg 600 agtctgcagt catttcctac tgtttcagga agctttctcc ttaacccctt agaaaaggct 660 gtggaacttg agctaaaata tgtcttacca ggttgcgtct aatgcccccc gttccctact 720 gggcagaaag acttgggtgc ttcctgagga gggatccttg gcagaagaga ggcctgggct 780 cacgagggct gagaacatgt ttcccagagt tgcaaggacc catct 825

Claims (12)

  1. 서열목록 제1서열, 서열목록 제3서열, 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 과립형 각막이상증 진단용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 과립형 각막이상증은 제2형 과립형 각막이상증(아벨리노 각막이상증)인 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 프로브의 말단에 형광물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 형광물질은 VIC 또는 FAM인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 다음의 단계를 포함하는 과립형 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계;
    (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 서열목록 제1서열 및 서열목록 제3서열의 프라이머 쌍과 서열목록 제6서열 및 서열목록 제7서열의 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 βIG-H3 유전자 엑손 4의 124번 코돈의 변이 여부를 판별하는 단계.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 과립형 각막이상증은 제2형 과립형 각막이상증(아벨리노 각막이상증)인 것을 특징으로 하는 방법.

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