KR101480522B1 - 아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아벨리노 각막이상증 판별에 유용한 중합효소연쇄반응용 프라이머와 프로브, 이들을 포함하는 키트 및 이들을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 아벨리노 각막이상증을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자를 정확하게 판별할 수 있다.

Description

아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트{Diagnostic Kit Useful for Allelic Discrimination of Avellino Corneal Dystrophy Genotype}

본 발명은 아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는 아벨리노 각막 이상증의 원인으로 알려진 BIGH3(또는 TGFB1) 유전자 중 엑손 4, 코돈 124번의 변이를 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응용 진단 키트에 관한 것이다.

각막 이상증의 발생 원인은 불명확하지만 일반적으로 유전적 원인이 있는 양안성 병변으로써 염증 없이 각막에 혼탁이 오는 질환이다. 아벨리노 각막이상증(Avellino corneal dystrophy)은 BIGH3 유전자 중 엑손 4, 코돈 124의 "CGC -> CAC" 변이로 인해 아르기닌(Arginine)이 히스티딘(Histidine)으로 치환되어 생기는 질환으로 과립각막 이상증으로 진단받은 환자 중 91％가 아벨리노 각막이상증인 것으로 보고된 바 있다(Kocak-Atlintas AG, Kocak-Midillioglu I, Akarsu AN, Duman S. BIGH3 gene analysis in the different diagnosis of corneal dystrophies. Cornea 2001;20:64-8., Klintworth GK. Advances in the molecular genetics of corneal dystrophies. Am J Ophthalmol 1999;128:747-54.).

아벨리노 각막이상증의 원인 가장 큰 원인은 BIGH3 유전자의 돌연변이에 의한 질환 발생이다. 아직 정확한 발생 기전이나 원인이 밝혀진 것은 아니며, 생활 자외선인 UVB에 의해서도 하이알린(Hyaline) 단백질 침착이 많이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한 쌍의 대립유전자에서 대립유전자 모두가 변이가 일어난 것을 동형접합자(homozygote)라고 하고, 대립유전자 중 하나에서만 변이가 발생한 것을 이형접합자(heterozygote)라고 한다. 아벨리노 각막이상증 동형접합자는 약 3세 부터 증상이 나타나서 6세경에는 급격하게 시력저하로 진행된다. 이형접합자의 경우 평생 동안 증상이 나타나지 않는 경우도 있지만, 증상이 발생하는 경우에는 약 12세부터 각막에 흰 점이 생기기 시작하며, 나이가 듦에 따라 흰 점의 숫자와 크기가 커져 60-70세 경에 시력이 떨어지기도 한다(Konishi M, Mashima Y, Nakamura Y, et al. Granular-lattice (Avellino) corneal dystrophy in Japanese patients. Cornea 1997;16:635-8).

현재 레이저를 사용한 시술전에는 현미경 검사를 통해 안구내 단백질의 침착 정도를 육안으로 확인하고 있으나, 병변이 진행되지 않은 환자에 대해서는 육안검사만을 통해서는 확인할 수 없어, 시술 후 각막 혼탁이 급격하게 진행되어 결국에는 실명을 하게 된다(Wan XH, Lee HC, Stulting RD, et al. Exacerbation of Avellino corneal dystrophy after laser in situ keratomileusis. Cornea 2002;21:223-6.).

따라서 레이저를 사용한 시술 전에 아벨리노 각막이상증 환자에 대해 유전적으로 정확하고, 신속한 유전자형을 판단할 수 있는 제품의 개발이 필요하다. 현재 아벨리노 검사는 염기서열 분석을 통해 변이부위를 확인하는 방법으로 행해지고 있다. 하지만 염기서열 분석법은 정확도가 높으나 고가의 장비와 시약을 필요로 하며 6시간 이상의 시간을 소요한다는 단점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 공개특허 제2010-0115030호

Kocak-Atlintas AG, Kocak-Midillioglu I, Akarsu AN, Duman S. BIGH3 gene analysis in the different diagnosis of corneal dystrophies. Cornea 2001;20:64-8. Klintworth GK. Advances in the molecular genetics of corneal dystrophies. Am J Ophthalmol 1999;128:747-54. Konishi M, Mashima Y, Nakamura Y, et al. Granular-lattice (Avellino) corneal dystrophy in Japanese patients. Cornea 1997;16:635-8. Wan XH, Lee HC, Stulting RD, et al. Exacerbation of Avellino corneal dystrophy after laser in situ keratomileusis. Cornea 2002;21:223-6.

본 발명자들은 아벨리노 각막이상증의 원인이 되는 BIGH3 유전자의 엑손 4, 코돈 124 위치의 단일염기다형성을 신속하고 정확하게 진단하기 위한 분자생물학적 진단방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들이 개발한 프라이머와 프로브를 사용한 실시간 중합효소연쇄반응법을 이용하면 정상인과 아벨리노 각막이상증 환자의 대립유전자형을 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아벨리노 각막이상증 판별에 사용되는 중합효소연쇄반응용 프라이머쌍을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 아벨리노 각막 이상증 판별용 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 아벨리노 각막 이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아벨리노 각막 이상증(Avellino corneal dystrophy) 판별에 사용되는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머쌍을 제공한다.

본 발명은 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자의 변이 부위를 포함하는 영역을 특이적으로 증폭하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머쌍을 제공한다.

본 발명에서 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자 변이는 BIGH3 유전자 중 엑손 4, 코돈 124의 "CGC -> CAC" 변이이다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 PCR에 의한 핵산 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응효소하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다. 본 발명의 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 혼성복합체 또는 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 혼성복합체 또는 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머쌍(primer pair)"은 상기 설명된 프라이머로서 주형의 5＇말단 서열에 결합하는 정방향 프라이머(forward primer)와 3＇말단 서열에 결합하는 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성되는 쌍을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.

본 명세서에서 용어 "실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)"은 중합효소연쇄반응에 기초하여 타깃 DNA 분자를 증폭과 동시에 정량하는 방법을 의미하며, 실시간 PCR 방법에 의하면 DNA 시료내에서 하나 이상의 특정 서열을 검출 및 정량을 행하는 것이 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ⅱ) 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 아벨리노 각막이상증 판별에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)용 키트를 제공한다.

본 발명에서 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응용 키트는 프라이머쌍과 프로브를 포함한다.

본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법에서 사용되는 프로브는 상기 프라이머쌍에 의해 증폭되는 염기서열 내부의 일부 서열에 상보적으로 결합한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프로브는 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자 엑손 4, 코돈 124의 정상형 "CGC" 및 변이형"CAC"에 각각 상보적으로 결합하는 1 쌍의 프로브를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)" 는 타깃이 되는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 상기 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서 타깃 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 본 발명의 프로브가 변형될 수 있다. 예를 들어, 리포터(reporter)형광물질 또는 형광억제물질(quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅(tagging)될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 실시간 PCR에 사용되는 프로브의 5'-말단에는 리포터-형광물질이 태깅(tagging)되어 있고, 3'-말단에는 형광억제물질(quencher)이 태깅되어 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 정상형 염기에 결합하는 프로브의 5'-말단에 태깅되는 리포터 형광물질과 변이형 염기에 결합하는 프로브의 5'-말단에 태깅되는 리포터 형광물질은 서로 다른 파장의 범위를 갖는 물질이다.

본 발명에서 리포터 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며 예를 들어, 리포터 형광물질은 FAM, VIC, TET, 6-JOE, HEX, TAMRA, Texas Red, Cy3, 또는 Cy5를 사용할 수 있으며, 형광억제물질은 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, DABCYL, MGB-NFQ 또는 ROX 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 프로브는 타깃 서열에 특이적으로 혼성화되지만, 3'-말단에 존재하는 형광억제물질의 작용에 의해 5'-말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 핵산증폭반응의 다음 단계인 연장 단계(extension step)에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5'말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광억제물질에 의한 형광억제가 해제됨으로써 형광을 방출한다.

본 발명의 프로브는 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상의 프로브이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브는 서열번호 9 서열을 갖는 정상형 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 변이형 프로브를 포함한다.

본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 아벨리노 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다: (a) 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계; (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ⅱ) 서열번호 3 내지 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 BIGF3 유전자 엑손 4의 코돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계.

이하에서 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 보다 상세히 설명한다.

단계 (a): 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계

본 발명의 방법에서 아벨리노 각막 이상증을 판별하고자 하는 대상자로부터 분리한 생물학적 시료에서 지놈 DNA를 추출하여 얻는다.

본 명세서에서 용어 "생물학적 시료"는 대상자로부터 분리된 시료로서 지놈 DNA를 추출할 수 있는 세포를 포함하는 시료를 의미하며, 예를 들어 혈액, 구강상피세포, 모근 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 생물학적 시료로부터 지놈 DNA의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 통상적인 방법, 예컨대 페놀-클로로포름(Phenol-Chloroform) 추출 방법에 따라 실시될 수 있다(Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p1215. 1998). 지놈 핵산의 분리 및 정제에 대한 구체적인 내용은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

단계 (b): 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ⅱ) 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계

상기 단계 (a)에서 분리한 지놈 DNA를 주형으로 하고, 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자 엑손 4, 코돈 124의 유전자 변이 "CGC -> CAC"를 포함하는 영역을 증폭하도록 디자인된 프라이머쌍과 상기 유전자 변이의 정상형(G) 및 변이형(A)를 검출할 수 있도록 디자인된 프로브를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행한다. 본 발명에서 사용되는 프라이머쌍과 프로브에 대한 내용은 상술된 내용과 동일하므로 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브를 포함한다.

본 발명의 방법에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 바람직하게는, DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 이는 Taq (Thermus aquaticus), Tth(Thermus thermophilus), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pfu(Pyrococcus furiosus)를 포함한다.

유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타깃 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성(denaturation) 과정, (ⅱ) 어닐링(annealing), 연장(elongation) 및 변성(denaturation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클 프로그램을 통해 행한다.

단계 (c): 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 BIGF3 유전자 엑손 4의 코돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계

상기 단계 (b)에서 행한 실시간 중합효소연쇄반응의 형광 방출을 분석하여 BIGH3 유전자 엑손 4, 코돈 124의 정상형 "CGC" 및 변이형"CAC" 여부를 판단한다. 이러한 분석 및 판단은 실시간 중합효소연쇄반응에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 상술된 본 발명의 프라이머쌍 및 프로브에 의해 PCR 증폭되는 산물은 유전자형에 따라 고유의 형광값을 수치화한다. PCR 증폭된 DNA 증폭산물은 당업계의 공지된 방법, 예를 들어 실시간 DNA 증폭 장치에 의해 시각화된 결과를 관찰할 수 있다. 정상형 염기(G)를 검출하는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 BIGH3의 정상 유전자형을 갖는 것으로 판단하고, 변이형 염기(A)를 검출하는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 BIGH3의 변이 유전자형을 갖는 것으로 판단한다.

본 발명은 아벨리노 각막이상증 판별에 유용한 중합효소연쇄반응용 프라이머와 프로브, 이들을 포함하는 키트 및 이들을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 아벨리노 각막이상증을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자를 정확하게 판별할 수 있다.

도 1은 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 본 발명의 프라이머쌍을 사용하여 정상인과 아벨리노 각막 이상증 이형접합자의 지놈 DNA를 증폭한 결과이다. 증폭 DNA 산물에 대해 염기서열분석을 통해 정상인과 아벨리노 각막이상증 이형접합자의 염기서열이 정확하게 증폭되었음을 확인할 수 있다.
도 2는 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 포함 영역을 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍의 염기서열과 이 프라이머쌍의 위치를 보여준다.
도 3은 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 3 및 서열번호 4의 정상 및 변형 염기 판별 프로브 위치를 보여준다.
도 4은 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6의 정상 및 변형 염기 판별 프로브 위치를 보여준다.
도 5는 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 7 및 서열번호 8의 정상 및 변형 염기 판별 프로브 위치를 보여준다.
도 6은 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 9 및 서열번호 10의 정상 및 변형 염기 판별 프로브 위치를 보여준다.
도 7은 서열번호 3 및 서열번호 4의 정상 및 변형 염기 판별 프로브를 사용한 아벨리노 각막 이상증 SNP 특이적 형광 프로브 증폭곡선을 보여준다. 서열번호 3의 정상인 유전자형 G 검출 프로브에는 VIC을 형광 표지하였으며, 서열번호 4의 아벨리노 유전자형 A 검출 프로브에는 FAM을 형광 표지하였다. 서열번호 3과 서열번호 4의 프로브를 사용한 경우에는, 정상인 유전자형(G/G 타입)에서 VIC과 FAM 형광이 비슷하게 증폭되고, 아벨리노 각막이상증 이형접합 유전자형(G/A 타입)과 아벨리노 각막이상증 동형접합 유전자형(A/A 타입)에서는 변별력이 낮아 유전자형 검출 정확도가 낮은 것을 알 수 있다.
도 8은 서열번호 5 및 서열번호 6의 정상 및 변형 염기 검출 프로브를 사용한 아벨리노 각막이상증 SNP 특이적 형광 프로브 증폭곡선을 보여준다. 서열번호 5의 정상 유전자형(G) 검출 프로브에는 VIC을 형광 표지하였으며, 서열번호 6의 아벨리노 유전자형(A) 검출 프로브에는 FAM을 형광 표지하였다. 서열번호 5과 서열번호 6의 프로브를 사용한 경우에는 정상인 유전자형(G/G 타입)에서 VIC과 FAM 형광이 비슷하게 증폭되고, 아벨리노 각막이상증 이형접합 유전자형(G/A 타입)과 아벨리노 각막이상증 동형접합 유전자형(A/A 타입)에서는 변별력이 낮아 유전자형 검출 정확도가 낮은 것을 알 수 있다.
도 9은 서열번호 7 및 서열번호 8의 정상 및 변형 염기 검출 프로브를 사용한 아벨리노 각막이상증 SNP 특이적 형광 프로브 증폭곡선을 보여준다. 서열번호 7의 정상인 유전자형(G) 검출 프로브에는 FAM을 형광 표지하였으며, 서열번호 8의 아벨리노 유전자형(A) 검출 프로브에는 VIC을 형광 표지하였다. 서열번호 7과 서열번호 8의 프로브를 사용한 경우에는 정상인 유전자형(G/G 타입)에서 VIC과 FAM 형광이 비슷하게 증폭되고, 아벨리노 각막이상증 이형접합 유전자형(G/A 타입)과 아벨리노 각막이상증 동형접합 유전자형(A/A 타입)에서는 변별력이 낮아 유전자형 검출 정확도가 낮은 것을 알 수 있다.
도 10는 서열번호 9 및 서열번호 10의 정상 및 변형 염기 검출 프로브를 사용한 아벨리노 각막이상증 SNP 특이적 형광 프로브 증폭곡선을 보여준다. 서열번호 9의 정상인 유전자형(G) 검출 프로브에는 FAM을 형광 표지하였으며, 서열번호 10의 아벨리노 유전자형(A) 검출 프로브에는 VIC을 형광 표지하였다. 정상 유전자형(G/G 타입)에서는 FMA 형광 증폭 곡선이, 아벨리노 각막이상증 동형접합 유전자형(A/A 타입)에서는 VIC 형광 증폭 곡선, 아벨리노 각막이상증 이형접합 유전자형(G/A 타입)에는 FAM 및 VIC 형광 증폭 곡선이 나타남을 확인할 수 있어, 각 유전자형에 대한 검출 정확도가 매우 높은 것을 알 수 있다.
도 11은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍과, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프로브쌍(패널 A), 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브쌍(패널 B), 서열번호 7 및 서열번호 8의 프로브쌍(패널 C), 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍(패널 D)을 사용하여 아벨리노 유전자형 판별(Avellino corneal dystrophy allelic discrimination)을 비교 수행한 결과를 보여준다. 붉은색 점은 정상인의 유전자 형(G/G 타입)을 표현하며, 초록색 점은 아벨리노 이형접합자의 유전자형(G/A 타입)을 나타내고, 파란색 점은 아벨리노 동형접합자(A/A 타입)의 유전자형을 의미한다. 유전형 분석 그림에서는 분석이 가능한 것으로 확인되나 증폭곡선 분석에서는 정확한 확인이 어렵다.
도 12은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍과 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 아벨리노 각막이상증 유전자형 판별(Avellino corneal dystrophy allelic discrimination)과 증폭곡선(amplification plot) 분석을 수행한 결과이다. 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍은 증폭곡선에서도 다른 프로브 보다 변별력이 우수함을 알 수 있었다.
도 13a는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 피험자 검체 80명을 대상으로 실시간 PCR을 진행한 후, ABI 실시간 증폭장치 프로그램(7500 Software V2.0.5, ABI, USA)을 사용하여 실험 결과를 분석한 결과이다.
도 13b는 도 13a의 결과에서 이형접합자(G/A type)로 판명된 피험자 3명을 대상으로 염기서열분석을 수행하였으며, 그 결과 BIGH3 유전자중 엑손 4, 코돈 124번 위치에 G/A SNP가 있는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 시료

실시간 PCR 분석에 사용한 시료는 정상인 77명과 아벨리노 각막이상증 확진자 3명 총 80명의 검체를 사용하였다. 재현성 테스트에는 100명의 검체를 사용하였다. 지놈 DNA 추출을 위해 피험자로부터 구강상피세포를 채취하여 시료로 사용하였다.

2. DNA 추출 및 농도 측정

시료로부터 지놈 DNA의 추출 및 정제는 Miller 등의 방법(Miller EU SS, Dykes ADD, Peoples HF. Nucleonic Acids Res. 16, p1215.(1998))을 일부 보완하여 실시하였다. 추출 및 정제한 지놈 DNA의 정량 분석은 Spectrophotometer ND-1000 (Nanodrop, USA)을 이용하여 260 - 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다. 멸균 증류수를 이용하여 모두 5 ng/㎕로 보정한 후 실험 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

3. 실시간 PCR 증폭용 프라이머쌍의 제작

NCBI에 등록된 아벨리노 각막이상증 관련 BIGH3 유전자의 지놈 염기서열을 토대로 엑손 4 코돈 124번의 SNP가 포함되어 증폭되도록 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PCR 프라이머쌍을 디자인하여 제작하였다(표 1 참조).

4. BIGF3 유전자 엑손 4 코돈 124번 SNP 판별용 프로브의 디자인

BIGF3 유전자 엑손 4 코돈 124번 변이형(CGC -> CAC)을 정상형과 구별할 수 있는 프로브를 제작하였다. 정상형 유전자를 검출하는 프로브에는 FAM을 표지하였고, 아벨리노 각막이상증 변이형 프로브에는 VIC을 표지하였으며, 프로브의 3′-말단에는 MGB를 켄칭(quenching)하였다. 상기와 같은 프로브를 사용하는 경우 정상인에게는 FAM 형광값만 나타나고, 아벨리노 각막이상증 변형 유전자를 동형접합으로 갖는 경우에는 VIC 형광값만 나타나게 되며, 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자에게서는 FAM과 VIC 형광값이 함께 나타나도록 설계하였다(표 1 참조).

5. 프라이머 및 프로브를 사용한 실시간 PCR 증폭을 위한 반응

실시간 증폭 PCR 반응은 주형 DNA (1 ng/㎕) 5 ㎕, 프라이머 및 프로브 믹스 5 ㎕, 2X Multiplex PCR Smart mix (With UDG) (SolGent, Korea) 10 ㎕를 첨가하여 최종 20 ㎕의 반응액을 제조하여 사용하였다. 실시간 PCR 반응은 실시간 염기서열 증폭장치 7500(ABI, USA)을 사용하였고, 50℃에서 3분간 반응시켜 PCR 산물의 오염을 제거하고, 60℃에서 1분간 형광값 pre-read 단계를 수행한 후, PCR 실험을 수행하였다. 증폭 반응은 95℃에서 15분간 전-변성(pre-denaturation)을 실시한 후 95℃에서 30 초간 변성, 60℃에서 1분간 어닐링(annealing)과 연장(extention)을 40 사이클 수행한 후 마지막으로 60℃에서 1분간 post-read 단계를 행하였다. 주형(template)은 상술한 바와 같이 피험자 구강상피세포에서 추출한 지놈 DNA를 사용하였으며, 음성대조군(negative control)은 증류수를 사용하여 교차오염을 확인하였다. 대립유전자 판별 플롯(Allelic discrimination plot)과 PCR 증폭 플롯(PCR amplification plot)은 ABI 프로그램을 사용하여 확인하였다. 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자의 양상을 보이는 검체는 염기서열 분석법을 사용하여 최종 확인하였다.

Size (bp)	이름	염기서열	Conc. (pmole/rxn)
113	ACD Forward	5' CCC TGG GAG TCG TTG GAT C 3' (서열번호 1)	10
	ACD Reverse	5' CTC GTT GCT AGG GGC GAA G 3' (서열번호 2)
	ACD G Probe	5' VIC TAC ACG GAC CgC ACG G MGBNFQ 3' (서열번호 3)	3
	ACD A Probe	5' FAM TAC ACG GAC CaC ACG MGBNFQ 3' (서열번호 4)
	ACD G Probe	5' VIC TAC ACG GAC CgC ACG MGBNFQ 3' (서열번호 5)	3
	ACD A Probe	5' FAM TGT ACA CGG aCA C MGBNFQ 3' (서열번호 6)
	ACD G Probe	5' FAM CGG ACC gCA CGG A MGBNFQ 3' (서열번호 7)	3
	ACD A Probe	5' VIC CGG ACC aCA CGG A MGBNFQ 3' (서열번호 8)
	ACD G Probe	5' FAM TCC GTG cGG TCC G MGBNFQ 3' (서열번호 9)	3
	ACD A Probe	5' VIC TCC GTG tGG TCC GT MGBNFQ 3' (서열번호 10)

실험결과

1. 제작한 프라이머쌍을 이용한 PCR 증폭

NCBI에 등록된 아벨리노 각막이상증 관련 BIGH3 유전자의 지놈 염기서열을 토대로 엑손 4 코돈 124번의 SNP 부위가 포함되어 증폭되도록 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 PCR 프라이머쌍을 사용하여 지놈 DNA 증폭을 실시하였다. 증폭된 DNA의 염기서열 분석을 통해 정상인과 아벨리노 각막이상증 이형접합자의 유전자 부위가 정확하게 증폭되었음을 확인하였다(도 1).

2. 아벨리노 각막이상증 대립유전자형의 분석용 프로브 선별

BIGF3 유전자 엑손 4 코돈 124번 변이형(CGC -> CAC)을 정상형과 구별할 수 있도록 제작한 프로브 중에서 결합력이 우수한 프로브를 선별하는 실험을 행하였다. 실험에 사용한 프라이머 및 프로브는 상기 표 1에 나타내었다. 상기 표 1에서 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브는 결합 특이도를 향상시키기 위해 역방향으로 제작하였으며, SNP 염기는 소문자로 표기하였다. 프라이머와 프로브간의 결합력을 고려하여 프라이머와 프로브를 동일한 농도를 사용하지 않았다. 실험 결과, 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용한 실시간 PCR 증폭에서 대립유전자 판별곡선(Allelic discrimination plot)과 PCR 증폭곡선(PCR amplification plot)의 대립유전자 변별력이 가장 우수한 것으로 확인되었다(도 7 내지 도 10 결과 참조).

도 10에서 보여지는 바와 같이, 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용한 경우, 다른 서열을 갖는 프로브쌍들에 비해, 아벨리노 각막이상증 이형접합자 보인자 유전자형인 G/A에서 FAM과 VIC 형광값이 동일하게 나와 변별력이 우수한 것이 확인되었다.

도 11에는 표 1의 서열번호 3 내지 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 실시간 PCR을 진행한 후, ABI 실시간 증폭장치 프로그램(7500 Software V2.0.5, ABI, USA)을 사용하여 실험 결과를 분석한 결과를 나태었다. 도 11에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 사용하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프로브쌍(패널 A), 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브쌍(패널 B), 서열번호 7 및 서열번호 8의 프로브쌍(패널 C), 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍(패널 D)을 사용하여 아벨리노 유전자형 판별(Avellino corneal dystrophy allelic discrimination)을 비교 수행한 결과이다. 도 11의 결과에서 붉은색 점은 정상인의 유전자 형(G/G 타입)을 표현하며, 초록색 점은 아벨리노 이형접합자의 유전자형(G/A 타입)을 나타내고, 파란색 점은 아벨리노 동형접합자(A/A 타입)의 유전자형을 의미한다. 도 11의 ABI 실시간 증폭장치 프로그램을 사용한 유전형 분석 결과에서는, 서열번호 3 내지 서열번호 8의 프로브도 아벨리노 각막이상증 대립유전자형의 분석이 가능한 것으로 확인되나, 상기 도 7 내지 도 10의 증폭곡선을 사용한 분석에서는 상기 서열번호 3 내지 서열번호 8의 프로브들은 정확한 대립유전자 판별이 어렵다는 것을 알 수 있었다.

3. 실시간 PCR 증폭에 의한 아벨리노 각막이상증 대립유전자 판별 테스트

도 12의 결과는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 아벨리노 각막이상증 대립유전자 판별곡선(Avellino corneal dystrophy allelic discrimination plot)과 증폭곡선(amplification plot)분석을 수행한 결과이다. 이 결과에서 본 발명의 프라이머쌍 및 프로브쌍이 대립유전자 판별곡선의 변별력과 증폭곡선의 변별력도 모두 우수한 것을 확인할 수 있었다. HRM (High resolution melting curve) 기반의 유전자형 분석 장비는 MBG 프로브 기반의 유전자형 분석이 불가능하다. 따라서, 증폭곡선에서의 변별력도 매우 중요하다. 본 발명의 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍은 증폭곡선에서도 다른 프로브 보다 변별력이 우수함을 확인하였다.

도 13a의 결과는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 피험자 검체 80명을 대상으로 실시간 PCR을 진행한 후, ABI 실시간 증폭장치 프로그램(7500 Software V2.0.5, ABI, USA)을 사용하여 실험 결과를 분석한 결과이다. 도 13b의 결과는 상기 도 13a의 결과에서 현미경 검사를 통해 이형접합자(G/A 타입)으로 확인된 검체 3개를 대상으로 염기서열을 분석한 결과이다. 이 결과를 통해 대립유전자 판별이 100％ 정확도를 나타내는 것을 확인하였고, 염기서열 분석 결과를 통해서도 코돈 124번째 위치에 SNP가 존재하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Solgent Co., Ltd. <120> Diagnostic Kit Useful for Allelic Discrimination of Avellino Corneal Dystrophy Genotype <130> PN130073 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ccctgggagt cgttggatc 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ctcgttgcta ggggcgaag 19 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 3 tacacggacc gcacgg 16 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 4 tacacggacc acacg 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 5 tacacggacc gcacg 15 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 6 tgtacacgga cac 13 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 7 cggaccgcac gga 13 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 8 cggaccacac gga 13 <210> 9 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 9 tccgtgcggt ccg 13 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> real time PCR probe <400> 10 tccgtgtggt ccgt 14

Claims (6)

1. 삭제
2. (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ⅱ) 서열번호 9의 염기서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)용 키트.
   
3. 삭제
4. 제 2 항에 있어서, 상기 프로브의 말단에 형광물질 또는 형광억제물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
   
5. 다음의 단계를 포함하는 아벨리노 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법:
   (a) 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계;
   (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ⅱ) 서열번호 9의 염기서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 염기서열을 갖는 프로브를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및
   (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 BIGF3 유전자 엑손 4의 코돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계.
   
6. 삭제

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