WO2014126398A1 - 아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트 - Google Patents

아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트 Download PDF

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WO2014126398A1
WO2014126398A1 PCT/KR2014/001185 KR2014001185W WO2014126398A1 WO 2014126398 A1 WO2014126398 A1 WO 2014126398A1 KR 2014001185 W KR2014001185 W KR 2014001185W WO 2014126398 A1 WO2014126398 A1 WO 2014126398A1
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seq
probe
corneal dystrophy
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real
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PCT/KR2014/001185
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명현군
한상은
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솔젠트(주)
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic kit for determining avelino corneal dystrophy. More specifically, the present invention relates to a diagnostic kit for real-time polymerase chain reaction including a primer and a probe capable of diagnosing axon 4 and codon 124 in a BIGH3 (or TGFB1) gene known to cause avelino corneal dystrophy.
  • a diagnostic kit for real-time polymerase chain reaction including a primer and a probe capable of diagnosing axon 4 and codon 124 in a BIGH3 (or TGFB1) gene known to cause avelino corneal dystrophy.
  • Avellino corneal dystrophy is a disease caused by the substitution of arginine with histidine for the "CGC-> CAC" mutation of BIGH3 gene exon 4 and codon 124. 91% of cases have been reported to be avelino corneal dystrophy (Kocak-Atlintas AG, Kocak-Midi 11 ioglu I, Akarsu AN, Duman S. BIGH3 gene analysis in the different diagnosis of corneal dystrophies. Cornea 2001; 20: 64 8., Kl intworth GK. Advances in the molecular genetics of corneal dystrophies. Am J Ophthalmol 1999; 128: 74 h 54.).
  • an object of the present invention is to provide a primer pair for polymerase chain reaction used for the determination of avelino corneal dystrophy.
  • Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for determining avelino corneal dystrophy.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for determining avelino corneal dystrophy.
  • Another object of the present invention to provide a method for diagnosing avelino corneal dystrophy.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of a polymerase chain reaction primer pair used for the determination of avelino corneal dystrophy.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the kit for real-time polymerase chain reaction used to determine avelino corneal dystrophy.
  • the present invention has a sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 used for the determination of Avellino corneal dystrophy-primer pair for polymerase chain reaction (PCR) To provide.
  • the present invention provides a primer pair for a polymerase chain reaction (PCR) that specifically amplifies a region including a mutation site of the BIGH3 gene known to cause avelino corneal dystrophy.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the BIGH3 gene mutation known as the cause of avelino corneal dystrophy is the "CGC-> CAC” mutation of exon 4 and codon 124 in the BIGH3 gene.
  • primer is complementary to the 5 'end sequence or 3' end sequence of the target nucleic acid site which is amplified at the time of nucleic acid amplification by PCR, respectively, and is suitable in suitable buffers at suitable temperatures, i.e. , 4 other nucleoside triphosphates and A single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for a polymerase reaction of a template-directed nucleic acid under a polymerization reaction enzyme.
  • suitable lengths of primers are typically 15-30 nucleotides, although varying depending on various factors, such as temperature and the use of the primer. Short primer molecules generally require lower temperatures to form a highly stable hybridization complex with the template.
  • primers need not be exactly complementary to the sequence of the template but must be complementary enough to form a hybrid-complex with the template.
  • Primers of the present invention are either localized or annealed to one site of the template to form a complex complex or double chain structure. Conditions for nucleic acid localization suitable for forming such complex complexes or double chain structures are described by Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, etc. , Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
  • primer pair 1 is composed of a forward primer that binds to the 5 'terminal sequence of the template and a reverse primer that binds to the 3' terminal sequence as the primers described above. Means a pair.
  • the primer pair of the invention consists of forward and reverse primers having the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the term "real-time PCR” means a method of simultaneously amplifying and quantifying a target DNA molecule based on a polymerase chain reaction. It is possible to detect and quantify a specific sequence
  • the present invention relates to a primer pair having a sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and ( ⁇ ) SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 10
  • a kit for real-time PCR for real-time PCR which is used to determine avelino corneal dystrophy comprising one or more of probes having a sequence selected from the group consisting of:
  • the polymerase chain reaction kit includes a primer pair and a probe.
  • the probe used in the real-time polymerase chain reaction method of the present invention binds to some sequence inside the nucleotide sequence amplified by the primer pair.
  • the probe comprises a pair of probes that complementarily bind to the normal "CGC” and variant “CAC” of BIGH3 gene exon 4, codon 124, which are known to cause avelino corneal dystrophy, respectively. Include.
  • the term “probe” refers to a linear oligomer having a naturally occurring or modified monomer or bond, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides that can be localized to the specific nucleotide sequence to which the target is.
  • the probe is single stranded for maximum efficiency in localization.
  • the probe is preferably deoxyribonucleotide.
  • a sequence that is completely complementary to a sequence including a target nucleotide may be used, but a sequence that is substantially complementary within a range that does not prevent specific localization may be used.
  • the probe of the present invention may be modified within the range that the advantages of the probe of the present invention, ie, the specificity of the localization, are not impaired.
  • a reporter phosphor or quencher may be tagged at the end of the probe oligonucleotide.
  • a reporter-fluorescent material is tagged at the 5'-end of the probe used for the real-time PCR of the present invention, and a fluorescent inhibitor is tagged at the 3'-end.
  • the reporter phosphor tagged at the 5′-end of the probe binding to the normal base and the reporter phosphor tagged at the 5 1 —end of the probe binding to the variant base have different wavelengths. It is a substance having a range of.
  • the reporter fluorescent material and the fluorescent inhibitor are not limited to specific materials.
  • the reporter fluorescent material may use FAM, VIC, TET, 6-JOE, HEX, TAMRA, Texas Red, Cy3, or Cy5.
  • Fluorescence inhibitors BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, DABCYL, MGB-NFQ or ROX can be used.
  • the 5'-terminal reporter fluorescent substance does not emit fluorescence by the action of the fluorescent inhibitor present at the 3'-end.
  • the probe localized to the template is decomposed and the fluorescent substance at the 5 1 terminal is decomposed. It is separated from the probe to release the fluorescence by fluorescence suppression by the fluorescence inhibitor.
  • the probe of the present invention is at least one probe having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 10.
  • the probe of the present invention includes a normal probe having a sequence of SEQ ID NO: 9 and a variant probe having a sequence of SEQ ID NO: 10.
  • Kits of the invention may optionally include reagents necessary for PCR amplification, such as complete fluid, DNA polymerase, DNA polymerase cofactor and dNTPs. Kits of the invention can be prepared in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.
  • the present invention provides a method for providing information necessary for determining avelino corneal dystrophy, comprising the steps of: (a) obtaining genome DNA from a biological sample isolated from a subject; (b) a primer pair having the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 using the genome DNA as a template; And (ii) real time polymerase chain reaction using at least one of a probe having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 10; And (c) determining a mutation or normal genotype of ⁇ don 124 of BIGF3 gene axon 4 from the product of the real-time polymerase chain reaction.
  • genome DNA is extracted from a biological sample isolated from a subject to determine avelino corneal dystrophy.
  • biological sample refers to a sample including cells from which genome DNA can be extracted as a sample separated from a subject, and includes, for example, blood, oral epithelial cells, hair roots, and the like. Isolation and purification of genome DNA from the biological sample can be carried out according to conventional methods known in the art, such as phenol-Chloroform extraction method (Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF., Nucleotic Acids Res. 16, p. 1215, 1998). For specific details on the isolation and purification of genome nucleic acids, see Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), which is incorporated herein by reference.
  • the probe comprises a probe having a sequence of SEQ ID NO: 9 and a probe having a sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the DNA polymerase is a thermostable DNA polymerase obtained from various bacterial species. It includes Taq (Thermus aquaticus), Tth (Thermus thermophi lus) ,; Thermus fi 1 iformis, Thermi s " f lavus, Thermococcus literalis, and Pfu (Pyrococcus furiosus).
  • components necessary for the amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially limited to the concentration of the components.
  • Joiners such as Mg2 +, dATP, dCTP, dGTP and dTTP are required to be provided to the reaction mixture such that the desired degree of amplification can be achieved.
  • All enzymes used for amplification reactions can be active under the same reaction conditions. In fact, the supernatant ensures that all enzymes are close to the optimum reaction conditions.
  • the amplification process of the present invention can be carried out in a single reaction product without changing conditions such as addition of the reaction product.
  • Annealing or shaking in the present invention is carried out under stringent conditions that allow specific binding between the nucleotide sequence and the primer sequence of the target template DNA.
  • Stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary with ambient environmental variables.
  • the amplification reaction by the polymerase may be performed several cycles of several cycles consisting of a typical (i) initial denaturation process, (ii) annealing, elongat ion and denaturation. Repeated cycles and (iii) the final heat treatment process or thermal cycle program with appropriate modifications to these processes.
  • Fluorescence emission of the real-time polymerase chain reaction performed in step (b) is analyzed to determine whether BIGH3 gene axon 4 and codon 124 are normal "CGC” and variant "CAC". Such analysis and determination can be easily performed using software for analyzing fluorescence generated in real-time polymerase chain reaction.
  • the product PCR amplified by the primer pairs and probes of the present invention described above quantifies the intrinsic fluorescence value according to genotype. PCR amplified DNA amplification products can observe the results visualized by methods known in the art, such as real time DNA amplification apparatus.
  • Fluorescence generated from a probe that detects a normal base (G) is detected as having a normal genotype of BIGH3 It is determined that the mutant genotype of BIGH3 is detected when fluorescence generated from the probe for detecting the mutant base (A) is detected.
  • the present invention provides a method for diagnosing americ corneal dystrophy, comprising the steps of: (a) obtaining genome DNA from a biological sample isolated from a subject; (b) a primer pair having the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 using the genome DNA as a template; And (ii) real-time polymerase chain reaction using at least one of a probe having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 10; And (c) determining a mutation or normal genotype of codon 124 of BIGF3 gene axon 4 from the product of the real-time polymerase chain reaction.
  • the probe of step (b) provides a method characterized in that the probe having a sequence of SEQ ID NO: 9 and the probe having a sequence of SEQ ID NO: 10.
  • a primer pair for a polymerase chain reaction (PCR) having a sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 used to determine avelino corneal dystrophy.
  • the invention is (i) a pair of primers having a sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; And (ii) a kit for real-time PCR for the determination of avelino corneal dystrophy comprising at least one probe having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 10 to provide.
  • the present invention provides a use, characterized in that the probe having a sequence of SEQ ID NO: 9 and the probe having a sequence of SEQ ID NO: 10. ,
  • the present invention is characterized in that a fluorescent material or a fluorescent inhibitor is coupled to the end of the probe Serves the purpose.
  • the present invention relates to polymerase chain reaction primers and probes useful for the determination of avelino corneal dystrophy, kits comprising them and a method for determining avelino corneal dystrophy through real-time polymerase chain reaction. According to the present invention, it is possible to accurately determine the heterozygous heterozygote of Avelino corneal dystrophy in a very simple and economical way. [Brief Description of Drawings]
  • 1 shows the genome DNA of normal and avelino corneal dystrophy heterozygotes using primer pairs of the present invention having the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 ; It is a heavy result.
  • the sequencing of the amplified DNA product confirms that the nucleotide sequence of the heterozygous heterozygote and avelino corneal dystrophy is correctly amplified.
  • Figure 3 shows the SNP (CGC-> CAC) position of exon 4 codon 124 of the BIGH3 gene and the normal and modified base discrimination probe position of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 for determining this.
  • Figure 4 shows the SNP (CGC-> CAC) position of axon 4 codon 124 of the BIGH3 gene and the normal and modified base discrimination probe position of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for determining this.
  • Figure 5 shows the SNP (CGC-> CAC) position of exon 4 codon 124 of the BIGH3 gene and the normal and modified base determination probe position of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 for determining this.
  • Figure 6 shows the SNP (CGC one> CAC) position of axon 4 codon 124 of the BIGH3 gene and the normal and modified base discrimination probe position of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 to determine it.
  • Genotype G detection probes of SEQ ID NO: 3 were fluorescently labeled with VIC, and FAM was fluorescently labeled with the avelino genotype A detection probe of SEQ ID NO: 4.
  • VIC and FAM fluorescence were similarly amplified in normal genotype (G / G type), and avelino corneal dystrophy heterozygotic genotype (G / A type) and avelino cornea.
  • Aberrant homozygous genotypes (A / A types) have low discrimination ability, indicating low genotype detection accuracy.
  • FIG. 8 shows Abelino corneal dystrophy SNP specific fluorescent probe amplification curves using normal and modified base detection probes of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • the normal genotype (G) detection probe of SEQ ID NO: 5 was fluorescently labeled with VIC
  • the Abelino genotype (A) detection probe of SEQ ID NO: 6 was fluorescently labeled.
  • VIC and FAM fluorescence were similarly amplified in normal genotype (G / G type), and avelino corneal dystrophy heterozygote genotype (G / A type) and avelino cornea.
  • a / A type the discrimination ability is low and genotype detection accuracy is low.
  • FIG. 9 shows avelino corneal dystrophy SNP specific fluorescent probe amplification curves using the normal and modified base detection probes of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • the genotype (G) detection probe of SEQ ID NO: 7 was fluorescently labeled with FAM
  • the avelino genotype (A) detection probe of SEQ ID NO: 8 was fluorescently labeled with VIC.
  • VIC and FAM fluorescence were similarly amplified in the normal genotype (G / G type), and avelino keratinosis heterozygotic genotype (G / A type) and avelino corneal dystrophy In homozygous genotypes (A / A type), the discrimination ability is low and genotype detection accuracy is low.
  • FIG. 10 shows Avelino corneal dystrophy SNP, specific fluorescent probe amplification curves using normal and modified base detection probes of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • FIG. The genotype (G) detection probe of SEQ ID NO: 9 was fluorescently labeled with FAM, and the avelino genotype (A) detection probe of SEQ ID NO: 10 was fluorescently labeled with VIC.
  • the FMA fluorescence amplification curve In normal genotype (G / G type), the FMA fluorescence amplification curve In the Bellino corneal dystrophy homozygous genotype (A / A type), the VIC fluorescence amplification curve showed the FAM and VIC fluorescence amplification curves in the avelino corneal dystrophy heterozygote genotype (G / A type). It can be seen that the detection accuracy is very high.
  • FIG. 11 shows primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, probe pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 (Panel A), probe pairs of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (Panel B), SEQ ID NO: Avel 1 ino corneal dystrophy allelic discr iminat ion was compared using a probe pair of SEQ ID NO: 8 (Panel C) or a probe pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (Panel D). Shows.
  • the red dot represents the genotype (G / G type) of the normal person
  • the green dot represents the genotype (G / A type) of the avelino heterozygote
  • the blue dot represents the avelino homozygote (A / A type) Means genotype.
  • Genotyping Figures show that analysis is possible, but amplification curve analysis is difficult to determine.
  • FIG. 12 shows Abel 1 ino corneal dystrophy allelic discrimination ⁇ -amplification plot using primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and probe pairs of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 ) Is the result of analysis. Probe pairs of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 was found to be superior to other probes in the amplification curve.
  • FIG. 13a illustrates real-time PCR of 80 test subjects using a probe pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 to a primer pair of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and then ABI real time amplification apparatus program (7500 Software V2.0.5, ABI, USA) to analyze the experimental results.
  • FIG. 13B is a subject identified as a heterozygote (G / A. Type) in the results of FIG. 13A .
  • the samples used for the real-time PCR analysis were used in 80 samples of 77 normal subjects and 3 confirmed avelino corneal dystrophy. 100 samples were used for the reproducibility test. Oral epithelial cells were collected from the subject and used as samples for genome DNA extraction.
  • the extraction and purification of the genome DNA from the sample was performed by partially supplementing Miller et al. (Miller EU SS, Dykes ADD, Peoples HF. Nucleonic Acids Res. 16, pl215. (1998)).
  • the absorbance was measured at 260 ⁇ 280 nm using a Spectrophotometer ND-1000 (Nanodrop, USA) to confirm the DNA concentration and purity. All were calibrated to 5 ng / z ⁇ using sterile distilled water and then stored at -20 ° C until experimental use.
  • PCR primer pairs represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were designed and prepared to include amplification of the SNP of axon 4 codon 124 ( See Table 1).
  • Real-time Amplification PCR Reactions are based on template DNA (1 ng / ⁇ ) 5 ⁇ , primer and probe mix 5 Hi, 2X Multiplex PCR Smart mix (With UDG) (Sol Gent, Korea 10 ⁇ was added to prepare a final 20 reaction solution.
  • Real-time PCR reaction was performed using a real-time sequence amplification apparatus 7500 (ABI, USA), and the reaction of PCR product was removed at 50 ° C for 3 minutes, and the fluorescence value pre-read step was performed at 60 ° C for 1 minute.
  • Amplification reaction was performed by pre-denaturation at 95 ° C for 15 minutes, then denatured at 95 ° C for 30 seconds, and annealed and extended at 60 ° C for 1 minute. After 40 cycles of ion), a post-read step was performed at 60 ° C for 1 minute.
  • genome DNA extracted from oral epithelial cells of a subject was used as described above, and a negative control group was identified using cross-contamination using distilled water. Allelic discrimination plots and PCR amplification plots were identified using the ABI program. Samples showing the appearance of avelino corneal dystrophy heterozygous carriers were finally identified using sequencing.
  • Genome DNA amplification was performed using PCR primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, which were constructed to include the SNP site of axon 4 codon 124 based on the genome sequence of the BIGH3 gene related to avelino corneal dystrophy registered in NCBI. It was. The sequencing of the amplified DNA confirmed that the gene region of the heterozygous heterozygote and avelino corneal dystrophy was correctly amplified (FIG. 1).
  • FIG. 11 is a real-time PCR using a probe pair of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 10 in Table 1, and analyzed the experimental results using the ABI real-time amplification program (7500 Software V2.0.5, ABI, USA) The results were slow.
  • the probe pair of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 (Panel A), the probe pair of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (Panel B), SEQ ID NO: 7 And Avellino corneal dystrophy allelic discrimination comparison using the probe pair of SEQ ID NO: 8 (Panel C) or the probe pair of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 (Panel D).
  • the red dot represents the genotype (G / G type) of the normal person
  • the hyperdot represents the genotype (G / A type) of the avelino heterozygote
  • the blue dot represents the avalino homozygote (A / Genotype A)
  • genotype analysis results using the ABI real-time amplification program of Figure 11 it is confirmed that the probe of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8 is also possible to analyze the avelino corneal dystrophy allele.
  • the probes of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8 were difficult to accurately identify alleles.
  • 13A shows the sequence numbers of the primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 13B is a result of analyzing the nucleotide sequence of three specimens identified as heterozygotes (G / A type) through microscopic examination in the result of FIG. 13A. This result confirmed that allele discrimination showed 100% accuracy, and the sequencing analysis also showed that SNP was present at the 124th codon: ' .

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Abstract

본 발명은 아벨리노 각막이상증 판별에 유용한 중합효소연쇄반응용 프라이머와 프로브, 이들을 포함하는 키트 및 이들을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 아벨리노 각막이상증을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자를 정확하게 판별할 수 있다.

Description

014001185
1
【명세서】
[발명의 명칭】
아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트 【기술 분야】
본 발명은 아벨리노 각막 이상증 판별용 진단 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는 아벨리노 각막 이상증의 원인으로 알려진 BIGH3(또는 TGFB1) 유전자 중 액손 4, 코돈 124 번꾀 ¾이를 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반웅용 진단 키트에 관한 것이다.
【배경 기술】
각막 이상증의 발생 원인은 불명확하지만 일반적으로 유전적 원인이 있는 양안성 병변으로써 염증 없이 각막에 흔탁이 오는 질환이다. 아벨리노 각막이상증 (Avellino corneal dystrophy)은 BIGH3 유전자 증 엑손 4, 코돈 124의 "CGC -> CAC" 변이로 인해 아르기닌 (Arginine)이 히스티딘 (Histidine)으로 치환되어 생기는 질환으로 과립각막 이상증으로 진단받은 환자 중 91%가 아벨리노 각막이상증인 것으로 보고된 바 있다 (Kocak-Atlintas AG, Kocak-Midi 11 ioglu I， Akarsu AN, Duman S. BIGH3 gene analysis in the different diagnosis of corneal dystrophies. Cornea 2001 ;20 :64ᅳ 8. , Kl intworth GK. Advances in the molecular genetics of corneal dystrophies. Am J Ophthalmol 1999; 128 :74그 54. ) .
아벨리노 각막이상증의 원인 가장 큰 원인은 BIGH3 유전자의 돌연변이에 의한 질환 발생이다. 아직 정확한 발생 기전이나 원인이 밝혀진 것은 아니며， 생활 자외선인 UVB에 의해서도 하이알린 (Hyaline) 단백질 침착이 많이 발생하는 것으로 알려져 있다.
한 쌍의 대립유전자에서 대립유전자 모두가 변이가 일어난 것을 동형접합자 (homozygote)라고 하고， 대립유전자 중 하나에서만 변이가 발생한 것을 이형접합자 (heterozygote)라고 한다. 아벨리노 각막이상증 동형접합자는 약 3세 부터 증상이 나타나서 6세경에는 급격하게 시력저하로 진행된다. 이형접합자의 경우 평생 동안 증상이 나타나지 않는 경우도 있지만， 증상이 발생하는 경우에는 약 12세부터 각막에 흰 점이 생기기 시작하며, 나이가 듦에 따라 흰 점의 숫자와 크기가 커져 60-70세 경에 시력이 떨어지기도 한다 (Konishi M, Mash i ma Y, Nakatnura Y, et al . Granularᅳ latt ice (Avel 1 ino) corneal dystrophy in Japanese patients. Cornea 1997； 16:635-8) .
현재 레이저를 사용한 시술전에는 현미경 검사를 통해 안구내 단백질의 침착 정도를 육안으로 확인하고 있으나， 병변이 진행되지 않은 환자에 대해서는 육안검사만을 통해서는 확인할 수 없어， 시술 후 각막 흔탁이 급격하게 진행되어 결국에는 실명을 하게 된다 (Wan XH, Lee HC, Stult ing RD, et al. Exacerbation of Avel 1 ino corneal dystrophy after laser in situ keratomileusis. Cornea 2002;21:223-6. ) .
따라서 레이저를 사용한 시술 전에 아벨리노 각막이상증 환자에 대해 유전적으로 정확하고， 신속한 유전자형을 판단할 수 있는 제품의 개발이 필요하다. 현재 아벨리노 검사는 염기서열 분석을 통해 변이부위를 확인하는 방법으로 행해지고 있다. 하지만 염기서열 분석법은 정확도가 높으나 고가의 장비와 시약을 필요로 하며 6시간 이상의 시간을 소요한다는 단점이 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 아벨리노 각막이상증의 원인이 되는 BIGH3 유전자의 액손 4, 코돈 124 위치의 단일염기다형성을 신속하고 정확하게 진단하기 위한 분자생물학적 진단방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들이 개발한 프라이머와 프로브를 사용한 실시간 중합효소연쇄반웅법을 이용하면 정상인과 아벨리노 각막'이상증 환자의 대립유전자형을 정확하게 판별할 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다. ^ 따라서, 본 발명의 목적은 아벨리노 각막이상증 판별에 사용되는 중합효소연쇄반웅용 프라이머쌍을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 아벨리노 각막 이상증 판별용 진단키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아벨리노 각막 이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아벨리노 각막 이상증을 진단하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 아벨리노 각막이상증 판별에 사용되는 중합효소연쇄반웅용 프라이머쌍의 용도를 제공하는데 있다 .
본 발명의 또 다른 목적은 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응용 키트의 용도를 제공하는데 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 아벨리노 각막 이상증 (Avellino corneal dystrophy) 판별에 사용되는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는- 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명은 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자의 변이 부위를 포함하는 영역을 특이적으로 증폭하는 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머쌍을 제공한다.
본 발명에서 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자 변이는 BIGH3 유전자 중 엑손 4， 코돈 124의 "CGC -> CAC" 변이이다.
본 발명의 명세서에서 용어 프라이머 (primer)"는 PCR에 의한 핵산 증폭 반웅시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 즉， 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반웅효소하에서 주형 -지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 을리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대， 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 층분히 안정된 흔성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 흔성복합체 (hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다. 본 발명의 프라이머는 주형의 한 부위에 흔성화 또는 어닐링되어, 흔성복합체 또는 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 흔성복합체 또는 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 흔성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor , N.Y. (2001) 및 Haymes , B.D. , 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머쌍 (primer pair)1'은 상기 설명된 프라이머로서 주형의 5 ' 말단 서열에 결합하는 정방향 프라이머 (forward primer)와 3 ' 말단 서열에 결합하는 역방향 프라이머 (reverse primer)로 구성되는 쌍을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 , 본 발명의 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 정방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
본 명세서에서 용어 "실시간 중합효소연쇄반웅 (real-time PCR)' '은 증합효소연쇄반웅에 기초하여 타깃 DNA 분자를 증폭과 동시에 정량하는 방법을 의미하몌 실시간 PCR 방법에 의하면 DNA 시료내에서 하나 이상의 특정 서열을 검출 및 정량을 행하는 것이 가능하다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 ) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (Π) 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 아벨리노 각막이상증 판별에 사용되는 실시간 증합효소연쇄반웅 (real-time PCR)용 키트를 제공한다.
본 발명에서 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반웅용 키트는 프라이머쌍과 프로브를 포함한다.
본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법에서 사용되는 프로브는 상기 프라이머쌍에 의해 증폭되는 염기서열 내부의 일부 서열에 상보적으로 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 프로브는 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자 엑손 4, 코돈 124의 정상형 "CGC" 및 변이형 "CAC"에 각각 상보적으로 결합하는 1 쌍의 프로브를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "프로브 (probe)" 는 타깃이 .되는 특정 뉴클레오티드 서열에 흔성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 을리고머를 의미한다. 바람직하게는， 상기 프로브는 흔성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서 타깃 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 흔성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 프로브의 이점， 즉 흔성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 본 발명의 프로브가 변형될 수 있다. 예를 들어， 리포터 (reporter)형광물질 또는 형광억제물질 (quencher)이 프로브 올리고뉴클레오타이드의 말단에 태깅 (tagging)될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 실시간 PCR에 사용되는 프로브의 5'-말단에는 리포터 -형광물질이 태깅 (tagging)되어 있고， 3'- 말단에는 형광억제물질 (quencher)이 태깅되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 정상형 염기에 결합하는 프로브의 5'-말단에 태깅되는 리포터 형광물질과 변이형 염기에 결합하는 프로브의 51—말단에 태깅되는 리포터 형광물질은 서로 다른 파장의 범위를 갖는 물질이다.
본 발명에서 리포터 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며 예를 들어， 리포터 형광물질은 FAM, VIC, TET, 6-JOE, HEX, TAMRA, Texas Red, Cy3, 또는 Cy5를 사용할 수 있으며, 형광억제물질은 BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, DABCYL, MGB-NFQ 또는 ROX 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 프로브는 타깃 서열에 특이적으로 흔성화되지만， 3'- 말단에 존재하는 형광억제물질의 작용에 의해 5'-말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나， 핵산증폭반응의 다음 단계인 연장 단계 (extension step)에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해， 주형에 흔성화된 프로브가 분해되고, 51말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광억제물질에 의한 형광억제가 해제됨으로써 형광을 방출한다.
본 발명의 프로브는 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상의 프로브이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 프로브는 서열번호 9 서열을 갖는 정상형 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 변이형 프로브를 포함한다.
본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약， 예컨대， 완층액, DNA 중합효소， DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 아벨리노 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다: (a) 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계 ; (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ii) 서열번호 3 내지 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반웅의 산물로부터 BIGF3 유전자 액손 4의 ^돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계. 이하에서 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 보다 상세히 설명한다. 단계 (a): 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계
본 발명의 방법에서 아벨리노 각막 이상증을 판별하고자 하는 대상자로부터 분리한 생물학적 시료에서 지놈 DNA를 추출하여 얻는다.
본 명세서에서 용어 "생물학적 시료"는 대상자로부터 분리된 시료로서 지놈 DNA를 추출할 수 있는 세포를 포함하는 시료를 의미하며, 예를 들어 혈액， 구강상피세포， 모근 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 생물학적 시료로부터 지놈 DNA의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 통상적인 방법， 예컨대 페놀—클로로포름 (Phenol-Chloroform) 추출 방법에 따라 실시될 수 있다 (Miller et SA, Dykes DD, Polesky HF. , Nucleotic Acids Res. 16， p.1215, 1998). 지놈 핵산의 분리 및 정제에 대한 구체적인 내용은 Sambrook et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며， 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 단계 (b): 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ii) 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계
상기 단계 (a)에서 분리한 지놈 DNA를 주형으로 하고， 아벨리노 각막이상증의 원인으로 알려진 BIGH3 유전자 엑손 4， 코돈 124의 유전자 변이 "CGC -> CAC"를 포함하는 영역을 증폭하도록 디자인된 프라이머쌍과 상기 유전자 변이의 정상형 (G) 및 변이형 (A)를 검출할 수 있도록 디자인된 프로브를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반웅을 행한다. 본 발명에서 사용되는 프라이머쌍과 프로브에 대한 내용은 상술된 내용과 동일하므로 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브를 포함한다 .
본 발명의 방법에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반웅에 이용될 수 있으며， 바람직하게는, DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 이는 Taq (Thermus aquaticus), Tth(Thermus thermophi lus) ,； Thermus f i 1 iformis, Thermi s " f lavus, Thermococcus literalis, 및 Pfu(Pyrococcus furiosus)를 포함한다.
유전자 증폭 반웅을 실시할 때, 반웅 용기에 반웅에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반웅이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자， dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 흔합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반웅에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반웅 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완층액은 모든 효소들이 최적의 반웅 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반웅물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반웅물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 흔성화는 타깃 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열 -의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 ( i ) 초기 변성 (denaturation) 과정 , ( ii ) 어닐링 (anneal ing)， 연장 (elongat ion) 및 변성 (denaturation)으로 이루어지는 하나의 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (iii) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클 프로그램을 통해 행한다. 단계 (c): 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 BIGF3 유전자 액손 4의 코돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계
상기 단계 (b)에서 행한 실시간 중합효소연쇄반응의 형광 방출을 분석하여 BIGH3 유전자 액손 4, 코돈 124의 정상형 "CGC" 및 변이형 "CAC" 여부를 판단한다. 이러한 분석 및 판단은 실시간 중합효소연쇄반웅에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 상술된 본 발명의 프라이머쌍 및 프로브에 의해 PCR 증폭되는 산물은 유전자형에 따라 고유의 형광값을 수치화한다. PCR 증폭된 DNA 증폭산물은 당업계의 공지된 방법， 예를 들어 실시간 DNA 증폭 장치에 의해 시각화된 결과를 관찰할 수 있다. 정상형 염기 (G)를 검출하는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 BIGH3의 정상 유전자형을 갖는 것으로 판단하고, 변이형 염기 (A)를 검출하는 프로브로부터 발생되는 형광이 검출되는 경우 BIGH3의 변이 유전자형을 갖는 것으로 판단한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 아 ^리노 각막이상증을 진단하는 방법을 제공한다: (a) 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계; (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ii) 서열번호 3 내지 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반웅을 행하는 단계; 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응의 산물로부터 BIGF3 유전자 액손 4의 코돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계 .
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 단계 (b)의 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브인 것을특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머쌍의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ii) 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반웅 (real-time PCR)용 키트의 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명은 상기 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브인 것을 특징으로 하는 용도를 제공한다. ,
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명은 상기 프로브의 말단에 형광물질 또는 형광억제물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 용도를 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명은 아벨리노 각막이상증 판별에 유용한 중합효소연쇄반웅용 프라이머와 프로브, 이들을 포함하는 키트 및 이들을 사용하여 실시간 증합효소연쇄반웅올 통해 아벨리노 각막이상증올 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 매우 간단하고 경제적인 방법으로 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자를 정확하게 판별할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 본 발명의 프라이머 쌍을 사용하여 정상인과 아벨리노 각막 이상증 이형접합자의 지놈 DNA를 증 ; 폭한 결과이다. 증폭 DNA 산물에 대해 염기서열분석을 통해 정상인과 아벨 리노 각막이상증 이형접합자의 염기서열이 정확하게 증폭되었음을 확인할 수 있다.
도 2는 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 포함 ： 영역을 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 을리고뉴클레오티드 프 라이머쌍의 염기서열과 이 프라이머쌍의 위치를 보여준다.
도 3은 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 3 및 서열번호 4의 정상 및 변형 염기 판 별 프로브 위치를 보여준다.
도 4은 BIGH3 유전자의 액손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6의 정상 및 변형 염기 판 별 프로브 위치를 보여준다.
도 5는 BIGH3 유전자의 엑손 4 코돈 124번의 SNP (CGC -> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 7 및 서열번호 8의 정상 및 변형 염기 판 별 프로브 위치를 보여준다.
도 6은 BIGH3 유전자의 액손 4 코돈 124번의 SNP (CGC 一> CAC) 위치 및 이를 판별하기 위한 서열번호 9 및 서열번호 10의 정상 및 변형 염기 판 별 프로브 위치를 보여준다.
도 7은 서열번호 3 및 서열번호 4의 정상 및 변형 염기 판별 프로브 를 사용한 아벨리노 각막 이상증 SNP 특이적 형광 프로브 증폭곡선을 보여 준다. 서열번호 3의 정상인 유전자형 G 검출 프로브에는 VIC을 형광 표지하 였으몌 서열번호 4의 아벨리노 유전자형 A 검출 프로브에는 FAM을 형광 표 지하였다. 서열번호 3과 서열번호 4의 프로브를 사용한 경우에는， 정상인 유전자형 (G/G 타입)에서 VIC과 FAM 형광이 비슷하게 증폭되고， 아벨리노 각 막이상증 이형접합 유전자형 (G/A 타입)과 아벨리노 각막이상증 동형접합 유 전자형 (A/A 타입)에서는 변별력이 낮아 유전자형 검출 정확도가 낮은 것을 알 수 있다.
도 8은 서열번호 5 및 서열번호 6의 정상 및 변형 염기 검출 프로브 를 사용한 아벨리노 각막이상증 SNP 특이적 형광 프로브 증폭곡선을 보여준 다. 서열번호 5의 정상 유전자형 (G) 검출 프로브에는 VIC을 형광 표지하였 으며, 서열번호 6의 아벨리노 유전자형 (A) 검출 프로브에는 FAM을 형광 표 지하였다. 서열번호 5과 서열번호 6의 프로브를 사용한 경우에는 정상인 유 전자형 (G/G 타입)에서 VIC과 FAM 형광이 비슷하게 증폭되고， 아벨리노 각막 이상증 이형접합 유전자형 (G/A 타입)과 아벨리노 각막이상증 동형접합 유전 자형 (A/A 타입)에서는 변별력이 낮아 유전자형 검출 정확도가 낮은 것을 알 수 있다.
도 9은 서열번호 7 및 서열번호 8의 정상 및 변형 염기 검출 프로브 를 사용한 아벨리노 각막이상증 SNP 특이적 형광 프로브 증폭곡선올 보여준 다. 서열번호 7의 정상인 유전자형 (G) 검출 프로브에는 FAM을 형광 표지하 였으며， 서열번호 8의 아벨리노 유전자형 (A) 검출 프로브에는 VIC을 형광 표지하였다. 서열번호 7과 서열번호 8의 프로브를 사용한 경우에는 정상인 유전자형 (G/G 타입)에서 VIC과 FAM 형광이 비슷하게 증폭되고， 아벨리노 각 막이상증 이형접합 유전자형 (G/A 타입)과 아벨리노 각막이상증 동형접합 유 전자형 (A/A 타입 )에서는 변별력이 낮아 유전자형 검출 정확도가 낮은 것을 알 수 있다.
도 10는 서열번호 9 및 서열번호 10의 정상 및 변형 염기 검출 프로 브를 사용한 아벨리노 각막이상증 SNP ,특이적 형광 프로브 증폭곡선을 보여 준다. 서열번호 9의 정상인 유전자형 (G) 검출 프로브에는 FAM을 형광 표지 하였으며， 서열번호 10의 아벨리노 유전자형 (A) 검출 프로브에는 VIC을 형 광 표지하였다. 정상 유전자형 (G/G 타입 )에서는 FMA 형광 증폭 곡선이 , 아 벨리노 각막이상증 동형접합 유전자형 (A/A 타입 )에서는 VIC 형광 증폭 곡선 아벨리노 각막이상증 이형접합 유전자형 (G/A 타입 )에는 FAM 및 VIC 형광 증 폭 곡선이 나타남을 확인할 수 있어， 각 유전자형에 대한 검출 정확도가 매 우 높은 것을 알 수 있다.
도 11은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍과， 서열번호 3 및 서열번호 4의 프로브쌍 (패널 A), 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브쌍 (패 널 B), 서열번호 Ί 및 서열번호 8의 프로브쌍 (패널 C), 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍 (패널 D)을 사용하여 아벨리노 유전자형 판별 (Avel 1 ino corneal dystrophy allelic discr iminat ion)을 비교 수행한 결과 를 보여준다. 붉은색 점은 정상인의 유전자 형 (G/G 타입)을 표현하며, 초 록색 점은 아벨리노 이형접합자의 유전자형 (G/A 타입)을 나타내고， 파란색 점은 아벨리노 동형접합자 (A/A 타입)의 유전자형을 의미한다. 유전형 분석: 그림에서는 분석이 가능한 것으로 확인되나 증폭곡선 분석에서는 정확한 확 인이 어렵다.
도 12은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍과 서열번호 9 및 서 열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 아벨리노 각막이상증 유전자형 판별 (Avel 1 ino corneal dystrophy allelic discrimination)^- 증폭곡선 (amplification plot) 분석을 수행한 결과이다. 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍은 증폭곡선에서도 다른 프로브 보다 변별력이 우수함을 알 수 있었다.
도 13a는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호 9와 서 열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 피험자 검체 80명을 대상으로 실시간 PCR 을 진행한 후， ABI 실시간 증폭장치 프로그램 (7500 Software V2.0.5, ABI , USA)을 사용하여 실험 결과를 분석한 결과이다.
도 13b는 도 13a의 결과에서 이형접합자 (G/A. type)로 판명된 피험자
3명을 대상으로 염기서열분석을 수행하였으며, 그 결과 BIGH3 유전자중 액 손 4， 코돈 124번 위치에 G/A SNP가 있는 것을 확인하였다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실험 재료 및 방법
1. 시료
실시간 PCR 분석에 사용한 시료는 정상인 77명과 아벨리노 각막이상증 확진자 3명 총 80명의 검체를 사용하였다. 재현성 테스트에는 100명의 검체를 사용하였다. 지놈 DNA 추출을 위해 피험자로부터 구강상피세포를 채취하여 시료로 사용하였다.
2. DNA추출 및 농도 측정
시료로부터 지.놈 DNA의 추출 및 정제는 Miller 등의 방법 (Miller EU SS, Dykes ADD, Peoples HF. Nucleonic Acids Res. 16, pl215. (1998))을 일부 보완하여 실시하였다. 추출 및 정제한 지놈 DNA의 정량 분석은 Spectrophotometer ND-1000 (Nanodrop, USA)을 이용하여 260 ᅳ 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다. 멸균 증류수를 이용하여 모두 5 ng/z^로 보정한 후 실험 사용 전까지 -20°C에 보관하였다.
3. 실시간 PCR증폭용 프라이머쌍의 제작
NCBI에 등록된 아벨리노 각막이상증 관련 BIGH3 유전자의 지놈 염기서열을 토대로 액손 4 코돈 124번의 SNP가 포함되어 증폭되도록 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 PCR 프라이머쌍을 디자인하여 제작하였다 (표 1 참조).
4. BIGF3 유전자 액손 4 코돈 124번 SNP 판별용 프로브의 디자인
BIGF3 유전자 액손 4 코돈 124번 변이형 (CGC —> CAC)을. 정상형과 구별할 수 있는 프로브를 제작하였다. 정상형 유전자를 검출하는 프로브에는 FAM을 표지하였고, 아벨리노 각막이상증 변이형 프로브에는 VIC을 표지하였으며， 프로브의 3' -말단에는 MGB를 켄칭 (quenching)하였다. 상기와 같은 프로브를 사용하는 경우 정상인에게는 FAM 형광값만 나타나고， 아벨리노 각막이상증 변형 유전자를 동형접합으로 갖는 경우에는 VIC 형광값만 나타나게 되며 , 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자에게서는 FAM과 VIC 형광값이 함께 나타나도록 설계하였다 (표 1 참조).
5. 프라이머 및 프로브를 사용한 실시간 PCR 증폭을 위한 반웅 실시간 증폭 PCR 반웅은 주형 DNA (1 ng/μΐ) 5 μ , 프라이머 및 프로브 믹스 5 Hi, 2X Multiplex PCR Smart mix (With UDG) (Sol Gent, Korea) 10 ^를 첨가하여 최종 20 의 반웅액을 제조하여 사용하였다. 실시간 PCR 반웅은 실시간 염기서열 증폭장치 7500(ABI, USA)을 사용하였고 50°C에서 3분간 반웅시켜 PCR 산물의 오염을 제거하고， 60°C에서 1분간 형광값 pre-read 단계를 수행한 후, PCR 실험을 수행하였다.ᅵ 증폭 반웅은 95°C에서 15분간 전ᅳ변성 (pre— denaturation)을 실시한 후 95°C에서 30 초간 변성， 60°C에서 1분간 어닐링 (annealing)과 연장 (extent ion)을 40 사이클 수행한 후 마지막으로 60°C에서 1분간 post-read 단계를 행하였다. 주형 (template)은 상술한 바와 같이 피험자 구강상피세포에서 추출한 지놈 DNA를 사용하였으며， 음성대조군 (negative control)은 증류수를 사용하여 교차오염을 확인하였다. 대립유전자 판별 플롯 (Allelic discrimination plot)과 PCR 증폭 플롯 (PCR amplification plot)은 ABI 프로그램을 사용하여 확인하였다. 아벨리노 각막이상증 이형접합 보인자의 양상올 보이는 검체는 염기서열 분석법을 사용하여 최종 확인하였다.
【표 1】
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
실험결과
1. 제작한 프라이머쌍을 이용한 PCR증폭
NCBI에 등록된 아벨리노 각막이상증 관련 BIGH3 유전자의 지놈 염기서열을 토대로 액손 4 코돈 124번의 SNP 부위가 포함되어 증폭되도록 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 PCR 프라이머쌍을 사용하여 지놈 DNA 증폭을 실시하였다. 증폭된 DNA의 염기서열 분석을 통해 정상인과 아벨리노 각막이상증 이형접합자의 유전자 부위가 정확하게 증폭되었음을 확인하였다 (도 1).
2. 아벨리노 각막이상증 대립유전자형의 분석용 프로브 선별
BIGF3 유전자 액손 4 코돈 124번 변이형 (CGC -> CAC)을 정상형과 구별할 수 있도록 제작한 프로브 증에서 결합력이 우수한 프로브를 선별하는 실험을 행하였다. 실험에 사용한 프라이머 및 프로브는 상기 표 1에 나타내었다. 상기 표 1에서 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브는 결합 특이도를 향상시키기 위해 역방향으로 제작하였으며， SNP 염기는 소문자로 표기하였다. 프라이머와 프로브간의 결합력을 고려하여 프라이머와 프로브를 동일한 농도를 사용하지 않았다. 실험 결과， 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용한 실시간 PCR 증폭에서 대립유전자 판별곡선 (Allelic discrimination plot)과 PCR 증폭곡선 (PCR amplif icat ion plot)의 대립유전자 변별력이 가장 우수한 것으로 확인되었다 (도 7 내지 도 10 결과 01185
16
참조).
도 10에서 보여지는 바와 같이， 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용한 경우， 다른 서열을 갖는 프로브쌍들에 비해， 아벨리노 각막이상증 이형접합자 보인자 유전자형인 G/A에서 FAM과 VIC 형광값이 동일하게 나와 변별력이 우수한 것이 확인되었다.
도 11에는 표 1의 서열번호 3 내지 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 실시간 PCR을 진행한 후， ABI 실시간 증폭장치 프로그램 (7500 Software V2.0.5, ABI, USA)을 사용하여 실험 결과를 분석한 결과를 나태었다. 도 11에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 사용하여， 서열번호 3 및 서열번호 4의 프로브쌍 (패널 A), 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브쌍 (패널 B), 서열번호 7 및 서열번호 8의 프로브쌍 (패널 C), 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍 (패널 D)을 사용하여 아벨리노 유전자형 판별 (Avellino corneal dystrophy allelic discrimination^ 비교 수행한 결과이다. 도 11의 결과에서 붉은색 점은 정상인의 유전자 형 (G/G 타입)을 표현하며, 초톡색 점은 아벨리노 이형접합자의 유전자형 (G/A 타입)을 나타내고, 파란색 점은 아밸리노 동형접합자 (A/A 타입)의 유전자형을 의미한다. 도 11의 ABI 실시간 증폭장치 프로그램을 사용한 유전형 분석 결과에서는, 서열번호 3 내지 서열번호 8의 프로브도 아벨리노 각막이상증 대립유전자형의 분석이 가능한 것으로 확인되나， 상기 도 7 내지 도 10의 증폭곡선을 사용한 분석에서는 상기 서열번호 3 내지 서열번호 8의 프로브들은 정확한 대립유전자 판별이 어렵다는 것을 알 수 있었다.
3. 실시간 PCR 증폭에 의한 아벨리노 각막이상증 대립유전자 판별 테스트
도 12의 결과는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호 9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 아벨리노 각막이상증 대립유전자 판별곡선 (Avel 1 ino corneal dystrophy allelic discrimination plot)과 증폭곡선 (amplification plot)분석을 수행한 결과이다. 이 결과에서 본 발명의 프라이머쌍 및 프로브쌍이 대립유전자 판별곡선의 변별력과 증폭곡선의 변별력도 모두 우수한 것을 확인할 수 있었다. HRM (High resolution melting curve) 기반의 유전자형 분석 장비는 MBG 프로브 기반의 유전자형 분석이 불가능하다. 따라서, 증폭곡선에서의 변별력도 매우 중요하다 / 본 발명의 서열번호 9 및 서열번호 10의 프로브쌍은 증폭곡선에서도 다른 프로브 보다 변별력이 우수함을 확인하였다.
도 13a의 결과는 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머쌍에 서열번호
9와 서열번호 10의 프로브쌍을 사용하여 피험자 검체 80명을 대상으로 실시간 PCR을 진행한 후， ABI 실시간 증폭장치 프로그램 (7500 Software V2.0.5, ABI, USA)을 사용하여 실험 결과를 분석한 결과이다. 도 13b의 결과는 상기 도 13a의 결과에서 현미경 검사를 통해 이형접합자 (G/A 타입)으로 확인된 검체 3개를 대상으로 염기서열을 분석한 결과이다. 이 결과를 통해 대립유전자 판별이 100% 정확도를 나타내는 것을 확인하였고, 염기서열 분석 결과를 통해서도 코돈 124번째 위치에 SNP가 존재하는 것을:' 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이' 아닌 점은' 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 중합효소연쇄반웅 (polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머쌍.
【청구항 2】
(i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ii) 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 실시간 중합효소연쇄반웅 (real-time PCR)용 키트.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 4】
제 2 항에 있어서， 상기 프로브의 말단에 형광물질 또는 형광억제물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 5】
다음의 단계를 포함하는 아벨리노 각막이상증 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법 :
(a) 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계; (b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ii) 서열번호 3 내지 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반웅을 행하는 단계 ; 및
(c) 상기 실시간 중합효소연쇄반웅의 산물로부터 BIGF3 유전자 액손 4의 코돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 단계 (b)의 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 7】
다음의 단계를 포함하는 아벨리노 각막이상증을 진단하는 방법:
(a) 대상자에서 분리된 생물학적 시료로부터 지놈 DNA를 얻는 단계;
(b) 상기 지놈 DNA를 주형으로 하여 (0 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (H) 서열번호 3 내지 서열번호 10으로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 행하는 단계; 및
(c) 상기 실시간 중합효소연쇄반웅의 산물로부터 BIGF3 유전자 액손 4의 코돈 124의 변이 또는 정상 유전자형을 판별하는 단계.
【청구항 8]
제 7 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9】
아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 증합효소연쇄반웅 (polymerase chain reaction, PCR)용 프라이머쌍의 용도.
【청구항 10】
(i) 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 갖는 프라이머쌍; 및 (ii) 서열번호 3 내지 서열번호 10로 이루어지는 군에서 선택된 서열을 갖는 프로브 중 하나 이상을 포함하는 아벨리노 각막 이상증 판별에 사용되는 실시간 증합효소연쇄반웅 (real-time PCR)용 키트의 용도. 【청구항 11】
제 10 항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 9의 서열을 갖는 프로브 및 서열번호 10의 서열을 갖는 프로브인 것을 특징으로 하는 용도: 【청구항 12】
제 10 항에 있어서， 상기 프로브의 말단에 형광물질 또는 형광억제물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 용도.
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