WO2006064745A1 - 塩基多型の同定方法 - Google Patents

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WO2006064745A1
WO2006064745A1 PCT/JP2005/022741 JP2005022741W WO2006064745A1 WO 2006064745 A1 WO2006064745 A1 WO 2006064745A1 JP 2005022741 W JP2005022741 W JP 2005022741W WO 2006064745 A1 WO2006064745 A1 WO 2006064745A1
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WO
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oligonucleotide
nucleotide polymorphism
enzyme
sequence
identification method
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Application number
PCT/JP2005/022741
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yutaka Takarada
Original Assignee
Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a nucleic acid sequence. More specifically, the present invention relates to a nucleic acid sequence analysis method capable of simultaneously detecting a plurality of nucleotide polymorphisms contained in a sample.
  • the nucleic acid sequence analysis method of the present invention is useful in genetic engineering, molecular biology, and related industrial fields.
  • the nucleotide polymorphism is a genotype having a sequence different from the wild type, and the polymorphic gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism.
  • the polymorphic gene plays an important role as a cause of inter-individual variation in the occurrence of side effects and treatment failures in drug metabolism.
  • It is also known as a cause of individual differences such as basal metabolism known as constitution.
  • they also serve as genetic markers for many diseases. Therefore, elucidation of these mutations is clinically important, and routine phenotyping is particularly recommended for psychiatric patients and volunteers in clinical studies (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2). Therefore, a nucleic acid sequence analysis method for detection of each genotype following identification of the causative polymorphic gene is desirable.
  • nucleic acid sequencing can detect and identify nucleotide polymorphisms contained in nucleic acid sequences, but it requires a great deal of effort to prepare vertical nucleic acids, polymerase reactions, polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis of nucleic acid sequences. And time is needed. In addition, there is a problem that an expensive device that can save labor by using an automatic sequencer in recent years is required.
  • a Southern hybridization method see, for example, Non-Patent Document 3
  • a DNA region having a base sequence complementary to a labeled DNA probe can be identified. That is, in the Southern hybridization method, nucleic acid fragments are electrophoresed on a flat plate of agarose gel or polyacrylamide gel, and the size of the fragments is determined.
  • nucleic acid fragments After separation by (length), it is denatured into a single strand, and -trocellulose or A membrane such as nylon is affixed, the nucleic acid fragments are transferred and fixed as they are in the electrophoresis pattern, and then hybridized with a nucleotide polymorphism-specific DNA probe labeled with RI (radioisotope) or the like to form a probe. Detect nucleic acid fragments on the complementary membrane by autoradiography or the like.
  • the Southern hybridization method it is possible to determine the electrophoresis position and molecular weight of the target nucleic acid fragment, but it takes a long time for operations such as electrophoresis and autoradiography. Since it is detected only by the fact that it cannot be analyzed quickly, or by the ability to hybridize with nucleotide polymorphism-specific DNA probes, the presence or absence of nucleotide polymorphisms must be determined without strict probe specificity. There were problems such as difficulty in identifying similar sequences for detection.
  • a method for identifying a nucleic acid sequence using an enzyme a method using a ligase (for example, see Patent Documents 1 and 2) and a method using a nuclease (for example, see Patent Document 3) are known.
  • OLA oligonucleotide ligation assembly
  • two probes or probe elements that span the desired target region are hybridized to the target region.
  • the probe element makes a base pair with an adjacent target base
  • the opposite ends of the probe element are linked by a ligation reaction, for example, by ligase treatment.
  • the ligated probe element is assayed to reveal the presence of the target sequence.
  • a hybridization using a solid phase called a DNA microarray (DNA chip) in which a plurality of detection oligonucleotide probes are bound to the solid phase.
  • DNA chip DNA microarray
  • a number of liquid processing steps are required and several incubation and wash temperatures must be carefully controlled to maintain the stringency required for single nucleotide mismatch identification. Since the optimal hybridization conditions vary greatly depending on the probe sequence, this method is difficult to multiplex.
  • a method has also been disclosed in which polymorphisms can be analyzed by DNA microarray using several tens of oligonucleotides per one polymorphic sequence to solve this problem (see, for example, Patent Document 4).
  • analysis is performed using a specialized array of probes that are tiled based on each polymorphic form.
  • Tiling refers to the use of a group of related fixed probe probes, some exhibiting complete complementarity to the reference sequence, and others indicating a reference sequence power mismatch. (For example, see Patent Document 5).
  • this method is very costly because several tens of oligonucleotides are used for one type of polymorphism.
  • a method of measuring a plurality of polymorphisms with a DNA microarray by ligating a polymorphism with a ligase and specifically measuring with a DNA microarray is also disclosed (see, for example, Patent Document 6).
  • This method can reduce the number of oligonucleotides on the DNA microarray. Since only ligase is used for ligation of oligonucleotides, an oligonucleotide with a phosphate group attached to the end is necessary and the cost is high.
  • a ligation reaction occurs with any oligonucleotide adjacent to the oligonucleotide, and nonspecific ligation is likely to occur. In particular, the risk increases as the number of polymorphs to be analyzed increases.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 6-44880
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 2622255
  • Patent Document 3 JP-A-3-43098
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-514091
  • Patent Document 5 EP730663
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-511060
  • Non-Special Reference 1 European Consensus Conference on Pharmacogenetics.
  • Non-Patent Document 2 European Journal Of Clinical Pharmacology 36, pp. 51-554 (issued in 1989)
  • Non-Patent Document 3 Laboratory Manual Genetic Engineering Supplement, Pages 70-75 (issued in 1996) Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 A diagram showing a part of the reaction mechanism of the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid sequence analysis method excellent in easily and simultaneously detecting the types of a plurality of nucleotide polymorphisms contained in a sample.
  • the present invention relates to a method for simultaneously identifying a plurality of nucleotide polymorphisms.
  • the first oligonucleotide and the second oligonucleotide are ligated using an enzyme having a nuclease activity and an enzyme having a ligase activity to generate a ligated oligonucleotide, which is complementary to the ligated oligonucleotide.
  • Arrangement A method for identifying a polynucleotide polymorphism characterized by identifying the type of the linked oligonucleotide using a detection probe having a sequence.
  • the first oligonucleotide for detecting the wild type and the first oligonucleotide for detecting the polymorphism are labeled with fluorescent substances having different fluorescence wavelengths. 6 Or 7 multiple nucleotide polymorphism identification method.
  • the detection probe comprises a sequence complementary to at least a part of the first oligonucleotide and the second oligonucleotide.
  • any one of 1 to 3 characterized in that the detection probe includes a portion of a polymorphic sequence The multiple nucleotide polymorphism identification method.
  • a 14-nucleotide polymorphism identification method wherein the solid phase on which the detection probe is immobilized is a DNA microarray.
  • a method for identifying 16 multi-nucleotide polymorphisms characterized in that the amplification method is any method selected from the group consisting of PCR, NASBA, LCR, SDA, RCR and TMA.
  • An 18-nucleotide polymorphism identification method wherein the amplification method is any method selected from the group consisting of PCR, NASBA, LCR, SDA, RCR and TMA.
  • Enzyme containing ligase activity is T4 DNA ligase, Ecoli DNA ligase, RNA ligase zeta, or at least one selected enzyme, One to three polynucleotide polymorphisms Identification method.
  • thermostable enzyme is derived from Tth, Taq, KOD or Pfo Nucleotide polymorphism identification method.
  • Tth-derived metathermic DNA polymerase One or two species selected from the group consisting of Tth-derived metathermic DNA polymerase, Taq-derived metathermic D ⁇ polymerase, KOD-derived metathermic DNA polymerase, and Pfo-derived metathermic DNA polymerase 26.
  • nucleotide polymorphism includes any of a single nucleotide polymorphism, an insertion, and a deletion polymorphism.
  • a multiple nucleotide polymorphism identification method characterized by detecting using a plurality of types of detection probes.
  • a kit for simultaneously identifying a plurality of types of nucleotide polymorphisms contained in a sample comprising at least the following (0 to ( ⁇ ):
  • V a detection probe complementary to at least a part of the second oligonucleotide and / or a detection probe complementary to at least a part of the second oligonucleotide and the first oligonucleotide
  • a kit for simultaneously identifying a plurality of types of nucleotide polymorphisms contained in a sample comprising at least the following (0 to (vi):
  • kits containing a solid phase on which detection probes are pre-fixed are pre-fixed.
  • kits characterized in that the solid phase is a DNA microarray.
  • nucleotide polymorphism-specifically linked oligonucleotide is detected in a gene-specific manner, so that a plurality of nucleotide polymorphisms can be obtained. It can be easily detected.
  • a chromosome containing a specific nucleotide polymorphism site or a fragment thereof contained in a sample is a target nucleic acid containing a nucleotide polymorphism site that carries information on the target gene. If there is, there is no particular limitation.
  • the target nucleic acid include Alu sequences, exons, introns and promoters of genes encoding proteins. More specifically, genes related to various diseases including genetic diseases, drug metabolism, lifestyle-related diseases (hypertension, diabetes, etc.) can be mentioned. For example, the ACE gene can be mentioned as hypertension.
  • polymorphic nucleic acid of a chromosome or a nucleic acid fragment refers to a wild-type nucleic acid in which at least one nucleotide is point-mutated and replaced with another nucleotide, or one of the wild-type nucleic acids. It is a nucleic acid containing an insertion or deletion sequence in the part. It has been elucidated that the constitution is different depending on such a base polymorphism, and the method of the present invention examines whether or not the nucleic acid in the sample has such an expected polymorphism. Is the method.
  • the method for detecting a base polymorphism in the present invention is characterized in that an enzyme containing a nuclease activity and an enzyme containing a ligase activity are used sequentially and Z or simultaneously.
  • the activity can be performed by, for example, an enzyme, and an enzyme having both activities can also be used.
  • examples of the enzyme having nuclease activity include Mung bean nuclease, S1 nuclease, and exonucleases I to VII.
  • Enzymes containing ligase activity include T4DNA
  • thermostable enzymes examples include ligase, E. coli DNA ligase, RNA ligase and the like. It is preferable that the enzyme containing nuclease activity and the enzyme containing ligase activity are thermostable enzymes.
  • the thermostable enzyme should be derived from Tth, Taq, KOD, Pfo.
  • the enzyme having nuclease activity may be a DNA polymerase.
  • a heat-resistant DNA polymerase derived from Tth, Taq, KOD, or Pfo may be used.
  • a specific embodiment of the method for detecting a base polymorphism of the present invention is a method for identifying a plurality of base polymorphisms contained in a sample
  • a first oligonucleotide containing a nucleotide polymorphism sequence portion is prepared, complementary to the strand strand nucleic acid to which the first oligonucleotide hybridizes, and hybridized adjacent to the first oligonucleotide.
  • Preparing a second oligonucleotide comprising a sequence in which the polymorphic sequence portion does not form a complementary strand to either of the polymorphic sequences;
  • the base pair of the second nucleotide is not formed!
  • the base is removed by an enzyme containing nuclease activity.
  • the phosphate group remains and the base is removed. That is, a phosphate group is generated for the first time by an enzyme having a nuclease activity, and the first oligonucleotide and the second oligonucleotide are linked by an enzyme having a ligase activity.
  • the nucleotide polymorphism of a specific nucleic acid sequence contained in a sample is identified by detecting the linked oligonucleotide.
  • the first oligonucleotide is an oligonucleotide containing a base complementary to a predicted sequence portion of the nucleotide polymorphism.
  • the portion at which the nucleotide polymorphism is expected is at the 3rd end of the first nucleotide.
  • the second oligonucleotide is preferably located on the third side of the first oligonucleotide.
  • an oligonucleotide containing a base that is not complementary to the expected sequence portion of the nucleotide polymorphism is preferable.
  • the base that is not complementary to the expected sequence portion of the nucleotide polymorphism is at the 5 ′ end of the second oligonucleotide.
  • the design method of the first oligonucleotide and the second oligonucleotide will be described.
  • the first oligonucleotide and the second oligonucleotide are brought into contact with a target nucleic acid containing an expected sequence portion of the nucleotide polymorphism.
  • a target nucleic acid containing an expected sequence portion of the nucleotide polymorphism.
  • the 3 'end of the first oligonucleotide is designed to hybridize with the expected sequence of the nucleotide polymorphism, and the 5th end of the second oligonucleotide is predicted to be the nucleotide polymorphism.
  • the length that does not hybridize with the expected sequence portion of the nucleotide polymorphism at the 5 ′ end of the second oligonucleotide may be at least one base.
  • the enzyme containing ligase activity causes the first and second oligonucleotides to react with each other. Design so that nucleotides can be combined!
  • the length of the first oligonucleotide and the second oligonucleotide in the present invention is 13 to 35 bases, preferably 16 to 30 bases.
  • the 3 ′ terminal base of the first oligonucleotide is designed to be the expected oligonucleotide of the nucleotide polymorphism site
  • the wild-type first oligonucleotide is a base complementary to the base of the wild-type nucleic acid
  • the polymorphic first oligonucleotide places a base complementary to the base of the polymorphic nucleic acid.
  • the overlapping base of the second oligonucleotide is complementary to both the wild type and the polymorphism. Select something other than the correct base. By selecting bases that are not complementary to both the wild type and polymorphism, only one type of second oligonucleotide needs to be prepared when measuring one type of base polymorphism.
  • the second oligonucleotide can be used only in the combination of the wild-type first oligonucleotide Z second oligonucleotide Z wild-type nucleic acid and polymorphic first nucleotide Z second oligonucleotide Z polymorphic nucleic acid. Except for the overlapping portion of nucleotides, the bases that overlap the second oligonucleotide are removed by the enzyme containing the nuclease activity because they match completely. At this time, the phosphate group remains and is removed, so that the first oligonucleotide and the second oligonucleotide are linked together by the action of an enzyme containing ligase activity.
  • the 3 'end of the first oligonucleotide is not complementary, so ligase activity is reduced. Ligation by the containing enzyme does not occur.
  • the wild-type first oligonucleotide and the polymorphic first oligonucleotide are allowed to act simultaneously.
  • the first oligonucleotide and the second oligonucleotide are hybridized to a chromosome or nucleic acid fragment containing a base polymorphism.
  • the conditions for performing the ibridization may be the conditions that are normally used. For example, it can be performed according to the method described in Molecular Cloning (issued in 1989).
  • the overlapping part of the second oligonucleotide contains the nuclease activity. Cleave with a suitable enzyme.
  • the enzyme activity that can be used is as described above.
  • an exonuclease such as a DNA polymerase that has an exonuclease activity is preferable.
  • the 5 ′ end of the second oligonucleotide overlaps with the first oligonucleotide, use an exonuclease to cleave the overlapping portion of the second oligonucleotide and Make the group protrude.
  • the phosphate group protruding to the 5th side of the second oligonucleotide and the first oligonucleotide 3 ′ side are combined with an enzyme having a ligase activity to form one oligonucleotide.
  • the site corresponding to the nucleotide polymorphism in the first oligonucleotide is not complementary, the site corresponding to the nucleotide polymorphism is not complementary even when cleaved by endonuclease. Cannot bind to one oligonucleotide.
  • an enzyme containing nuclease activity and an enzyme containing ligase activity are used for the sample nucleic acid using a wild-type first oligonucleotide, it reacts with the 1S polymorphism that is single-stranded if the sample nucleic acid is wild-type. Does not happen.
  • an enzyme containing nuclease activity and an enzyme containing ligase activity are used for the sample nucleic acid using the polymorphic first oligonucleotide, if the sample nucleic acid is polymorphic, it will be a single strand. The reaction will not occur.
  • humans and higher organisms have the ability to have one gene each from the father and one from the mother for each type of gene. It can also be distinguished whether the polymorphism is homo or hetero.
  • the present invention also provides a method for causing the measured! /, Multiple types of polymorphisms to act on an enzyme containing a nuclease activity and an enzyme containing a ligase activity in the same reaction system.
  • the term “plural types” means that at least one type or two or more types of base polymorphisms are measured.
  • the first oligonucleotides for wild type and polymorphism are used. It is preferable to apply a different label to the tide, for example, a fluorescent label capable of distinguishing the fluorescence wavelength. At least the fluorescent labeling for labeling the first oligonucleotide for wild type and polymorphism is different! / If the first oligonucleotide and the second oligonucleotide for identifying multiple types of nucleotide polymorphisms are different You can mix them up.
  • the nucleic acid fragment containing the polymorphic sequence may be amplified by the amplification reaction shown below before the above hybridization. Is possible.
  • the amplification method is not particularly limited, but PCR (Polymerase
  • the enzyme containing nuclease activity and the enzyme containing ligase activity are allowed to act to bind oligonucleotides, and then the bound products are amplified in the amplification reaction described above to enable detection. Is possible.
  • a sequence on which the primer used in the amplification reaction acts can be added to the 5 ′ end side of the first oligonucleotide and the 3 ′ end side of the second oligonucleotide.
  • the linked oligonucleotide obtained by the above reaction is detected as follows using a detection probe.
  • nucleotide having oligotin, linker arm, fluorescent substance, or oligo dGTP, oligo dATP, oligo dTTP, oligo dCTP, etc. may be added to the terminal at the end of the synthesis to introduce a modifying group.
  • nucleotides with piotin, linker arm, fluorescent substance, etc. instead of nucleotides in the tide sequence, substitution may be carried out by synthesis and introduction of a modifying group.
  • Labels of known oligonucleotides such as radioactive substances such as 32 P and 35 S, synthesized enzymes such as ALP and POD, and fluorescent substances such as FITC, HEX, 6-FAM, and TET. May be introduced.
  • different oligonucleotide sequences may be added to the wild-type first oligonucleotide and the nucleotide polymorphism first oligonucleotide, respectively.
  • a first oligonucleotide labeled with a fluorescent substance or the like and a second nucleic acid are hybridized with a specific nucleic acid, and an enzyme having a ligase activity and an enzyme having a nuclease activity are sequentially and Z or simultaneously acting, then dissociated, hybridized with polymorphism-specific detection probe and wild-type detection probe bound to the solid phase, and washing the hybridized forceful nucleic acid
  • it is detected whether or not it is hybridized by labeling the first oligonucleotide of the nucleic acid hybridized with each detection probe, and the base polymorphism is wild type or polymorphic or mixed depending on the detection signal ratio of each detection probe
  • detection of wild-type and polymorphism can be performed by adding a mixed base to the sequence of the base polymorphism part. It can also be performed with the single detection probe used.
  • a different label for example, a fluorescent label capable of distinguishing the fluorescence wavelength, is added to the wild-type and polymorphic first oligonucleotides so that a plurality of types of polymorphisms can be simultaneously activated in at least one reaction system.
  • An enzyme containing ligase and an enzyme containing ligase activity may be allowed to act.
  • the first oligonucleotide and the second oligonucleotide for identifying multiple types of base polymorphisms May be mixed.
  • the fluorescent label for labeling the first oligonucleotide for the wild type and the polymorph it is more preferable if the fluorescence wavelengths can be distinguished, and it is more preferable to use fluorescent dyes having different colors.
  • the wild-type first oligonucleotide may be labeled with Cy3 at the end and Cy5 with the polymorphic first oligonucleotide at Cy5, and vice versa. .
  • the target nucleic acid is a polymorphic nucleic acid, and the 5 'end is modified with Cy3.
  • the case where the prepared wild-type first oligonucleotide and the polymorphic first oligonucleotide whose 5 ′ end is modified with Cy5 is used is shown.
  • the second oligonucleotide is set with the “probable sequence portion of the nucleotide polymorphism” at the 5th end thereof, and complemented with the “sequence portion of the nucleotide polymorphism expected”.
  • the wrong base is set.
  • the bases located at the 5th and the end of the second oligonucleotide should be set as non-complementary bases even when the target nucleic acid is a wild type.
  • the polymorphic first oligonucleotide is designed so that the A at the end and the G at the 5 'end of the second oligonucleotide overlap.
  • it is designed so that the 3, terminal C of the wild type first oligonucleotide overlaps the 5, 5 terminal G of the second oligonucleotide.
  • Fig. 1 (1) shows a case in which the polymorphic first oligonucleotide and the second oligonucleotide act on the polymorphic nucleic acid.
  • a at the 3rd end of the first polymorphic oligonucleotide is hybridized to the polymorphic site, and 5th from the 5th end of the second oligonucleotide is hybridized to the adjacent site.
  • G at the 5th end of the second oligonucleotide is not complementary because it is not complementary to the polymorphic site.
  • the enzyme at the end of the second oligonucleotide is cleaved by the action of an enzyme containing nuclease activity, and a phosphate group is generated.
  • an enzyme containing ligase activity acts to link two oligonucleotides.
  • Fig. 1 (2) shows a case where a wild-type first oligonucleotide and a second oligonucleotide act on a polymorphic nucleic acid.
  • the third end of the wild-type first oligonucleotide is non-complementary to the polymorphic site, so it should be neutralized.
  • the G at the 5 'end of the second oligonucleotide is not complementary because it is not complementary to the polymorphic site.
  • an enzyme containing nuclease activity cannot cleave the 5th and 5nd ends of the second oligonucleotide. Therefore, an enzyme containing ligase activity cannot act and the two oligonucleotides are not linked.
  • the target nucleic acid is a wild-type nucleic acid
  • the result is opposite to that in FIG. 1, and the polymorphic first oligonucleotide and the second oligonucleotide are not linked, and the wild-type first oligonucleotide and A second oligonucleotide is linked.
  • the target nucleic acid is a homologue of only the polymorphic nucleic acid
  • only the linked polymorphic first oligonucleotide and second oligonucleotide are obtained, and the target nucleic acid is only the wild-type nucleic acid.
  • a 1: 1 mixture will be obtained.
  • FIG. 1 illustrates the case of one type of base polymorphism for easy explanation.
  • the present invention provides a method for measuring at least one type or two or more types of base polymorphisms.
  • at least the fluorescent labels for labeling the first oligonucleotide for wild type and for the polymorphism are different! / If there is a difference, the first oligonucleotide and the second oligonucleotide for identifying multiple types of nucleotide polymorphisms
  • An oligonucleotide may be mixed and an enzyme containing nuclease activity and an enzyme containing ligase activity may be allowed to act in the same reaction system.
  • an enzyme containing nuclease activity and an enzyme containing ligase activity may be allowed to act in the same reaction system.
  • a solid phase in which multiple types of detection probes for detecting these nucleotide polymorphisms are immobilized without crossing each type is used. This is possible.
  • the enzyme containing nuclease activity and the enzyme containing ligase activity a DNA microarray with the above detection oligonucleotides immobilized May be used. Advantages of using DNA microarrays Considering cost and ease of operation, it is advantageous.
  • the present invention also provides a detection system using a DNA microarray that is convenient and advantageous in terms of cost.
  • the detection probe used in the present invention requires a base sequence that includes a nucleotide polymorphism part, and preferably has a strength of at least 15 consecutive bases, more preferably at least 18 consecutive bases.
  • those containing a sequence complementary to a part of the second oligonucleotide, or those containing a sequence complementary to a part of the first oligonucleotide and a part of the second oligonucleotide are good.
  • the detection probe can be prepared by chemical synthesis or biological methods using DNA, RNA, or PNA as long as it forms a complementary strand with a specific nucleic acid sequence.
  • D of Perkin Elma It can be synthesized by phosphoramidite method using NA synthesizer type 391. Purification may be carried out with FPL C on a MONO-Q column or reverse phase column.
  • Other synthesis methods include the phosphoric acid triester method, the H-phosphonate method, and the thiophosphite method.
  • the polymorphic sequence portion of the detection probe may be a mixed base.
  • the mixed base means a base including a base complementary to either the wild type or the polymorphic force.
  • the polymorphic sequence portion may be a base of T or G.
  • a specific adjustment method will be described with an example. It can be synthesized by mixing T and G at the time of synthesis by the phosphoramidite method or the like.
  • the ratio of the bases in the detection probe varies depending on the synthesis ratio of mixing, but the ratio can be selected if a desired signal is obtained. Preferably, 1: 1 is good.
  • the case where the wild type is C and the polymorphism is A has been described as an example. However, when there are multiple polymorphisms, there may be more than three types of mixed bases.
  • a DNA microarray using the detection probe to be used in the present invention an existing method may be used.
  • Known methods for producing a DNA microarray include a method of directly synthesizing a probe on the surface of a solid support (on-chip method) and a method of fixing a probe prepared in advance on the surface of a solid substrate.
  • the DNA microarray is preferably prepared by the latter method.
  • a probe having a functional group introduced therein is synthesized, and the probe is spotted on the surface of the solid phase substrate that has been surface-treated and covalently bonded (for example, Lamture,
  • a probe is covalently bonded to a surface-treated solid phase substrate via a spacer or a crosslinker.
  • a method of aligning a small piece of polyacrylamide gel on a glass surface and covalently binding a probe to it (Yershov,
  • the DNA microarray of the present invention can be produced by any of the above methods.
  • spotting when spotting is performed by dropping a probe onto the surface of a solid phase substrate, it can be performed by a pin method, or an ink disclosed in JP-A-2001-116750 or JP-A-2001-186881. It is also possible to adopt a jet method. After spotting, each spot is fixed on a solid phase substrate by cooling, adding moisture to the spot (humidity is kept at about 80% for a certain period of time), immobilizing treatment by baking and drying, etc. Can be completed.
  • the solid phase substrate of the DNA microarray can be obtained by using plastic, silicone, ceramic, etc., in addition to the glass (slide glass) used for ordinary DNA microarrays.
  • the DNA microarray provided by the present invention and the first and second oligonucleotides linked by ligase are at least about 26 to 70 bases, the reactivity with the detection probe is good on the DNA microarray. Has the feature that it can be easily operated
  • a first oligonucleotide for wild type in order to identify a single-base polymorphism, a first oligonucleotide for wild type, a first oligonucleotide for polymorphism labeled with fluorescent substances having different fluorescence wavelengths, and a second oligonucleotide are used. If one type of nucleotide is prepared for each, it is sufficient to prepare at least one type of detection probe containing a mixed base. Therefore, the present invention is far superior to the conventional method in simultaneously measuring a plurality of types of polymorphs.
  • the present invention can greatly contribute to speeding up, efficiency, etc. in the industrial field of those skilled in the art.
  • the detection probe on the DNA microarray for detection removes the base sequence that does not form a base pair that occurs in the sequence portion of the base polymorphism when each oligonucleotide is hybridized, and then acts on the ligase activity. It has the characteristic that it can detect the binding substance of the 1st oligonucleotide and 2nd oligonucleotide couple
  • the first and second oligonucleotides may be labeled in advance with an enzyme, piotin, a fluorescent substance, a hapten, an antigen, an antibody, a radioactive substance, a luminophore, or the like as described above.
  • Table 1 shows the genes to be measured and SNP sites.
  • an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 30 (see Table 2) (hereinafter sometimes abbreviated as Oligo 1 to 30) is a DNA synthesis contractor. (Japan Bioservice Co., Ltd., Saddy Co., Ltd., GENSET)
  • Oligo 16-20 is separately mixed 1: 1 with the spot solution (Matsunami Glass Industrial Co., Ltd .: DSP0050).
  • the mixed oligonucleotide solution is spotted on a slide glass for DNA microarray (Matsunami Glass Industrial Co., Ltd .: SDA0011). Put it in a wet box and leave it overnight. After drying, lightly wash with water and leave overnight in 1% BSA aqueous solution. Lightly wash with water twice, then centrifuge (2000 rpm, 2 minutes) and dry.
  • first and second oligonucleotides are hybridized with a specific nucleic acid, ligase activity and nuclease activity are allowed to act sequentially and Z or simultaneously, and then the presence or absence of the linked first and second oligonucleotides is determined.
  • the present invention provides a method for determining a sequence portion of a nucleotide polymorphism by detecting an array to which a detection probe is bound. The nuclease activity causes the phosphate group to protrude from the 5th and the 5th ends of the second oligonucleotide, thus eliminating the reaction of binding the phosphate group when preparing the oligonucleotide.
  • the present invention also provides a method in which several nucleotide polymorphisms simultaneously act on nuclease activity and ligase activity in at least one reaction system. Furthermore, since the first and second oligonucleotides ligated with ligase are at least about 26 to 70 bases, they have a feature that they can be easily manipulated on an array having good reactivity with the detection probe. According to the present invention, since a plurality of nucleotide polymorphisms can be easily detected, it is expected to greatly contribute to the industry.

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Abstract

【課題】本発明の目的は、試料中に含まれる複数の塩基多型の種類を、容易に、同時検出するのに優れた核酸配列分析法を提供することにある。 【解決手段】複数種類の塩基多型を測定すべき試料と、複数種類の第一オリゴヌクレオチドと、複数種類の第二オリゴヌクレオチドとを、ハイブリダイゼーションさせ、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性含む酵素とを用いて第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成させ、該連結オリゴヌクレオチドに相補的配列を有する検出用プローブを用いて該連結オリゴヌクレオチドの種類を同定することによって、試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する。

Description

明 細 書
塩基多型の同定方法
技術分野
[0001] 本発明は、核酸配列の分析法に関する。さら〖こ詳しくは、試料中に含まれる複数の 塩基多型を同時に検出することができる核酸配列分析法に関する。本発明の核酸配 列分析法は、遺伝子工学や分子生物学及びこれらに関連する産業分野において有 用である。
背景技術
[0002] 本発明において、塩基多型とは野生型とは異なる配列を有する遺伝子型であって、 多型遺伝子は薬物代謝において副作用および治療失敗の発生において個体間変 動の原因として重要な役割を果たして 、る。また体質として知られる基礎代謝等の個 人差の原因としても知られている。その上、これらは多数の疾患の遺伝マーカーとし ての働きもする。それゆえ、これら突然変異の解明は臨床的に重要であり、ルーチン の表現型分類が臨床研究における精神医学患者および自発志願者にとって特に推 奨される（例えば、非特許文献 1及び 2参照)。それゆえ、原因となる多型遺伝子の同 定に続くそれぞれの遺伝子型の検出用の核酸配列分析法が所望される。
[0003] 従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法 (シークェンシング法） がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる塩基多型を検出、同定することが できるが、铸型核酸の調製、ポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸 配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークェ ンサーを用いることで省力化は行うことができる力 高価な装置が必要であるという問 題がある。
[0004] 他の方法として、サザンハイブリダィゼーシヨン法がある（例えば、非特許文献 3参 照)。この方法によれば、標識された DNAプローブと相補的な塩基配列を持つ DNA の領域を同定することができる。即ち、サザンハイブリダィゼーシヨン法では、核酸断 片をァガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの平板上で電気泳動させ、断片の大きさ
(長さ）によって分離した後、変性させて一本鎖とし、その平板に-トロセルロースや ナイロン等のメンブランを張り付け、核酸断片を電気泳動パターンそのままにトランス ファーし、固定した後、 RI (放射性同位体)等で標識した塩基多型特異的 DNAプロ ーブとハイブリッドを形成させ、プローブに相補的なメンブラン上の核酸断片をオート ラジオグラフィ一等により検出する。
[0005] サザンハイブリダィゼーシヨン法によれば、 目的とする核酸断片の電気泳動位置や 分子量を決めることができるが、電気泳動やオートラジオグラフィ一等の操作に長時 間を要し、迅速に分析を行うことができないこと、塩基多型特異的 DNAプローブとハ イブリダィゼーシヨンした力否かだけで検出するため、プローブの特異性を厳密にし ないと、塩基多型の有無を検出するための類似配列を識別することが困難である等 の問題があった。
[0006] 他に、酵素を用いた核酸配列の識別方法として、リガーゼを用いた方法 (例えば、 特許文献 1及び 2参照）や、ヌクレアーゼを用いた方法 (例えば、特許文献 3参照）が 知られている。リガーゼを用いる方法として良く知られるオリゴヌクレオチド連結アツセ ィ（"OLA")において、所望の標的領域にまたがる 2つのプローブまたはプローブェ レメントが標的領域にハイブリダィズされる。プローブエレメントが隣接の標的塩基と 塩基対になると、プローブエレメントの向かい合う末端は、連結反応により、例えばリ ガーゼ処理により結ばれる。連結プローブエレメントは検定されて、標的配列の存在 が明らかにされる。
[0007] 近年、標的遺伝子における多数の配列の各々の存在 '不存在を検出するのに有用 な方法に関して、（例えば、遺伝子スクリーニング分野において)必要性が増大して いる。例えば 400種もの変異が嚢胞性線維症に関連している。この疾患に対する遺 伝子的前処置のためのスクリーニングにおいて、 "嚢胞性線維症"の積極的な同定を 行うために、対象者のゲノム DNAにおける可能性のある相違する遺伝子配列変異 のすベてを検査することが最適である。 1回のアツセィで可能性ある変異部位のすべ ての存在 ·不存在を検査するのが理想的である。
[0008] そのような多数の塩基多型解析方法として、複数の検出用オリゴヌクレオチドプロ一 ブを固相に結合した、 DNAマイクロアレイ（DNAチップ）と呼ばれる固相を用いたハイ ブリダィゼーシヨンアツセィ方法がある。し力し、固相ハイブリダィゼーシヨンアツセィに おいては、多数の液体処理工程を必要とし、単一ヌクレオチド 'ミスマッチ識別に要す るストリジェンシィを保持するために、いくつかのインキュベーションおよび洗浄温度を 注意深くコントロールしなければならな 、。最適ハイブリダィゼーシヨン条件がプロ一 ブ配列によって大きく変わるので、この方法の多重化は困難である。
[0009] この問題を、 1種の多型配列あたり数十本のオリゴヌクレオチドを用いて、 DNAマイ クロアレイにより多型を解析可能にした方法も開示されている（例えば、特許文献 4参 照)。この方法によると、それぞれの多型性形態に基づいて並べられた (tiled)プロ一 ブの特殊ィ匕されたアレイを用いて分析する。並べ付け (tiling)は、関連する固定ィ匕プ ローブの群の使用をいい、その 、くつかが参照配列に対して完全な相補性を示し、 そして他のものは参照配列力 のミスマッチを示す (例えば、特許文献 5参照)。しか しこの方法では、 1種の多型に数十本のオリゴヌクレオチドを用いるため、非常にコス トが力かる方法である。
[0010] また、チトクローム P450の 1種の多型を、 240本ものプローブで検出する手法も知 られている力 多くのプローブを作製せねばならず、コストがかかる。また、この方法を 用いて複数種類の多型を同定するには、さらに多くのプローブを必要とするので、不 慮の非特異的反応も懸念される。非特異的反応を少なくするためには、厳密なプロ ーブ設計が必要となるが、膨大な量の組み合わせを検討せねばならな 、。
[0011] 複数の多型について、リガーゼにより、多型特的にオリゴヌクレオチドを連結して、 D NAマイクロアレイで測定する方法も開示されている（例えば、特許文献 6参照)。この 方法では DNAマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドは少なくできる力 オリゴヌクレオ チドの連結にリガーゼしか用いていないので、末端にリン酸基を結合したオリゴヌタレ ォチドが必要でありコストが高ぐまた、リン酸基のオリゴヌクレオチドと隣接すればど のオリゴヌクレオチドとも連結反応が起こり、非特異的連結が生じやすい。特に解析 する多型が増えるほどその危険性は高くなる。
[0012] 特許文献 1 :特公平 6—44880号
特許文献 2：特許第 2622255号
特許文献 3 :特開平 3—43098号
特許文献 4:特開 2002— 514091号 特許文献 5 : EP730663号
特許文献 6：特開 2000 - 511060号
非特干文献 1： European Consensus Conference on Pharmacogenetics.
Commission of the European Communities, Luxembourg 第 87〜9 6頁（1990年発行）
非特許文献 2 : European Journal Of Clinical Pharmacology 第 36卷、第 5 51〜554頁（1989年発行）
非特許文献 3：ラボマニュアル遺伝子工学増補版、 第 70〜75頁（1996年発行） 図面の簡単な説明
[0013] [図 1]本発明の反応機序の一部の例を示した図
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 従来技術では、塩基多型を解析するために、高価な機器を必要としたり、厳密なプ ローブの特異性が必要であったり、操作に長時間要したりといった問題があった。ま た、多数の塩基多型を同時に解析する場合にも、注意深い操作が必要であったり、 非特異的連結反応が生じたりといった問題があった。従って、本発明の目的は、試料 中に含まれる複数の塩基多型の種類を、容易に、同時検出するのに優れた核酸配 列分析法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決でき ることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、複数の塩基多型を同時に 同定する方法に関する。
1.試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、複数種 類の塩基多型を測定すべき試料と複数種類の第一オリゴヌクレオチドと複数種類の 第二オリゴヌクレオチドをノヽイブリダィゼーシヨンさせ、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と リガーゼ活性を含む酵素とを用いて第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチド とを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成させ、該連結オリゴヌクレオチドに相補的配 列を有する検出用プローブを用いて該連結オリゴヌクレオチドの種類を同定すること を特徴とする複数塩基多型同定方法。
2.第一オリゴヌクレオチドに塩基多型の配列部分と相補的な配列が含まれることを 特徴とする 1の複数塩基多型同定方法。
3.第二オリゴヌクレオチドに塩基多型の予想される配列部分と相補的でな!、配列が 含まれることを特徴とする 1の複数塩基多型同定方法。
4.第二オリゴヌクレオチドの 5'末端に塩基多型の予想される配列部分と相補的でな い配列が含まれることを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
5.第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを、塩基多型の予想される配列 部分を含む標的核酸に接触させたときに、塩基多型の予想される配列部分において 少なくとも 1塩基以上オーバーラップするように設計されて ヽることを特徴とする 1〜3 のいずれかの複数塩基多型同定方法。
6.第一オリゴヌクレオチドが、予め標識されていることを特徴とする 1〜3のいずれか の複数塩基多型同定方法。
7.標識が酵素、ピオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質、発光団 および特定の核酸配列力 なる群力 選ばれたいずれかの方法であることを特徴と する 6の複数塩基多型同定方法。
8.野生型を検出するための第一オリゴヌクレオチドと、多型を検出するための第一ォ リゴヌクレオチドが、それぞれの異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識されて ヽる ことを特徴とする 6又は 7の複数塩基多型同定方法。
9.検出用プローブを用いて連結オリゴヌクレオチドを検出する方法が、ノ、イブリダイ ゼーシヨンであることを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
10.検出用プローブが、少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を 含むことを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
11.検出用プローブが、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの 一部に相補的な配列を含むことを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定 方法。
12.検出用プローブが多型配列の部分を含んでいることを特徴とする 1〜3のいずれ かの複数塩基多型同定方法。
13.検出用プローブの多型配列の部分が、ミックス塩基であることを特徴とする 12の 複数塩基多型同定方法。
14. 1種類以上の検出用プローブが、固相に固定されていることを特徴とする 1〜3 のいずれかの複数塩基多型同定方法。
15.検出用プローブを固定した固相が DNAマイクロアレイであることを特徴とする 14 の複数塩基多型同定方法。
16.連結オリゴヌクレオチドを増幅反応により増幅した後、検出することを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
17.増幅方法が、 PCR、 NASBA、 LCR、 SDA、 RCRおよび TMAよりなる群から 選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする 16の複数塩基多型同定方法。
18.試料が予め増幅された核酸であることを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基 多型同定方法。
19.増幅方法が、 PCR、 NASBA、 LCR、 SDA、 RCRおよび TMAよりなる群から 選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする 18の複数塩基多型同定方法。
20.ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び Z又は同 時に用いることを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
21.ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一であることを 特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
22.ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1ヌクレアーゼ、ェ キソヌクレアーゼ I〜VIIからなる群力 選択される少なくとも 1種の酵素であることを特 徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
23.リガーゼ活性を含む酵素が T4DNAリガーゼ、 Ecoli DNAリガーゼ、 RNAリガ一 ゼカ なる群力 選択される少なくとも 1種の酵素であることを特徴とする 1〜3の ヽず れかの複数塩基多型同定方法。
24.ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素である ことを特徴とする 1〜3のいずれかの複数塩基多型同定方法。
25.耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfoに由来することを特徴とする 24の複数 塩基多型同定方法。
26.ヌクレアーゼ活性を含む酵素が DNAポリメラーゼであることを特徴とする 1〜3の いずれかの複数塩基多型同定方法。
27. DNAポリメラーゼカ Tth由来の而熱性 DNAポリメラーゼ、 Taq由来の而熱性 D ΝΑポリメラーゼ、 KOD由来の而熱性 DNAポリメラーゼ及び Pfo由来の而熱性 DNA ポリメラーゼカもなる群より選ばれた 1種又は 2種以上の DNAポリメラーゼであること を特徴とする 26の複数塩基多型同定方法。
28.塩基多型が 1塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む 1〜3のいずれかの 複数塩基多型同定方法。
29.試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、
(1)該塩基多型の配列部分を含む複数種類の第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第 一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でノ、イブリダィズしない配列を 含む複数種類の第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び該第二オリゴヌクレオチドを、試料中に含まれる染 色体又は核酸断片とハイブリダィズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダィズした時に、塩基多型の配列部分で該第 二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しな 、塩基配列を、ヌクレアーゼ活性を 含む酵素により除去した後、リガーゼ活性を含む酵素を作用させることにより、該オリ ゴヌクレオチドを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成し、
(4)該連結オリゴヌクレオチドを、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的 な複数種類の検出用プローブ、および/または、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドと 該第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な複数種類の検出用プローブを用いて検 出することを特徴とする複数塩基多型同定方法。
30.試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって 、少なくとも下記の (0〜(ν)を含むことを特徴とするキット。
(0塩基多型の配列部分を含む 2種類以上の第一オリゴヌクレオチド
(ii)第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダィズしな 、配 列を含む 2種類以上の第二オリゴヌクレオチド (iii)ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(iv)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(V)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/また は、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出 用プローブ
31.試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって 、少なくとも下記の (0〜(vi)を含むことを特徴とするキット。
(0塩基多型の予想される配列部分にぉ 、て、多型を示す塩基と相補的な配列が含 まれる 2種類以上の多型第一オリゴヌクレオチド
(ii)塩基多型の予想される配列部分にぉ 、て、野生型を示す塩基と相補的な配列が 含まれる 2種類以上の野生型第二オリゴヌクレオチド
(m)多型型および Zまたは野生型第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の予想 される配列部分でノ、イブリダィズしない配列を含む 2種類以上の第二オリゴヌクレオ チド
(iv)ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(V)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(vi)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/また は、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出 用プローブ
32.検出用プローブが予め固定されている固相を含む 30または 31のキット。
33.固相が DNAマイクロアレイであることを特徴とする 30または 31のキット。
発明の効果
[0016] リガーゼ活性を含む酵素と、ヌクレアーゼ活性含む酵素を逐次及び Z又は同時に 用い、塩基多型特異的に連結されたオリゴヌクレオチドを、遺伝子特異的に検出する ことで、複数の塩基多型を容易に検出することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む染 色体又はその断片は、 目的の遺伝子の情報を担う塩基多型部位を含む標的核酸で あれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、 Alu配列、蛋白質をコードす る遺伝子のェキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。より具体的には、 遺伝病を含む各種疾患、薬物代謝、生活習慣病 (高血圧、糖尿病等）に関連する遺 伝子が挙げられる。例えば、高血圧として ACE遺伝子が挙げられる。
[0018] 本発明において、染色体又は核酸断片の多型核酸とは、野生型核酸のうち少なく とも 1つのヌクレオチドが点突然変異して他のヌクレオチドに置換されているものや、 野生型核酸の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸のことである。このような塩基多 型により体質等が異なっていることが解明されてきており、本発明の方法は試料中の 核酸がこのような予想される多型を有している力否かを検査する方法である。
[0019] 本発明における塩基多型を検出する方法においては、ヌクレアーゼ活性を含む酵 素とリガーゼ活性を含む酵素を逐次及び Z又は同時に用いることを特徴とする。該 活性は、例えば、酵素によって行うことができ、両活性を備えた酵素を使用することも 可能である。
[0020] 具体的には、ヌクレアーゼ活性を含む酵素としては、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1ヌ クレアーゼ、ェキソヌクレアーゼ I〜VII等を例示することができる。リガーゼ活性を含 む酵素としては、 T4DNA
リガーゼ、 E.coli DNAリガーゼ、 RNAリガーゼ等を例示することができる。ヌクレア一 ゼ活性を含む酵素とリガーゼ活性を含む酵素は、耐熱性酵素であることが好まし ヽ。 例えば、耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KOD、 Pfoに由来するのがよい。また、ヌクレアーゼ 活性を含む酵素が DNAポリメラーゼであってもよい。例えば、 Tth、 Taq、 KOD、 Pfo由 来の耐熱性 DNAポリメラーゼを用いても良 、。
[0021] 本発明の塩基多型の検出方法の具体的態様としては、試料中に含まれる複数の塩 基多型を同定する方法であって、
(1)塩基多型の配列部分を含む第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第一オリゴヌタレ ォチドがハイブリダィズするストランド鎖の核酸と相補的で、該第一オリゴヌクレオチド に隣接してハイプリし、該塩基多型の配列部分が多型のどちらの配列とも相補鎖を 形成しない配列を含む第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを、核酸とハイブリダィズさせ (3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダィズした時に生じる塩基多型の配列部分で
、第二ヌクレオチドが有する塩基対を形成しな!、塩基をヌクレアーゼ活性を含む酵素 により除去する。この時、リン酸基が残って塩基が除去される。すなわち、ヌクレア一 ゼ活性を含む酵素により初めてリン酸基が生成されて、リガーゼ活性を含む酵素によ り第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドが連結される。この連結されたオリ ゴヌクレオチドを検出することで、試料中に含まれる特定の核酸配列の塩基多型を同 定する方法である。
[0022] 具体的には、第一オリゴヌクレオチドは、塩基多型の予想される配列部分と相補的 な塩基を含むオリゴヌクレオチドである。好ましくは、該塩基多型が予想される部分は 、第一ヌクレオチドの 3，末端がよい。
[0023] 第二オリゴヌクレオチドは、第一オリゴヌクレオチドよりも 3，側に位置するのが好まし い。第二オリゴヌクレオチドの特徴として、塩基多型の予想される配列部分と相補的 でない塩基を含むオリゴヌクレオチドであるのがよい。好ましくは、塩基多型の予想さ れる配列部分と相補的でない塩基は第二オリゴヌクレオチドの 5'末端にあるのがよ い。
[0024] さらに詳細に、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの設計方法を説明 すると、塩基多型の予想される配列部分を含む標的核酸に第一オリゴヌクレオチドと 第二オリゴヌクレオチドとを接触させたときに、塩基多型の予想される配列部分にお V、て少なくとも 1塩基以上オーバーラップするように設計するのがよ 、。オーバーラッ プさせるためには、第一オリゴヌクレオチドの 3 '末端は塩基多型の予想される配列部 分とハイブリダィズするように設計し、第二オリゴヌクレオチドの 5，末端は塩基多型の 予想される配列部分とハイブリダィズしな 、ように設計するのがよ 、。第二オリゴヌク レオチドの 5 '末端で、塩基多型の予想される配列部分とハイブリダィズしない長さは 、少なくとも 1塩基上であればよい。この第二オリゴヌクレオチドの 5，末端で塩基多型 の予想される配列部分とハイブリダィズしな ヽ塩基を、ヌクレアーゼ活性により除去し たときに、リガーゼ活性を含む酵素により第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオ チドが結合できるように設計すればよ!、。 [0025] 本発明における第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの長さとしては、 13 〜35塩基、好ましくは、 16〜30塩基である。例えば、第一オリゴヌクレオチドの 3 '末 端塩基が塩基多型部位の予想されるオリゴヌクレオチドになるように設計し、野生型 第一オリゴヌクレオチドは野生型核酸の該塩基と相補的な塩基、及び多型第一オリ ゴヌクレオチドは多型核酸の該塩基と相補的な塩基を配置させる。さらに、第二オリ ゴヌクレオチドの 5，末端が第一オリゴヌクレオチドと 1塩基オーバーラップするよう設 計する場合は、該第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップする塩基は、野生型、多 型とも、相補的な塩基以外のもの選択する。野生型、多型共に相補的でない塩基を 選択することによって、第二オリゴヌクレオチドは 1種類の塩基多型を測定する場合に は 1種類調製するのみでよい。
[0026] このように設計した場合、野生型第一オリゴヌクレオチド Z第二オリゴヌクレオチド Z 野生型核酸、及び多型第一ヌクレオチド Z第二オリゴヌクレオチド Z多型核酸の組 合せにおいてのみ、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップする部分を除いて、完 全に一致する為、ヌクレアーゼ活性を含む酵素により第二オリゴヌクレオチドのォー バーラップする塩基が除去される。この時、リン酸基を残して除去されるため、リガ一 ゼ活性を含む酵素を作用させることによって、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌク レオチドは連結して 1本になる力 野生型第一オリゴヌクレオチド/第二オリゴヌタレ ォチド Z多型核酸、及び多型第一ヌクレオチド Z第二オリゴヌクレオチド Z野生型核 酸の組合せにおいては、第一オリゴヌクレオチドの 3 '末端が相補的にならないので、 リガーゼ活性を含む酵素による連結が起こらない。
[0027] ヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素
本発明にお！、ては、上記野生型第一オリゴヌクレオチドと多型第一オリゴヌクレオチ ドを、同時に作用させる。
0上記第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを塩基多型を含む染色体 又は核酸断片にハイブリダィズさせる。ノ、イブリダィズさせる条件は、通常行われる条 件でよい。例えば、モレキュラークローユング（1989年発行）に記載の方法に従って 、行うことができる。
ii)次に第二オリゴヌクレオチドのオーバーラップした部分を、ヌクレアーゼ活性を含 む酵素を用いて切断する。使用できる酵素活性としては、上述したとおりである。好ま しくは、ェキソヌクレアーゼ活性が好ましぐ DNAポリメラーゼ等のェキソヌクレアーゼ が好ましい。
第二オリゴヌクレオチドの 5 '末端が第一オリゴヌクレオチドとオーバーラップしてい る場合には、 5，ェキソヌクレアーゼを用いて、第二オリゴヌクレオチドのオーバーラッ プしている部分を切断し、リン酸基を突出させる。
iii)同時に、第二オリゴヌクレオチドの 5，側に突出したリン酸基と、第一オリゴヌタレ ォチド 3'側とをリガーゼ活性を含む酵素を用いて結合させ、 1本のオリゴヌクレオチド にする。
[0028] 本発明において、第一オリゴヌクレオチド中の塩基多型に対応する部位が相補的 でないと、エンドヌクレアーゼで切断されても、塩基多型に対応する部位が相補的で ないため、リガーゼ活性によって 1本のオリゴヌクレオチドに結合することができない。
[0029] 野生型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸にヌクレアーゼ活性を含む酵素及 びリガーゼ活性を含む酵素を用いた場合、試料核酸が野生型であれば 1本鎖となる 1S 多型では反応が起きない。逆に、多型第一オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸 にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を用いた場合、試料核 酸が多型であれば 1本鎖となる力 野生型であれば反応は起こらない。特に、ヒトを始 め、高等生物は、 1種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子 をそれぞれ 1つずつ有している力 この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモ 力 多型のホモか、ヘテロかを区別することもできる。
[0030] 本発明では、測定した!/、複数種類の塩基多型を、同一の反応系でヌクレアーゼ活 性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させる方法も提供する。本発明で 複数種類とは、少なくとも 1種類又は 2種類以上の塩基多型を測定することを意味す る。複数種類の塩基多型を同定する場合、別々の反応系でヌクレアーゼ活性を含む 酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させる方法も実施しても良いが、同一の反 応系で実施すれば更に簡便性が向上し、コスト的にも更に有利となる。複数種類の 塩基多型を少なくとも 1種類の反応系で同時にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガ ーゼ活性を含む酵素を作用させる場合は、野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオ チドに異なる標識、例えば蛍光波長が区別できる蛍光標識を付与することが好ましい 。少なくとも野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光標識が異な つて!/、れば、複数種類の塩基多型を同定するための第一オリゴヌクレオチドと第二ォ リゴヌクレオチドが混在して ヽても構わな 、。
[0031] 標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、上記ハイブリダィゼー シヨンをする前に、前記多型配列を含む核酸断片を以下に示す増幅反応によって、 増幅しておくことも可能である。上記増幅法としては特に限定されるものではないが、 PCR (Polymerase
chain reaction ;特公平 4 67960号公報、特公平4 67957号公報）、NASBA (N ucleic acia sequence-based
amplification method ; Nature 第 350卷、第 91頁 (1991))、 LCR (W089/12696、特 開平 2- 2934号など）、 SDA (Strand
Displacment Amplification； Nucleic Acids Res. 第二 0卷、第一 691頁 (1992))、 RCR (WO90/01069 TMA (Transcription
Mediated amplification Method ;J.Clin.Microbiol. 第 31卷、第 3270頁 (1993))などが 挙げられ、 V、ずれにお ヽても適用することが可能である。
[0032] また、ヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させて、ォ リゴヌクレオチドを結合させた後、結合産物を上記に示す増幅反応において増幅す ることで検出可能にすることも可能である。この時、第一オリゴヌクレオチドの 5 '末端 側と第二オリゴヌクレオチドの 3 '末端側に、増幅反応に用いるプライマーが作用する 配列を付加しておくこともできる。
[0033]
上記反応によって得られる連結したオリゴヌクレオチドを、検出用プローブを用 、て 以下のようにして検出する。
[0034] 第一オリゴヌクレオチドに予め標識を賦することが好ま 、。その場合は、合成時に ピオチン、リンカ一アーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドまたはオリゴ dGTP、オリ ゴ dATP、オリゴ dTTP、オリゴ dCTP等を 5，末端に付加し修飾基を導入しても良い。 あるいはピオチン、リンカ一アーム、蛍光物質等を有するヌクレオチドをオリゴヌクレオ チド配列中のヌクレオチドの替わりに置換して合成し修飾基を導入しても良い。ある いは合成したヌクレオチドに後から32 P、 35Sなどの放射性物質、 ALP、 PODなどの酵 素、 FITC、 HEX, 6-FAM、 TETなどの蛍光物質など、公知のオリゴヌクレオチドの標 識物を導入しても良い。あるいは野生型第一オリゴヌクレオチドと塩基多型第一オリ ゴヌクレオチドに、それぞれ異なるオリゴヌクレオチド配列を付加してぉ 、てもよ!/、。
[0035] 具体的には、例えば、蛍光物質等で標識した第一オリゴヌクレオチドと、第二オリゴ ヌクレオチドを用いて特定核酸とハイブリダィズさせ、リガーゼ活性を含む酵素とヌク レアーゼ活性を含む酵素を逐次及び Z又は同時に作用させた後、解離させ、固相 に結合させた多型に特異的な検出用プローブ及び野生型に特異的な検出用プロ一 ブとハイブリダィズさせ、ハイブリダィズしな力つた核酸を洗いだし、各検出用プロ一 ブとハイブリダィズした核酸の第一オリゴヌクレオチドの標識によりハイブリダィズした か否かを検出し、各検出用プローブの検出シグナルの比により塩基多型が野生型か 多型もしくは混合型であるのかを同定する方法が挙げられる。
[0036] 野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドに異なる標識、例えば色の異なる蛍光 標識を付与することで、野生型及び多型の検出を塩基多型部分の配列にミックス塩 基を用いた 1つの検出用プローブで行うこともできる。
[0037] 野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドに異なる標識、例えば蛍光波長が区別 できる蛍光標識を付与して、複数種類の塩基多型を少なくとも 1種類の反応系で同 時にヌクレアーゼ活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させてもよい 。この場合、少なくとも野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光 標識が異なっていれば、複数種類の塩基多型を同定するための第一オリゴヌクレオ チドと第二オリゴヌクレオチドが混在して 、ても構わな 、。野生型用と多型用の第一 オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光標識は、蛍光波長が区別できればよぐ更に好ま しくは発色の異なる蛍光色素がよい。特に限定されないが、例えば、野生型用の第 一オリゴヌクレオチドの 5，末端を Cy3、多型用の第一オリゴヌクレオチドの 5，末端を Cy5で標識すればよぐまた、その逆の標識でもよい。
[0038] 図を用いて本発明の反応機序の一部の例を説明するが、これにより本発明が限定 されるものではない。図 1では、標的核酸を多型核酸とし、 5'末端が Cy3により修飾 された野生型第一オリゴヌクレオチドと 5'末端が Cy5により修飾された多型第一オリ ゴヌクレオチドを用いた場合を一例として示して 、る。
[0039] この例の場合、第 2オリゴヌクレオチドにおいてその 5，末端に「塩基多型の予想され る配列部分」が設定されて!、るとともに「塩基多型の予想される配列部分」と相補的で ない塩基が設定されている。なお、この場合、第 2オリゴヌクレオチドの 5，末端に位置 する塩基は、標的核酸が野生型の場合も相補的でない塩基を設定するのがよい。ま た、この例の場合、多型第一オリゴヌクレオチドの 3，末端の Aと、第 2オリゴヌクレオチ ドの 5'末端の Gがオーバーラップするよう設計されている。また、野生型第一オリゴヌ クレオチドの 3，末端の Cと、第 2オリゴヌクレオチドの 5，末端の Gがオーバーラップす るよう設計されている。
[0040] 図 1の（1)では、多型核酸に多型第一オリゴヌクレオチドと第 2オリゴヌクレオチドが 作用するケースを示している。この場合、多型第一オリゴヌクレオチドの 3，末端の A は多型部位にハイブリダィズしており、その隣接する部位には第二オリゴヌクレオチド の 5，末端から 2番目の Tがハイブリダィズしている。なお第二オリゴヌクレオチドの 5， 末端の Gは、多型部位に非相補なのでノヽイブリダィズしていない状態である。この場 合、ヌクレアーゼ活性を含む酵素の作用により、第二オリゴヌクレオチドの 5，末端の G が切断されるとともに、リン酸基が生成される。ここにリガーゼ活性を含む酵素が作用 させ、二つのオリゴヌクレオチドを連結させる。
[0041] 図 1の（2)では、多型核酸に野生型第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチド が作用するケースを示している。この場合、野生型第一オリゴヌクレオチドの 3，末端 は多型部位に非相補なのでノヽイブリダィズして ヽな 、。なお第二オリゴヌクレオチド の 5'末端の Gは、多型部位に非相補なのでノヽイブリダィズしていない状態である。こ の場合、ヌクレアーゼ活性を含む酵素は、第二オリゴヌクレオチドの 5，末端の G切断 できない。従って、リガーゼ活性を含む酵素は作用できず、二つのオリゴヌクレオチド は連結されない。
[0042] 標的核酸が野生型核酸の場合の図は示していないが、図 1と反対の結果となり、多 型第一オリゴヌクレオチドと第 2オリゴヌクレオチドが連結されず、野生型第一オリゴヌ クレオチドと第二オリゴヌクレオチドが連結される。 [0043] 図 1のケースの場合、標的核酸が多型核酸だけのホモの場合は、多型第一オリゴヌ クレオチドと第 2オリゴヌクレオチドの連結物だけが得られ、標的核酸が野生型核酸 だけのホモの場合は、野生型第一オリゴヌクレオチドと第 2オリゴヌクレオチドの連結 物だけが得られ、標的核酸が多型核酸と野生型核酸のへテロの場合は、両者の連 結物の比率がほぼ 1： 1の混合物が得られることになる。
[0044] 図 1ではわ力りやすく説明するために 1種類の塩基多型の場合を説明した力 本願 発明では、少なくとも 1種類又は 2種類以上の塩基多型を測定する方法を提供する。 すなわち、少なくとも野生型用と多型用の第一オリゴヌクレオチドの標識用の蛍光標 識が異なって!/、れば、複数種類の塩基多型を同定するための第一オリゴヌクレオチ ドと第二オリゴヌクレオチドが混在して、同一の反応系でヌクレアーゼ活性を含む酵 素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させてもよい。このように、複数種類の塩基多 型の検出に係る反応を同一の反応系で行った場合、下記に示す方法で検出するの がよい。
[0045] 複数種類の塩基多型を検出するには、これらの塩基多型を検出するための複数種 類の検出用プローブが、 1種類毎に交わることなく固定ィ匕された固相を用いることで 可能となる。複数種類の塩基多型を少なくとも 1種類の反応系で同時にヌクレアーゼ 活性を含む酵素及びリガーゼ活性を含む酵素を作用させた反応生成物を測定する ために、上記検出用オリゴヌクレオチドを固定した DNAマイクロアレイを用いても良い 。 DNAマイクロアレイを用いるの力 コストや操作の簡便性を考慮しても有利である。
[0046] 本発明では、利便性がよぐコスト的にも有利な DNAマイクロアレイを用いた検出系 も提供する。このような DNAマイクロアレイを作製するため、検出用プローブの設計方 法について説明する。本発明で使用される検出用プローブは、塩基多型部分を含み 、好ましくは連続した少なくとも 15塩基以上、より好ましくは連続した少なくとも 18塩 基以上力もなる塩基配列が必要である。また、第二オリゴヌクレオチドの一部に相補 的な配列を含むもの、もしくは、第一オリゴヌクレオチドの塩基多型部位を含む一部と 第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含むものがよい。検出用プローブは 特定核酸配列と相補鎖を形成すれば DNAでも RNAでも PNAでもよぐ化学合成ま たは生物学的な方法により調製することができる。例えば、パーキンエルマ一社の D NAシンセサイザー 391型を用いてホスホアミダイト法により合成できる。精製は FPL Cで MONO— Qカラムや逆相カラムにて実施しても良い。他の合成方法としてリン酸 トリエステル法、 H—ホスホネート法、チォホスファイト法等がある。
[0047] 検出用プローブの多型配列の部分が、ミックス塩基であっても良い。ミックス塩基と は、野生型と多型のいずれ力と相補的な塩基を含む塩基を意味する。具体的に例を 挙げると、多型配列の部分が、野生型が Cで多型が Aの場合には、 T又は Gの塩基 であればよい。具体的な調整方法を、例を挙げて説明すると、ホスホアミダイト法など により合成時に、 Tと Gを混合して合成すればよい。混合の合成比率により、検出プロ ーブ中の塩基の存在比率が異なってくるが、所望のシグナルを得た 、比率を選択す ればよい。好ましくは、 1 : 1がよい。野生型が Cで多型が Aの場合を例にあげて説明 したが、多型が複数になる場合には、ミックス塩基が 3種類以上になっても差し支えな い。
[0048] 本発明で、使用する検出用プローブを用いて DNAマイクロアレイを作製するため には、既存方法を用いても良い。 DNAマイクロアレイの作製方法としては、固相担体 表面で直接プローブを合成する方法 (オン'チップ法)と、予め調製したプローブを固 相基体表面に固定する方法とが知られている力 この発明の DNAマイクロアレイは後 者の方法で作製することが好ましい。予め調製したプローブを固相基体表面に固定 する場合には、官能基を導入したプローブを合成し、表面処理した固相基体表面に プローブを点着し、共有結合させる（例えば、 Lamture,
J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids
Res. 22:5456-5465, 1994)。プローブは、一般的には、表面処理した固相基体にス ぺーサ一やクロスリンカ一を介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲ ルの微小片を整列させ、そこにプローブを共有結合させる方法 (Yershov,
G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4913, 1996)、あるいはポリ L—リジンを被覆 した固相基体にプローブを結合する方法 (特開 2001— 186880号公報)も知られて 、 る。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプト アビジンを含むァガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電 させることでピオチンィ匕プローブを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳 密なハイブリダィゼーシヨンを可能にする方法も知られて 、る (Sosnowski,
R.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1119-1123, 1997)。この発明の DNAマイク ロアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。また、プローブを 固相基体表面に滴下させてスポッティングを行う場合には、ピン方式によって行うこと もできるし、特開 2001-116750号公報ゃ特開 2001-186881号公報に開示されているィ ンクジェット方式を採用する事も可能である。スポッティングの後は、冷却、スポットに 対する水分付加 (湿度〜 80%程度に一定時間保持)、焼成乾燥による固定化処理等 を行うことによって、各スポットを固相基体上に固定し、 DNAマイクロアレイを完成する ことができる。なお、 DNAマイクロアレイの固相基体は、通常の DNAマイクロアレイに 使用されるガラス (スライドガラス)の他、プラスチック、シリコーン、セラミック等を使用 することちでさる。
[0049] 本発明で提供する DNAマイクロアレイと、リガーゼで連結された第一及び第二オリ ゴヌクレオチドは、少なくとも 26塩基から 70塩基程度なので、検出プローブとの反応 性がよぐ DNAマイクロアレイ上において、容易に操作可能であるという特徴を有する
[0050] また、従来法の一例に従えば、 1塩基の多型を検出するために 240本ものプローブ を作製しなければならな力つた。本発明によれば、 1塩基の多型を同定するために、 異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識された野生型用の第一オリゴヌクレオチド と多型用の第一オリゴヌクレオチドと、第二オリゴヌクレオチドとを、それぞれ 1種類ず つ用意すれば、ミックス塩基を含む検出用プローブはすくなくとも 1種類作製するだ けでよい。従って、本発明は、複数種類の多型を同時に測定において、従来法より遙 かに優れている。また、プローブ数が少なくすむので、非特異反応の発生確率を低 減できる利点がある。非特異反応は、産業ィ匕時の障壁となることが多いので、本発明 は、当業者の産業分野において、スピードアップ、効率ィ匕などに大いに貢献できる。
[0051] キット
本発明において、キットとしては、
(0塩基多型の配列部分を含む 2種類以上の第一オリゴヌクレオチド
(ii)第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダィズしな 、配 列を含む 2種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iii)ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(iv)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(V)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な 2種類以上の検出用プローブ 、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に 相補的な 2種類以上の検出用プローブ
が含まれていてもよい。
[0052] また、本発明にお 、て、キットとしては、
(0塩基多型の予想される配列部分にぉ 、て、多型を示す塩基と相補的な配列が含 まれる 2種類以上の多型第一オリゴヌクレオチド
(ii)塩基多型の予想される配列部分にぉ 、て、野生型を示す塩基と相補的な配列が 含まれる 2種類以上の野生型第二オリゴヌクレオチド
(iii)多型型および Zまたは野生型第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の予想 される配列部分でノ、イブリダィズしない配列を含む 2種類以上の第二オリゴヌクレオ チド
(iv)ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(V)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(vi)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な 2種類以上の検出用プローブ 、および/または、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に 相補的な 2種類以上の検出用プローブ
が含まれていてもよい。
[0053] 検出用 DNAマイクロアレイ上の検出プローブは、各々のオリゴヌクレオチドがハイブ リダィズした時に塩基多型の配列部分で生じる塩基対を形成しない塩基配列をヌク レアーゼ活性により除去した後、リガーゼ活性を作用させることにより結合される第一 オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドの結合物を検出し得るものであるという 特徴を有する。また、第一及び第二オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、 ピオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質および発光団などによって 標識されていてもよい。 実施例
[0054] 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定され るものではない。
[0055] ( 1)遣伝早谐 fefflPCRプライマーおよびプローブの合成
測定する遺伝子と SNP部位を表 1に示す。この 5種類の SNPの同時解析をおこなう ために、配列番号 1〜30 (表 2参照）に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド ( 以下、オリゴ 1〜30と略すこともある）を DNA合成受託会社（(株）日本バイオサービス 、（株）サヮディー、 GENSET
KK、アマシャムフアルマシア バイオテク (株)等）に依頼した。
[0056] [表 1]
Figure imgf000022_0001
[0057] [表 2]
Figure imgf000022_0002
[0058] (2) Multi-PCRによる遣伝子の増幅 ヒト白血球からフエノール'クロロフォルム法により抽出した DNA溶液をサンプルとし て使用して、下記試薬を添加して、下記条件により Multi-PCRにより、 5種類の遺伝子 多型部位を含む核酸断片を増幅した。
[0059] 纏
以下の試薬を含む 25 IX 1溶液を調製した。
bTaq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ 1〜10 各々 2.5 pmol
X 10緩衝液 2.5 μ \
2mM dNTP 2.5 μ 1
bTaq DNAポリメラーゼ (東洋紡績 (株)） 1.25 U
抽出 DNA溶液 20 ng
[0060] 增幅条件
94。C '5分
94°C '30秒、 60°C '30秒、 72°C、 30秒（40サイクル）
72°C '2分
[0061] (3)ヌクレアーゼ リガーゼ反]^
(2)で増幅した反応液 20 μ 1に、以下の試薬 10 μ 1を加え反応混合液とした。
オリゴ 11〜25 各々 2.5pmol
X 10 bTaq緩衝液 1 1
200mM MgCl 1.2 ^ 1
2
lOOmM NAD 0.3 ^ 1
Tth DNA ligase (Epicentre Technology) 5U
rTaq DNAポリメラーゼ (東洋紡績 (株）） 0.625 U
アルカリフォスファターゼ (東洋紡績 (株)） 3U
[0062] 反応条件
37°C '30分
94。C '5分
94°C · 30秒、 60°C · 2分（ 15サイクル） [0063] (4)検出
(a) DNAマイクロアレイの作成
オリゴ 16— 20を別々に、スポット溶液 (松波ガラス工業株式会社: DSP0050)に 1： 1に 混合する。混合したオリゴヌクレオチド溶液を、 DNAマイクロアレイ用スライドガラス (松 波硝子工業株式会社: SDA0011)にスポットする。湿箱に入れて一晩放置。乾燥した 後、軽く水洗し、 1%BSA水溶液に一晩放置する。軽く水洗を 2回繰り返した後、遠心 機で、（2000rpm、 2分)遠心し乾燥させる。
[0064] (b)ハイブリダィゼーシヨン
(3)の反応液 2.5 μ 1に 0.6Ν NaOH溶液 2.5 μ 1カ卩ぇ混合する。混合液にハイブリ溶液（ 200mMクェン酸—リン酸緩衝液 (ρΗ6. 0)、 2%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）、 75 OmM NaCl、0. l%NaN )を 20 1加え、良く混和し、（a)で作成した DNAマイクロ
3
アレイにカバーグラスをかけ、その隙間より注入する。 55°Cで 2時間保温する。
[0065] (c)洗浄
2時間保温した後、 55°Cに保温した洗浄液 l (2 X SSC (pH7. 0)、 1%SDS)〖こいれ 20分放置。さらに室温で洗浄液 2 (250 iu lの50mMトリス—塩酸緩衝液(pH7. 5)、 0. 025% Tween20溶液）に入れ、 15分放置。最後に遠心機で、（2000rpm、 2分)遠 心し乾燥させる。
[0066] (d)測定
富士フィルム社製アレイスキャナ FLA8000で測定後、アレイゲイジ（富士フィルム社製 )ソフトで解析し、スポットの蛍光値を測定した。表 3からわ力るように、 5種類の SNPを 同時に解析し、多型が判別できた。
[0067] [表 3]
Figure imgf000024_0001
産業上の利用可能性 本発明は、第一及び第二オリゴヌクレオチドを特定核酸とハイブリダィズさせ、リガ ーゼ活性とヌクレアーゼ活性を逐次及び Z又は同時に作用させた後、連結した第一 及び第二オリゴヌクレオチドの存在の有無を、検出用プローブが結合したアレイで検 出することで、塩基多型の配列部分を判定する方法を提供する。ヌクレアーゼ活性に より、第二オリゴヌクレオチドの 5，末端にリン酸基を突出させるので、オリゴヌクレオチ ド作製時にリン酸基を結合させる反応を省略できる。また、ヌクレアーゼ活性によって 5'末端にリン酸基が突出した第二オリゴヌクレオチドのみし力連結反応が生じないた め、非特異的連結反応が軽減される。本発明では、数種類の塩基多型を少なくとも 1 種類の反応系で同時にヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を作用させる方法も提供 する。さらに、リガーゼで連結された第一及び第二オリゴヌクレオチドは少なくとも 26 塩基から 70塩基程度なので、検出プローブとの反応性がよぐアレイ上において、容 易に操作可能であるという特徴を有する。本発明により、複数の塩基多型を容易に検 出することができることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。

Claims

請求の範囲
[1] 試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、複数種 類の塩基多型を測定すべき試料と複数種類の第一オリゴヌクレオチドと複数種類の 第二オリゴヌクレオチドをノヽイブリダィゼーシヨンさせ、ヌクレアーゼ活性を含む酵素と リガーゼ活性を含む酵素とを用いて第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチド とを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成させ、該連結オリゴヌクレオチドに相補的配 列を有する検出用プローブを用いて該連結オリゴヌクレオチドの種類を同定すること を特徴とする複数塩基多型同定方法。
[2] 第一オリゴヌクレオチドに塩基多型の配列部分と相補的な配列が含まれることを特 徴とする請求項 1記載の複数塩基多型同定方法。
[3] 第二オリゴヌクレオチドに塩基多型の予想される配列部分と相補的でない配列が含 まれることを特徴とする請求項 1記載の複数塩基多型同定方法。
[4] 第二オリゴヌクレオチドの 5'末端に塩基多型の予想される配列部分と相補的でな い配列が含まれることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型 同定方法。
[5] 第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドとを、塩基多型の予想される配列部 分を含む標的核酸に接触させたときに、塩基多型の予想される配列部分において少 なくとも 1塩基以上オーバーラップするように設計されて!、ることを特徴とする請求項 1 〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[6] 第一オリゴヌクレオチドが、予め標識されていることを特徴とする請求項 1〜3のい ずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[7] 標識が酵素、ピオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射線物質、発光団ぉ よび特定の核酸配列からなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とす る請求項 6に記載の複数塩基多型同定方法。
[8] 野生型を検出するための第一オリゴヌクレオチドと、多型を検出するための第一オリ ゴヌクレオチドが、それぞれの異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識されているこ とを特徴とする請求項 6又は 7に記載の複数塩基多型同定方法。
[9] 検出用プローブを用いて連結オリゴヌクレオチドを検出する方法が、ノ、イブリダィゼ ーシヨンであることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定 方法。
[10] 検出用プローブが、少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な配列を含 むことを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[11] 検出用プローブが、少なくとも第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドの一 部に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩 基多型同定方法。
[12] 検出用プローブが多型配列の部分を含んでいることを特徴とする請求項 1〜3のい ずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[13] 検出用プローブの多型配列の部分が、ミックス塩基であることを特徴とする請求項 1
2記載の複数塩基多型同定方法。
[14] 1種類以上の検出用プローブが、固相に固定されていることを特徴とする請求項 1
〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[15] 検出用プローブを固定した固相が DNAマイクロアレイであることを特徴とする請求 項 14に記載の複数塩基多型同定方法。
[16] 連結オリゴヌクレオチドを増幅反応により増幅した後、検出することを特徴とする請 求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[17] 増幅方法が、 PCR、 NASBA、 LCR、 SDA、 RCRおよび TMAよりなる群から選ば れたいずれかの方法であることを特徴とする請求項 16に記載の複数塩基多型同定 方法。
[18] 試料が予め増幅された核酸であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の 複数塩基多型同定方法。
[19] 増幅方法が、 PCR、 NASBA、 LCR、 SDA、 RCRおよび TMAよりなる群から選ば れたいずれかの方法であることを特徴とする請求項 18に記載の複数塩基多型同定 方法。
[20] ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素を逐次及び Z又は同時 に用いることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法
[21] ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が、同一であることを特 徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[22] ヌクレアーゼ活性を含む酵素が、 Mung beanヌクレアーゼ、 S1ヌクレアーゼ、ェキソ ヌクレアーゼ I〜VIIからなる群力も選択される少なくとも 1種の酵素であることを特徴と する請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[23] リガーゼ活性を含む酵素が T4DNAリガーゼ、 Ecoli DNAリガーゼ、 RNAリガーゼ 力 なる群力 選択される少なくとも 1種の酵素であることを特徴とする請求項 1〜3の いずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[24] ヌクレアーゼ活性を含む酵素と、リガーゼ活性を含む酵素が耐熱性酵素であること を特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[25] 耐熱性酵素が Tth、 Taq、 KODまたは Pfoに由来することを特徴とする請求項 24に記 載の複数塩基多型同定方法。
[26] ヌクレアーゼ活性を含む酵素が DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項 1
〜3のいずれかに記載の複数塩基多型同定方法。
[27] DNAポリメラーゼが、 Tth由来の而熱性 DNAポリメラーゼ、 Taq由来の而熱性 DN
Αポリメラーゼ、 KOD由来の而熱性 DNAポリメラーゼ及び P1U由来の而熱性 DNAポ リメラーゼカ なる群より選ばれた 1種又は 2種以上の DNAポリメラーゼであることを 特徴とする請求項 26に記載の複数塩基多型同定方法。
[28] 塩基多型が 1塩基多型、挿入、欠失多型のいずれかを含む請求項 1〜3のいずれか に記載の複数塩基多型同定方法。
[29] 試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定する方法であって、
(1)該塩基多型の配列部分を含む複数種類の第一オリゴヌクレオチドを調製し、該第 一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でノ、イブリダィズしない配列を 含む複数種類の第二オリゴヌクレオチドを調製し、
(2)該第一オリゴヌクレオチド及び該第二オリゴヌクレオチドを、試料中に含まれる染 色体又は核酸断片とハイブリダィズさせ、
(3)各々のオリゴヌクレオチドがハイブリダィズした時に、塩基多型の配列部分で該第 二オリゴヌクレオチドに生じる塩基対を形成しな 、塩基配列を、ヌクレアーゼ活性を 含む酵素により除去した後、リガーゼ活性を含む酵素を作用させることにより、該オリ ゴヌクレオチドを連結し連結オリゴヌクレオチドを生成し、
(4)該連結オリゴヌクレオチドを、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的 な複数種類の検出用プローブ、および/または、少なくとも該第二オリゴヌクレオチドと 該第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な複数種類の検出用プローブを用いて検 出することを特徴とする複数塩基多型同定方法。
[30] 試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって、 少なくとも下記の (0〜(v)を含むことを特徴とするキット。
(0塩基多型の配列部分を含む 2種類以上の第一オリゴヌクレオチド
(ii)第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の配列部分でハイブリダィズしな 、配 列を含む 2種類以上の第二オリゴヌクレオチド
(iii)ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(iv)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(V)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/また は、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出 用プローブ
[31] 試料中に含まれる複数種類の塩基多型を同時に同定するためのキットであって、少 なくとも下記の (i)〜(vi)を含むことを特徴とするキット。
(0塩基多型の予想される配列部分にぉ 、て、多型を示す塩基と相補的な配列が含 まれる 2種類以上の多型第一オリゴヌクレオチド
(ii)塩基多型の予想される配列部分にぉ 、て、野生型を示す塩基と相補的な配列が 含まれる 2種類以上の野生型第二オリゴヌクレオチド
(iii)多型型および Zまたは野生型第一オリゴヌクレオチドと隣接し該塩基多型の予想 される配列部分でノ、イブリダィズしない配列を含む 2種類以上の第二オリゴヌクレオ チド
(iv)ヌクレアーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(V)リガーゼ活性を含む少なくとも一種の酵素
(vi)少なくとも第二オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出用プローブ、および/また は、少なくとも第二オリゴヌクレオチドと第一オリゴヌクレオチドの一部に相補的な検出 用プローブ
[32] 検出用プローブが予め固定されている固相を含む請求項 30または 31に記載のキッ [33] 固相が DNAマイクロアレイであることを特徴とする請求項 30または 31に記載のキット
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