KR20080029234A - 그람 음성 및 양성 박테리아를 구별하기 위한 프라이머세트, 프로브 세트, 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이, 상기 프로브 세트를 이용하여 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 키트를 제공한다.
프라이머, 프로브, 16S rRNA
Description
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 6개의 프라이머 세트를 사용하여 단일 PCR 및 다중 PCR한 결과 얻어진 산물을 아가로스 겔 전기영동한 결과이다.
본 발명은 그람 음성 및 양성 박테리아를 구별하기 위한 프라이머 세트, 프로브 세트, 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이, 상기 프로브 세트를 이용하여 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 키트에 관한 것이다.
박테리아의 검출 및 이의 정확한 동정은 임상 진단에서 중요한 역할을 한다. 그리하여, 박테리아 감염에서 특정 병원균은 적절한 치료를 개시하기 위해 가능한한 신속하게 동정되어야 한다.
통상적인 의료 진단에서, 박테리아는 전통적으로 선택 배지 및 박테리아의 생화학적 특성의 조사를 통해 동정되어 왔다. 그러나, 정확한 종을 동정할 수 없는 경우가 종종 발생한다. 더욱이, 상기 연구는 시간이 많이 소요되며, 다양한 후속 연구를 위해서는 순수한 배양을 필요로 한다. 상이한 배양 조건을 갖는 다양한 그룹의 박테리아는 전통적인 배양 방법에 의해 접근하기가 어려웠다.
최근에, 핵산 기재 방법이 박테리아를 검출하기 위해 도입되었다. 상기 방법은 예를 들면, 종 특이적인 프라이머를 이용한 핵산 증폭 반응을 포함한다. 검출은 통상적으로 겔 전기영동 또는 미세역가 플레이트에서 고정화된 프로브를 통해 수행된다. 그러나, 상기 기술은 가능한 병원성 미생물 중에서 하나 이상을 검출하는데는 적합하지 않다. 상기 문제를 해결하는 방법은 상이한 종 특이적인 증폭 프라이머 및 해당하는 프로브의 혼합물을 포함하는 핵산 증폭이다.
미국 특허 공개공보 2004/0171007에는 그람 양성 박테리아를 검출하는 방법 및 해당 프라이머가 개시되어 있다. 미국 특허 공개공보 2002/0081606에는 시료에서 그람 양성 박테리아를 검출 및 동정하는 방법 및 해당 프라이머가 개시되어 있다.
상기한 바와 같은 종래 기술에 의하더라도 100종 이상의 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별할 수 있는 프라이머 세트는 개시된 바 없다. 또한, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별할 수 있는 프로브는 개시된 바 없다.
본 발명의 목적은 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별할 수 있는 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성 되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 5의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트 및
서열번호 7의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 11의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올 리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 상기 표적 서열은 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 중 하나 이상 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역 중 하나 이상인 것이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 5의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 7의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오 티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 9의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 11의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트; 및
서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 길이는 약 5-50 뉴클레이티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명의 프라이머 세트는 16S rRNA를 기초로 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아를 구별하면서, 다양한 박테리아 종을 적은 수의 프라이머 세트로 검출할 수 있는 특이적 프라이머를 디자인하였다. 디자인한 프라이머는 그람 음성 박테리아에 대해 특이적인 프라이머 3 세트 및 그람 양성 박테리아에 대해 특이적 인 프라이머 3 세트이다. 프라이머 디자인을 위해 이용한 박테리아는 그람 음성 박테리아 69종 및 그람 양성 박테리아 55종으로, 총 124종이었다. 본 발명에 이용된 프라이머 세트에서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 그람 음성 박테리아 66종을 검출할 수 있으며, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 그람 음성 박테리아 2종을 검출할 수 있으며, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트는 그람 음성 박테리아 1종을 검출할 수 있으며, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 그람 양성 박테리아 51종을 검출할 수 있으며, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 그람 양성 박테리아 3종을 검출할 수 있으며, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트는 그람 양성 박테리아 1종을 검출할 수 있다. 본 발명에 이용된 박테리아는 하기 표 1과 같다.
표 1. 본 발명에 이용된 박테리아 균주
본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR하는 경우, 증폭할 수 있는 표적 서열 영역은 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역으로 구성된다.
본 발명의 프라이머 세트는 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 서열로 구성된다. 바람직한 프라이머 세트의 일 예는 하기 표 2에 나타내었다.
표 2. 본 발명의 프라이머 세트의 일 예
| 프라이머 | 서열번호 | 비고 |
| gramn1-F | 1 | 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역 증폭용 정방향 프라이머 |
| gramn1-R | 2 | 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역 증폭용 역방향 프라이머 |
| gramn2-F | 3 | 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 증폭용 정방향 프라이머 |
| gramn2-R | 4 | 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 증폭용 역방향 프라이머 |
| gramn3-F | 5 | 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 증폭용 정방향 프라이머 |
| gramn3-R | 6 | 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 증폭용 역방향 프라이머 |
| gramp1-F | 7 | 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역 증폭용 정방향 프라이머 |
| gramp1-R | 8 | 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역 증폭용 역방향 프라이머 |
| gramp2-F | 9 | 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 증폭용 정방향 프라이머 |
| gramp2-R | 10 | 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 증폭용 역방향 프라이머 |
| gramp3-F | 11 | 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역 증폭용 정방향 프라이머 |
| gramp3-R | 12 | 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역 증폭용 역방향 프라이머 |
상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역을 증폭하며, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 822번 내지 1218번 뉴클레오 티드 영역을 증폭하며, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트는 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역을 증폭하므로, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 유전자 산물의 크기는 각각 203bp, 397bp 및 285bp 이다. 또한, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역을 증폭하며, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역을 증폭하며, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트는 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역을 증폭하므로, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 유전자 산물의 크기는 각각 266bp, 100bp 및 135bp 이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
서열번호 13 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 16 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 19 내지 21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트; 및
서열번호 22 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 25 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그 의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 28 내지 30로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 세트에 있어서 서열번호 13 내지 15의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 16 내지 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 19 내지 21의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트; 및
서열번호 22 내지 24의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 25 내지 27의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 28 내지 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 세트에 있어서 서열번호 13 내지 15의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 16 내지 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 19 내지 21의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 22 내지 24의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 25 내지 27의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 28 내지 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아 의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 프로브 세트는 각각 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 증폭된 PCR 산물 내의 일부 서열에 해당하며, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 프로브 세트는 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트는 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 서열로 구성된다. 바람직한 프로브 세트의 일 예는 하기 표 3에 나타내었다.
표 3. 본 발명의 프로브 세트의 일 예
| 서열번호 | 프로브 | 그람 음성/양성 박테리아 | 16S rRNA 유전자 중의 표적 뉴클레오티드 영역 |
| 13 | gramn1-pr1 | 음성 | 357번 내지 559번 |
| 14 | gramn1-pr2 | 음성 | 357번 내지 559번 |
| 15 | gramn1-pr3 | 음성 | 357번 내지 559번 |
| 16 | gramn2-pr1 | 음성 | 822번 내지 1218번 |
| 17 | gramn2-pr2 | 음성 | 822번 내지 1218번 |
| 18 | gramn2-pr3 | 음성 | 822번 내지 1218번 |
| 19 | gramn3-pr1 | 음성 | 289번 내지 573번 |
| 20 | gramn3-pr2 | 음성 | 289번 내지 573번 |
| 21 | gramn3-pr3 | 음성 | 289번 내지 573번 |
| 22 | gramp1-pr1 | 양성 | 884번 내지 1149번 |
| 23 | gramp1-pr2 | 양성 | 884번 내지 1149번 |
| 24 | gramp1-pr3 | 양성 | 884번 내지 1149번 |
| 25 | gramp2-pr1 | 양성 | 29번 내지 128번 |
| 26 | gramp2-pr2 | 양성 | 29번 내지 128번 |
| 27 | gramp2-pr3 | 양성 | 29번 내지 128번 |
| 28 | gramp3-pr1 | 양성 | 593번 내지 727번 |
| 29 | gramp3-pr2 | 양성 | 593번 내지 727번 |
| 30 | gramp3-pr3 | 양성 | 593번 내지 727번 |
본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에 있어서, 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 올리고뉴클레오티드 프로브가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
시료를 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및
상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서, "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행되는 것인 방법이다. 본 구체예에서, 상기 높은 엄격도 혼성화 조건은 바람직하게는 65℃에서 동일한 몰의 Na2HPO4 및 NaH2PO4, 1mM EDTA 및 0.02% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 0.12 M 포스페이트 버퍼를 포함하는 것이다.
또한, 본 명세서에 있어서, "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그 후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 고도로 상동적인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 시료는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아로부터 유래된 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 핵산은 염색체 DNA, cDNA 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법이다.
"PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 이러한 PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다.
본 발명에서는 다중 PCR을 수행하며, 그람 음성 박테리아에 특이적인 프라이머 세트 및 그람 양성 박테리아에 특이적인 프라이머 세트를 적어도 각각 1 세트씩 이용한다. 바람직하게는 그람 음성 박테리아에 특이적인 프라이머 세트 3개 및 그람 양성 박테리아에 특이적인 프라이머 세트 3개를 이용하여 다중 PCR을 수행하는 것이다. 상기 각각의 프라이머 3 세트씩을 이용하면 보다 많은 박테리아 종을 구별할 수 있다.
표적 핵산을 증폭하는 방법은 상기 PCR 외에도, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 표적 서열은 검출가 능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화될 수 있다. 마이크로어레이 기판 상에 고정화되는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 구별은 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 상기 PCR 산물을 표지하고, 이를 상기 프로브 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키고, 그로부터 발생하는 신호를 검출하여 이루어질 수 있다. 상기 검출가능한 신호는 예를 들면, 광학적 신호 또는 전기적 신호가 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신(fluorescein), Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 또한, 상기 PCR 산물은 혼성화 전 또는 후에 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 표지되거나, 표지되어 있지 않을 수 있다. 표지되어 있지 않은 경우의 상기 PCR 산물과 프로브 올리고뉴클 레오티드의 혼성화 결과는 예를 들면, 전기적 신호를 통하여 검출할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한,
본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 상기 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하는 것도 가능하지만, 보다 정확한 구별을 위해 상기 프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물에 특이적으로 혼성화할 수 있는 프로브 세트를 이용할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
1: 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한
프
라이머의 선발
본 실시예에서는 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 프라이머를 선발하였다. 이를 위해, 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자에 특이적인 표적 서열의 선발 및 그를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 설계하였다.
먼저, Genbank로부터 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아의 서열을 입수하고 DNASTAR 프로그램을 이용하여 이들로부터 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아에 특이적인 16S rRNA 유전자 서열을 선발하였다. 분석에 사용된 박테리아 종 및 그 숫자는 상기 기재된 바와 같다.
그 결과, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 및 서열번호 11 및 12의 6개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 설계하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 각각 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중 하나 이상을 증폭할 수 있다.
실시예
2: 본 발명의
프라이머
세트를 이용한 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아의 16S
rRNA
유전자의 증폭
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 그람 음성 박테리아와 그람 양성 박테리아의 16S rRNA를 증폭하였다.
먼저, 하기 표 4에 나타낸 3종의 그람 음성 박테리아 및 3종의 그람 양성 박테리아의 표적 박테리아의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 실시예 1에서 제작된 6개의 프라이머 세트 중 각 세트를 프라이머로 하여 단일 PCR (single PCR)을 수행하여 각 표적 서열을 특이적으로 증폭하는지를 확인하였다.
표 4. PCR에 이용된 종(species)
| # | 종 | 프라이머 세트 |
| 013 | 클렙시엘라 뉴모니애 | gramn1 |
| 012 | 헬리코박터 파일로리 | gramn2 |
| 004 | 클라미도필라 뉴모니애 | gramn3 |
| 026 | 스태필로코커스 오레우스 | gramp1 |
| 027 | 스태필로코커스 콘니아이 | gramp2 |
| 017 | 미코플라스마 뉴모필라 | gramp3 |
단일 PCR (single PCR) 조건은 다음과 같다. MgCl2 1.5mM, dNTP 250 mM, 트리스-HCl (pH 9.0) 10 mM 및 Taq 폴리머라제 1 유닛, 프라이머 약 2 pmol을 포함하는 혼합액 중에 G-스핀 게놈 DNA 추출 키트 (iNtRON 사)로부터 추출된 게놈 DNA 2㎕를 포함하는 20㎕의 반응액을 95℃에서의 변성 10초, 60℃에서의 어닐링 10초 및 60℃에서의 연장 13초를 25회 반복하였으며, 작동시간은 29분 5초이었다.
다음으로, 본 실시예에서는 3종의 그람 음성 박테리아 및 3종의 그람 양성 박테리아의 표적 박테리아의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 실시예 1에서 제작된 6개의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR을 수행하고, 그 산물을 아가로스 겔 상에서 확인하였다.
다중 PCR에 사용된 PCR 믹스 조성은 다음과 같았다. 증류수 10.5㎕, 10x버퍼 7.5㎕, dNTP 200μM (각각) 1㎕, 말단 표지된 프라이머 400nM (각각) (Bioneer, 한국) 20㎕, 추출된 게놈 DNA 5㎕, Taq 폴리머라제 1㎕(5 유닛)를 포함하는 총 50㎕ 반응액을 사용하였다.
다중 PCR 조건은 95℃에서 1분 동안 초기 변성, 95℃에서 5초 동안 변성, 62 ℃에서 13초 동안 어닐링 및 72℃에서 15초 동안 연장 반응을 25회 반복하고, 72℃에서 1분 동안 연장 반응을 수행하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 6개의 프라이머 세트를 사용하여 단일 PCR 및 다중 PCR한 결과 얻어진 산물을 아가로스 겔 전기영동한 결과이다. 도 1에서, "Gn1" 및 "Gn2"로 표시된 것은 각각 클렙시엘라 뉴모니애 및 헬리코박터 파일로리에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 gramn1 및 gramn2 프라이머 세트를 이용하여 PCR한 결과이다. 또한, "Gp1", "Gp2" 및 "Gp3"로 표시된 것은 각각 스태필로코커스 오레우스, 스태필로코커스 콘니아이 및 미코플라스마 뉴모필라에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 gramp1, gramp2 및 gramp3 프라이머 세트를 이용하여 PCR한 결과이다. 먼저, 단일 PCR 수행 결과, Gn2를 제외한 나머지 프라이머 세트의 경우에 원하는 PCR 산물을 얻을 수 있었다. Gn2의 경우에는 PCR 산물이 관찰되지 않았는데, 이는 헬리코박터 파일로리는 서열 변이가 심한 종이어서 본 발명의 PCR 조건에서는 검출이 되지 않은 것이므로, PCR 조건의 최적화가 필요한 것으로 생각된다.
다중 PCR은 각 박테리아 균주에 대해 6개의 프라이머 세트를 동시에 첨가하여 PCR한 것으로, 그 결과는 단일 PCR 결과와 거의 동일하다. 이는 각 프라이머 세트가 각 박테리아 균주에 대해 특이적이라는 것을 나타내는 것이다. 따라서, 본 발명의 6개의 프라이머 세트를 이용하면, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 명확하게 구별할 수 있다는 것을 알 수 있다. 즉, 미지의 박테리아 균주를 대상으로 하여 본 발명의 6개의 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR을 수행하고, 아가로스 겔 전기영동하여 PCR 산물의 크기를 측정하면, 측정된 PCR 산물의 크기로부터 미지의 박테리아 균주가 그람 음성인지 양성인지 알 수 있는 것이다.
실시예
3: 본 발명의
프로브의
설계
본 실시예에서는 실시예 2에서 증폭된 증폭 산물을 마이크로어레상에 고정화되어 있는 프로브와 혼성화시키고, 그 혼성화 정도를 검출하기 위해 프로브를 설계하였다.
DNASTAR 프로그램을 이용하여 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 증폭된 영역으로부터 프로브를 선발하였다. 선발된 프로브는 상기 표 3에 기재된 바와 같다.
본 발명의 프라이머 세트에 의하면, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 효율적으로 구별할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 높은 특이성을 가지고 구별할 수 있다.
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negative and positive bacteria
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Claims (21)
- 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 5의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트 및서열번호 7의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이 루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 11의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 서열은 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 중 하나 이상 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역 중 하나 이상인 것인 올 리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 5의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상 의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 7의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 9의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역을 증폭 하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 11의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트; 및서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559 번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 제9항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
- 서열번호 13 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 16 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 19 내지 21로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트; 및서열번호 22 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 25 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 28 내지 30로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트.
- 제11항에 있어서, 서열번호 13 내지 15의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 16 내지 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 19 내지 21의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트; 및서열번호 22 내지 24의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 25 내지 27의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 28 내지 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클 레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트.
- 제12항에 있어서, 서열번호 13 내지 15의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 16 내지 18의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 19 내지 21의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 22 내지 24의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브;서열번호 25 내지 27의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및서열번호 28 내지 30의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자 중의 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 그람 음성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 357번 내지 559번 뉴클레오티드 영역, 822번 내지 1218번 뉴클레오티드 영역 및 289번 내지 573번 뉴클레오티드 영역 및 그람 양성 박테리아의 16S rRNA 유전자의 884번 내지 1149번 뉴클레오티드 영역, 29번 내지 128번 뉴클레오티드 영역 및 593번 내지 727번 뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이.
- 시료를 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 시료는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아로부터 유래된 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 및 방사성을 발하는 물질인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 키트.
- 제20항에 있어서, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 추가로 포함하는, 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아를 구별하기 위한 키트.
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