JP2001517300A - リソグラフィ・マスクの設計および基板上での多様なプローブの合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 基板上にプローブを合成するシステムおよび方法を用意する。１つまたは複数のシフト・レチクルを利用して、基板の指定の場所に単量体を一様に付加する。シフト・レチクルは、単量体付加の段階と段階の間に、基板に対してシフトされる。さらに、所望のプローブの特性を合成時に指定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 リソグラフィ・マスクの設計および基板上での多様なプローブの合成 発明の背景 本発明は、マスクを生成するためのコンピュータ・システムに関する。より詳 細には、本発明は、マスクを生成し利用して、基板上にプローブを形成するため のシステムおよび方法を提供する。 米国特許第５，４２４，１８６号には、特に、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、 ペプチド、多糖およびその他の物質などの高密度分子アレイを形成し、使用する 先駆的手法が記載されている。この特許は、あらゆる目的で参照によって本明細 書に組み込まれる。光学的に除去可能な基を表面から逐次的に除去し、この表面 の露出した領域に単量体を結合し、このプロセスを繰り返すことによって、例え ば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドのアレイをこの表面上に形成させる。こ れらの手法は、オリゴヌクレオチド、ペプチドおよびその他の物質の超高密度ア レイを形成するのに使用されている。このようなアレイは例えば、薬品の開発、 オリゴヌクレオチドの配列決定、オリゴヌクレオチド配列の検査、およびその他 のさまざまな用途に役立つ。この発明に関連した合成技術は、「ＶＬＳＩＰＳ」 技術、または「超大規模固定化ポリマー合成（Very Large Scale Immobilized P olymer Synthesis）」技術として知られるようになった。 このようなアレイを形成し使用するさらなる手法が、やはり、あらゆる目的で 参照によって組み込まれる米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。 該手法は、基板（またはチップ）の部分を機械的に保護し、選択的に、基板の保 護除去／基板への物質結合を実施するシステムを含む。現在、これらの手法は「 ＶＬＳＩＰＳ ＩＩ」として知られている。アレイ合成のさらなる手法が、やは り、あらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる米国出願第０８／３２ ７，５１２号に記載されている。 これらの手法に基づいて製作された高密度アレイは例えば、プローブのアレイ をスクリーニングして、関心の標的に相補的なプローブがどれかを決定するのに 使用される。前述の発明の特定の一態様によれば、このアレイを、標識した標的 に露出させる。標的は、広範な物質で標識することができるが、代表的な標識は フルオレセイン標識である。次いでこのアレイを、共焦点顕微鏡ベースの検出シ ステムまたはその他の関連システムで走査し、アレイのどこに標的が結合してい るかを識別する。標識にはその他、放射性標識、大分子標識などがある。ただし これらに限定されるわけではない。 このような方法によって劇的な成果が得られる一方で、いくつかの状況では限 界が見られる。例えば、前述の手法に従ったアレイ中の分子レイアウトの設計で は、その際に、基板上の露光する位置を区画する「マスク」を設計する必要があ る。このようなマスクの製作は容易であるが、費用がかさむ傾向がある。このよ うなマスクの設計が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれ る米国特許第５，５７１，６３９号に記載されている。 特定の用途に対して、アレイ中で特定の分子レイアウトを用意することが望ま しい場合も多い。例えば、あらゆる目的のために参照によって組み込まれるＰＣ Ｔ ＷＯ９５／１１９９５には、ＨＩＶ診断、ある種のガンに関係する遺伝子の 診断、ミトコンドリア・オリゴヌクレオチドの評価、およびその他の用途に使用 する特定のアレイの合成が記載されている。これらの用途の多くでは、ＨＩＶ診 断でのように、同一のチップが大量に要求される。多くの状況では、特定のプロ ーブ・アレイの製造に、１００またはそれ以上ものレチクルを有するマスク（ま たはマスク・セット）が必要となる。これらの状況では、マスクのコストは、マ スク１枚当たりにすれば高いものとなるが、特定の１つのマスクを用いて合成す ることができる同一のアレイの数を考慮すれば、かなり小さいものとなる。 多くのその他の用途、例えば特定の研究用途などでは、特定のプローブ・レイ アウトを有するアレイを、おそらくは１つだけといった比較的少ない数で合成す ることが望ましい。これは確かに可能であり、当技術分野において広範にその有 用性が認められているが、たった数個のプローブ・アレイを製造するために単一 のマスク（またはマスク・セット）を製作するとコストがかさむ。したがってこ れらの状況での「チップあたり」のマスクのコストはかなり高い（数千ドル程度 ）ものになる。 したがって、プローブ・アレイ製造におけるリソグラフィック・マスクの設計 および使用のより効率的な手法を見つけ出すこと、具体的には、少量設計の際に 、必要なレチクルの数を減らすことが望まれる。 発明の概要 本発明はプローブのアレイをより経済的に基板上に合成する手法を提供する。 １つまたは複数の「シフト」レチクルを利用して、多くの異なるプローブ・セッ トを基板上に合成する。シフト・レチクルは、単量体付加段階後に（位置１つ分 またはそれ以上）シフトされ、その後、再使用されるレチクルであり、これは、 必要なレチクル（またはマスク）の数を低減させる。さらにこのシフト・マスク は合成時に、基板の、あるプローブ場所に単量体を一様に追加する。本発明の実 施態様によって、プローブの長さおよび照会位置を合成時に指定することができ るようになり、そのため、チップ合成における柔軟性が向上する。 本発明の一実施態様は、基板上にプローブを合成する方法であって、基板上の 、少なくとも１つのシフト・レチクルによって指定された場所に単量体を結合す る段階、前記少なくとも１つのシフト・レチクルを基板に対してシフトさせる段 階、前記少なくとも１つのシフト・レチクルをシフトさせた後に、前記基板上の 、前記少なくとも１つのシフト・レチクルによって指定された場所に単量体を結 合する段階を含み、単量体を含むプローブを基板上に合成する方法が提供される 。 本発明の他の実施態様は、基板上にプローブを合成する方法であって、基板の 指定の場所に単量体を一様に追加するための少なくとも１つのレチクルを用意す る段階、所望のプローブの特性に関する入力を受け取る段階、および前記少なく とも１つのレチクルを利用して、基板上に前記所望のプローブを合成する段階を 含む方法が提供される。前記特性を、所望のプローブの長さ、照会位置、または 、所望のプローブを合成するための単量体付加順序とすることができる。 本発明の他の実施態様では、基板上にプローブを合成する方法であって、単量 体付加領域を有し、それぞれのレチクルが、異なる種類の単量体を基板上に結合 するためのレチクルであるレチクル・セットを用意する段階、前記セットのそれ ぞれのレチクルを利用して、異なる種類の単量体を含む単量体の第１の層を基板 上に結合する段階、および前記セットのそれぞれのレチクルを基板に対してシフ トさせ、前記第１の層の上に、異なる種類の単量体を含む単量体の第２の層を結 合する段階を含み、２つの単量体を含む複数のプローブが基板上に形成される方 法が提供される。 他の実施態様では、基板上にプローブを合成するためのレチクルのレイアウト を決定するための方法であって、標的単量体配列の入力を受け取る段階、前記標 的配列中の単量体の種類を選択する段階、および前記標的配列中の前記選択した 種類のそれぞれの単量体の位置に対応する単量体付加領域を有するレチクルを設 計する段階を含む方法が提供される。 他の実施態様では、基板上にプローブを合成する方法であって、基板上の、レ チクルの単量体付加領域セットによって指定された場所に、複数の第１の単量体 を結合する段階、前記レチクルを基板に対してシフトさせる段階、および前記第 １の単量体の１つの単量体の上の、前記レチクルの単量体付加領域セットによっ て指定された場所に、少なくとも１つの第２の単量体を結合する段階を含み、前 記第１および第２の単量体を含むプローブが基板上に形成される方法が提供され る。 他の実施態様では、コンピュータ・システムによって実現される、基板上にプ ローブを合成するためのレチクルのレイアウトを決定するための方法であって、 標的単量体配列の入力を受け取る段階、前記標的配列中の単量体の種類を選択す る段階、および ｎ×（ｉ−１）＋１ によって指定された単量体付加領域を有するレチクルを設計する段階を含み、上 式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第１の単量体の位置であ る方法が提供される。 他の実施態様では、基板上に合成されたプローブを含む基板のレイアウトを指 定するための方法であって、基板上に合成するプローブを、それぞれがプローブ を含む分析領域の配列リストとして定義する段階、分析領域の前記配列リストの 特性に関する入力を受け取る段階、および前記入力された特性を用いて、それぞ れの分析領域のプローブを基板上に合成するために、少なくとも１つのレチクル を設計する段階を含む方法が提供される。入力される特性は一般に、分析領域の 場所、スケールまたは向きを含む。 他の実施態様では、シフト・マスクを利用して、標的中の塩基位置を照会する ための多様なプローブを合成する。例えば、全ての可能な照会位置を含む特定の 長さのプローブを合成する。さらに、異なる照会位置を有する異なる長さのプロ ーブをチップ上に同時に合成する。 本明細書に記載の発明の性質および利点は、明細書の残りの部分および添付図 面を参照することによってさらに理解することができよう。 図面の簡単な説明 第１図は、本発明のソフトウェア実施形態を実施するのに使用されるコンピュ ータ・システムの一例を示す図である。 第２図は、本発明のソフトウェア実施形態を実施するのに使用される一般的な コンピュータ・システムのシステム・ブロック図を示す図である。 第３Ａ図は、標的配列の検出に利用することができるプローブ・セットを示す 図、第３Ｂ図は、一実施形態におけるこのプローブ・セットの基板上でのレイア ウトを示す図である。 第４図は、第３Ａ図のプローブ・セットを生成する従来技術のレチクルを示す 図である。 第５図は、第３Ａ図のプローブ・セットを生成するための従来技術の単量体の 付加を示す図である。 第６図は、本発明の一実施形態に基づくレチクル生成プロセスの高水準流れ図 である。 第７図は、第３Ａ図のプローブ・セットを生成するシフト・レチクルを示す図 である。 第８Ａ図〜第８Ｃ図は、これらのシフト・レチクルを使用して先のプローブ・ セットを生成する単量体の付加を示す図である。 第９Ａ図および第９Ｂ図は、複数のプローブ・セットを生成するためのレチク ルを示す図である。 第１０図は、線状レチクルから方形レチクルへの変形を示す図である。 第１１Ａ図は、照会位置に単量体を付加するためのレチクルを示す図、第１１ Ｂ図は、照会位置のところが異なるチップ上のプローブを示す図、第１１Ｃ図は 、第１１Ａ図のレチクルと同様のレチクルを用いて生成したチップの像を示す図 である。 第１２Ａ図は、照会位置に単量体を付加するための別のレチクルを示す図、第 １２Ｂ図は、照会位置のところが異なるチップ上のプローブを示す図、第１２Ｃ 図は、第１２Ａ図のレチクルと同様のレチクルを用いて生成したチップの像を示 す図である。 第１３Ａ図は、異なる長さの複数のプローブ・セットを生成するためのレチク ルを示す図であり、第１３Ｂ図は、複数の長さのプローブ・セットを有するチッ プを示す図である。 第１４Ａ図は、複数のレチクルを含むマスクを示す図、第１４Ｂ図は、一実施 形態におけるレチクルのレイアウトを示す図、第１４Ｃ図は、２枚のチップ上に 同時にプローブを合成するためのレチクルを示す図、第１４Ｄ図は、２枚のチッ プ上に異なる長さのプローブを同時に合成するためのマスクを示す図、第１４Ｅ 図は、サンプル・チップのレイアウトを示す図である。 第１５Ａ図は、他の実施形態におけるチップのレイアウトを示す図、第１５Ｂ 図は、チップ上の行の対に特定の単量体を結合するためのシフト・レチクルを示 す図、第１５Ｃ図は、チップ上の単一のレーンに特定の単量体を結合するための シフト・レチクルを示す図、第１５Ｄ図は、対照レーンを形成するためのシフト ・レチクルを示す図である。 第１６図は、本発明の他の実施形態に基づくレチクルを生成するプロセスの高 水準流れ図を示す図である。 第１７Ａ図〜第１７Ｄ図は、単一のシフト・レチクルの形成を示す図である。 第１８図は、第３Ａ図のプローブ・セットを生成する単一のレチクル、および このレチクルを使用した単量体の追加を示す図である。 第１９図は、複数のプローブ・セットを生成するためのレチクルを示す図であ る。 第２０Ａ図は、他の実施形態のシフト・レチクルを示す図、第２０Ｂ図〜第２ ０Ｄ図は、照会位置レチクルを示す図、第２０Ｅ図は、完全相補プローブ、照会 位置プローブ、および欠失プローブを含むチップを示す図である。 第２１Ａ図は、長さの異なる関係プローブを合成するためのシフト・レチクル を示す図、第２１Ｂ図は、基板上に合成できるプローブのレイアウトの一例を示 す図である。 第２２図は、スペックル・マスクの単純な例を示す図である。 第２３図は、第７図のシフト・レチクルがスペックル・マスクであることを示 す図である。 第２４図は、スペックル・マスクのパッキングを示す図である。 第２５図は、ポスト・チップ合成を利用したチップのレイアウトを示す図であ る。 第２６図は、ポスト・チップ合成を利用した他のチップのレイアウトを示す図 である。 第２７Ａ図は、緊密に充填されたレーンを有するチップの活性領域を示す図、 第２７Ｂ図は、第２７Ａ図のサブ領域を示す図、第２７Ｃ図は、エッジを最小限 に抑えるよう第２７Ｂ図のサブ領域を合成する方法を示す図である。 第２８図は、異なる照会位置を有する等しい長さのプローブを生成するシフト ・レチクルを示す図である。 第２９図は、第２８図のレチクルによって生成することができるプローブを示 す図である。 第３０図は、異なる長さおよび異なる照会位置を有するプローブを生成するシ フト・レチクルを示す図である。 第３１図は、第３０図に基づくシフト・レチクルによって生成することができ るプローブを示す図である。 第３２図は、標的中の塩基位置９個ごとに照会するプローブを生成するための シフト・レチクルを示す図である。 好ましい実施形態の説明用語 以下の用語は、本明細書で使用するとき、以下の意味を有するものとする。 「マスク」は、光を選択的に通過させるいくつかの開口を有する、通常はガラ ス製のプレートであるリソグラフィ部材について言う。マスクは、１つまたは複 数のレチクルを含むことができる。 「レチクル」は、露光中に基板に光を導くのに使用するマスク全体またはマス クの特定の部分について言う。導入 本明細書では、光誘導合成手法を使用し、高密度で小型の分子プローブ・アレ イを製作する。該アレイを、オリゴヌクレオチド、ペプチド、小分子（ベンゾジ アザピン、プロスタグランジン、βターン・ミメティックなど）、非天然配位子 、または酵素のアレイ、あるいは、オリゴ糖など「ビルディング・ブロック」形 式で合成されるその他の広範な分子のアレイとすることができる。オリゴヌクレ オチド・プローブ・アレイは、本明細書の発明の特定の例に従って使用すること ができるアレイの代表的なものである。 オリゴヌクレオチド・プローブ・アレイの設計および製造は、本発明の特定の 例に基づくＶＬＳＩＰＳ技術に依存する。オリゴヌクレオチド・プローブ・アレ イ製作の最初の段階は、チップ上に合成するオリゴヌクレオチド・プローブ・セ ットを選択することを含む。例えば、遺伝子中の単一位置での塩基変更突然変異 の検出が望ましいと仮定する。本明細書の手法は、先の単一位置の周囲の短領域 と相補的な４つのプローブからなるプローブ・セットを用意する。第１のプロー ブは、遺伝子のその領域の野生型（正常）配列と正確に相補的である。その他の ３つのプローブは、照会をする位置（すなわち、照会位置）の塩基が、野生型配 列とは相補的でない３つの塩基で置換されていることを除き、第１のプローブと 同一である。 こうすると、塩基変更突然変異の如何に関係なく、プローブのうちの１つが、 標的オリゴヌクレオチド配列と完全に相補的となる。遺伝子中のこのような突然 変異を検出する、すなわち、遺伝子を再配列するには、遺伝子中のそれぞれの位 置に対して同様のプローブ・セットを定義すればよい。例えば、薬剤耐性に関係 する突然変異の検出に必要なＨＩＶの１０４０個の塩基を再配列するには、一般 に４１６０個のプローブが必要である。このような手法は、あらゆる目的のため に参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ ＷＯ９５／１１９９５に詳細に 記載されている。当然ながら、ペプチド・アレイなどのアレイでは、プローブ選 択の手法は異なったものとなる。 プローブ・セットを選択した後、チップ上でのプローブのレイアウトを決定す る。このレイアウトを使用して、チップ合成プロセスで使用するフォトリソグラ フィ・マスクを設計する。これらの設計は、一般に電子形態で生成され、これら を使用して、半導体産業で広く使用されているようなマスクをマスク製造工場で 製作する。 第１図に、チップ合成用のマスクを生成するための本発明のソフトウェア実施 形態を実行するのに使用されるコンピュータ・システムの一例を示す。第１図に は、モニタ３、画面５、キャビネット７、キーボード９およびマウス１１を含む コンピュータ・システム１が示されている。マウス１１は、マウス・ボタン１３ などの１つまたは複数のボタンを有することができる。キャビネット７は、本発 明を組み込んだコンピュータ・コードを含むソフトウェア・プログラムを格納し 、取り出すのに利用できるＣＤ−ＲＯＭドライブ１５およびハード・ドライブ（ 図示せず）を収容する。コンピュータ可読媒体としてＣＤ−ＲＯＭ１７を示した が、フロッピー・ディスク、ＤＲＡＭ、ハード・ドライブ、フラッシュ・メモリ 、テープなどを含むその他のコンピュータ可読媒体を利用することもできる。キ ャビネット７はさらに、プロセッサ、メモリなどのよく知られたコンピュータ構 成要素（図示せず）を収容する。 第２図に、本発明のソフトウェア実施形態を実行するのに使用されるコンピュ ータ・システム１のシステム・ブロック図を示す。第１図のとおり、コンピュー タ・システム１は、モニタ３およびキーボード９を含む。コンピュータ・システ ム１はさらに、中央処理装置１０２、システム・メモリ１０４、入出力制御装置 １０６、ディスプレイ・アダプタ１０８、リムーバブル・ディスク１１２、固定 ディスク１１６、ネットワーク・インタフェース１１８およびスピーカ１２０な どのサブシステムを含む。リムーバブル・ディスク１１２は、フロッピー、テー プ、ＣＤ−ＲＯＭ、リムーバブル・ハード・ドライブ、フラッシュ・メモリなど の、取り外し可能なコンピュータ可読媒体を代表する。固定ディスク１１６は、 内部ハード・ドライブなどを代表する。本発明との使用に適したその他のコンピ ュータ・システムには、追加のサブシステムを含むもの、またはこれより少ない サブシステムを含むものがある。例えば、別のコンピュータ・システムとして、 ２つ以上のプロセッサ１０２を含むもの（すなわちマルチプロセッサ・システム ）、またはメモリ・キャッシュを含むものが可能である。 １２２などの矢印は、コンピュータ・システム１のシステム・バス・アーキテ クチャを表す。ただしこれらの矢印は、サブシステムを連結する働きをする任意 の相互接続方式を示すものである。例えば、ディスプレイ・アダプタ１０８をロ ーカル・バスを介して中央処理装置１０２に接続すること、または、このシステ ムがメモリ・キャッシュを含むことができる。しかし、第２図に示したコンピュ ータ・システム１は、本発明の使用に適したコンピュータ・システムの一例に過 ぎない。本発明との使用に適したその他のサブシステム構成を明らかにすること は、当業者にとって容易であろう。例えば、本発明のソフトウェア実施形態を、 ＩＢＭ互換コンピュータ、サン・マイクロシステムズ社のワークステーションな どの上に実装することができる。 光誘導化学合成は、半導体ベースのフォトリソグラフィと固相化学合成を結合 する。このプロセスを開始するにあたって、光化学的に除去可能な保護基で修飾 したリンカーを、固体基板またはチップ表面に付与する。光は、フォトリソグラ フィ・マスクまたはレチクルを通して合成面の特定の領域に誘導され、それらの 領域を化学結合に対して活性化する。一連の化学ビルディング・ブロック（Ａ、 Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴ）の最初のブロックをチップとともにインキューベートし、 先段階で露光したサイトで化学結合を起こさせる。次に光を、新しいマスクを通 して基板の異なる領域に導き、この化学サイクルを繰り返す。 光のパターンおよび化学試薬の順序が、チップ表面上でのそれぞれのオリゴヌ クレオチド・プローブの識別を指示する。組合せ合成法を使用して、非常に少な いプロセス段階で何百万もの化合物を短時間に作り出すことができる。 オリゴヌクレオチド・プローブ・アレイは、（例えば患者のサンプルの）より 長い標的オリゴヌクレオチド配列の認識に使用することができる数千または数百 万のオリゴヌクレオチド・プローブを含む。チップ上のオリゴヌクレオチド・プ ローブ・セットによるオリゴヌクレオチド・サンプルの認識は、オリゴヌクレオ チドのハイブリッド形成の機構を通して実施される。オリゴヌクレオチドのハイ ブリッド形成は、２本の相補的オリゴヌクレオチド鎖が互いに結合する（ＡがＴ と、ＧがＣと対をなす）単純なプロセスである。オリゴヌクレオチド標的が、オ リゴヌクレオチド・プローブのアレイとハイブリット形成するとき、標的は、標 的オリゴヌクレオチド配列の一部と相補的なプローブに結合する。 標的オリゴヌクレオチドの配列に関する情報は、どのプローブが標的とハイブ リット形成したかに基づいて決定することができる。このようなアレイは、オリ ゴヌクレオチド・プローブ・アレイの、オリゴヌクレオチド配列分析、オリゴヌ クレオチド配列検査、突然変異分析、ｍＲＮＡ発現モニタリング、および医療診 断上の研究における用途を有する。 本明細書の発明は、マスク製造のコストを低減させるプローブ・アレイ合成手 法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、基板上にプローブ・アレイを合 成するのに使用することができる１個または数個のシフト・レチクルを設計する ことによって、マスクのコストが低減される。したがって、このシフト・レチク ルを使用して、「カスタムメイド」のプローブ・アレイを合成することができる が、それにも関わらず、このようなカスタムメイド・プローブ用のマスク・セッ トを製作するチップ１枚当たりのコストは大幅に低減する。 第３Ａ図に、配列ＴＧＡＣＡＴを含むことが期待される核酸サンプルの評価に 望ましいと考えられるプローブ・セットを示す。サンプルを評価して、その配列 が実際にＴＧＡＣＡＴであるかどうかを判定するためには、第３Ａ図に示すよう な３量体プローブのセットを基板上に合成する。特定のサンプルが、配列ＴＧＡ ＣＡＴ（「標的」配列）を確かに有する場合、プローブＡＣＴ、ＣＴＧ、ＴＧＴ およびＧＴＡはそれの相補配列であるので、サンプルは、それぞれのプローブと ハイブリッド形成することが期待される。しかし２番目の塩基位置（「Ｇ」）に 変更がある場合、１つの塩基が標的とミスマッチなので、ＡＣＴプローブ領域で 観測されるハイブリッド形成はおそらく減るであろう。例えば、特定のサンプル が配列ＴＡＡＣＡＴを有すると仮定する。ＡＣＴは、配列ＴＡＡＣＡＴのどの位 置においても完全には相補的ではないので、おそらくＡＣＴプローブ領域ではハ イブリッド形成は観測されない。 ＰＣＴ ＷＯ９５／１１９９５に開示されているように、追加のプローブを合 成して、特定の位置にどの変更が存在するかを求めることができる。例えば、Ａ ＣＴプローブに加えて、プローブＡＡＴ、ＡＴＴおよびＡＧＴを基板上に合成す る（照会位置を下線で示す）。例えば、プローブＡＴＴのハイブリッド形成が強 ければ、それは、サンプルがＴＡＡＣＡＴである可能性が高いことを示す。 第３Ｂ図に、配列ＴＧＡＣＡＴを含むと期待されるサンプル中の突然変異を求 めるのに望ましいと考えられるプローブ・セットを示す。それぞれの列は、照会 位置に対応するサンプル中のヌクレオチドを決定するための４つのプローブのプ ローブ・セットを含む。図示のとおり、列のそれぞれの４つのプローブは、照会 位置のところが異なっている。好ましい実施形態では、それぞれの照会位置のヌ クレオチドが同じプローブが１つの行に配置されており、これによって、Ａレー ン、Ｃレーン、ＴレーンおよびＧレーンが形成される。第３Ａ図の野生型プロー ブは、プローブ領域に「＊」を付して示されている。一般に、１つのプローブ領 域またはセルの中には、同一のプローブが数多くある（例えば、数百または数千 ）。 第４図に、第３Ａ図のＡＣＴ、ＣＴＧ、ＴＧＴおよびＧＴＡプローブを合成す るのに利用される従来技術のレチクルを示す。レチクル１および６は、基板上に ヌクレオチドＡを追加するためのものである。レチクル２は、基板上にヌクレオ チドＣを追加するためのものである。レチクル４は、基板上にヌクレオチドＧを 追加するためのものである。最後に、レチクル３および５は、基板上にヌクレオ チドＴを追加するためのものである。これらのレチクルを利用すると、この合成 を、不必要な追加段階を省いた、Ａ、Ｃ、Ｔ、そしてＧの繰り返し追加と見るこ とができる。 レチクルを示した図で、陰を付けた部分はレチクルを貫通する開口を表し、光 は、この開口を通して基板上の領域の保護を除去する（deprotect）。次いで、 単 量体（例えば、ヌクレオチド）が、保護除去された領域に結合することができる ように、単量体を基板上に流す。好ましい実施形態では、レチクルの単量体付加 領域が開口であるが、同様の方法において、単量体付加領域をレチクル上で閉じ ることもできる。 第５図に、プローブ・セットを生成するための従来技術のヌクレオチド単量体 の追加を示す。レチクル１〜６を利用して、基板２０２に単量体を逐次的に追加 する。第５図の最上段では、レチクル１を利用して、基板の、このレチクルの単 量体付加領域によって指定された場所にヌクレオチドＡを追加する。次いで、レ チクル２を利用して、このレチクルの指定のとおりに基板にヌクレオチドＣを追 加する。このプロセスをレチクル６まで続け、これによって、標的配列の分析に 利用できる４つのプローブを得る。 第５図のプロセスを、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧの繰り返し追加と見ることができる が、ある場合には、特定の単量体付加段階を「省く」ことができる。例えば第５ 図では、２回目のＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ追加サイクルで、Ｇ追加後のＡおよびＣの追加 が省かれている。したがって、これらのプローブの合成には６つのレチクルが必 要となる。最悪の場合、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧの追加が、プローブ中のｎ個の単量 体のそれぞれに必要となる。したがって最悪の場合には、プローブ・セットを合 成するためにｎ×４個のレチクルが必要となる。多くの場合、この数は、上の例 のように配列が許すある数ｍにまで低減される。上の例では、ｍは６であり、最 悪の場合の１２（３×４）レチクルよりもよい。しかし、プローブ中の単量体の 数が増えるにつれて、必要なレチクルの数はかなり大きくなり、そのためコスト も増大する。 本発明は、はるかに少ないレチクルを使用してプローブ・アレイを合成する手 法を提供する。これによってコストは大幅に低減する。本発明の一実施形態では 、わずか１つのレチクルを使用して、例えば、正確な相補的プローブ・セットを 作成することができる。追加のレチクルを利用して、照会位置のヌクレオチドを 変更したプローブを製作すること、および別のレチクルを利用して、基板上に異 なるプローブ・セット（例えば、異なるプローブ長を有するプローブ・セット） を製作することができる。シフト・レチクル・セット 一実施形態で、本発明は、所望のプローブを基板上に合成するのにシフト・レ チクルのセットを利用する。シフト・レチクル・セットは、基板に追加するそれ ぞれの単量体に対して１つのレチクルを含む。これらのレチクルを利用して、プ ローブの長さおよび照会位置を、合成時に、例えばレチクルを生成した後に指定 することができる。 第６図に、シフト・レチクル・セットを生成するプロセスの高水準流れ図を示 す。段階２５２で、標的配列と完全に相補的な配列のヌクレオチドに番号を付け る。したがって、第３Ａ図に示した標的配列では、ヌクレオチドに１〜６の番号 を付ける。続いて、標的配列を検出するためのプローブを合成する４つの１×６ レチクルを形成する。４つのレチクルをそれぞれ利用して、基板上に異なる単量 体（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を追加する。 段階２５４で、ヌクレオチドＡ追加用のレチクルを基板に作成する。このレチ クルは、標的配列に完全に相補的な配列中のそれぞれのＡに対応する開口を有す るように設計される。したがって、完全に相補的な配列ＡＣＴＧＴＡでは、レチ クルが、ヌクレオチド１および６に対応する開口を有する。第７図のレチクル１ に、このように生成されたレチクルを示す。 段階２５６で、ヌクレオチドＣ追加用のレチクルを同様の方法で作成する。こ のレチクルは、標的配列と完全に相補的な配列中のそれぞれのＣに対応する開口 を有するように設計される。したがってこのレチクルは、標的のヌクレオチド２ に対応する開口を有するように設計される。第７図のレチクル２に、ヌクレオチ ドＣ追加用のレチクルを示す。段階２５８および２６０では、第７図に示したレ チクル３および４を、それぞれヌクレオチドＧおよびＴに対して同様の方法で作 成する。 段階２６２で、これらのマスクの設計を含むコンピュータ・ファイルを出力す る。このファイルを、マスク生成システムで利用して、合成に使用するマスクを 生成することができる。マスクを設計するためのシステムが、あらゆる目的のた めに参照によって本明細書に組み込まれる米国出願第０８／２４９，１８８号に 記載されている。 第８Ａ図〜第８Ｃ図に、これらのシフト・レチクルを使用して先のプローブ・ セットを生成する、単量体の追加を示す。第８Ａ図では、シフト・レチクルを使 用して、単一の単量体「層」を基板３０２上に生成する。単量体「層」の意味す るところは、単量体付加段階のそれぞれの合成サイクルによって、基板上の指定 場所に単量体が一様に追加されるということである。第８Ａ図に示すように、指 定場所が、基板の活性領域全体を含んでもよい。しかし第１８図に示すように、 指定場所が、活性領域の場所のサブセットだけを含むのでもよい。 続けて第８Ａ図を参照する。レチクル１を最初に使用して、基板上にへヌクレ オチドＡを迫加する。続いてレチクル２を利用し、基板にヌクレオチドＣを追加 し、その後、レチクル３および４を利用して、ヌクレオチドＧおよびＴをそれぞ れ追加する。Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの１回の合成サイクルで、単一の単量体層が、基板 上の中央の４つの位置として示した基板の活性領域に追加された。かっこ内の番 号は、使用するレチクルを指示する。矢印は、レチクルが基板と位置合せする場 所（すなわち、それぞれのレチクル中の可能な最初の開口）を示す。それぞれの 合成サイクルの終了後、全てのレチクルを位置１つ分だけシフトさせる。 第８Ｂ図では、図中の矢印で示すように、レチクルが、基板に対して位置１つ 分だけ左にシフトされている（第８Ａ図と比較されたい）。次いでそれぞれのレ チクルを１サイクルさせ、異なるそれぞれの単量体を、基板上のレチクルによっ て指定された場所に追加する。このときもやはり、レチクルによって、単一の単 量体層が基板の活性領域に追加される。レチクルを左にシフトさせる、すなわち 左に平行移動させるように示したが、当然ながら、レチクルを右、またはその他 の任意の方向にシフトさせることもできる。 第８Ｃ図で、レチクルを再び、図中の矢印に示すように位置１つ分だけ左にシ フトさせる。レチクルを１サイクルさせ、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔを、基板 上のレチクルの開口によって指定された場所に追加する。最後のレチクルを利用 し終わると、第８Ｃ図の最下段に示すとおり、基板の中央の位置に、標的配列に 完全に相補的な４つのプローブが合成されている。これらの４つのプローブは基 板の活性領域を表す。図中の、基板の活性領域内にないプローブを基板の「エッ ジ」と呼ぶ。サンプルの分析または配列決定時、これらのエッジ・プローブは一 般に無視される。 単純にするため、レチクルの単量体付加領域が、対象基板上に単一の単量体を 付加するものとして示した。しかし実際には、レチクルのそれぞれの単量体付加 領域は、開口によって指定された領域に数百ないし数千の単量体を付加する。同 様に、レチクルは一般に、数百行のプローブを基板上に合成する。好ましい実施 形態では、プローブが４行の倍数に合成され、それぞれの行の中のプローブが、 その他のプローブと、照会位置のヌクレオチド１つだけ異なる。 第９Ａ図〜第９Ｂ図に、第３図に示した標的配列用の複数のプローブ・セット を生成するのに使用することができるレチクルを示す。第９Ａ図は、第７図のレ チクル１と同様のレチクルを示す。ただしこのレチクルは、４行のプローブ、２ セットを生成するのに利用される。同様に第９Ｂ図は、第７図のレチクル２と同 様ではあるが、４行のプローブ、２セットを生成するのに利用されるレチクルを 示す。ヌクレオチドＧおよびＴ用のレチクルについては図示しないが、これらも 同じように生成される。 これらの４つのそれぞれのシフト・レチクルを利用して、標的配列に相補的と 考えられる４行のプローブ、２セットを基板上に生成する。この合成のそれぞれ の合成サイクルで、この標的に相補的な１セットのｎ量体プローブが生成される 。したがってこれらのシフト・レチクルを通して３サイクルさせると、基板は、 １セットの３量体相補プローブを含む。相補プローブの長さを、使用する単量体 付加段階の合成サイクル数によって合成時に選択することができる。「合成サイ クル」は、基板に追加するそれぞれの単量体を通したサイクルと定義される。１ 回の合成サイクルによって、一般には基板の活性領域である基板上の指定の場所 に１層の単量体層が追加される。 第１０図に、線状レチクルから方形レチクルへの変形を示す。シフト・レチク ルを長い線状のレチクルとして示してきたが、線状レチクルを、方形のシフト・ レチクルに変形することができる。線状レチクル３０２は、１６個の活性セルお よび３個の余分のセルを含む。余分のセルは、基板に対してシフトさせるために レチクルに追加したセルである。線状シフト・レチクル中のセルの数は一般にこ れよりもかなり大きいが、図示の目的から単純なレチクルを示した。 線状レチクルを方形レチクルに変形する際、１６個の活性セルは方形の領域内 に配置され、適当な余分のセルがエッジに配置される。こうして、このレチクル の正方形領域にセル１〜１６を配置することによって、方形レチクル３０４が形 成される。方形レチクルのそれぞれの行末には、線状レチクル中の余分のセルと 同数の余分のセルが置かれ、これらの余分のセルは、活性セルの後に順番に続く 。その結果生じる方形レチクルは、標的配列用のプローブ行を形成するシフト・ レチクルである。 照会位置に異なる単量体を付加するには、第１１Ａ図および第１２Ａ図に示す ようなレチクルを利用する。第１１Ａ図に、照会位置単量体を基板上に結合する のに使用するレチクルを示す。このレチクルは、単量体をプローブに付加するの に利用する複数の開口行を含む。これらの行は、第９Ａ図および第９Ｂ図に示し たレチクルと垂直である。 まず、第１１Ａ図のレチクルを用いて、ヌクレオチドＡのような単量体をある 列のプローブ（すなわち、Ａ−レーン）に付加する。次いで、レチクルを次の列 のプローブへと下方に移動し、次いで、ヌクレオチドＣのような異なる単量体を この列のプローブ（すなわち、Ｃ−レーン）に付加する。異なる単量体が１セッ トのプローブ中の各列における照会位置に付加されるまで、このプロセスを続け る。削除の場合には、単量体をその列のプローブに付加しない。 したがって、プローブ中の第３の位置に照会位置を有する５量体プローブを生 成させるため、基質の活性領域中に２量体プローブを生成させるシフト・レチク ルにより単量体付加段階の合成サイクルを２回行う。次いで、照会位置レチクル を用いて、シフト・レチクルを移動する方向に対して直交する方向にマスクを移 動させることにより、各列のプローブに異なる単量体を付加する。削除の場合を 除き、照会位置レチクルは、１回の合成サイクルによって基質の活性領域中に一 層の単量体を付加する。次いで、シフト・レチクルを２つの位置に移動させた後 （余分な位置は、照会位置レチクルによって用いられる合成サイクルを反映する ）、シフト・レチクルを用いて、単量体付加段階の合成サイクルを２回行うこと により、最後の２つの単量体をプローブに付加する。 照会位置が異なるチップ上のプローブを、第１１Ｂ図に示す。上半分のチップ には、プローブ中の３番目のヌクレオチドに照会位置を有する４量体プローブが 含まれる（容易に確認できるように、照会ヌクレオチドを丸で囲んである）。図 に示すように、チップのこの半分の活性領域には４量体プローブがある。チップ の下半分には、異なる長さのプローブをチップ上で同時に合成することができる １つの追加レチクルとともに、同一のシフト・レチクルおよび照会位置レチクル を同時に用いて合成した活性領域中の３量体プローブが含まれる。このレチクル について、第１３Ａ図を参照しながらより詳細に説明する。 本発明のシフト・レチクルは、標的構造特異的であるが、配列特異的ではない 。例えば、シフト・レチクルを用いて、ＤＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖に 相補的なプローブを合成することができる。さらにＴＧＡＣＡＴに相補的なプロ ーブを生成させるシフト・レチクルを用いて、シフト・レチクルを用いたＡおよ びＴヌクレオチドを交換することによりＡＧＴＣＴＡに相補的なプローブを生成 させることもできる。したがって、合成時に、合成サイクル中のシフト・レチク ルの順序、合成サイクル中の単量体、各シフト・レチクルに関係する単量体、お よび照会位置を選択することにより、プローブの特徴を指定することができる。 第１１Ｃ図は、前述の方法で生成されたチップのイメージである。チップは、 中央位置に照会位置を持つ２０量体プローブを有する。このチップは、１０００ 塩基対配列のＨＩＶを配列決定するためのものである。前述の例は、本発明を理 解してもらうために簡略化してあることを理解されたい。チップ・イメージは、 実際のチップを示し、したがって、より複雑であるが、より大きなスケールに拡 張された本発明の原理を利用する。 基質のエッジ領域のプローブは、第１１Ｃ図のチップの右側に示すように、様 々なハイブリッド形成強度で標識された標的に結合する。しかし、チップの活性 領域がどこで始まり、どこで終わるかを視覚的に確認することは困難である。好 ましい実施形態においては、第１２Ａ図に示すように、照会位置レチクルを使用 する。このレチクルは、基質の活性領域に対応、またはさらに大きな開口を有し ている。開口は基質のエッジ領域の上方にはならないため、基質のエッジ領域の プローブは照会位置ヌクレオチドを受け取らない。このように、エッジ領域にお ける各コラムのプローブは同一となり、したがって、エッジ領域はチップ・イメ ージ中のストライプのように見えるため、活性領域の開始はより容易に確認でき る。これは、第１１Ｃ図中のチップの左側に示される。 照会位置が異なるが第１２Ａ図に示すレチクルを用いて合成されたチップ上の プローブを、第１２Ｂ図に示す。チップの上半分には、プローブの３番目のヌク レオチドに照会位置を有する４量体プローブが含まれる。示すように、チップの この半分の活性領域レーンには４量体プローブがある。円で囲んだ照会ヌクレオ チドは活性領域だけに付加された。したがって、活性領域外（エッジ）の各コラ ム中のプローブは、同一である。同一であるため、得られるストライプを用いて 、ハイブリッド形成および走査後にチップのエッジを確認することができる。チ ップの下半分には、第１３Ａ図に示すレチクルを用いて合成された３量体プロー ブが含まれる。 前述のようにして合成されたチップを第１２Ｃ図に示すが、エッジ領域はスト ライプにより容易に確認できる。チップは、中央位置に照会位置を持つ２０量体 プローブを有する。このチップは、２，５００塩基対配列のＨＩＶを配列決定す るためのものである。 これらのシフト・レチクルおよび照会位置レチクルを用い、レチクルのサイズ によってのみ制限される標的配列用に、任意の置換位置を有する任意の長さのプ ローブが合成できる。通常、レチクルのサイズは、基質の列に沿った標的のサイ ズに所望の長さの合成プローブを加え１を減じたものに等しい。例えば、チップ 上に１００列のセルがあり、標的配列が１００単量体と等しいか長い場合には、 レチクルは、１２量体プローブに対して１１１セル（または可能な単量体付加領 域）幅となる（すなわち、１００＋１２−１）。 本発明では、５種類のレチクルを用いて、標的配列に対し任意の照会位置を有 する任意の長さのプローブを配列決定できる。さらに、合成前に、プローブの長 さおよび照会位置を決める必要がない。レチクルを生成させた後、基質上に生成 された特定のプローブは、単量体付加段階のサイクル数および照会位置レチクル を用いるサイクルを示すことにより合成時に決めることができる。 第１３Ａ図に示すレチクルを用いて、所望ならば、合成時に決められた長さを 有する様々な長さのプローブを生成させることができる。レチクルには、１セッ トのプローブに光を当てることができる開口が含まれる。チップの上半分だけが 脱保護されるように、このレチクルをシフト・レチクルと組み合わせて用いるこ とができる。例えば、このレチクルを用いて、第１層のヌクレオチドをチップの 上半分だけに付加することができる。第１層のヌクレオチドを加えた後、チップ 全体にヌクレオチドを付加することにより合成を続けることができる。このよう にして、第１１Ｂ図および第１２Ｂ図の４量体および３量体プローブが生成され た。 あるいは、第１３Ａ図のレチクルを用い、合成を停止することができる。ある 領域でプローブを合成した後、レチクルによって特定された領域を脱保護し、次 の露光がこの領域のプローブを脱保護しないようにキャップ付け試薬を基質に加 えることができる。キャップ付け領域は、ＤＭＴまたは他のいずれの既知キャッ プ付け試薬でもよい。このレチクルを用い、基質の１つの領域は、基質の他の領 域とは異なる長さのプローブを含むことができる。例えば、第１３Ｂ図に示す基 質には、８量体プローブおよび１２量体プローブが含まれる。８量体プローブが まずチップ全体に生成し、次いで第１３Ａ図のレチクルを用い、続く露光が続く 単量体の付加を引き起こさないように、チップ全体をキャップする。１２量体プ ローブの領域はキャップされていないので、続く単量体付加によって１２量体プ ローブが生じる。 さらに、第１３Ａ図に示すレチクルを用い、ヌクレオチド削除を有するプロー ブを合成することができる。例えば、ヌクレオチド付加サイクルをスキップする レチクルを用いることによって、削除を有するプローブを合成することができる 。 第１４Ａ図は、複数のレチクルを含むマスクである。マスク５００には、各ヌ クレオチド単量体あたり１つの、シフト・レチクル５０２、５０４、５０６、５ ０８が含まれる。このマスクには、基質の活性領域に優先して照会位置に単量体 を付加する照会位置レチクル５１０も含まれる。さらに、このマスクには、合成 後にプローブをキャップするため基質の全表面を脱保護するために用いるレチク ル５１２が含まれる。複数のレチクルを含むマスクを第１４Ａ図に示すが、本発 明は、各マスクが単一のレチクルを含むようなシステムに、有利に用いることが できる。 一実施形態におけるレチクルのレイアウトを第１４Ｂ図に示す。大部分のレチ クルには、基質のＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンの連続するグループのための単量 体付加領域を有する列が含まれる。レーンの各グループに対する単量体付加領域 は通常、第９Ａ図および第９Ｂ図に示すものと同一である。Ａ、Ｃ、Ｇ、および Ｔレーンに対応する各グループの列は、標的の異なるセクションに相補的なプロ ーブを合成するために異なる。例えば、１つのグループは５００〜５９９位のヌ クレオチドを確認するためのプローブを合成するためのものであるが、次のグル ープは、６００〜６９９位のヌクレオチドを確認するためのプローブを合成する ためのものである。 第１４Ｂ図の最上段および最下段のレチクルは、対照オリゴヌクレオチド配列 に相補的なプローブを生成させるためのものである（すなわち、対照プローブ・ レーン）。対照配列は、走査後にチップの活性領域をより容易に確認および／ま たは調整できるようにするために標的に付加される既知の配列である。 ２つのチップ上のプローブを同時に合成するためのレチクルを、第１４Ｃ図に 示す。示すように、各チップに対し同一のＡレチクル、Ｃレチクル、Ｇレチクル 、Ｔレチクルおよび照会位置レチクルがある（チップ１およびチップ２と表記す る）。２つの同一チップを同時に生成できるように、これらのレチクルは同一ガ ラス片上に置かれる。したがって、合成サイクルがＡで始まると、２つのＡレチ クルが用いられる。次いで、合成サイクルの次のヌクレオチドを付加するため次 のヌクレオチド・レチクルがチップの上になるようにガラスを移動する。次の合 成サイクルでは、チップに対して水平に移動した位置のチップ上にレチクルを位 置させる。したがって、ヌクレオチド・レチクルはチップよりも幅広い。 照会位置レチクルを用い、チップ上のプローブの照会位置でヌクレオチドを合 成することができる。照会位置ヌクレオチドを付加するように指定された合成サ イクルでは、ガラスはチップに関して垂直に移動する。ヌクレオチド・レチクル は水平に移動し、また照会位置レチクルは垂直に移動するように説明したが、レ チクルが任意の方向に移動できることを理解されたい。また、チップ１およびチ ップ２に対するレチクルは同一である必要はなく、２つのチップに限定されるも のではない。したがって、本発明により、複数の異なるチップを同時に合成する ことができる。 ２つのチップ上に様々な長さのプローブを同時に合成するためのマスクを、第 １４Ｄ図に示す。様々な長さのプローブを合成するためにチップの領域を選択し 、レチクルを用いる方法はすでに説明した（例えば、第１３Ａ図および第１３Ｂ 図を参照）。この目的を達成するための別法を第１４Ｄ図中のマスクで説明する 。 マスクには、第１４Ｃ図で説明したレチクルと同様なレチクルが含まれ、実際 、マスクの左最下段のレチクルは、これらのレチクルと同一である。下のチップ は、チップのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーン５つのグループを有する。示すように 、マスクの左最下段中のレチクルは、５つのグループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレ ーンのそれぞれに対応する単量体付加領域の列を有する。各グループのＡ、Ｃ、 Ｇ、およびＴレーンは同一であるが、すべてのレチクルが同数のグループを有す るとは限らない。１、２，３、および４グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーン を持つ他のレチクルがある。 様々な長さのプローブを有するチップを合成するため、チップ上の所望の領域 で単量体を付加するレチクルを選択する。例えば、プローブ中央に照会位置を有 する２つのチップ上で同時に３、５、７、９、および１１量体プローブを合成し たいときには、１つの合成サイクルに対し単一グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ レーンを持つレチクルを最初に用いることができる。その結果、単量体は、チッ プの先頭部分に結合する。 次に、１つの合成サイクルに対し２つのグループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレー ンを持つレチクルを用いることができる。２層の単量体を持つ先頭領域（すなわ ち、２量体プローブ）および１層の単量体を持つ隣接領域が合成される。チップ 上に５、４、３、２、および１層の単量体を有する領域が得られるまで、３、４ および５グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンを持つレチクルを用いてこのプ ロセスを繰り返すことができる（チップの最上段から最下段まで）。 次いで、マスクの下半分で照会位置レチクルを用い、照会位置ヌクレオチドを すべてのチップ上のプローブに付加することができる。照会位置レチクルを用い た後、ヌクレオチドを付加する前のプロセスを逆転させることができる。合成後 、 オープン・チップ・レチクルを用い、プローブをキャップすることによってプロ ーブの中央に照会位置を持つ３、５、７、９、および１１量体プローブを有する ２つのチップを生成させることができる。これらのチップのうち１つのレイアウ トを第１４Ｅ図に示す。 遺伝子型決定または遺伝子発現の応用分野で通常用いられる別の実施形態にお けるチップのレイアウトを、第１５Ａ図に示す。第１５Ａ図に示されるように、 チップ５５０は、完全相補レーン５５２，突然変異レーン５５４および対照レー ン５５６を有する。完全相補レーンは、標的配列に対し完全に相補的なプローブ を有する。突然変異レーンは、突然変異位置を除いて標的配列に対して相補的な プローブを有する。突然変異レーンを用いて、データの妥当性をチェックする。 したがって、完全相補レーンのハイブリッド形成強度を突然変異レーンのハイブ リッド形成強度と比較する。 特定の単量体を一対の列中のチップ上に結合するためのシフト・レチクルを、 第１５Ｂ図に示す。このレチクルを用いて、完全相補および突然変異列の双方に ヌクレオチドを付加することができる。通常、各合成サイクルにおいて使用され る、各ヌクレオチド１つずつの４つのレチクルがある（第７図を参照）。しかし 、１つのレチクルのみを示す。 単一のレーン中のチップ上に特定の単量体を結合させるためのシフト・レチク ルを、第１５Ｃ図に示す。第１５Ｃ図に示すシフト・レチクルを用い、完全相補 のプローブとは異なるプローブを突然変異レーンに生成させることができる。前 と同様に、通常は各ヌクレオチドを付加するために１つずつ、４つのレチクルが あるが、話を簡単にするために１つを示す。１回の合成サイクルで、これらのシ フト・レチクルを用い、第１５Ｂ図に示すレチクルで行ったように、完全相補レ ーン中の標的配列に完全に相補的なヌクレオチドを付加することができる。 本発明により、第１５Ｃ図に示したものと同一のシフト・レチクルを用い、突 然変異レーン中のプローブに突然変異ヌクレオチドを付加することができる。単 量体付加領域が突然変異レーンの上にくるようにシフト・レチクルを垂直に移動 する。突然変異ヌクレオチドを突然変異レーン中のプローブに付加するため、合 成サイクル中のヌクレオチド付加段階の順序を変更することができる。例えば、 ある合成サイクルでヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、次いでＴを付加する時には、Ｔ、 Ｇ、Ｃ、次いでＡという逆の順序で付加することができる。したがって、突然変 異レーンの各プローブは、付加された突然変異ヌクレオチドを有することになる 。 あるいは、ヌクレオチド付加段階の順序はもとのままにして、用いるシフト・ レチクルの順序を変えることができる。突然変異レーン中のプローブに突然変異 ヌクレオチドを付加するという同一の効果があることは明らかであろう。 対照プローブを含む対照レーンを生成させるためのシフト・レチクルを、第１ ５Ｄ図に示す。この対照プローブは、走査結果を解析するためチップとハイブリ ド化する既知のオリゴヌクレオチドと完全に相補的であってよい。この場合も、 １つのシフト・レチクルを示すが、通常各単量体について１つずつある。 前記実施形態は、標的配列に相補的な様々な長さのプローブを生成させるため に用いることができるシフト・レチクルを提供する。照会位置ヌクレオチドを有 するプローブまたは前記と同一の基質上に様々な長さのプローブを生成させるた めに、これらのシフト・レチクルを１つまたは複数のマスクとともに用いること ができる。レチクル数を大幅に減らすことができることから（例えば、５レチク ルまたはそれ以下）、基質上にプローブを生成させるためのコストが低下する。 合成時にプローブの特徴を特定できるので、柔軟性が増す。単一シフト・レチクル 別の実施形態において、本発明は、標的配列に相補的なプローブを合成するた めに用いることができる単一シフト・レチクルを提供する。本発明の本実施形態 に従って生成させるための方法の高水準流れ図を、第１６図に示す。段階６０２ で、標的配列の完全相補ヌクレオチドの番号付けを行う。第３Ａ図に示すように 標的配列がＴＧＡＣＡＴのとき、完全相補はＡＣＴＧＴＡとなる。したがって、 完全相補中のヌクレオチドは、始めのＡが１、Ｃが２、始めのＴが３のように、 １〜６の番号が振られる。 次いで、単一シフト・レチクルを、段階６０４〜６１０に従って生成させる。 これらの段階は、任意の特定の順序で行う必要はなく、実際、平行して行えるこ とに注意されたい。さらに、各式は、示したヌクレオチドに特有ではない。しか し、各段階が各ヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴについて、順番に行われるよう に説明する。 段階６０４では、式ｎ×（ｉ−１）＋１に従って、完全相補の各Ａに対する単 一レチクル中に開口が生成され、ここで、ｎは、異なるタイプの単量体（例えば 、ヌクレオチド）数に等しく、ｉは、完全相補（または所望のプローブ）中の単 量体の位置に等しい。ヌクレオチドＡは、完全相補中の基本位置１および６にあ ることから、ｎは、４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴに対して４に等しく 、ｉは、始めのＡに対して１、および第２のＡに対して６となり、開口は位置１ および２１の単一レチクル中に生成される。得られる単一レチクルを、第１７Ａ 図に示す。 段階６０６では、式ｎ×（ｉ−１）＋２に従って、完全相補の各Ｃに対する単 一レチクル中に開口が生成され、ここで、ｎは、異なるタイプの単量体数に等し く、ｉは、完全相補中の単量体の位置に等しい。ヌクレオチドＣは、完全相補中 の基本位置２にあることから、ｎは、４に等しく、ｉは、２となり、開口は位置 ６の単一レチクル中に生成される。ＡおよびＣ双方に開口を有する単一レチクル を、第１７Ｂ図に示す。 段階６０８では、式ｎ×（ｉ−１）＋３に従って、完全相補の各Ｇに対する単 一レチクル中に開口が生成される。ヌクレオチドＧは、完全相補中の基本位置４ にあることから、ｎは、４に等しく、ｉは、２となり、開口は位置１５の単一レ チクル中に生成される。Ａ、ＣおよびＧに開口を有する単一レチクルを、第１７ Ｃ図に示す。 段階６１０では、式ｎ×（ｉ−１）＋４に従って、完全相補の各Ｔに対する単 一レチクル中に開口が生成される。ヌクレオチドＴは、完全相補中の基本位置３ および５にあることから、ｎは、４に等しく、ｉは、２となり、開口は位置１２ および２０の単一レチクル中に生成される。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに開口を有する 単一レチクルを、第１７Ｄ図に示す。 段階６１２では、単一レチクルを含むマスクを生成させるためのマスク・ファ イルが出力される。通常、このマスク・ファイルはコンピュータ作動システムに よって用いられ、マスクを生成させる。 第３Ａ図のプローブ・セットを生成させる単一シフト・レチクルおよびこのレ チクルを用いる単量体の付加を、第１８図に示す。レチクル６５２は、第１６図 を参照して説明したプロセスに従って製造される。示すように、このレチクルに は、６サイクルのＡ、Ｃ、ＧおよびＴ（前記レチクル１〜６で表示する）が含ま れる。各サイクルには、示すような様々な位置の単一開口が含まれる。 まず、マスクを用い、マスクによって特定される領域でヌクレオチドＡを基質 に付加する。各連続合成段階ごとに、１つの位置または各段階のセルの分だけレ チクルを移動すると、各ヌクレオチド合成サイクルに対し４シフトが生ずる。表 の左に順に列挙するヌクレオチド付加段階とともに、レチクルの下、表６５４に このプロセスを示す。表の点線は、基質の活性領域の右境界を示す。言い換える と、点線の右へのヌクレオチドは、基質とは結合しない。 通常、この表を合成中に用いることはないが、本実施形態で基質上のプローブ をいかにして生成させるかを理解してもらう目的で示す。表中の各コラムは、基 質上のプローブを示す。しかし、モノマーが付加されるに従って表が下方へ伸び るため、各コラム中の先頭から１番目のヌクレオチドが基質により近い。 基質の下の４本の矢印によって示される所望の３量体プローブを有する基質６ ５６が得られる。各サイクルは、各所望のプローブに１つのヌクレオチドを付加 するため、所望のプローブは、これら特定領域におけるヌクレオチドの規則的付 加によって生成される。したがって、照会位置ヌクレオチドを付加するために、 第１１Ａ図および第１２Ａ図に示す位置と同様な照会位置レチクルを用いること ができる。照会位置ヌクレオチドを付加した後、次いで、単一シフト・レチクル の合成サイクルをスキップさせてレチクルを４つの位置またはセルの分移動させ る（例えば、第１８図の左方に）。 示すように、所望のプローブの周囲に多くの「ジャンク」プローブがある。通 常、標的の配列決定の間は、これらのプローブを無視する。話を簡単にするため に、単一レチクルを直線レチクルとして示した。しかし、第１９図に示すように 、２セットの４列のプローブを生成させるためにレチクルを用いることができる 。本発明の原理を拡張することにより、さらに多くの列のプローブを生成させる ことができる。 単一シフト・レチクルを長い直線レチクルとして示したが、この直線レチクル は、第１０図に示すように矩形シフト・レチクルに変換することができる。単一 シフト・レチクルを各単量体付加段階とともに移動させるため、得られる矩形レ チクル中の各列末端の余分なセル数は本質的に多くなる。 本発明の本実施形態により、標的配列に完全に相補的なプローブを単一シフト ・レチクルにより基質上に合成することが可能となる。追加のレチクルを用い、 照会位置ヌクレオチドを有するプローブまたは前述のような様々な長さのプロー ブを合成することができる。必要なレチクル数が減少することにより、本実施形 態は、プローブ・アレイ合成のためのマスクを生成させるコストを大幅に低減す る。さらに、合成時に所望のプローブの特徴を特定できることから、柔軟性も増 す。他のシフト・レチクルの実施形態 別の実施形態において、本発明は、突然変異、削除などを検出するためのプロ ーブを合成するために用いることができるシフト・レチクルを提供する。これら のシフト・レチクルは標的配列構造特異的ではないので、標的配列は合成時に指 定することができる。言い換えれば、１セットの「一般」シフト・レチクルを用 いて、任意の標的配列を解析するためのプローブを合成することができる。さら に、これらのプローブは極めて少ないレチクルで生成させることができる。 突然変異および削除を検出するための複数の単量体を含むプローブを合成する ためのシフト・レチクルを、第２０Ａ図〜第２０Ｄ図に示す。シフト・レチクル がどのように働くかを説明するために、例を示すのが有益であろう。１５量体標 的の中間（または８番目）位置における突然変異または削除を検出するようなプ ローブを合成したいと仮定しよう。通常、標的配列はもっと長いが、この例は本 発明を例示するために用いることを理解されたい。 標的配列がＴＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＣＧのとき、以下のプローブを合成す るのが望ましい。ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＧＡＴＧＣ、ＡＴＧＧＣＡＣＧＴＣＧＡ ＴＧＣ、ＡＴＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＧＣ、ＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＧＡＴＧＣ、 ＡＴＧＧＣＡＣＴＣＧＡＴＧＣ。第１のプローブが標的配列の完全相補であるこ とを示す照会位置ヌクレオチドに下線を引いた。続く３プローブは照会位置に突 然変異を有し、最後のプローブは照会位置に削除を有する。 ４つのシフト・レチクル（またはそれ以下）を用い、これらのプローブを合成 することができる。第２０Ａ図のシフト・レチクルは、非照会位置単量体を基質 に結合させるために用いる。標的配列の相補に対応するヌクレオチド付加段階を サイクルさせる。シフト・レチクルの前記ヌクレオチドによって指示されるよう に、始めのＡを付加し、次いで、Ｔ、次いでＧなどを付加する。各単量体付加段 階の後、シフト・レチクルを左に１位置移動する。シフト・レチクルは５列上に あるように示されるため、第８単量体付加段階までに５つの同一プローブが生成 される。 完全相補中のＴに対応する第８単量体付加段階では、ただ１つの単量体付加領 域がプローブの上に来る。したがって、Ｔは、第２０Ａ図の先頭プローブである プローブの１つに付加されるだけである。 単一単量体付加領域を有するレチクルを、第２０Ｂ図に示す。このレチクルを 用い、先頭から２番目のプローブの８番目の位置にＧを付加することができる。 同様に、第２０Ｃ図および第２０Ｄ図のレチクルを用い、レチクルの一単量体付 加領域に対応するプローブの８番目の位置にＣおよびＡを付加することができる 。この位置の削除が検出できるように、最下段のプローブは８番目の位置に付加 された単量体を有しない。第２０Ｂ図〜第２０Ｄ図は、３種類のシフト・レチク ルを示しているが、垂直に移動する単一シフト・レチクルを用いることができる 。 照会位置ヌクレオチドを付加した後、第２０Ａ図のシフト・レチクルを用い、 残りのヌクレオチドをプローブに付加する。これらのプローブを含むチップを第 ２０Ｅ図に示す。チップ８００には、完全相補的プローブ、照会位置プローブ、 および削除を検出するためのプローブが含まれる。 前述のシフト・レチクルを改変して様々な長さのプローブを生成させることが できる。様々な長さの関連プローブを基質上に合成するためのシフト・レチクル を第２１Ａ図に示す。このシフト・レチクルは、９、１１、１３、１５、１７、 １９、および２１量体プローブを生成させるために幅を変化させた単量体付加領 域を有する。第２１Ａ図中の矢印で指示された方向に沿ってシフト・レチクルを 移動させながら、単量体を基質に付加する。 様々な幅の単量体付加領域をデザインして、標的配列の同一位置の周りに中心 を置く様々な長さのプローブを得ることができる。例えば、第２１Ａ図に示すよ うに、各単量体付加段階を１〜２１に標識する。段階１では、ただ１つの領域が 付加された単量体を有する。続くそれぞれの段階は、この領域およびその上の領 域に単量体を付加する。このように、シフト・レチクルの階段段階デザインによ り、種々の長さのプローブを基質上で合成することが可能になる。シフト・レチ クルの各末端で階段段階デザインを用いることにより、単一階段段階で遂行され るプローブの代わりに、このプローブは、２つの単量体が異なる。 基質上に合成することができるプローブのレイアウトの一例を、第２１Ｂ図に 示す。チップ８５０には、９、１１，１３、１５、１７、１９、および２１量体 を含む領域が含まれる。それぞれの長さのプローブに対して一列あることを説明 しただけであるが、それぞれの長さのプローブに対して複数の列があり得る。例 えば、照会位置のヌクレオチドに対して１つ、それぞれの長さのプローブに対し て４列ある。照会位置において、第１１Ａ図および第１２Ａ図を参照しながら説 明したような照会位置レチクルを用い、シフト・レチクルを用いる代わりに照会 位置ヌクレオチドを付加することができる。本発明の利点は、プローブの配列、 プローブの長さ、および照会位置が合成時に選択できることである。 本発明の本実施形態は、様々な長さを有し、標的配列中のある位置の周りに中 心を置くプローブの合成を可能にする。シフト・レチクルを照会位置レチクルと ともに用い、突然変異を検出する様々な長さのプローブを生成させることができ る。 本発明の本実施形態は、シフト・レチクルが標的配列構造特異的ではないとい う顕著な利点を有する。したがって、標的の配列を合成時に特定し、「一般的」 セットのシフト・レチクルを用い、標的配列を解析するためのプローブを合成す ることができる。本発明の他の実施形態に関して言えば、必要なレチクル数が顕 著に減少し、チップを生成させるためのコストが低下する。また、所望のプロー ブの特性（例えば、照会位置）を合成時に特定できるため、柔軟度も増す。スペックル・マスク 本発明のいくつかの実施形態ではスペックル・マスクを利用する。「スペック ル・マスク」は、結論から言うと、各位置に開口を有し、それによって実際にフ ル・オープン・マスクを生成できると言われている１セットのレチクルである。 スペックル・マスクの簡単な例を第２２図に示す。示すように、３つのレチクル は、異なる位置に単一単量体付加開口を有している。開口を加え合わせると、フ ル・オープン・マスクが生成する。これがスペックル・マスクの性質である。 スペックル・マスクの別の例は、第７図に示すレチクル・セット（またはマス ク）である。これらのマスクには、レチクル中の各単量体付加領域あたり１つお よびただ１つの開口が同時に含まれる。フル・オープン・マスクを生成させるま でどのようにシフト・レチクル開口が追加するかを、第２３図に示す。 スペックル・マスクの基本的性質は、合成サイクルにすべてのレチクルを用い たときに、正確に１つの単量体が基質の活性領域中の各プローブに付加されるこ とである。この性質を用いると、任意の長さのプローブおよび照会位置を合成時 に構築することが可能となる。 スペックル・マスクの別の応用は、単一スペックル・セットから多くの異なる チップを生成させることである。各セルに１〜４の無作為番号を割り付ける（ま たは、単量体の番号がたまたま割り付けられる）ことによりグリッドを得て、ス ペックル・セットを構築する。この番号は、どのレチクルがその位置に開口を有 するかを示す。合成サイクルの中でＡ、Ｃ，Ｇ、およびＴのいくつかの過突然変 異（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）によって４つのすべてのレチクルをサイクルさせ ると、１セットの「無作為」ヌクレオチドが基質上の各プローブに付加する。い くつかの任意の（ｘおよびｙ）オフセットを各段階に用いたときには、各プロー ブに付加されるヌクレオチド間の関連性はほとんど期待されない。それぞれの異 なるセットのオフセットの場合、極端に異なるプローブのセットを生成させるこ とができる。したがって、規則的な長さのプローブを有する「無作為」チップ（ チップのエッジ上のプローブは無視する）を生成させることができる。 スペックル・セットのもう１つの応用は、規則的長さのプローブの選択された セットを生成させることである。そのプローブ・セットを含む配列を取り出し、 その配列に対するシフト・マスクを生成させることによって、特定のプローブ・ セットを生成するシフト・マスクを生成させることができる。しかし、通常、い くつかのプローブ・セットを含む配列は、プローブの全長よりはるかに長い。シ フト・マスクは、配列の全長とほぼ等しい多くのセルを含むため、いくつかのプ ローブ・セットを生成させるには非能率な方法かもしれない。 シフト・マスクは１次元オフセットを用いてプローブを生成させる。これを見 る方法は、各プローブをストリップｌ×ｎ（ここで、ｎは、プローブの長さ）と してマスク上にコードしなければならない。このストリップをマスク・セット上 に集めて、プローブ・セットを生成させる。どのストリップ対も矩形を重ね合わ せることのできる方法の数に対応してＯ（ｎ）通りに相互作用することができる だけである。 スペックル・セット上にプローブを詰めるよりよい方法は、二次元オフセット を用いるものである。二次元オフセットにより、「スペックル」中のマスク上に プローブをコードする−−いくつかのｎセル配列（ここで、ｎは、プローブの長 さ）。通常、２つのスペックルが相互作用する方式Ｏ（ｎ²）通りがある。この ことは、二次元オフセットを用いてスペックル・セット中に効率よくプローブを 詰めることができることを示唆している。しかし、この問題は、オフセットを選 択する自由度、各合成サイクルで用いる塩基過突然変異、およびプローブ位置が 与えられても、計算上は極めて困難に見える。オフセットの選択されたセットお よび塩基過突然変異が与えられれば、いくつかの形の模擬的アニーリングを用い て位置を選択できるかもしれない。 スペックル・マスクのパッキングを第２４図に示す。共通配列ＣＴＧを利用す ることにより、２つの配列ＡＣＴＧＴおよびＡＴＣＴＧを詰めることができる。 スペックル・マスクのパッキングは、示すようなｘおよびｙオフセットの双方を 含む。 スペックル・セットのいくつかの可能な一般化が存在する。用いる塩基セット より多くのマスクを用いて自由度数を増加させることができる。いくつかのオー プン・マスクになるマスク・セットを生成させることもできる（マスクのフルセ ットを合わせたとき、各セルは正確にｋ回開く）。さらに、オープン・マスクに なる多くの異なるサブセットを有するマスク・セットを生成させることができる 。ポスト・チップ合成 前述の実施形態においては、矩形グリッドとしてレチクルをデザインした。矩 形グリッドは、マトリックス表示を切り換えるのに適しているために用いられる 。スイッチ・マトリックスは、組合せマスクの優れた生成を提供するが、通常、 すべてのセルが同一サイズである矩形セルのアレイを含むチップを要求する。ブ ランク・レーン（プローブを含まないレーン）がプローブを含むレーンと同一の サイズであるため、これらのチップには無駄な空間を含む。 ポスト・チップ合成により、関連する各プローブ・セット（例えば、照会位置 で単一塩基が異なるプローブ）はテキスト・ドキュメント中のキャラクタとして 扱われる。関連プローブのセットを「解析領域」と呼ぶ。キャラクタは現代のプ リンタ中の矩形グリッドに限定されないため、解析領域も制限されず、代わりに 増減、回転、伸縮、または操作できる。したがって、解析領域を配列リストとし て入力することができる。 ポスト・チップ合成の一実施形態におけるチップのレイアウトを第２５図に示 す。解析領域９００には、Ｇ、Ｔ、Ａ、およびＣと表示された４つのセルが含ま れ、各セル中のプローブの照会位置のヌクレオチドを示している。示すように、 解析領域は、円型パターンで配置する。解析領域のただ１つのリングを示すが、 さらに多くのリングを中心の周囲に生成させることができる。この解析領域パタ ーンを拡張し、コンピュータ制御機器で読みとるためのセクタおよびトラックを 含むハード・ドライブ上に格納されるデータと類似するようにできる。 ポスト・チップ合成に用いる別のチップのレイアウトを第２６図に示す。この 実施形態で、解析領域は、蓄音機レコードと同様、スパイラル・パターンで合成 される。さらに、チップ上にプローブを合成するマスクは、矩形セルにヌクレオ チドを付加しなかった。代わりに、プローブは、照会ヌクレオチド文字、Ａ、Ｃ 、Ｇ、またはＴの輪郭でチップ上に合成された。予想通り、示された試料配列と 最もよくハイブリッド形成するプローブは、最高の強度を生成し、これらキャラ クタのうちの１つに最も明るい輪郭を生成する。言い換えれば、走査イメージの 右 に塩基を読み取ることができる。 あるいは、コンピュータ・システムが光学的キャラクタ認識技術を利用し、走 査イメージから照会塩基を示すキャラクタを読み取ることができる。解析領域の スパイラル配置により、このプロセスをさらに追加することができる。 ポスト・チップ合成により、解析領域を様々な方位、スパイラル、または解析 領域間の空間を様々に変えて配置することができる。チップをレイアウトする際 の柔軟性も生まれ、多くの応用で非常に有益であると実証できる。エッジ最小化 基質の活性領域を最大限利用するため、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーン群をブラ ンク・レーンなしに詰めることは有益であることがある。複数グループのＡ、Ｃ 、Ｇ、およびＴレーン１００２を含む基質活性領域１０００を第２７Ａ図に示す 。示すように、レーン１００２の各グループを隔てるブランク・レーンはない。 活性領域の物的財産の最も優れた利用に見えるが、あるグループのＴレーンにお けるプローブの合成は、別のグループの隣接するＡレーンにおけるプローブの合 成に悪影響を与えることがある。 あるグループの合成が他のグループにどのように影響を与えるかを示すため、 第２７Ａ図からの８セル分のサブ領域１００４を第２７Ｂ図に示す。示すように 、４つのセル１０５０、１０５２、１０５４、および１０５６はＡ、Ｃ、Ｇ、お よびＴレーンの第１グループからのもので、４つのセル１０５８、１０６０、１ ０６２、および１０６４は隣接するグループからのものである。３番目の位置（ 下線で示す）に照会位置を有する５量体プローブが各セルの中にある。通常、実 際のプローブは５量体より長いが、読者に利するためにより短いプローブを示す 。 基質上のセルを隙間なく詰めると、他のセル群に隣接するセル（例えば、セル １０５６および１０５８）から得られるデータは正確ではない。その理由は、セ ル１０５６からのプローブＡＧＴＡＴおよびセル１０５８からのプローブＡＧＡ ＡＡに共通するのは１つの塩基のみであり、いずれのプローブも４番目の塩基が Ａであるためである。したがって、合成中、多くのマスクがこれらのセルのうち ただ１つのための開口となり、これが２つのセル間のマスク上に「エッジ」を生 成する。したがって、セル１０５８および１０６０中にプローブを生成させるた めに用いるレチクル上には４つのエッジがあるということが言える。 まったく対照的に、セル１０５４からのプローブＡＧＧＡＴおよびセル１０５ ６からのプローブＡＧＴＡＴは４つの共通塩基を有する。これら２つのプローブ は同一のプローブ・グループ由来であるため、照会位置塩基のみが異なる。した がって、セル１０５６および１０５８中にプローブを生成させるために用いるレ チクル上にはただ１つのエッジがあるということが言える。エッジ数の意義を以 下に説明する。 光は、レチクルのエッジの周りにいくらか拡散する傾向があるため、２つのセ ル間にエッジが多ければ多いほど、エッジ近くにセルが不正確なプローブを有す ることが多くなる。前述のように、セル１０５６と１０５８の間には４つのエッ ジがあり、一方セル１０５４と１０５６の間には１つのエッジのみがある。した がって、セル１０５６と１０５８の間の境界近くのプローブからのデータは、正 確性に劣ることになる。Ａ、Ｃ，Ｇ、およびＴレーンの群の間にブランク・レー ンを合成することにより、この「エッジ効果」は減少するが、ブランク・レーン 生成のためのエッジがあることから、この減少は約半分に過ぎない。 本発明は、照会位置塩基を合成する領域よりも広い領域で非照会位置塩基を合 成するシフト・レチクルを用いることによりエッジ数を減少させる。例えば、第 ９Ａ図および第９Ｂ図に示すシフト・レチクルは、４セル幅の単量体付加領域を 有する。非照会位置塩基が５セル幅のチップ上の領域で合成されるように、単量 体付加領域を５セル幅まで広げることができる。次いで、第１１Ａ図および第１ ２Ａ図に示すような照会シフト・レチクルを用い、非照会位置塩基によって占有 される領域より狭い（例えば、４セル幅）領域中で照会位置レチクルを合成する ことができる。 本発明が、どのようにエッジの低減をもたらすかをさらに明確に示すため、工 ッジを減らして合成できる第２７Ｂ図のサブ領域を第２７Ｃ図に示す。サブ領域 １００４’には、同一の参照番号を有する第２７Ｂ図のセルと同一の８セル、１ ０５０、１０５２、１０５４、１０５６、１０５８、１０６０、１０６２および １０６４が含まれる。しかし、サブ領域１００４’では、５セル幅で非照会位置 塩基を合成する。したがって、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンの複数グループ１０ ０２の周囲にはハーフ・セル１０７０および１０７２がある。 ハーフ・セル１０７０には、単一追加塩基すなわち照会塩基を除いたセル１０ ５０および１０５６中のプローブと同一の塩基が含まれる。したがって、ハーフ ・セル１０７０および境界となるフル・セルの間には１つのエッジの違いしかな い。前述のように、例えば、セル１０５４および１０５６の間には１つのエッジ の違いしかない。したがって、１０５０、１０５２、１０５４、および１０５６ の各セルは、それらの境界に同数のエッジを有することから、より正確なデータ が得られるはずである。 好ましい実施形態において、非照会位置塩基は５セル幅の領域中で合成するが 、その正確なサイズは必要ではない。照会位置塩基を合成する領域よりも広い領 域で非照会位置塩基を合成する場合に、エッジを減少させることができる。レー ンのグループ間に未使用の空間を有することは、チップ上の活性領域中の物的財 産を浪費すると思われるかもしれない。しかし、データはより正確になるため、 セルの濃度が実際に増加するように見かけのサイズをさらに減少させることがで きる。プローブ最適化 いくつかの例において、標的中の特定の塩基位置を照会する種々のプローブを 合成することは有益かもしれない。例えば、遺伝子中の特定の点突然変異にのみ 興味を持つこともある。特定の塩基を十分に照会するため、位置を照会する多数 の異なるプローブ（例えば、長さおよび／またはプローブ中の照会位置）を手に することは有益であろう。 本発明のある実施形態により、特定の塩基位置を照会するための異なるプロー ブを合成することが可能になる。概念的には、本発明は、非照会塩基レチクルを 照会位置レチクルと組み合わせる。異なる照会位置を有する等しい長さのプロー ブを生成するシフト・レチクルを第２８図に示す。この場合、「照会位置」は、 標的中の位置を照会するプローブ中の位置を意味する。「照会位置」は、照会中 の標的中の位置を指すこともある。 標的がＡＧＣＧＡＴＡＮＣＴＧＣＧＴＡであって、下線のＮが照会位置にある 未知の塩基を表すと仮定する。第２８図のシフト・レチクルは第７図に関して説 明したようにして生成させることができる。シフト・レチクルの先頭に示す塩基 は、標的中の対応する塩基を示しているに過ぎず、星印を付けた１１０２が、照 会位置を示す。レチクル中のこの位置のセルは、第１１Ａ図または第１２Ａ図の 照会位置レチクルと同様に生成する。示すように、照会位置では、各レチクルに 対して異なる単量体付加領域が生成する。例えば、レチクル１（Ａの場合）は、 Ａレーン中に単量体付加領域を有し、レチクル２（Ｃの場合）は、Ｃレーン中に 単量体付加領域を有し、以下同様である。 第２８図のシフト・レチクルを用いるときには照会位置レチクルは必要ない。 シフト・レチクルによるＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴの付加による８サイクルの後、プ ローブ中にすべての可能な照会位置を有する８量体プローブが合成される。 ８量体プローブの位置の例を第２９図に示す。チップ１１５０は、その活性領 域に異なる８セットの４プローブを有する。下の番号（１〜８）は、第２８図の シフト・レチクルを各単量体付加段階後に左へ移動した場合のプローブ中の照会 位置の場所を示す。Ａ１＠は、照会位置がプローブ中のチップにより近いことを 示し、一方、Ａ８＠は、照会位置がプローブ中のチップからより遠いことを示し ている。 第２８図のシフト・マスクを用いることにより、可能なあらゆる照会位置を有 する特定の長さのプローブを合成することができる。８量体を例として説明した が、本発明は、いずれの特定のプローブ長に限定されるものではない。さらに、 以下の通り、同時にチップ上に合成される種々の長さのプローブを手にすること によって、プローブをさらに最適化することができる。 種々の長さおよび照会位置を有するプローブを生成させるためのシフト・レチ クル１２００を、第３０図に示す。上半分のシフト・レチクル１２０２は第２８ 図のレチクル１と同一である。したがって、これを用い、異なる照会位置を有す る８量体を生成させることができる。下半分のシフト・レチクル１２０４は、２ つのブランク位置１２０６を有する以外は上半分と同様である。これらのブラン ク位置は、いずれのシフト・レチクル中にも単量体付加領域を有しない。ブラン クである２つの塩基位置があるため、シフト・レチクルの下半分は、上半分と同 程度に標的をカバーしない。話を簡単にするため、１つのシフト・レチクルのみ を示すが、核酸への応用の場合に、他の３塩基に対しこの他に３つのシフト・レ チクルがあることは容易に理解されるであろう。 第３０図のシフト・レチクルによって生成させることのできるプローブを、第 ３１図に示す。チップ１２５０は、第３０図のシフト・レチクルの異なる半分に 対応する２つのプローブ領域を有する。第１の領域１２５２は、４つのプローブ からなる８つの異なるセットを有し、ここで、下の番号（１〜８）は、プローブ 中の照会位置の場所を示す。前記と同様、Ａ１＠は、照会位置がプローブ中のチ ップにより近いことを示し、一方、Ａ８＠は、照会位置がプローブ中のチップか らより遠いことを示している。 第２の領域１２５４は、４つのプローブからなる８つの異なるセットを有する が、下の番号（１〜７）で示すように、プローブ中の第５の塩基に照会位置を有 する２セットのプローブがある。シフト・レチクル中のブランク位置のため、重 複プローブ・セットが生成した。さらに、領域１２５４中のプローブは、７量体 であり、プローブ中のそれぞれ可能な位置に照会位置を有するプローブを含む。 したがって、異なる長さおよび異なる照会位置のプローブを、本発明のシフト・ レチクルの実施形態で同時にチップ上に合成することができる。 重複プローブ・セットの生成を用い、合成中の問題の分離および／または得ら れるデータの正確性を増すことができる。例えば、第５の塩基に照会位置を有す る領域１２５４中の２セットのプローブは、配列に関しては同一であるが、塩基 は、異なる単量体付加段階の間に合成された。したがって、Ａを追加する第４の 単量体付加段階に欠点があれば、１セットのプローブに影響を及ぼすが、他には 影響を及ぼさない。したがって、重複プローブ・セットからのデータの正確性を 解析することにより、合成の問題点を確認することが可能であり、重複プローブ ・セットがあることにより、合成の問題点は別のプローブ・セットを用いること によって説明が可能である。 いくつかの実施形態において、重複プローブ・セットを生成させるために、ブ ランク・プローブはシフト・レチクル中の様々な位置に置かれる。前述のように 、 重複プローブ・セットを用い、合成中の問題点を分離し、おそらく誤差を説明す ることさえもできる。 シフト・レチクルをより長くして、標的中の複数の塩基位置を照会するプロー ブを合成することもできる。標的中の９番目毎の塩基位置を照会するプローブを 生成させるためのシフト・レチクルを第３２図に示す。シフト・レチクルの第１ の部分は、第２８図に示したもの（レチクル１）と同一である。しかし、このシ フト・レチクルはより長く、これを用いて、星印を付けた１２７５で示す塩基位 置を照会することができる。第３２図のプローブと同様のプローブを用い、例え ば、可能な照会位置すべてを有するプローブによって標的中の９番目毎の位置を 照会する８量体プローブを生成させることもできる。照会中の標的中の照会位置 は、シフト・レチクルのデザインで固定するが、他のシフト・レチクルを生成さ せて、標的中の他の位置を照会することができる。 偶数の照会位置用のシフト・レチクル１セットおよび奇数の照会位置用のシフ ト・レチクル１セットを用いることによって、プローブ数を低減させることもで きる。双方のプローブ・セットを用い、次いで、移動させる。この方法で、他の 可能な位置すべてに照会位置を有するプローブを合成できる。チップ上に合成さ れるプローブがより少ないことから、より多くの標的中の塩基位置をチップ上で 照会することができる。２セットのシフト・レチクルで説明したが（１つは偶数 位置のため、１つは奇数位置のため）、より多くのシフト・レチクルのセットを 用いることができる。例えば、（塩基位置ｍｏｄ３＝０）、（塩基位置ｍｏｄ３ ＝１）、（塩基位置ｍｏｄ３＝２）である標的中の各塩基位置に対するシフト・ レチクルの異なるセットを用いることができる。 前記の説明は、例示的なものであって限定的なものではない。本開示を概観す れば、本発明の多くの変形形態が当業者には明らかになるであろう。例示のため のみに、主にオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡの合成に関して本発明を説明した が、本発明は、他の多くの分子の合成にも応用できるはずである。さらに、主に 少数の同一アレイの製作に関して本発明を説明したが、本発明は、多数の同一ア レイを合成する状況にも応用できる。したがって、本発明の範囲は、前記の説明 に関して決定されるべきものではなく、添付の請求範囲ならびに均等物の全範囲 に関して決定されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ストリヤー，ルバート アメリカ合衆国・94305・カリフォルニア 州・スタンフォード・ソノマ テラス・ 843 (72)発明者 ミットマン，マイケル・ピイ アメリカ合衆国・94303・カリフォルニア 州・パロ アルト・セント フランシス ドライブ・2377

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．基板上にプローブを合成する方法において、 基板上の、少なくとも１つのシフト・レチクルによって指定された場所に単量 体を結合する段階と、 前記少なくとも１つのシフト・レチクルを基板に対してシフトさせる段階と、 前記少なくとも１つのシフト・レチクルをシフトさせた後に、前記基板上の、 前記少なくとも１つのシフト・レチクルによって指定された場所に単量体を結合 する段階と を含み、 単量体を含むプローブを基板上に合成する ことを特徴とする方法。 ２．前記少なくとも１つのシフト・レチクルが、それぞれのシフト・レチクルが 、特定の単量体を基板に付加するためのレチクルであるシフト・レチクル・セッ トであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．前記セット中のそれぞれのシフト・レチクルを利用して、異なる種類の単量 体の第１の層を基板上に結合する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に 記載の方法。 ４．異なる種類の単量体の第２の層を基板上に結合するために、前記セット中の それぞれのシフト・レチクルを基板に対してシフトさせる段階をさらに含むこと を特徴とする請求項３に記載の方法。 ５．前記セット中のそれぞれのシフト・レチクルが、標的配列中の特定の単量体 の位置に対応する単量体付加領域を有することを特徴とする請求項２に記載の方 法。 ６．前記少なくとも１つのシフト・レチクルが、 ｎ×（ｉ−１）＋１ によって指定される単量体付加領域を有するシフト・レチクルを含み、上式で、 ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第１の単量体の位置であること を特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．前記シフト・レチクルが、 ｎ×（ｉ−１）＋２ によって指定される単量体付加領域を有し、上式で、ｎ＝種類の異なる単量体の 数、ｉ＝標的配列中の第２の単量体の位置であることを特徴とする請求項６に記 載の方法。 ８．前記シフト・レチクルを利用して、異なる種類の単量体の第１の層を、基板 上の指定の場所に結合する段階をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の 方法。 ９．異なる種類の単量体の第２の層を基板上の指定の場所に結合するために、前 記シフト・レチクルを基板に対してシフトさせる段階をさらに含むことを特徴と する請求項８に記載の方法。 １０．基板上の、照会位置レチクルによって指定された場所に単量体を結合する 段階と、 照会位置レチクルを基板に対してシフトさせる段階と、 前記照会位置レチクルをシフトさせた後に、前記基板上の、前記照会位置レチ クルによって指定された場所に単量体を結合する段階と をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 １１．照会位置レチクルを、前記少なくとも１つのシフト・レチクルをシフトさ せる方向とは垂直の方向にシフトさせることを特徴とする請求項１０に記載の方 法。 １２．前記少なくとも１つのシフト・レチクルが、非野生型照会位置単量体を除 く所望のプローブ中のそれぞれの単量体に対応する単量体付加領域を有するシフ ト・レチクルを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 １３．前記非野生型照会位置単量体を除く前記所望のプローブ中のそれぞれの単 量体を結合するために、前記シフト・レチクルを基板に対してシフトさせる段階 をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。 １４．前記少なくとも１つのシフト・レチクルが、異なる長さの所望のプローブ に対応する単量体付加領域を有するシフト・レチクルを含むことを特徴とする請 求項１に記載の方法。 １５．異なる長さの前記所望のプローブを合成するために、前記シフト・レチク ルを基板に対してシフトさせる段階をさらに含むことを特徴とする請求項１４に 記載の方法。 １６．それぞれの単量体付加サイクルの間に、前記少なくとも１つのレチクルが 、基板の指定の場所に単量体を一様に付加することを特徴とする請求項１に記載 の方法。 １７．前記少なくとも１つのレチクルを利用して合成することを望むプローブの 特性に関する入力を受け取る段階をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記 載の方法。 １８．前記所望のプローブの前記特性が合成時に入力されることを特徴とする請 求項１７に記載の方法。 １９．前記特性が、前記所望のプローブの長さであることを特徴とする請求項１ ７に記載の方法。 ２０．前記特性が、前記所望のプローブの照会位置であることを特徴とする請求 項１７に記載の方法。 ２１．前記特性が、前記所望のプローブを合成するための単量体付加順序である ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。 ２２．前記単量体が、ヌクレオチド、ペプチドおよび糖類から構成されるグルー プから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ２３．基板上にプローブを合成する方法において、 基板の指定の場所に単量体を一様に付加するための少なくとも１つのレチクル を用意する段階と、 前記少なくとも１つのレチクルを利用して合成しようとするプローブの特性に 関する入力を受け取る段階と、 前記少なくとも１つのレチクルを利用して、基板上に前記所望のプローブを合 成する段階と を含むことを特徴とする方法。 ２４．前記所望のプローブの前記特性が合成時に入力されることを特徴とする請 求項２３に記載の方法。 ２５．前記特性が、前記所望のプローブの長さであることを特徴とする請求項２ ３に記載の方法。 ２６．前記特性が、前記所望のプローブの照会位置であることを特徴とする請求 項２３に記載の方法。 ２７．前記特性が、前記所望のプローブを合成するための単量体付加順序である ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。 ２８．基板上にプローブを合成する方法において、 単量体付加領域を有し、それぞれのレチクルが、異なる種類の単量体を基板上 に結合するためのレチクルであるレチクル・セットを用意する段階と、 前記セットのそれぞれのレチクルを利用して、異なる種類の単量体を含む単量 体の第１の層を基板上に結合する段階と、 前記セットのそれぞれのレチクルを基板に対してシフトさせ、前記第１の層の 上に、異なる種類の単量体を含む単量体の第２の層を結合する段階と を含み、 ２つの単量体を含む複数のプローブが基板上に形成される ことを特徴とする方法。 ２９．前記セットのそれぞれのレチクルを基板に対してシフトさせ、前記第２の 層の上に、単量体の第３の層を結合する段階をさらに含み、３つの単量体を含む 複数のプローブが基板上に形成されることを特徴とする請求項２８に記載の方法 。 ３０．照会位置レチクルを利用し、照会位置レチクルを、前記セットのそれぞれ のレチクルをシフトさせる方向とは垂直の方向にシフトさせることによって、異 なる単量体の層を基板上に結合する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２ ８に記載の方法。 ３１．前記レチクル・セットを設計する段階をさらに含み、この段階がさらに、 標的単量体配列の入力を受け取る段階と、 前記標的配列中の単量体の種類を選択する段階と、 前記標的配列中の前記選択した種類のそれぞれの単量体の位置に対応する単量 体付加領域を有するレチクルを設計する段階と を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。 ３２．前記標的配列中のそれぞれの種類の単量体について、前記選択段階および 前記設計段階を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載の 方法。 ３３．前記レチクル・セットがマスクの一部であることを特徴とする請求項２８ に記載の方法。 ３４．前記レチクル・セットが異なるマスクからであることを特徴とする請求項 ２８に記載の方法。 ３５．コンピュータ・システムにおいて、基板上にプローブを合成するためのレ チクルのレイアウトを決定するための方法であって、 標的単量体配列の入力を受け取る段階と、 前記標的配列中の単量体の種類を選択する段階と、 前記標的配列中の前記選択した種類のそれぞれの単量体の位置に対応する単量 体付加領域を有するレチクルを設計する段階と を含むことを特徴とする方法。 ３６．前記標的配列中のそれぞれの種類の単量体について、前記選択段階および 前記設計段階を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載の 方法。 ３７．基板上にプローブを合成する方法において、 基板上の、レチクルの単量体付加領域セットによって指定された場所に、複数 の第１の単量体を結合する段階と、 前記レチクルを基板に対してシフトさせる段階と、 前記第１の単量体の１つの単量体の上の、前記レチクルの単量体付加領域によ って指定された場所に、少なくとも１つの第２の単量体を結合する段階と を含み、 前記第１および第２の単量体を含むプローブが基板上に形成される ことを特徴とする方法。 ３８．前記第２の単量体の１つの単量体の上の、前記レチクルの単量体付加領域 によって指定された場所に、少なくとも１つの第３の単量体を結合するために、 前記レチクルを基板に対してシフトさせる段階をさらに含むことを特徴とする請 求項３７に記載の方法。 ３９．異なる種類のそれぞれの単量体を通したサイクルを実施する段階と、 異なる種類のそれぞれの単量体を結合する前に、前記レチクルを基板に対して シフトさせる段階と をさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。 ４０．異なる種類のそれぞれの単量体を用いるそれぞれのサイクルが、基板の指 定の場所に単量体を一様に付加することを特徴とする請求項３９に記載の方法。 ４１．照会位置レチクルを利用し、照会位置レチクルを、前記レチクルをシフト させる方向とは垂直の方向にシフトさせることによって、異なる単量体の層を基 板上に結合する段階をさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。 ４２．前記レチクルを設計する段階をさらに含み、この段階が、 ｎ×（ｉ−１）＋１ によって指定された単量体付加領域を有するレチクルを形成する段階を含み、上 式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第１の単量体の位置であ ることを特徴とする請求項３７に記載の方法。 ４３．前記レチクルを設計する前記段階が、 ｎ×（ｉ−１）＋２ によって指定される単量体付加領域を有するレチクルを形成する段階をさらに含 み、上式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第２の単量体の位 置であることを特徴とする請求項４２に記載の方法。 ４４．コンピュータ・システムにおいて、基板上にプローブを合成するためのレ チクルのレイアウトを決定するための方法であって、 標的単量体配列の入力を受け取る段階と、 前記標的配列中の単量体の種類を選択する段階と、 ｎ×（ｉ−１）＋１ によって指定される単量体付加領域を有するレチクルを設計する段階と を含み、 上式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第１の単量体の位置 である ことを特徴とする方法。 ４５．前記レチクルを設計する前記段階が、 ｎ×（ｉ−１）＋２ によって指定される単量体付加領域を有するレチクルを形成する段階をさらに含 み、上式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第２の単量体の位 置であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。 ４６．コンピュータ・システムにおいて、基板上に合成されたプローブを含む基 板のレイアウトを指定するための方法であって、 基板上に合成するプローブを、それぞれがプローブを含む分析領域の配列リス トとして定義する段階と、 分析領域の前記配列リストの特性に関する入力を受け取る段階と、 前記入力された特性を用いて、それぞれの分析領域のプローブを基板上に合成 するために、少なくとも１つのレチクルを設計する段階と を含むことを特徴とする方法。 ４７．前記特性が、前記分析領域のスケールであることを特徴とする請求項４６ に記載の方法。 ４８．前記特性が、前記分析領域の向きであることを特徴とする請求項４６に記 載の方法。 ４９．前記分析領域が、基板上で円形パターンに配置されることを特徴とする請 求項４６に記載の方法。 ５０．前記分析領域が、基板上でらせん形パターンに配置されることを特徴とす る請求項４６に記載の方法。