FR2850669A1 - Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l'inflammation, et applications. - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé et à des outils de détection de gènes inductibles par des médiateurs de l'inflammation, susceptibles de déterminer la situation physiologique précise d'un individu chez lequel on suspecte ou chez lequel on a diagnostiqué un état inflammatoire.

Description

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DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte à un procédé et à des outils de détection de gènes inductibles par des médiateurs de l'inflammation, susceptibles de déterminer la situation physiologique précise d'un individu chez lequel on suspecte ou chez lequel on a diagnostiqué un état inflammatoire.

ART ANTERIEUR
La réaction inflammatoire est un des modes de réponse les plus fréquents de l'organisme face à une agression. L'induction d'une inflammation peut être notamment provoquée par une infection bactérienne, virale ou fongique, par le développement de tumeurs cancéreuses, par des traumatismes physiques ou chimiques ou encore lors d'une nécrose tissulaire.

L'induction d'un état inflammatoire s'accompagne de la libération de nombreux médiateurs solubles, notamment des médiateurs solubles produits par les polynucléaires neutrophiles, les monocytes/macrophages, les lymphocytes, les mastocytes et les plaquettes, ces médiateurs solubles de l'inflammation étant communément désignés cytokines , parmi lesquelles on peut citer les interférons alpha, bêta ou gamma, le TNF alpha ou encore l'interleukine-6.

Aujourd'hui, le diagnostic clinique d'un état inflammatoire est principalement réalisé par une observation de différents symptômes retrouvés systématiquement dans des pathologies bien répertoriées, comme par exemple le rhumatisme inflammatoire chronique, ces symptômes pouvant le cas échéant être facilement identifiés, comme par exemple dans le cas d'une pneumopathie aiguë récente. Et lorsque les causes du syndrome inflammatoire ne peuvent être directement déterminées, on recherche des indices cliniques additionnels permettant d'orienter un éventuel diagnostic, indices additionnels qui ne sont pas nécessairement accessibles au diagnostic conventionnel.

Pour compléter le diagnostic conventionnel décrit ci-dessus, il serait possible de procéder à la détection de la présence de l'expression et/ou du niveau de l'expression de certains gènes connus pour être activés lors du

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développement d'une inflammation, comme certains médiateurs de l'inflammation cités précédemment.

Toutefois, à la connaissance du demandeur, il n'existe aujourd'hui aucun dispositif spécifique permettant de détecter la présence de l'expression et/ou du niveau de l'expression de gènes codant des médiateurs de l'inflammation.

La Société japonaise TaKaRa Biomedicals commercialise une puce à ADN sur laquelle sont immobilisés environ 240 fragments d'ADNc, d'une longueur d'environ 300 bases chacun, dérivés de gènes codant des cytokines, telles que les gènes codant le TNF, l'interleukine 1 alpha, l'interleukine 16, le Platelet Derived Growth Factor beta ou PDGFbeta , ou l'interféron gamma. Toutefois, cette puce à ADN contient essentiellement des ADNc dérivés de gènes codant de nombreuses autres protéines non liées spécifiquement à l'inflammation, telles que la prolactine, la protéine tumorale p53, des intégrines, l'oncogène GR02, l'activateur de la protéine RAS p21, la protéine ribosomale S5, des protéines se fixant à la chromatine, la protéine homologue de MutY de E. Coli, la cycline A2, et de nombreuses enzymes appartenant à diverses classes telles que des réductases, des deshydrogénases etc.

Les outils complémentaires d'aide au diagnostic disponibles aujourd'hui sont très incomplets car les ADNc immobilisés sur ces puces à ADN ne sont pas représentatifs des multiples situations physiologiques qui peuvent être rencontrées lors du déclenchement d'une réaction inflammatoire d'un type donné, chez un individu.

Il existe donc un besoin, dans l'état de la technique, pour des outils permettant une détection plus précise de la situation physiologique d'un individu donné, chez lequel on suspecte l'occurrence d'une réaction inflammatoire, ou chez lequel a déjà été diagnostiqué un état inflammatoire, qu'il soit local ou systémique.

SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à un procédé pour préparer un ensemble de moyens permettant la détection, dans un échantillon corporel préalablement collecté chez un individu, de l'expression ou du niveau de l'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation. Elle est

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aussi relative à un ensemble de moyens de détection préparé par ledit procédé, comprenant une collection de sondes nucléotidiques spécifiques..

L'invention concerne aussi un dispositif de détection de l'expression, ou du niveau d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.

L'invention a également trait à l'utilisation d'une sonde ou d'une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus, pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.

L'invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens de détection tels que définis ci-dessus ou un dispositif tel que défini ci-dessus, avec un échantillon à tester ; b) détecter les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou dans ledit dispositif et les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon.

L'invention est également relative à un procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens de détection tels que définis ci-dessus ou un dispositif tel que défini ci-dessus avec ledit échantillon ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques comprises dans l'ensemble de moyens ou dans le dispositif qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.

Font également partie de l'invention des kits ou nécessaires adaptés pour la mise en oeuvre des procédés ci-dessus.

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Définitions générales Echantillon
Par échantillon , on entend selon l'invention un matériel résultant, directement ou indirectement, du prélèvement d'un fragment de tissu ou d'une fraction aliquote de fluide biologique chez un mammifère humain ou non humain dont on veut préciser la situation physiologique vis-à-vis d'une éventuelle réaction inflammatoire. L'échantillon initial peut être le résultat d'une biopsie pratiquée chez l'individu, ou d'un prélèvement d'un fluide biologique comme un prélèvement de sang, de salive, de larmes, d'urine, etc. L'échantillon englobe aussi un milieu contenant les ARN messagers cellulaires extraits à partir d'une biopsie ou d'un prélèvement de fluide biologique. L'échantillon peut être aussi un milieu contenant des ADNc obtenus à partir des ARN messagers préalablement extraits à partir de la biopsie ou du prélèvement du fluide biologique.

Acide nucléique, nucléotide, etc.

Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984) et AUSUBEL et al. (1994) .

Selon l'invention, on entend par acide nucléique un désoxyribonuléoside, un ribonucléoside, un polymère de désoxyribonucléotides, un polymère de ribonucléotides, indifféremment sous la forme d'une molécule simple brin ou d'une molécule double brin, y compris un ARN, un ADN ou une molécule hybride ARN/ADN. Le terme acide nucléique englobe les analogues non naturels des nucléotides naturels.

Ainsi, le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04064.

Les termes " acide nucléique ", "polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN,

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d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme double brin.

Selon l'invention, un acide nucléique résultant directement de la transcription d'un gène déterminé englobe essentiellement le ou les ARN messagers synthétisés durant l'étape de transcription dudit gène.

Selon l'invention, un acide nucléique résultant indirectement de la transcription d'un gène déterminé englobe essentiellement un ADNc obtenu par la transcription inverse d'un ARN messager synthétisé durant l'étape de transcription dudit gène. En général, la transcription inverse de l'ARN messager est réalisée en présence d'une enzyme transcriptase inverse.

Gène inductible par un médiateur de l'inflammation
Selon l'invention, un gène inductible par un médiateur de l'inflammation consiste en un gène dont l'étape de transcription ou l'étape de traduction est modifiée sous l'action d'un médiateur de l'inflammation.

Principalement, cette expression englobe les gènes dont la transcription est activée sous l'action d'un médiateur de l'inflammation. Toutefois, elle englobe aussi les gènes dont la transcription est inhibée ou bloquée par un médiateur de l'inflammation.

Par médiateur de l'inflammation , au sens de l'invention, on entend une cytokine produite par les cellules lors de l'initiation ou du développement d'une réaction inflammatoire, locale ou systémique, chez un mammifère humain ou non humain. Les médiateurs de l'inflammation englobent : - les cytokines ayant une activité biologique d'augmentation de la perméabilité capillaire, telles que l'histamine, la bradykinine, le C3a, le
C5a, la LTC4, la LTD4, la PGE2, les prostaglandines, facteur XII, le facteur kiniogénique ; - les cytokines ayant une activité biologique de vasoconstriction, telles que le Thromboxane A2, les leucotriènes C et D ; - les cytokines ayant une activité biologique d'augmentation de l'adhésivité des phagocytes aux cellules endothéliales, telles que l'interleukine-1, le TNF-a ou le LTB4 ;

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- les cytokines ayant une activité biologique d'induction ou d'activation de la prolifération des cellules souches médullaires, telles que l'interleukine-1 et le C3c ; - les cytokines ayant une activité biologique de chimiotactisme cellulaire, telles que le C5a, le LTB4, l'interleukine-8, le PAF (pour le Platelet Agregating Factor ), l'histamine, la laminine, les fragments de collagène, les facteurs lymphocytaires, les facteurs chimiotactiques ; - les cytokines ayant l'activité biologique de relargage des médiateurs lysosomiaux intra-granulaires, telles que le C5a, l'interleukine-8, le
PAF ; - les cytokines ayant l'activité biologique d'augmentation de la production de radicaux oxygénés, telles que le C5a, le TNF-a, le PAF, l'interleukine-8, l'interféron-y (gamma) ; - les cytokines ayant l'activité biologique d'augmentation de la phagocytose, telles que le C3b, la partie Fc des IgG, l'interf ron-#i, la fibronectine ; - les cytokines ayant une activité biologique de formation de granulomes inflammatoires, telles que l'interféron-y, le TNF-a et l'interleukine-1 ; - les cytokines pyrogéniques, telles que le PGE2, l'interleukine-1 et le
TNF-a ; - les cytokines interférons de type I, tels que l'interféron-a, )'interféron-(3 et l'interféron-co et les cytokines interférons de type II, tel que l'interféron-y ; - d'autres cytokines, telles que l'interleukine-1, l'interleukine-2, l'interleukine-3, l'interleukine-4, l'interleukine-5, l'interleukine-6, l'interleukine-7, l'interleukine-8, l'interleukine-9, l'interleukine-10, l'interleukine-12, l'interleukine-13, l'interleukine-15, l'interleukine-17 ou encore le TNF-a.

De préférence, les médiateurs de l'inflammation capables d'induire les gènes sélectionnés selon l'invention englobent principalement les interférons de type 1 et de type Il définis ci-dessus, le TNF-a , l'IL-1, l'IL-2, l'IL-3, l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6, l'IL-9, l'IL-10, l'IL-12, l'IL-13, l'IL-15, l'angiotensine, le LIF, le CNTF, le PDGF, l'éerythropoïétine, le GCSF, le GMCSF, l'hormone de croissance, l'oncostatine, la prolactine et la thrombopïétine.

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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention fournit un procédé pour préparer un ensemble de moyens permettant de détecter la présence, dans un échantillon, d'acides nucléiques résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un ou plusieurs gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.

Comme indiqué précédemment, l'initiation et le développement d'une réaction inflammatoire chez un individu est accompagnée de la libération de divers facteurs solubles par les cellules, appelés médiateurs de l'inflammation. Par une réaction en cascade, les médiateurs de l'inflammation ainsi libérés vont induire ou stimuler l'expression d'autres gènes par les cellules, dont certains sont déjà connus.

La détection de l'expression et/ou du niveau de l'expression de ces gènes inductibles par les divers médiateurs de l'inflammation permettrait donc la détermination de l'état d'activation d'un ensemble de marqueurs associés à l'existence d'une réaction inflammatoire chez l'individu.

Une telle détection est en conséquence susceptible de compléter un diagnostic clinique préalable, sans que cette détection, en elle-même, ne constitue une étape essentielle d'un procédé de diagnostic d'un état inflammatoire chez un individu.

Le demandeur a montré selon l'invention que les gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation possédaient des caractéristiques de séquence nucléique communes.

Plus précisément, il est montré selon l'invention que la séquence de certains gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation contiennent de manière obligatoire une séquence répondant à la définition originale d'un premier motif consensus nucléotidique désigné ISRE/IRF-E ou ISRE , ou une séquence répondant à la définition originale d'un second motif consensus nucléotidique désigné GIRE , dont les caractéristiques originales de séquence sont décrites en détail dans la présente description.

Les travaux réalisés par les inventeurs ont permis de définir, pour la première fois, lesdits motifs nucléotidiques consensus ISRE et GIRE , ce qui a rendu possible la mise au point, selon l'invention, d'un procédé de préparation d'un ensemble de moyens de détection de l'expression, ou du

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niveau d'expression, de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.

Grâce à l'invention l'homme du métier dispose donc des moyens de base lui permettant de fabriquer des sondes nucléotidiques spécifiques de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.

L'utilisation de ces sondes nucléotidiques spécifiques, dans des réactions d'hybridation avec des acides nucléiques contenus dans un échantillon, rend désormais accessi ble à l'homme du métier la détermination fine de la situation physiologique d'un individu, à l'instant du prélèvement d'un échantillon corporel à partir de cet individu, chez lequel est déjà suspectée ou déjà diagnostiquée une réaction inflammatoire quelconque, qu'il s'agisse d'une réaction inflammatoire locale ou généralisée, le cas échéant d'un syndrome inflammatoire systémique connu sous le nom de SIRS.

Procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens de détection de l'invention.

Gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation selon l'invention
Le demandeur a montré selon l'invention que les gènes qui possèdent, dans leur séquence, un motif consensus nucléotidique ISRE ou un motif consensus nucléotidique GIRE , motifs dont la structure est définie en détail ci-dessous, consistaient en des gènes inductibles par au moins un médiateur de l'inflammation.

Plus spécifiquement, le demandeur a montré que le motif ISRE est en particulier caractéristique des gènes inductibles par les interférons de type # (IFN-a, IFN-p et IFN-w) et les interférons de type Il (IFN-y), ainsi que l'IL-6 et la combinaison TNF + IFN-y.

Plus spécifiquement, le demandeur a montré que le motif GIRE est en particulier caractéristique des gènes inductibles par les interférons de type Il (IFN-y), et a contribué à mettre en évidence une réponse des gènes contenant le motif GIRE à l'IL-1, l'IL-2, l'IL-3, l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6, l'IL-9, l'IL-10, l'IL-12, l'IL-13, l'IL-15, l'angiotensine, le LIF, le CNTF, le PDGF, l'éerythropoïétine, le GCSF, le GMCSF, l'hormone de croissance, l'oncostatine, la prolactine et la thrombopïétine.

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Le demandeur a ainsi montré selon l'invention que les gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation sont définis respectivement comme les gènes possédant dans leur séquence les caractéristiques structurales suivantes : - (i) les gènes qui comprennent, dans leur séquence, un motif consensus nucléotidique désigné ISRE/IRF-E ou encore ISRE , qui est caractérisé, selon l'invention, par les séquences suivantes : (i-1) la séquence SEQ ID N 1 suivante 5'-NNNGAA[N]xiGAAACN-3' (séquence sens), dans laquelle chaque N représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U),
G, ou C et x1 est un entier égal à 2 ou 3 ; (i-2) la séquence SEQ ID N 2 suivante 5'- NGTTTC[N]x2TTCNNN -
3' (séquence antisens), dans laquelle chaque N représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U),
G, ou C et x2 est un entier égal à 2 ou 3.

- (ii) les gènes qui comprennent, dans leur séquence, un motif consensus nucléotidique désigné GIRE , , qui peut être caractérisé selon l'invention par les séquences suivantes : (ii-1) la séquence SEQ ID N 3 suivante 5'-ATTTC[N]yiGAAA-3' (séquence sens), dans laquelle chaque N représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U),
G, ou C et y1 est un entier égal à 3,4 ou 5.

(ii-2) la séquence SEQ ID N 4 suivante TTTC[N]y2GAAAT (séquence antisens), dans laquelle chaque N représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U),
G, ou C et y2 est un entier égal à 3,4 ou 5.

Procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention.

L'invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un

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médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer une collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, selon les étapes de préparation suivantes : a1) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences nucléotidiques d'origine humaine, dont l'ensemble des séquences recouvrent au moins une fois la totalité du génome humain, les séquences comprenant au moins une copie d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4, puis (ii) créer une première collection de séquences nucléotidiques à partir de chaque séquence précédemment sélectionnée, chaque séquence nucléotidique contenue dans ladite première collection étant constituée, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', de la séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4, suivie des 285 nucléotides consécutifs localisés, dans chaque séquence sélectionnée en (i), immédiatement du côté 3' du dernier nucléotide en 3' de ladite séquence SEQ ID N 1, 2, 3 ou 4 ; a2) (i) pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans ladite première collection créée à l'étape a1), éliminer la séquence SEQ
ID N 1, 2,3 ou 4 localisée à l'extrémité 5' de ladite séquence nucléotidique et (ii) créer une seconde collection de séquences contenant toutes les séquences modifiées en (i), chacune des séquences contenues dans ladite seconde collection constituant une sonde ; a3) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), de la présence d'au moins une copie d'une séquence SEQ ID N 1,
2,3 ou 4, puis (ii) élimination, dans ladite seconde collection, des séquences comprenant au moins une copie de l'une des séquences
SEQ ID N 1,2, 3 ou 4, grâce à quoi une troisième collection de séquences, ne comprenant pas les séquences ainsi éliminées, est créée ;

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a4) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la troisième collection de séquences créée à l'étape a3), de chaque enchaînement de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type Alu ou de type répété susceptible d'être contenu dans ladite séquence nucléotidique, puis (ii) modification des séquences comprenant un tel enchaînement de nucléotides, par masquage desdits enchaînements de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type Alu ou de type répété par remplacement de chaque nucléotide A, T, G ou C contenu dans ladite séquence Alu ou répétée par un nucléotide N signifiant indifféremment A, T, G ou C, puis (iii) créer une quatrième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences contenues dans la troisième collection, éventuellement modifiées selon (ii) ; a5) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences contenant des séquences nucléotidiques consistant en des produits de transcription du génome humain, les séquences comprenant au moins l'une des séquences nucléotidiques contenues dans la quatrième collection de séquences créée à l'étape a4), puis (ii) créer une cinquième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences sélectionnées en (i) ; a6) (i) Sélectionner, dans la cinquième collection de séquences créée à l'étape a5), les séquences comprenant au moins 60 nucléotides consécutifs définissant un enchaînement ayant au moins 97% d'identité en nucléotides avec un enchaînement nucléotidique inclus dans au moins l'une des sondes contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), puis (ii) créer une sixième collection de séquences nucléotidiques contenant les séquences ainsi sélectionnées, ladite sixième collection de séquences consistant en la collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation ;

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b) synthétiser une collection de sondes nucléotidiques hybridant spécifiquement avec le produit de transcription d'au moins un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, ledit gène comprenant une séquence nucléotidique contenue dans la sixième collection de séquences préparée à l'étape a6), ladite collection de sondes ainsi synthétisées consistant en l'ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.

On a désigné six collections de séquences à l'étape a) du procédé cidessus, essentiellement pour des raisons de clarté dans la compréhension du procédé.

Selon un premier mode de réalisation, les six collections de séquences peuvent consister concrètement en six collections distinctes de séquences.

Selon un second mode de réalisation, une seule collection de séquences est créée, dont le contenu en séquences est modifié au fur et à mesure de la réalisation de chacune des étapes a1) à a6) du procédé.

Selon encore un autre mode de réalisation, moins de six collections de séquences sont créées, certaines seulement d'entre elles étant créées spécifiquement au cours de la réalisation de l'une ou de plusieurs des étapes a1) à a6) du procédé, les autres collections désignées dans le procédé résultant chacune à une étape donnée du procédé, d'une simple modification du contenu en séquences d'une collection créée à l'étape précédente.

Selon un aspect particulier du procédé ci-dessus, la collection de moyens de détection qu'il permet de préparer comprend, pour chaque gène inductible par un médiateur de l'inflammation, plusieurs sondes s'hybridant spécifiquement avec ce dernier.

Avantageusement, selon cet aspect particulier, la collection de moyens de détection comprend, en moyenne, au moins deux, de préférence trois, et de manière tout à fait préférée au moins quatre sondes s'hybridant

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spécifiquement avec chaque gène inductible par un médiateur de l'inflammation.

Avantageusement, le procédé décrit ci-dessus est caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape c) suivante : c) immobiliser chacune des sondes nucléotidiques synthétisées à l'étape b) sur un support.

Préférentiellement, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.

Préférentiellement, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur ledit support sous la forme d'une matrice ordonnée de sondes.

Ainsi, en utilisant le procédé décrit ci-dessus, l'homme du métier est en mesure, par de simples opérations de routine, de synthétiser les sondes s'hybridant spécifiquement avec les produits d'expression desdits gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, ces sondes constituant un ensemble de moyens de détection selon l'invention, qui est défini plus loin dans la description.

Description détaillée du procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention.

Etape a) du procédé
Le procédé décrit de manière détaillée ci-dessous a été réalisé successivement pour les séquences sens et antisens de chacun des motifs ISRE et GIRE, successivement sur le brin plus (+) et le brin moins (-) de chacun des chromosomes humains, et ce pour l'ensemble des séquences nucléotidiques contenues dans le génome humain .

L'étape a) du procédé est avantageusement réalisée à l'aide d'un programme d'ordinateur, ledit programme d'ordinateur contenant l'ensemble des instructions nécessaires pour commander à un ordinateur, dans la mémoire duquel il est chargé, l'exécution de l'ensemble des sous-étapes de l'étape a) du procédé.

De manière générale, pour la réalisation de l'étape a) du procédé en exécutant les instructions d'un programme d'ordinateur, l'homme du métier pourra se référer aux outils logiciels de base pour la programmation et pour

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la recherche et la comparaison de séquences nucléotidiques décrits par exemple par Altschul et al. (1990), Claverie et al. (1993), Wall et al. (1996), ainsi qu'aux outils logiciels xblast.c et blast.linux dont la référence est donnée à la fin de la présente description.

Un exemple illustratif d'un programme d'ordinateur permettant la réalisation de l'étape a) du procédé, rédigé dans les langages Péri (Larry Wall et al., 1996) et C, est spécifié à la fin de la présente description.

L'étape a) du procédé de l'invention est décrite en détails ci-dessous, et il est fait expressément référence à chacun des modules du programme d'ordinateur susceptible de réaliser chacune des sous-étapes a1) à a6) du procédé.

Dans le mode de réalisation du procédé dans lequel l'étape a) est réalisée à l'aide d'un programme d'ordinateur, ledit programme d'ordinateur comprend avantageusement un module central, appelé programme maître , qui comprend les instructions nécessaires à l'exécution de sousprogrammes, appelés modules , chacun de ses sous-programmes contenant les instructions nécessaires à l'exécution de chacune des sous- étapes a1) à a6) du procédé. Dans la présente description , il est décrit le programme maître permettant la réalisation de l'étape a) du procédé pour les séquences génomiques humaines qui contiennent le motif premier consensus nucléotidique ISRE . L'homme du métier est à même d'adapter aisément cet exemple de programme maître pour les séquences génomiques humaines contenant le second motif consensus nucléotidique GIRE , en remplaçant dans le programme les caractéristiques structurales du motif ISRE par les caractéristiques structurales du motif GIRE qui ont été détaillées précédemment dans la présente description.

Etape a1) correspondant au module de programme pg1.pl
Rechercher et récupérer successivement le motif consensus ISRE puis GIRE sous forme d'une expression régulière au sein d'un génome complet (en l'occurrence le draft du génome humain, Version UCSC du 13 juin 2001, http://qenome.ucsc.edu/) avec une fenêtre de décalage de +1 suivi d'une séquence de 285 nucléotides (appelée Sonde Electronique) directement en aval de chaque motif trouvé.

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Etape a2) correspondant au module de programme pg2.pl
Cette étape consiste à éliminer, à partir du fichier résultant de la première étape, chaque motif trouvé et à conserver la Sonde Electronique adjacente (de façon à exclure une localisation des motifs consensus sur une séquence transcrite).

Etape a3) correspondant au module de programme pq3.pl
A cette étape, chacune des Sondes Electroniques est testée pour la présence éventuelle d'un second ou plusieurs motifs identiques en aval du premier. Seules les Sondes Electroniques qui ne le contiennent pas sont conservées.

Le motif sens et reverse complémentaire (antisens) sont successivement recherchés.

Etape a4), étape de filtrage correspondant aux modules pq4 160.pl et pg4 15.pl, respectivement
A cette étape, on compare chacune des Sondes Electroniques avec une banque constituée de séquences Alu et de Séquences répétées (Fichiers: alu.human et repbase. seq récupérés le 3 Mars 2002 au NCBI). Du fichier repbase. seq a été extrait toutes les séquences "primates" et celles-ci ont été ajoutées au fichier alu.human pour constituer la banque nommée alu+primate~repbase.

La comparaison de chaque Sonde Electronique contre cette banque, alu+primate~repbase, est réalisée par un programme nommé Blastn (1) en fixant successivement deux valeurs au paramètre E (Expect Value) du programme blastn, respectivement 10e-160 et 10e-15. Ce paramètre, EValue (Expect Value) du programme Blastn, mesure, après recherche dans une banque de données, le nombre d'alignements qui pourrait être dû au hasard. Par conséquent, plus cette valeur est petite, c'est-à-dire proche de zéro, et plus le résultat obtenu est significatif. Dans cette étape, les valeurs fixées pour ce paramètre, successivement 10e-160 et 10e-15, ont pour but de ne retenir respectivement que les longs alignements et les courts alignements statistiquement significatifs.

Seules les Sondes Electroniques répondant aux critères fixés dans le programme Blastn seront masquées par l'intermédiaire d'un autre

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programme nommé xblast (2,4) c'est-à-dire que les lettres du langage nucléique (A, T,G,C) seront remplacées par des "N". Cette stratégie permet donc d'éviter que des séquences répétées (constituant une suite de N), présentes dans les sondes électroniques, ne puissent s'aligner à des séquences de transcrits (voir ci-dessous tc~bank-Hs). Les autres Sondes Electroniques resteront non modifiées.

Etape a5) correspondant au module de programme pq5.pl
Le fichier résultant de l'étape a4) (contenant les séquences électroniques dans lesquelles les séquences répétées ont été masquées) est utilisé par le programme Blastall (5) contre une banque de transcrits composés des fichiers suivants: Refseq

Fichier rna.gbk.gz (origine: ftp://ftp.ncbi.nih.qov/refseq/H sapiens/H sapiens/ RNA/) récupéré le 24-07-2002.

Fichier hs.fna.gz (origine: ftp:Ilftp.ncbi.nih.govlrefsealH sapiens/mRNA Prot/ ) récupéré le 24-07-2002.

Fichier mrna.gbk.gz (origine:lovelace.infobiogen.fr dans le répertoire suivant: /db/refseq/REFSEQ/H~sapiens/H~sapiens/mRNA/) récupéré le 24-07-2002.

Fichier rscu.gbff.Z (origine: ftj:llfto.ncbi.nih.govlrefseqlcumulativel) récupéré le 24-07-2002.

UniGene

Fichier Hs.seq.unig.gz (origine:ftp.7/ftp.ncbi.nih.gov/repositorv/Uniqene) récupéré le 24-07-02.

GenBank:

Fichier nt.Z (origine:ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/) récupéré le 24-07- 2002;données non redondantes de GenBank, EMBL, DDBJ, PDB.

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Les séquences des transcrits ou EST récupérés dans chacune des banques n'ont concerné que les 300 premiers nucléotides. L'ensemble a été rassemblé en un seul fichier appelé tc~Bank-Hs.

Les paramètres du programme blastn utilisés correspondent à ceux définis par défaut.

Etape a6) correspondant au module pq6.pl
Le fichier résultat de l'étape a5) a été traité dans le but de sélectionner les homologies significatives entre la Sonde Electronique et son transcrit selon les critères suivants: - la Sonde Electronique et le transcrit sont dans le même sens c'est-àdire 5' --> 3'.

- la longueur de l'homologie entre la Sonde Electronique et le transcrit homologue est définie comme une variable dans le programme (elle a été fixée à une valeur strictement supérieure à 60 nucléotides dans cet algorithme). Cette valeur a été choisie d'un part parce qu'elle correspond statistiquement à la taille d'un exon. De plus, les motifs recherchés (ceux responsables de l'induction précoce par les cytokines) étant majoritairement localisés à 100 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription, il est fortement probable que l'alignement entre les 285 nucléotides de la sonde électronique et les 300 premiers nucléotides des transcrits couvre une région d'au moins 60 nucléotides.

- Afin de ne considérer que les alignements commençant au début du transcrit (probabilité plus forte d'être en présence de la région immédiatement en aval de l'initiation de la transcription), le programme n'a retenu que les cas où les 60 nucléotides des 300 nucléotides des séquences transcrites sont localisés à l'extrémité 5'. Idéalement, l'alignement débute au premier nucléotide des 60 nucléotides.
Cependant, le programme a permis que l'alignement puisse commencer dans une fenêtre de 1 à 5 nucléotides de l'extrémité 5' du transcrit (la valeur de 5 revient à prévenir les erreurs de séquençage).

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- le rapport du nombre d'identité entre la Sonde Electronique et celui du transcrit significativement homologue est aussi une variable dans le programme (fixée ici à 0,970).

Etape b) du procédé
A l'étape b) du procédé, on synthétise une collection de sondes nucléotidiques hybridant spécifiquement avec le produit de transcription d'au moins un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, ledit produit de transcription comprenant une séquence nucléotidique contenue dans la sixième collection de séquences préparée à l'étape a6), ladite collection de sondes ainsi synthétisées consistant en l'ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.

Sonde nucl otidique
Par sonde nucléotidique , au sens de l'invention, on entend un polynucléotide qui s'hybride spécifiquement à un acide nucléique contenu dans un échantillon, cet acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène déterminé, ledit gène déterminé étant inductible par un médiateur de l'inflammation. Une sonde nucléotidique de l'invention ne s'hybride pas avec un quelconque autre acide nucléique également contenu dans le même échantillon, dans des conditions de stringence appropriées utilisées pour la réaction d'hybridation, qui sont de manière préférentielle des conditions de forte stringence.

Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes: Préhybridation : mêmes conditions que pour l'hybridation durée : 1 nuit.

Hybridation :

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5 x SSPE (0. 9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 7. 7, 5 mM E DTA)
5 x Denhardt's (0. 2% PVP, 0.2% Ficoll, 0. 2% SAB)
100 g/ml ADN de sperme de saumon
0. 1% SDS durée : 1 nuit.

Lavages :
2 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65 C
1 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65 C
0. 5 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65 C
0.1x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C.

Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).

Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation :
Tm= 81,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) - 0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9. 54-9.62).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4 (G+C) +2(A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en-dessous de Tm.

Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites sont mises en oeuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique de 20 bases de longueur et peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.

Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).

En particulier, il faut prendre en compte que le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que :

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a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en base de la sonde ou de l'amorce, les paires de bases G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologue entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants, tels que des agents favorisant la rupture de liaisons hydrogène , comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'incubation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume , tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou de l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.

De préférence, une sonde nucléotidique selon l'invention possède une séquence nucléotidique exactement complémentaire à la séquence cible visée. Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.

Sondes nucléotidiques de l'invention
Une sonde nucléotidique selon l'invention est une sonde nucléotidique hybridant spécifiquement, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence nucléotidique d'un ARN messager, ou de l' ADNc correspondant, qui est le produit de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation de l'invention.

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Une sonde nucléotidique de l'invention a au moins 20 nucléotides de longueur et peut atteindre une longueur de plusieurs kilobases, par exemple jusqu'à 6 kilobases, la taille maximale de la sonde étant limitée par la taille de la séquence cible visée. Avantageusement, une sonde nucléotidique selon l'invention a une longueur allant de 20 à 500 bases de longueur, de préférence de 20 à 250 bases de longueur.

Par exemple, une sonde nucléotidique selon l'invention peut comprendre 20, 21,22, 23,24, 25,30, 35,40, 45, 50, 100,150, 200,300, 400,500, 600,7100, 800,900, 1000,2000, 3000 ou 4000 bases de longueur, la taille maximale de la sonde étant limitée par la taille de l'acide nucléique cible visé.

De manière générale, la longueur d'une sonde nucléotidique selon l'invention peut être définie par la formule suivante :
Ls= x dans laquelle : - Ls est la longueur en bases de la sonde, et - x est un entier égal ou supérieur à 20, et x est égal ou inférieur à la longueur en bases (La) de l'acide nucléique cible visé, résultant directement ou indirectement de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.

Une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen N EP 0 707 592.

Chacune des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention sont incluses dans un ADNc unique obtenu par transcription inverse des ARN messagers constituant un produit de transcription d'un gène inductibles par un médiateur de l'inflammation. Chacune des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention ne peut donc être retrouvée que dans la séquence d'un gène déterminé, ou est

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complémentaire d'un ARN messager qui n'est produit qu'à partir de ce gène unique.

Pour fabriquer une sonde nucléotidique selon l'invention, qui s'hybride avec un gène déterminé dont l'expression est inductible par un médiateur de l'inflammation, l'homme du métier peut synthétiser un polynucléotide dont la séquence est identique à une séquence d'au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc correspondant à ce gène, ou un polynucléotide complémentaire d'une séquence d'au moins 20 nucléotides consécutifs d'un ARN messager produit par ce gène. La taille de la séquence cible sera fonction de la taille recherchée pour la sonde nucléotidique, dans les limites spécifiées précédemment.

A partir de chacune des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention l'homme du métier peut aisément obtenir l'ARN messager complet ou l'ADNc complet correspondant à un gène unique dont l'expression est inductible par un médiateur de l'inflammation.

Selon une première méthode, l'homme du métier peut rechercher la séquence d'ARNm ou d'ADNc complète du gène unique comprenant l'une des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention selon les étapes suivantes : (i) réaliser une comparaison entre les séquences contenues dans une ou plusieurs bases de données électroniques de séquences et la séquence de référence contenue dans la sixième collection de séquences de l'invention ; (ii) sélectionner la ou les séquences répertoriées dans ladite ou lesdites bases de données et qui contiennent ladite séquence de référence ; (iii) sélectionner, dans la séquence complète sélectionnée à l'étape (ii), la séquence du polynucléotide à synthétiser pour fabriquer la sonde nucléotidique
Selon une seconde méthode, l'homme du métier peut synthétiser au moins une amorce nucléotidique spécifique d'un gène unique, à partir des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, puis utiliser cette amorce pour produire un ADNc complet à partir d'un ARN messager unique avec lequel ladite amorce s'hybride, dans les conditions d'hybridation appropriées, de

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préférence des conditions d'hybridation de forte stringence. L'étape d'hybridation, puis d'allongement de l'amorce peuvent être réalisées par l'homme du métier selon des techniques conventionnelles, par extraction préalable des ARN messagers présents dans des cellules de mammifère humain ou non humain, en culture primaire ou en lignée cellulaire, puis mise en contact de l'amorce spécifique dans les conditions d'hybridation appropriées, puis allongement de l'amorce en présence d'une transcriptase inverse. L'amorce nucléotidique ayant subi l'allongement décrit ci-dessus peut être alors être directement utilisée comme sonde spécifique. Alternativement, l'amorce nucléotidique ayant subi l'allongement décrit cidessus peut servir de produit de départ pour la fabrication de la sonde spécifique finale, par exemple par l'action d'xonucléases, ou encore par l'action d'endonucléases de restriction, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Selon une troisième méthode, l'homme du métier peut synthétiser au moins une amorce nucléotidique spécifique d'un gène unique, à partir des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, puis utiliser cette amorce pour produire un ADNc complet à partir d'une collection de clones comprenant des vecteurs dans lesquels sont insérés des ADNc provenant de cellules de mammifère humain ou non humain, selon des techniques connues de l'homme du métier. L'ADNc complet ainsi généré peut alors être directement utilisé comme sonde spécifique. Alternativement, l'ADNc complet peut servir de produit de départ pour la fabrication de la sonde spécifique finale, par exemple par l'action d'xonucléases, ou encore par l'action d'endonucléases de restriction, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Ensemble de moyens et dispositif de détection selon l'invention
L'invention a pour objet un ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit ensemble de moyens comprend, pour chaque acide nucléique dont la présence est recherchée, au moins une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec ledit acide nucléique, ledit

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ensemble de moyens étant préparé par le procédé qui a été décrit en détail dans la présente description.

La sixième collection de séquences, qui consiste en la collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, comprend des séquences uniques contenues dans des gènes qui avaient, dans l'état de la technique, été plus ou moins caractérisés, du point de vue de leur fonction. Ainsi, on peut distinguer selon que pour chacun de ces gènes : (i) ledit gène avait déjà été caractérisé comme étant impliqué dans l'inflammation ; (ii) ledit gène possédait au moins une fonction connue dans au moins un autre domaine physiologique que l'inflammation ; (iii) ledit gène ne possédait encore aucune fonction connue.

L'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins une sonde s'hybridant spécifiquement avec un gène appartenant (a) à la catégorie (ii) ci-dessus des gènes dont l'implication dans une réaction inflammatoire n'était pas connue avant la présente invention ou (b) à la catégorie (iii) ci-dessus des gènes dont aucune fonction n'avait été identifiée avant l'invention.

Ainsi, selon un premier mode de réalisation préféré d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention, ledit ensemble de moyens de détection comprend au moins une sonde s'hybridant avec un gène comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 10. Les séquences nucléotidiques SEQ ID N 5 à SEQ ID N 10 sont illustrées notamment à l'exemple1 et consistent chacune en une séquence unique retrouvée dans la séquence d'un gène de fonction connue, ledit gène, ou ses produits d'expression, n'ayant pas été décrits auparavant comme des gènes dont l'expression est modifiée chez un individu développant une réaction inflammatoire. Ledit ensemble de moyens de détection peut comprendre des sondes s'hybridant chacune spécifiquement avec un seul parmi 1,2, 3,4, 5 ou 6 des gènes définis par chacune des séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 10.

Selon un second mode de réalisation préféré d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention, ledit ensemble de moyens de détection comprend au moins une sonde s'hybridant avec un gène

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comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 11 à SEQ ID N 25. Les séquences nucléotidiques SEQ ID N 11 à SEQ ID N 25 sont illustrées notamment à l'exemple1 et consistent chacune en une séquence unique retrouvée dans la séquence d'un gène de fonction auparavant inconnue. Ledit ensemble de moyens de détection peut comprendre des sondes s'hybridant chacune spécifiquement avec un seul parmi 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8,9, 10,11, 12,13, 14 ou 15 des gènes définis par chacune des séquences SEQ ID N 11 à SEQ ID N 25.

Selon un troisième mode de réalisation préféré, ledit ensemble de moyens de détection comprend au moins une sonde s'hybridant avec un gène comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 10 et au moins une sonde s'hybridant avec un gène comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 11 à SEQ ID N 25.

Selon un quatrième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens selon l'invention est caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les polynucléotides ayant au moins 20 nucléotides consécutifs des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou au moins 20 nucléotides consécutifs des séquences complémentaires aux séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.

Selon un cinquième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens selon l'invention est caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou une séquence complémentaire des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou parmi les séquences complémentaires aux séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.

Selon un sixième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens de détection selon l'invention est caractérisé en ce que chaque sonde nucléotidique consiste en un polynucléotide inclus dans la séquence d'un ARN messager ou d'un ADNc correspondant à un gène inductible par

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un médiateur de l'inflammation, lequel gène comprend une séquence contenue dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou en ce que chaque sonde nucléotidique consiste en un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de celle d'un polynucléotide inclus dans la séquence d'un ARN messager ou d'un ADNc correspondant à un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, lequel gène comprend une séquence contenue dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention
L'ensemble de moyens selon l'invention comprend au moins une sonde nucléotidique choisie parmi les sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus. Avantageusement, l'ensemble de moyens selon l'invention comprend la totalité des sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.

Selon un septième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens comprend plusieurs sondes s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique déterminé, résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.

Selon un premier aspect de ce septième mode de réalisation, pour un acide nucléique donné, l'ensemble de moyens comprend plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec la même séquence cible, le nombre de sondes nucléotidiques de séquences identiques pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, l'ensemble de moyens de l'invention permet une mesure quantitative de l'acide nucléique cible contenu dans l'échantillon testé.

Selon un second aspect de ce septième mode de réalisation, pour un acide nucléique donné, l'ensemble de moyens comprend plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec des séquences cibles distinctes incluses dans ledit acide nucléique, le nombre de sondes pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, l'ensemble de moyens permet une grande sensibilité de détection, du fait de sa capacité à détecter ledit acide nucléique cible dans l'échantillon testé, même dans le cas où ledit acide nucléique cible a subi des altérations physiques dans l'échantillon, comme par exemple des coupures par des exo- ou des endo- nucléases présentes dans le matériel source de départ, par exemple dans un extrait cellulaire, ou présentes dans l'échantillon à tester.

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De même, selon un mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens de détection selon l'invention comprend, pour un acide nucl éique cible déterminé, plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant spécifiquement avec ce dernier, comme cela est décrit pour les sondes s'hybridant avec les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou une séquence complémentaire des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.

Les acides nucléiques comprenant les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention possèdent des caractéristiques structurales communes, qui sont représentatives d'acides nucléiques dérivés de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.

Avantageusement, l'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins 10,20, 30,40, 50,50, 100,200, 250,300, 350,400, 450,500, 550,600, 650,700, 750,800, 850,900, 950 ou 1000 sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.

De manière générale, le nombre total de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention dépend en premier lieu du nombre d'acides nucléiques cibles distincts, correspondant chacun en un produit de transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, que l'on cherche à détecter dans l'échantillon. Ainsi, le nombre minimum total de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention est défini par la formule suivante :
Nsmin=y, dans laquelle : - Nsmin est le nombre minimal de sondes ; et - y représente le nombre d'acides nucléiques cibles distincts que l'on cherche à détecter.

De plus, le nombre total de sondes nucléotidiques contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention dépend également du nombre de sondes nucléotidiques identiques s'hybridant avec la même séquence cible incluse dans un acide nucléique déterminé que l'on cherche à détecter et dépend aussi du nombre de sondes s'hybridant avec des

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séquences cibles distinctes i ncluses dans ledit acide nucléique cible. Ainsi, le nombre de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention peut aussi être exprimé selon la formule suivante : NtotaF [[(aa1.A1ai) + (aa2.A1a2) +...+ (any.A1ay)] + [(ab1.A2a2) + (ab2.A2a2) +...+ (abny.A2ay)] +... + [(ax1.AXaX) + (ax2.A1a2) +...+ (axny.AXay)]], dans laquelle : - Ntotal est le nombre total de sondes ; et - A1, A2,..., AX représentent les acides nucléiques correspondant aux produits de transcription (ARNm ou ADNc) des gènes A1, A2, ... ,AX inductibles par un médiateur de l'inflammation ; - X est un entier dont la valeur maximale est égale au nombre total de séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention ; - A1a1, A1a2, , A1an représentent respectivement les séquences cibles distinctes a1, a2,..., an, contenues dans l'acide nucléique cible
A1, pour lesquelles au moins une sonde s'hybride spécifiquement , - n est un entier compris entre 0 et 100, et est préférentiellement égal à 0,1, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 11,12, 13,14 , 15,16, 17,18, 19 ou 20; - an1, an2, ..., any représentent le nombre de sondes identiques s'hybridant à la même séquence cible A1a1, A1a2, ,A1ay, contenue dans l'acide nucléique cible A1 et représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier compris entre 0 et 100, avantageusement entre 0 et 50, et sont de préférence égaux à 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ;
Une condition obligatoire est que l'ensemble des moyens de détection selon l'invention contienne au moins une sonde s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou avec une acide nucléique comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention..

Plus le nombre de sondes s'hybridant spécifiquement avec des acides nucléiques cibles distincts est grand, plus la précision concernant la situation

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physiologique des cellules du mammifère humain ou non humain dont proviennent les acides nucléiques de l'échantillon est précise.

Selon un premier mode de réalisation préférentiel, l'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins une sonde s'hybridant avec chacun des acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.

Selon un second mode de réalisation préférentiel, l'ensemble des moyens de détection selon l'invention peut comprendre certaines seulement des sondes nucléotidiques ci-dessus, en fonction de la situation physiologique suspectée du mammifère humain ou non humain à partir duquel provient l'échantillon à tester.

La mise en #uvre pratique de l'ensemble de moyens de détection selon l'invention pourra montrer que seulement certains sous-ensembles de sondes seront nécessaires pour obtenir un résultat exhaustif de la situation physiologique précise du mammifère humain ou non humain dont provient l'échantillon à tester, selon les symptômes que cet individu exprime, ou selon la nature du pré-diagnostic ou du diagnostic clinique déjà établi, par exemple parce que seulement certains des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation sont activés, ou au contraire inhibés ou bloqués, dans une situation physiopathologique déterminée.

Chacune des sondes nucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marquée, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 32P, , 3H, 35S, ), des molécules fluorescentes (5bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine), des molécules chimioluminescentes ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'

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Les sondes nucléotidiques constitutives de l'ensemble de moyens de détection de l'invention peuvent se présenter sous forme libre, en suspension dans une solution adaptée à la réalisation de la réaction d'hybridation avec les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon à tester.

Ensemble de moyens ou dispositifs de l'invention comprenant les sondes immobilisées sur un support ( puces à ADN ).

De manière tout à fait préférée, l'ensemble de moyens de détection selon l'invention est caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques contenues dans celui-ci sont immobilisées sur un support.

Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.

Selon un mode de réalisation préféré, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support sont ordonnées en matrices, comme dans les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N 5,143,854, dans les demandes PCT N WO 90/150 70 et 92/10092.

Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N 5,412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995.

Selon une mode de réalisation particulièrement avantageux, les sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention sont immobilisées sur le support de manière ordonnée, par exemple sous la forme d'une matrice de sondes.

De manière tout à fait préférée, dans la matrice ordonnée de sondes, la position de chaque sonde distincte est prédéterminée et connue.

L'invention a aussi pour objet un dispositif de détection de la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce ledit dispositif comprend au moins une sonde nucléotidique

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ou une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies dans la présente description, la ou les sondes nucléotidiques étant immobilisées sur un support.

Selon un premier aspect, le dispositif ci-dessus est caractérisé en ce que la pluralité de sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.

Ledit support sur lequel sont immobilisées les sondes constitutives de l'ensemble de moyens de détection selon l'invention consiste en un support solide. Les sondes nucléotidiques sont fixées sur ledit support, directement ou indirectement, par couplage d'une ou plusieurs molécules de liaison ( linkers ) sur le support, puis par couplage de chaque sonde sur une partie libre de la molécule de liaison. A titre illustratif, mais non limitatif, le support peut être un matériau polymère, un verre, une céramique, des fibres naturelles, un silicone, un métal et des matériaux composites des matériaux précédemment cités. Le support possède au moins une surface pratiquement plate. Par pratiquement plate , on entend une surface qui est macroscopiquement plane pour une fixation optimale des sondes nucléotidiques, par exemple sous la forme d'un réseau matriciel à deux dimensions.

La surface du support solide peut être fonctionnalisée par un silane, comme décrit par exemple dans la demande de brevet américain publiée sous le n US 2002/20081597 (Lowe et al.).

Elle peut être aussi activée comme décrit dans la demande brevet américain publiée sous le numéro 2002/20076709 (Hevesi et al.). Dans ce cas, le support d'immobilisation des sondes comprend des groupes oléfiniques, soit que les groupes oléfiniques soient constitutifs du matériau support, soit qu'ils sont incorporés au matériau support par des réactions chimiques ou par le dépôt de surface de molécules contenant des groupes oléfiniques. Les groupes oléfiniques peuvent être apportés par exemple en les fixant avec des dérivés chlorosilane, puis en oxydant les groupes oléfiniques en aldéhyde.

La surface du support peut être également fonctionnalisée par des groupes thiols, comme décrit dans le brevet américain n US 5,412,087 (McGall et al.).

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Selon encore un autre mode de réalisation, les sondes nucléotidiques sont fixées de manière non covalent sur la surface du support, comme décrit par exemple dans la demande de brevet américain n 2002/20042069 (Myer et al.). Par exemple, les sondes nucléotidiques sont liées au support par des liaisons faibles telles, que des interactions électrostatiques, des interactions hydrophobes, des forces de Van der Waals, etc.

De manière générale, un ensemble de moyens de détection ou un dispositif selon l'invention, lorsqu'il se présente sous la forme d'une puce à ADN , peut être préparé selon les techniques décrites dans le brevet américain n US 6,403,320 (Read et al.), la demande PCT publiée sous le n WO 95/11995 (Chee et al.) ou encore la demande PCT publiée sous le n WO 92/10092 (Fodor et al.).

L'ensemble de moyens de détection ou le dispositif selon l'invention peut également se présenter sous la forme de matrices ou empilées ou stacked arrays , comme décrit dans la demande de brevet américain n 2002/20051995 (Kumar).

Pour les moyens mise en oeuvre pour la détection du ou des hybrides formés avec une sonde nucléotidique selon l'invention, immobilisée sur un support, et un acide nucléique contenu dans l'échantillon à tester, l'homme du métier se référera avantageusement aux différents demandes de brevet et brevet cités ci-dessus.

La détection des hybrides formés peut être réalisée notamment par mesure de fluorescence ou mesure de radioactivité, par exemple lorsque les acides nucléiques contenus dans l'échantillon ont été marqués, selon des techniques connues en soi, soit par une molécule fluorescente, soit par une molécule radioactive, préalablement à leur mises en contact avec l'ensemble de moyens de détection ou avec le dispositif de détection selon l'invention.

La détection de la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon peut être également réalisée par mesure de la variation de divers paramètres physiques du support, tels que la variation de la température, de la longueur d'onde d'un faisceau lumineux, de la conductivité ou de la résistivité de la surface du support, à l'endroit du support sur lequel est immobilisée une sonde qui s'est hybridée avec un acide nucléique présent dans l'échantillon à tester.

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De manière tout à fait préférée, la localisation, sur la surface du support, de chaque sonde nucléotidique de séquence connue est prédéterminée. Ainsi, la mesure de la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon, en tout point de la surface du support sur lequel les sondes sont immobilisées, permet de déterminer dans un premier temps les différentes localisations de la surface du support auxquelles la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon est détectée et/ou quantifiée. Dans un second temps, une comparaison des coordonnées spatiales en deux dimensions (pour les matrices ordonnées bidensionnelles) ou en trois dimensions (pour le matrices empilées ou stacked arrays ) avec une table préétablie de correspondance entre les différentes coordonnées spatiales du support et l'identité de la ou des sondes immobilisées à ces coordonnées, permet directement de déterminer l'identité des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation qui sont actifs (si une hybridation avec la ou les sondes correspondantes est détectée) ou inactifs (si aucune hybridation avec la ou les sondes correspondantes n'est détectée).

Applications de l'ensemble de moyens de détection et du dispositif de détection selon l'invention
Comme indiqué précédemment, l'ensemble de moyens de détection ou le dispositif de détection tels que définis ci-dessus sont utiles, en général, pour détecter la présence d'acides nucléiques, principalement ARN messagers ou ADNc, indiquant le niveau d'activation d'un ou plusieurs gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus, pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.

Selon une telle utilisation, il est désormais possible d'accéder à des données physiopathologiques fines concernant un mammifère humain ou non humain chez lequel on suspecte une réaction inflammatoire, locale ou systémique, ou chez lequel on a déjà diagnostiqué une réaction

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inflammatoire locale ou systémique, le cas échéant généralisée, comme par exemple un choc septique ou un SIRS. Les réactions inflammatoires visées englobent les infections bactériennes, qu'elles soient aiguës, subaiguës ou chroniques. Sont également englobées les inflammations survenant dans les pathologies néoplasiques, y compris les lymphomes malins, les néoplasies viscérales (cancers du rein, cancers de l'appareil digestif, cancers du poumon). Sont également englobées les inflammations survenant au cours de maladies systémiques, tels que le rhumatismes inflammatoires chroniques (p. ex. polyarthrite rhumatoïde), les connectivités auto-immunes (p. ex. lupus érythémateux disséminé), les vascularites (p. ex. la maladie de Horton ou la péri-ertérite noueuse). Sont également englobées les réactions inflammatoires survenant au cours des maladies cardio-vasculaires (p. ex. thromboses veineuses profondes), les maladies inflammatoires (p. ex. la maladie de Crohn). Sont également englobées les diverses réactions inflammatoires iatrogènes provoquées par les effets secondaires induits par les traitements médicamenteux, par exemple l'induction d'effets secondaires inflammatoires par les principes actifs antibiotiques ou anti-épileptiques.

L'invention est également relative à un procédé pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens de détection ou un dispositif de détection selon l'invention, avec un échantillon à tester ; b) détecter les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou dans ledit dispositif et les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon.

Selon un premier aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine l'identité de la ou des sondes nucléotidiques qui ont hybridé avec le ou les acides nucléiques présents dans l'échantillon.

Selon un second aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que, à l'étape b), ont détermine les rapports quantitatifs des différents acides nucléiques contenus dans l'échantillon et qui ont hybridé avec les sondes nucléotidiques.

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Selon un troisième aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine l'identité du ou des sondes nucléotidiques ayant hybridé avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.

Selon un quatrième aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain.

Selon un cinquième aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé ne ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ADNc obtenus par transcription inverse d'ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain
Une utilité principale de l'ensemble de moyens de détection ou du dispositif selon l'invention est qu'il permet de réaliser un profil de l'expression des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, à partir d'un échantillon provenant d'un individu à tester.

L'invention est aussi relative à un procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens ou un dispositif selon l'invention avec ledit échantillon ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques comprises dans l'ensemble de moyens ou dans le dispositif qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.

L'invention concerne aussi un procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) réaliser le procédé de détection de la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène

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inductible par un médiateur de l'inflammation avec ledit échantillon, tel qu'il a été défini précédemment ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.

Les résultats obtenus, c'est à dire l'identité des gènes actifs et des gènes non actifs, ainsi que, le cas échéant, le niveau d'activation des gènes actifs, est de nature à rendre compte fidèlement de la situation physiologique ou physiopathologique de l'individu testé, une fois que l'étape essentielle d'un diagnostic clinique a été réalisée.

De plus, lorsque plusieurs profils d'expression sont réalisés à partir d'échantillons prélevés chez le même individu, à différentes périodes de temps, par exemple à des intervalles de temps déterminés, l'ensemble des résultats obtenu est de nature à rendre compte de l'évolution de la situation physiologique ou physiopathologique de l'individu testé, au cours du temps.

Par exemple, un suivi régulier du développement ou de la réduction d'une réaction ou d'une maladie inflammatoire peut être réalisé pour un individu donné.

Notamment, en fonction des résultats obtenus, le traitement médicamenteux peut être adapté plus finement, plus rigoureusement et plus précisément qu'avec les outils d'investigation actuels.

Selon encore un autre aspect, la mise en #uvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention, permet de déterminer la combinatoire minimale requise pour faire émerger une population lymphocytaire capable de produire un type particulier d'anticorps, de caractériser de manière fine les réponses des lymphocytes auxiliaires ( helper ) qui contrôlent l'immunité inflammatoires (lymphocytes Th1 et Th2), identifier les conditions appropriées pour supprimer la réponse immunitaire (p. ex. dans le cas de maladies allergiques et parasitaires).

Selon encore un autre aspect, la mise en #uvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention, permet l'évaluation des effets induits par les interférons de type 1 qui sont couramment utilisés comme molécules thérapeutiques dans le traitement des maladies tels que les cancers, les hépatites virales et la sclérose en plaque.

Leur usage a en effet été limité du fait des effets secondaires sévères, qui peuvent cependant être, dans une certaine mesure, prédits par une étude

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précise des propriétés anti-virales et immunomodulatrices d'autant plus efficacement qu'on dispose du moyen d'identifier les facteurs responsables de ces effets secondaires. L'ensemble de moyens de détection et le dispositif de détection qui font l'objet de la présente invention constituent l'un des moyens d'identification possible des facteurs responsables des effets secondaires précités.

Les études cliniques basées sur l'utilisation des cytokines en cancérologies, du fait de la complexité des activités biologiques auxiliaires induites, montrent combien une thérapie basée sur un effet de dose-réponse peut ne pas conduite aux résultats thérapeutiques recherchés. Par exemple, si une cytokine agit via l'immunomodulation, une dose trop importante peut supprimer la réponse biologique désirée, alors qu'une dose trop réduite peut ne pas induire la réponse biologique désirée.

Selon encore un autre aspect, le développement d'une tolérance à l'effet immunorégulateur lors d'un traitement quotidien peut nécessiter une intervention thérapeutique espacée dans le temps. Egalement dans cette situation, la mise en oeuvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention permet au clinicien d'établir rapidement la dose de médicament optimale ainsi que la fréquence du traitement pour un individu donné.

Dans l'état de la technique, l'utilisation de cellules souches afin de régénérer des tissus différenciés est une voie d'approche thérapeutique qui est envisagée de plus en plus sérieusement. L'un des obstacles principaux réside dans la caractérisation de la combinatoire de facteurs permettant de contrôler le passage de la cellule souche vers une cellule mature bien déterminée. Actuellement, plusieurs équipes scientifiques travaillent pour la mise au point de milieux de culture contenant les molécules nécessaires au développement des cellules différenciées d'un type tissulaire donné. Selon encore un autre aspect, la mise en oeuvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention rend possible l'identification de la ou des combinaisons appropriées de facteurs de croissance spécifiques, qui permettent l'activation de l'expression des gènes adéquats, marqueurs de la différenciation en un type cellulaire donné.

L'invention a aussi pour objet un kit ou nécessaire pour la réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de

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l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de moyens ou un dispositif selon l'invention.

Selon un premier aspect, le kit ou nécessaire tel que défini ci-dessus comprend en outre les réactifs nécessaires pour effectuer la réaction d'hybridation entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif.

Selon un second aspect, le kit ou nécessaire tel que défini ci-dessus comprend en outre des moyens destinés à révéler les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif et les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.

La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.

EXEMPLES Exemple 1 : Description détaillée de 21 gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation selon l'invention à partir desquels sont fabriquées les sondes constitutives des moyens de détection selon l'invention.

Description des références aux séquences
Chaque séquence nucléotidique représentative d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation référencée ci-dessous dans la présente description consiste en un ADNc obtenu à partir d'un ARN messager résultant de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation selon l'invention.

Il s'agit des séquences SEQ ID N 5 à 25 ci-dessous.

Chaque séquence nucléotidique ci-dessous est contenue dans la séquence du gène complet correspondant, ledit gène complet comprenant dans sa séquence un motif ISRE tel que défini précédemment.

Les séquences d'ADNc ont été classées selon chaque chromosome contenant le gène correspondant.

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Pour chaque chromosome, les séquences d'ADNc ont été classées selon qu'elles se retrouvent sur le brin (+) ou sur le brin (-) de l'ADN du chromosome considéré.

Pour chaque brin (+) ou (-) d'un chromosome, les séquences ont été classées selon qu'elles sont orientées en direction sens ou en direction antisens .

Pour chaque brin d'un chromosome déterminé, les séquences ont été numérotées comme la Nième occurrence du motif ISRE considéré dans la séquence dudit brin (+) ou (-) dudit chromosome.

La référence de chaque séquence d'ADNc est constituée comme suit : - SeqX est, pour un brin donné ((+) ou (-)) d'un chromosome donné, la
Xième occurrence sur ledit brin du motif ISRE ; - La référence de chaque séquence comprend aussi le nom abrégé d'au moins une base de données électronique de séquences dans laquelle ladite séquence est répertoriée : - emb signifie la base de données EMBL ; - Ref signifie la base de données RefSeq ; - UG signifie la base de données UNIGENE ; - Dbj signifie la base de données Database Japan ; et - gb signifie la base de données GenBank - La référence de chaque séquence comprend aussi le numéro d'accès [numéro identificateur] de la séquence dans au moins l'une des bases de données de séquences ci-dessus.

- Le cas échéant, la référence de chaque séquence comprend diverses annotations telles que les clones d'ADN dont la séquence provient et le nom de la protéine pour laquelle cette séquence code.

A la connaissance du demandeur, aucun des gènes représentés par chacune des séquences nucléotidiques ci-dessous n'a été décrit comme un gène dont l'expression est reliée à une réaction inflammatoire.

DESCRIPTION DES SEQUENCES A. Gènes à motif ISRE (codant pour des protéines non connues pour être inductibles par les cytokines) SEQ ID N 5 (Chromosome 1, Brin (+), Sens) >Seq 11210 : de depart: 259403167

<Desc/Clms Page number 40>

MOTIF= CTGGAAAGGAAACAG Seqll210

>OembXM~037495XM~037495 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA.

>ONM~018662 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA.

>Ogi1110370641refINM~018662.1 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA >OgnlIUGIHs#S3220035 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA /cds=(53,2617) /gb=NM~018662 /gi=11037064 /ug=Hs.26985 /len=6930

>Ogi1110370641refNM~018662.1 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA >Ogi181638681gbIAF222980.1IAF222980 Homo sapiens disrupted in Schizophrenia 1 protein (DISC1) mRNA, complete cds

>OembIXM-0547751XM~054775 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA.

>Ogi134138751dbjAB007926.1AB007926 Homo sapiens mRNA for KIAA0457 protein, partial cds E=5e-52 100/100 100 +/- :0 (99) 103-202 (99) Identities = 100/100 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 103 ggaaggagcaggaggcagcccaggcggagcgggaggagctggcagcggggcgcatgccag 162

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 ggaaggagcaggaggcagcccaggcggagcgggaggagctggcagcggggcgcatgccag 60 Query: 163 gcgggggtcctcagggcgccccagccgccgccggcggcgg 202

1111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 gcgggggtcctcagggcgccccagccgccgccggcggcgg 100 SEQ ID N 6 (Chromosome 1, brin (+), antisens) >Seq 918 : de depart: 22311514 MOTIF= AGTTTCCCTTCTCGA

>OembIXM~0279081XM~027908 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA.

>OembIXM~0279081XM~027908 Homo sapiens PTEN induced putative kinase
1 (PINK1), mRNA.

>ONM~032409 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA.

>Ogi114165271refINM~032409.1 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA >OgnlIUGIHs#S3619730 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA /cds=(94,1839) /gb=NM~032409 /gi=14165271

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/ug=Hs.6163 /len=2700

>Ogi1147337771refIXM~027908.11 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA >Ogi1141490991dbjIAB053323.11AB053323 Homo sapiens PINK1 mRNA for PTEN induced putative kinase 1, complete cds

>OembIXM~0279091XM~027909 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA.

>Ogi1141652711refINM~032409.11 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA E=le-49 96/96 100 +/- :0 (95) 190-285 (95)
Identities = 96/96 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 190 cgcagaggcaccgccccaagtttgttgtgaccggcgggggacgccggtggtggcggcagc 249

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 cgcagaggcaccgccccaagtttgttgtgaccggcgggggacgccggtggtggcggcagc 60 Query: 250 ggcggctgcgggggcaccgggccgcggcgccaccat 285

111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 ggcggctgcgggggcaccgggccgcggcgccaccat 96 SEQ ID N 7 (Chromosome 1, Brin (-), Antisens) >Seq 7826 : de depart: 182700849 MOTIF= AGTTTCCGGTTCTGT

>OembIXM~0162381XM~016238 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA.

>OembIXM~0162381XM~016238 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA.

>ONM~022354 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA.

>Ogi1116412661refINM~022354.11 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA >0gn1#UG#Hs#S3219762 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA /cds=(161,1015) /gb=NM~022354 /gi=11641266 /ug=Hs.147403 /len=1510

>Ogi1205334921refIXM~016238.71 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA >Ogi1107171641gbIAF306347.11AF306347 Homo sapiens sperm-specific protein SP-2 mRNA, complete cds >Ogi1116412661refINM~022354.11 Homo sapiens spermatogenesis associated protein 1 (SPAP1), mRNA E=le-40 87/89 97 +/- :0 (88) 108-196 (88)
Identities = 87/89 (97%)
Strand = Plus/ Plus

<Desc/Clms Page number 42>

Query: 108 gcagtcggtgggcgcggcggctgctggagcgtagcgcgacccgactcttaagttttcttt 167

11111111111111111111111111111 11111111111111111111111111111 Sbjct : 2 gcagtcggtgggcgcggcggctgctggaggctagcgcgacccgactcttaagttttcttt 61 Query: 168 tcctctccagaggggccgattagggagag 196

11111111111111111111111111111 Sbjct : 62 tcctctccagaggggccgattagggagag 90 SEQ ID N 8 (Chromosome 2, Brin (-), Sens) >Seq 7130 : de depart: 138255670 MOTIF= TGGGAAAGAGAAACA

>OembIXM~0439071XM~043407 Homo sapiens splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SFRS3), mRNA.

>ONM~003017 Homo sapiens splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SFRS3), mRNA.

>Ogi145069001refINM~003017.11 Homo sapiens splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SFRS3), mRNA >Ogi13384831gbIL10838.11HUMSRP20 Homo sapiens SR protein family, pre-mRNA splicing factor (SRp20) mRNA, complete cds E=3e-38 83/85 97 +/- :0 (84) 201-285 (84)
Identities = 83/85 (97%)
Strand = Plus/ Plus Query: 201 atgcatcgtgattcctgtccattggactgtaaggtttatgtaggcaatcttggaaacaat 260

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct: 1 atgcatcgtgattcctgtccattggactgtaaggtttatgtaggcaatcttggaaacaat 60 Query: 261 ggcaacaagaccgaactggaacggg 285 1 Il 1 1 Il 1 1 Il ### ######### Sbjct : 61 ggcaacaagacggaattggaacggg 85 SEQ ID N 9 (Chromosome 13, Brin (-), Sens) >Seq 4101 : de depart: 76713824 MOTIF= TGAGAAACCGAAACT

>OembIXM~0544011XM 054401 Homo sapiens putative breast epithelial stromal interaction protein (BRESI1), mRNA.

>ONM~033255 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1),

>Ogi115147247refNM~033255.11 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1), mRNA >0gi#14861637#gb#AF396928.1# Homo sapiens putative breast epithelial stromal interaction protein mRNA, complete cds

>Ogi1151472471refINM~033255.11 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1), mRNA >Ogi217324831embIAL831953.1HSM803266 Homo sapiens mRNA; cDNA

<Desc/Clms Page number 43>

DKFZp667P0410 (from clone DKFZp667P0410) >gnl#UG#Hs#S3817942 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1), mRNA /cds=(65,988) /gb=NM~033255 /gi=15147247 /ug=Hs.343800 /len=1508 E=e-131 236/236 100 +/- :0 (235) 50-285 (235)
Identities = 236/236 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 50 cgctaagcgtcccagccgcatccctcccgcagcgacggcggcccgggacccgcgggctgt 109

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 cgctaagcgtcccagccgcatccctcccgcagcgacggcggcccgggacccgcgggctgt 60 Query: 110 gaaccatgaacacccgcaatagagtggtgaactccgggctcggcgcctcccctgcctccc 169

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 gaaccatgaacacccgcaatagagtggtgaactccgggctcggcgcctcccctgcctccc 120 Query: 170 gcccgacccgggatccccaggacccttctgggcggcaaggggagctgagccccgtggaag 229

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I ! I I Sbjct : 121 gcccgacccgggatccccaggacccttctgggcggcaaggggagctgagccccgtggaag 180 Query: 230 accagagagagggtttggaggcagcccctaagggcccttcgcgggagagcgtcgtg 285

111111111111111111111111111111111111111111111111111111Il Sbjct : 181 accagagagagggtttggaggcagcccctaagggcccttcgcgggagagcgtcgtg 236 SEQ N 10.

>Seq 1032 : de depart: 22391622 MOTIF= CAAGAAAACGAAACT >0emb#XM~037374#XM~037374 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA.

>ONM~021629 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein beta subunit 4

>Ogi1203575311refINM~021629.21 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA >0gnl#UG#Hs#S3219369 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA /cds=(280,1302) /gb=NM~021629 /gi=20357531 /ug=Hs.172654 /len=3302

>Ogi1203575311refINM~021629.21 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA >Ogi170234381dbjIAK001890.11AK001890 Homo sapiens cDNA FLJ11028 fis, clone PLACE1004128, highly similar to GUANINE
NUCLEOTIDE-BINDING PROTEIN BETA SUBUNIT 4 >gnl#UG#Hs#S1971121 Homo sapiens cDNA FLJ11028 fis, clone PLACE1004128, highly similar to GUANINE NUCLEOTIDE-BINDING PROTEIN BETA SUBUNIT 4/cds=UNKNOWN/gb=AK001890 /gi=7023438 /ug=Hs.172654 /len=2567
E=8e-79 148/148 100 +/-:0 1-148 (147) 138-285 (147)
Identities = 148/148 (100%)
Strand = Plus/ Plus

<Desc/Clms Page number 44>

Query: 138 acgtccccgccgggcccgcgcgcctcgtgcctcgcgcctcgcgcctccagccacgtcccc 197

11111111111111111111/11/11111111111111111111/111111111111111 Sbjct : 1 acgtccccgccgggcccgcgcgcctcgtgcctcgcgcctcgcgcctccagccacgtcccc 60 Query: 198 gccccggctccggcgcgccgcggagttggctgctgggaggtgcgggactgggtgtggccg 257

111111111111111111111111111111111111111111111111111/11/11111 Sbjct : 61 gccccggctccggcgcgccgcggagttggctgctgggaggtgcgggactgggtgtggccg 120 Query: 258 gcggctctggtctcggctgtgagctgcg 285 ############################ Sbjct : 121 gcggctctggtctcggctgtgagctgcg 148 B. Gènes à motif ISRE (codant pour des protéines de fonction inconnue) SEQ ID N 11 (Chromosome 1, Brin (+), Antisens) >Seq 6431 : de depart: 165375886 MOTIF= AGTTTCTCTTTCTTC >OembIXM~030965IXM~030965 Homo sapiens hypothetical gene supported by AB033071; AB051480 ; AK000726 ; NM~015383 (LOC90335), mRNA.

>0emb#XM~030964#XM~030964 Homo sapiens hypothetical gene supported by AB033071; AB051480 ; AK000726 ; NM~015383 (LOC90335), mRNA.

>0emb#XM~034731#XM~034731 Homo sapiens hypothetical protein (DJ328E19.C1.1), mRNA.

>0emb#XM~044868#XM~044868 Homo sapiens hypothetical gene supported by AB033071; AB051480 ; AK000726; NM~015383 (LOC92396), mRNA.

>0emb#XM~053190#XM~053190 Homo sapiens hypothetical protein FLJ20719 (FLJ20719), mRNA.

>emb#XM~054554#XM~054554 Homo sapiens hypothetical gene supported by AB033071; AB051480 ; AK000726 ; NM~015383 (LOC113657), mRNA.

>0emb#XM~016972#XM~016972 Homo sapiens hypothetical gene supported by AB033071; AB051480 ; AK000726; NM~015383 (LOC90335), mRNA.

>0emb#XM~054260#XM~054260 Homo sapiens similar to KIAA1693 protein; hypothetical protein FLJ20719 (H. sapiens) (LOC91631), mRNA.

>ONM~015383 Homo sapiens hypothetical protein DJ328E19.C1.1 (DJ328E19.C1.1), >0gi#7657016#ref#NM~015383.1# Homo sapiens hypothetical protein (DJ328E19.C1.1), mRNA
E=4e-34 76/78 97 +/-:0 1-78 (77) 208-285 (77)

<Desc/Clms Page number 45>

Identities = 76/78 (97%)
Strand = Plus/ Plus Query: 208 aagacctcataaaatttatgctgaggaatgagcgacagttcaaggaggagaagcttgcag 267

1 1 1 Il 1 III 1 1 Il 1 1 Il 1 1 Il 1 1 1 Il 1 1 III 1 Il 1 1 Il 1 Il 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Il l " Sbjct : 1 aagatctcataaaatctatgctgaggaatgagcgacagttcaaggaggagaagcttgcag 60 Query: 268 agcagctcaagcaagctg 285 ################## Sbjct : 61 agcagctcaagcaagctg 78 SEQ ID N 12 >Seq 964 : de depart: 20574200 MOTIF= GCAGAAGAGGAAACT >0emb#XM~009277#XM~009277 Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963), mRNA.

>ONM~014963 Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963), mRNA.

>OgnlIUGIHs#S2139651 Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963), mRNA /cds= (215,4315) /gb=NM~014963 /gi=7662409 /ug=Hs.7724 /len=4877

>Ogi1205455651refIXM~009277.51 Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963), mRNA >Ogi145895691dbjIAB023180.11AB023180 Homo sapiens mRNA for KIAA0963 protein, complete cds >0gi#7662409#ref#NM~014963.1# Homo sapiens KIAA0963 protein(KIAA0963), mRNA E=le-30 64/64 100 +/- :0 (63) 222-285 (63)
Identities = 64/64 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 222 gcccgaaacccggaagtgagcggcggcagctgcgaggctcggagaaacaggcgccgcggg 281

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 gcccgaaacccggaagtgagcggcggcagctgcgaggctcggagaaacaggcgccgcggg 60 Query: 282 ctcc 285 #### Sbjct : 61 ctcc 64 SEQ ID N 13 (Chromosome 10, Brin (+), Antisens) >Seq 5530: position de depart: 104011566 MOTIF= AGTTTCTGTTCCTTT >0emb#XM~005954#XM~005954 Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA.

>Ogi1147450031refIXM~005954.31 Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA >ONM~014896 Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA.

* >OgnlIUGIHs#S2139630 Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA /cds= (168,1769) /gb=NM~014896 /gi=7662365 /ug=Hs.199117 /len=4113

>Ogi142402761dbjIAB020701.11AB020701 Homo sapiens mRNA for KIAA0894 protein, complete cds

<Desc/Clms Page number 46>

>0gi#7662365#ref#NM~014896.1# Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA E=3e-47 99/100 99 +/- :0 (99) 183-281 (98)
Identities = 99/100 (99%), Gaps = 1/100 (1%)
Strand = Plus/ Plus Query: 183 gattattttgcttccggacctcgactggaaattttttaaaagcccttatgacaaatgagc 242

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 gattattttgcttccggacctcgactggaaattttttaaaagcccttatgacaaatgagc 60 Query: 243 atgttacctctcc-tttttctttttagcagctttcagctt 281

1111111111111 11111111111111111111111111 Sbjct : 61 atgttacctctccttttttctttttagcagctttcagctt 100 SEQ ID N 14 (Chromosome 14, Brin (-), Sens) >Seq 1684 : de depart: 32572132 MOTIF= CCGGAAGCGGAAACT >0emb#XM~007430#XM~007430 Homo sapiens KIAA0317 gene product (KIAA0317), mRNA.

>ONM~014821 Homo sapiens KIAA0317 gene product (KIAA0317), mRNA.

>0gnl#UG#Hs#S2139475 Homo sapiens KIAA0317 gene product (KIAA0317), mRNA /cds= (471,2942) /gb=NM~014821 /gi=7662051 /ug=Hs.20126 /len=5402 >0gi#7662051#ref#NM~014821.1# Homo sapiens KIAA0317 gene product (KIAA0317), mRNA E=le-49 99/100 99 +/- :0 (99) 26-125 (99)
Identities = 99/100 (99%)
Strand = Plus/ Plus Query: 26 gccggttcccaggccgggtggagaccaactctggggtctgttggtgggagagtggggagc 85

111111111111111111111111111111111111111 11111111111111111111 Sbjct : 1 gccggttcccaggccgggtggagaccaactctggggtctcttggtgggagagtggggagc 60 Query: 86 ccgtcttctgctgagtgctgccgccccttcccaggacagc 125

1111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 ccgtcttctgctgagtgctgccgccccttcccaggacagc 100 SEQ ID N 15 (Chromosome 14, Brin (-), Sens) >Seq 1961 : de depart: 38133588 MOTIF= GCTGAAACCGAAACC >0emb#XM~007469#XM~007469 Homo sapiens hypothetical protein FLJ11271 (FLJ11271), mRNA.

>ONM~018373 Homo sapiens hypothetical protein FLJ11271 (FLJ11271), mRNA.

>0gnl#UG#Hs#S2293578 Homo sapiens hypothetical protein FLJ11271 (FLJ11271), mRNA /cds=(82,519) /gb=NM~018373 /gi=8922963 /ug=Hs.109654 /len=1354

>Ogi17023825dbjAK002133.1AK002133 Homo sapiens cDNA FLJ11271 fis, clone PLACE1009319, moderately similar to Rattus norvegicus outer membrane protein mRNA

<Desc/Clms Page number 47>

>0gi#8922963#ref#NM~018373.1# Homo sapiens hypothetical protein FLJ11271 (FLJ11271), mRNA E=5e-52 100/100 100 +/- :0 (99) 11-110 (99)
Identities = 100/100 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 11 gggcgcagcgccgagattgattcaccttcacctgtgctgcactccagctgacccaagtag 70

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 gggcgcagcgccgagattgattcaccttcacctgtgctgcactccagctgacccaagtag 60 Query: 71 gaagccagacgagctgtaaaacatgaacggaagagtggat 110

1111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 gaagccagacgagctgtaaaacatgaacggaagagtggat 100 SEQ ID N 16 (Chromosome 15, Brin (-), Sens) >Seq 2089 : de départ: 43348924 MOTIF= CAGGAAATTGAAACT

>Ogill33758221refINM -024611.11 Homo sapiens hypothetical protein FLJ11896 (FLJ11896), mRNA
E=5e-52 100/100 100 +/-:0 1-100 (99) 185-284 (99)
Identities = 100/100 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 185 ataatagtgatggaaagacagctgttgtgggttctaacttaagttccagaccagctagtc 244

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 ataatagtgatggaaagacagctgttgtgggttctaacttaagttccagaccagctagtc 60 Query: 245 caaattcttcctcaggacaggcttctgtaggaaaccagac 284

1111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 caaattcttcctcaggacaggcttctgtaggaaaccagac 100 SEQ ID N 17 (Chromosome 2, Brin (-), Sens) >Seq 4608 : de depart: 88299855 MOTIF= AGCGAAAGAGAAACT >gnlIUGIHs#S2532973 AV707659 Homo sapiens cDNA, 5' end /clone=ADBBSA11 /clone~end=5' /gb=AV707659/gi=10724924 /ug=Hs.74921 /len=733 E=9e-85 164/166 98 +/- :0 (165) 120-285 (165)
Identities = 164/166 (98%)
Strand = Plus/ Plus Query: 120 aggctgcggaccagccccccacacttccccctacacctctggcgggttcgcgccgtggac 179

1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 aggctgcggtccagccccccacactttcccctacacctctggcgggttcgcgccgtggac 60 Query: 180 gcccccgccctgcgggaggaggggctggcgcggattttagggacttcctgggatgcggag 239

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct: 61 gcccccgccctgcgggaggaggggctggcgcggattttagggacttcctgggatgcggag 120 Query: 240 atcggctctgaaccatcccctttctgctgcccggagctggggaagc 285

1111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 121 atcggctctgaaccatcccctttctgctgcccggagctggggaagc 166 SEQ ID N 18 (Chromosome 4, Brin (+), Sens)

<Desc/Clms Page number 48>

>Seq 5668 : de depart: 117322292 MOTIF= GAGGAAATAGAAACT >gnl#UG#Hs#S3365105 602498968F1 Homo sapiens cDNA, 5' end /clone=IMAGE:4612649 /clone~end=5' /gb=BG428292 /gi=13334798 /ug=Hs.292472 /len=1008 E=5e-31 68/68 100 +/- :0 (67) 218-285 (67)
Identities = 68/68 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 218 ttagggtcagtgaacagtaatgatttaggtatacagctaggacctacatttaaattctta 277

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 5 ttagggtcagtgaacagtaatgatttaggtatacagctaggacctacatttaaattctta 64 Query: 278 cctgtcta 285 ######## Sbjct : 65 cctgtcta 72 SEQ ID N 19.

>Seq 4720: position de depart: 94183459 MOTIF= AATGAAAAGAAACTT >gnlIUGIHs#S3552312 602624658F1 Homo sapiens cDNA, 5' end /clone=IMAGE :4749638 /clone~end=5' /gb=BG678948 /gi=13910345 /ug=Hs.17384 /len=955
E=3e-35 82/83 98 +/-:0 4-85 (81) 203-285 (82)
Identities = 82/83 (98%), Gaps = 1/83 (1%)
Strand = Plus/ Plus Query: 203 aattcaaaacatactccttatattaaggattatagcaccatattttttgtatattcccta 262

111111111111111111111111111111111111111111 11111111111111111 Sbjct : 4 aattcaaaacatactccttatattaaggattatagcaccata-tttttgtatattcccta 62 Query: 263 tgtgtaactttttcctgttggta 285 ###################### Sbjct : 63 tgtgtaactttttcctgttggta 85 SEQ ID N 20 (Chromosome 5, Brin (+), antisens) >Seq 6860 : de depart: 137080329 MOTIF= GAAGAAATGAAACTT >gnlIUGIHs#S3438451 Homo sapiens FKSG56 (FKSG56) mRNA, complete cds /cds= (48,422) /gb=AF336883/gi=13384194 /ug=Hs.344028 /len=799
E=2e-61 131/135 97 +/-:0 1-135 (134) 151-285 (134)
Identities = 131/135 (97%)
Strand = Plus/ Plus Query: 151 ccttccccagtgtttgtgtccctgggtacttgagattagggagtggtgatgactcttaac 210

111111 11111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 ccttccgcagtgtttgtgtccctgggtacttgagattagggagtggtgatgactcttaac 60 Query: 211 tagcatgctgccttcaagcatctgtttaacaaagcacatcttgcactgcccttaatccat 270

111111111111111111111111111111111111111111111 1111111111111 Sbjct : 61 gagcatgctgccttcaagcatctgtttaacaaagcacatcttgcaccgcccttaatccat 120

<Desc/Clms Page number 49>

Query: 271 ttaaccctgagtgga 285 # ############# Sbjct : 121 tcaaccctgagtgga 135 SEQ ID N 21 (Chromosome 7, Brin (+), >Seq 7018 : de depart: 138487975 MOTIF= CTAGAAAGAGAAACT >gnlIUGIHs#S2649922 Homo sapiens cDNA FLJ11779 fis, clone
HEMBA1005921 /cds=UNKNOWN /gb=AK021841 /gi=10433109 /ug=Hs.196342 /len=1336 E=4e-65 128/129 99 +/- :0 (128) 157-285 (128)
Identities = 128/129 (99%)
Strand = Plus/ Plus Query: 157 atcatagtagaaccaccgtgttctaaccttattgtgtatcaccataacagtttattgtgg 216

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 atcatagtagaaccaccgtgttctaaccttattgtgtatcaccataacagtttattgtgg 60 Query: 217 ctctgatgtcataaaggaagagacatggaagaagaaaaagggggaaaaacgtagtattta 276

11111111111111111111111111111 111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 ctctgatgtcataaaggaagagacatggaggaagaaaaagggggaaaaacgtagtattta 120 Query: 277 aaattcttt 285 1 1 111 1 1 Il Sbjct : 121 aaattcttt 129 SEQ ID N 22 >Seq 2907 : de départ: 56347835 MOTIF= CAGGAAAAGAAACTG >gnlIUGIHs#S3053159 602303069F1 Homo sapiens cDNA, 5' end /clone=IMAGE:4394585 /clone~end=5' /gb=BG024183 /gi=12409495 /ug=Hs.350159 /len=1130
E=2e-76 161/164 98 +/- :0 1-164 (163) 117-278 (161)
Identities = 161/164 (98%), Gaps = 2/164 (1%)
Strand = Plus/ Plus Query: 117 aggttactcactataaacaatatccacccaacacaa-gcaa-agtttattcctactttga 174

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 aggttactcactataaacaatatccacccaacacaacgcgagagtttattcctactttga 60 Query: 175 atgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagt 234

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 atgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagt 120 Query: 235 attttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggta 278

11111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 121 attttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggta 164 SEQ ID N 23 (Chromosome 8, Brin (+), Sens) >Seq 1580 : de depart: 30265967 MOTIF= GGAGAAACTGAAACT >gnlIUGIHs#S2006324 EST383718 Homo sapiens cDNA /gb=AW971629 /gi=8161475 /ug=Hs.88218 /len=500 E=e-150 280/284 98 +/- :0 (283) 2-285 (283)
Identities = 280/284 (98%)
Strand = Plus/ Plus

<Desc/Clms Page number 50>

Query: 2 agagattaaatgatttattcagtacatggcagggtcaggactgagccaaggcattgtggc 61

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 agagattaaatgatttattcagtacatggcagggtcaggactgagccaaggcattgtggc 60 Query: 62 tccagttcatctccccgttacggtcaggggtgcttatgaactcatagtggggtcgggggt 121

1111111111 1111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 tccagttcatttccccgttacggtcaggggtgcttatgaactcatagtggggtcgggggt 120 Query: 122 agaggagagacgtaacacaaacatgagaaacaattagaggaccatgcaaggcagggtgta 181

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 121 agaggagagacgtaacacaaacatgagaaacaattagaggaccatgcaaggcagggtgta 180 Query: 182 attcagtcctaaatcacataatccagagagcaagtgctagaagaattcgggagaaggagc 241

1111111111111111111111111 1111111111111111 11111111111111111 Sbjct : 181 attcagtcctaaatcacataatccaaagagcaagtgctagaaaaattcgggagaaggagc 240 Query: 242 atttcctccaggcattcctgggatcctaccaagtgagaaggcag 285

111111111111111111111111111111111111 1111111 Sbjct : 241 atttcctccaggcattcctgggatcctaccaagtgaaaaggcag 284 SEQ ID N 24 (Chromosome 12, Brin (-), Sens) >Seq 3482 : de depart: 71200075 MOTIF= TTAGAAAATGAAACT >gnlIUGIHs#S2654527 Homo sapiens cDNA: FLJ23092 fis, clone LNG07245, highly similar to AF007130 Homo sapiens clone 23750 unknown mRNA /cds=UNKNOWN /gb=AK026745 /gi=10439667 /ug=Hs.12871 /len=2050 E=le-28 64/64 100 +/- :0 (63) 222-285 (63)
Identities = 64/64 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 222 aaaatagacgatcgtttaaaattggaagcagagatggaattaaaagacttacaccagcct 281

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 aaaatagacgatcgtttaaaattggaagcagagatggaattaaaagacttacaccagcct 60 Query: 282 aaaa 285 #### Sbjct : 61 aaaa 64 SEQ ID N 25 (Chromosome 15, Brin (+), Sens) >Seq 3086 : de depart: 77422375 MOTIF= CCAGAAATGAAACTT >gnlIUGIHs#S1570556 Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone
EUROIMAGE 28993/cds=UNKNOWN /gb=AL109678/gi=5689803 /ug=Hs.21597 /len=1426 E=e-108 197/197 100 +/- :0 (196) 89-285 (196)
Identities = 197/197 (100%)
Strand = Plus/ Plus Query: 89 caattatagattaaaaatatcagaagcatttccagattattcttaaaagttgatgagatc 148

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 1 caattatagattaaaaatatcagaagcatttccagattattcttaaaagttgatgagatc 60 Query: 149 ttcccaaaccagaatgacaactgaggatgagatgtgcatagattaaatggtaaagtgggt 208

111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Sbjct : 61 ttcccaaaccagaatgacaactgaggatgagatgtgcatagattaaatggtaaagtgggt 120

<Desc/Clms Page number 51>

Query: 209 ggttctcaggtgagaagcagtgaggaccattcattttgcagcctaaaaattttaggggat 268

111111111111111111111111111111111111111/11/111/1/111111/1/11 Sbjct : 121 ggttctcaggtgagaagcagtgaggaccattcattttgcagcctaaaaattttaggggat 180 Query: 269 gcaaactgtcatttccc 285 ################# Sbjct : 181 gcaaactgtcatttccc 197

<Desc/Clms Page number 52>

Exemple 2: Description d'un exemple illustratif d'un programme d'ordinateur pour la réalisation de l'étape a) du procédé de l'invention Le programme d'ordinateur illustré ci-dessous a été rédigé dans le langage de programmation PERL .

I. Programme Maître (pour le motif ISRE ) #!/usr/bin/perl # chr1.fa Brin Plus, Motif Sens, Version UCSC du 13-06-2001 # Motif ISRE Sens : .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} system "pg1.pl chr1.fa .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} >res~chr1"; system "pg2.pl res~chr1 > ti1" , system "pg3.pl ti1 .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}"; system " mv isre~moins isre~-~s"; system " mv isre~plus isre~+~s"; # Motif ISRE Reverse Complementaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} system "pg3.pl isre~-~s .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}"; system " mv isre~moins isre2~-~s"; system " mv isre~plus isre2~+~s"; system "pg4~new160.pl isre2~-~s alu+primate~repbase"; system "mv sequencg2 chr1~alu-";

system " pg4 new15.p1 chrl-alu- alu+primate-repbase";

<Desc/Clms Page number 53>

system "mv sequencg2 chr1~alu2-"; system " blastall -p blastn -d tc~bank -a2-i chr1~alu2- > ta1 " ; system " pg6.pl ta1 0. 970 > plus~chr1 " ; # chr1.fa,brin Plus,Motif Reverse Complementaire, #Version UCSC du 13-06-2001 # Motif ISRE Reverse Complementaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} system " pg1.pl chr1.fa .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} > res~chr1~as"; system "pg2.pl res~chr1~as > ti1~as" ; system "pg3.pl ti1~as .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}"; system " mv isre~moins isre~-~as"; system " mv isre~plus isre~+~as"; # Motif ISRE Sens : .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} system "pg3.pl isre~-~as .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}"; system " mv isre~moins isre2~-~as"; system " mv isre~plus isre2~+~as"; system "pg4~new160.pl isre2~-~as alu+primate~repbase";

<Desc/Clms Page number 54>

system "mv sequencg2 chr1~alu-~as";

system " pg4-newl5.pl chrl-alu--as alu+primate-repbase"; system "mv sequencg2 chr1~alu2-~as"; system "blastall -p blastn -d tc~bank -a2 -i chr1~alu2-~as > ta1~as " ; system " pg6.pl ta1~as 0. 970 > plus~chr1~as " ; #revcomp~chr1 .fa. Brin Moins, Motif ISRE Sens, Version UCSC du 13-06-2001 # Motif ISRE Sens : .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} system " pg1.pl revcomp~chr1.fa .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} >res~chr1~rc"; system "pg2.pl res~chr1~rc > ti1~rc" ; system "pg3.pl ti1~rc .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}"; system " mv isre~moins isre~-~src"; system " mv isre~plus isre~+~src"; # Motif ISRE Reverse Complementaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} system "pg3.pl isre~-~src .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}"; system " mv isre~moins isre2~-~src"; system " mv isre~plus isre2~+~src";

system " pg4~newl60.pi isre2~-~src alu+primate-repbase";

<Desc/Clms Page number 55>

system "mv sequencg2 chr1~alu-~rc";

system " pg4 new15.p1 chr1 alu =rc alu+primate-repbase"; system "mv sequencg2 chr1~alu2-~rc"; system " blastall -p blastn -d tc~bank -a2-i chr1~alu2-~rc > ta1~rc "; system " pg6.pl ta1~rc 0. 970 > moins~chr1 "; # revcomp~chr1.fa, Brin Moins, Motif Reverse Complementaire, Version #UCSC du 13-06- 2001 # Motif ISRE Reverse Complementaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} system "pg1.pl revcomp~chr1.fa .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} > res~chr1~asrc"; system "pg2.pl res~chr1~asrc > ti1~asrc" ; system "pg3.pl ti1~asrc .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}"; system " mv isre~moins isre~-~asrc"; system " mv isre~plus isre~+~asrc": # Motif ISRE Sens : .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} system "pg3.pl isre~-~asrc .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}"; system " mv isre~moins isre2~-~asrc"; system " mv isre~plus isre2~+~asrc";

system " pg4 new160.p1 isre2~-~asrc alu+primate-repbase";

<Desc/Clms Page number 56>

system "mv sequencg2 chr1~alu-~asrc";

system " pg4 newl5.pl chrl-alu--asrc alu+primate-repbase"; system "mv sequencg2 chr1~alu2-~asrc"; system " blastall -p blastn -d tc~bank -a2-i chr1-alu2-~asrc > ta1~asrc system " pg6.pl ta1~asrc 0. 970 > moins~chr1~as Il. Module pg1.p1 #!/usr/bin/perl if ($#ARGV != 1) print "usage : utilise 2 arguments: first, fichier chromosome; second, motif recherche \n"; exit ; } $j = 1 ; open(F, $ARGV[0]) Il die ("I can't open this chromosome file\n"); $regexp = $ARGV[1]; $line = <F>; while ($line) { if ($line =- /^>/) { $name = $line; $seq = while (($line = <F>) && ($line !# /^>/) { chomp $line; $seq .= $line; #pareil que : $seq = $seq . $line } $Iseq = length( $seq ) ; for ( $i = 0 ; < $Iseq ; $i++){ $partseq = substr( $seq , $i, 15); if($partseq =- /^$regexp/o ){ $partseq = substr ($seq, $i, 300); $seqelec {$partseq}++;

<Desc/Clms Page number 57>

print ">Seq $j: position de départ: $i \n$partseq \n"; $j=$j+1; } } } else $line = <F>; } } close F ; III. Module pa2.p1 #!/usr/bin/perl $i =1; if ($#ARGV !=0){ print "usage : <Fichier de séquences au format fasta>\n"; exit ; } open (FS, $ARGV[O]); $x= <FS>; while ($x) { if ($x =# /^>/) { $line = $x; } if ($x !# /^>/) { $x=# s/^.{15}//; $line .= $x; print $line;

<Desc/Clms Page number 58>

} $x= <FS>; } close (FS) ; IV. Module pg3.p1 #!/usr/bin/perl if ($#ARGV != 1) { print "usage : 1 er argument : - fichier output de pg2.pl \n"; print " 2eme argument : - d'expression reguliere recherche \n"; exit ; } $seq1 = $seq2 = ""; open(F, "$ARGV[O]") Il die "can't open the file ti1"; $regexp = $ARGV[1]; $!!ne = <F>; while ($line) { if ($line =- /^>#^\s+>/) { $name = $line; $seq = ""; while (($line = <F>) && ($line !- /^>/)) { $seq .= $line; } $Iseq = length( $seq ) ;

<Desc/Clms Page number 59>

for ( $i = 0 ; $i < $Iseq ; $i++){ $partseq = substr( $seq , $i, 15); if($partseq =# /^$regexp/o ){ $seqq {$partseq}++; } } if (%seqq) { #teste le contenu du hachage $name .= $seq ; $seq1 .= $name; $name=""; %seqq = (); } else { $name .= $seq ; $seq2 .= $name; $name = ""; %seqq = (); } } else $line = <F>; } } close F ; sélect (ISRE~PLUS); open (ISRE~PLUS, ">isre~plus"); print ISRE~PLUS " $seq1 \n" ; sélect (ISRE~MOINS); open (ISRE~MOINS, ">isre~moins"); print ISRE~MOINS " $seq2 \n" ;

<Desc/Clms Page number 60>

V. Module pq4 160.p1 #!/usr/bin/perl if ($#ARGV != 1) print "usage : utilise 2 arguments : - de séquences au format fasta \n"; print " - Banque de séquence au format fasta utilisée \n"; exit ; } $bank = $ARGV[1] ; open (FSE , ">sequencg2"); open (FSOR, ">fsor"); open (F, $ARGV[0]); $line = <F>; while ($line) { if ($line =- /^>#^\s+>/) { $name = $!!ne; $seq = while (($line = <F>) && ($line !# /^>/)) { #chop $line; $seq .= $line; } open (FSOR, ">fsor"); print FSOR $name; print FSOR $seq; print FSOR "\n"; $fsor.=$name; $fsor.=$seq; #system "nedit fsor&"; #print $fsor ; #exit; system "blastall -p blastn -d $bank -e 1 e-160 -a2-i fsor -o other" ; open(FS, "other") Il die ("fichier output blastn introuvable\n");

<Desc/Clms Page number 61>

while (($line2 = <FS>) && ($line2 !# / No hits found /)) {} if ($line2 =- / No hits found /) { open (FSE , " sequencg2"); print FSE $fsor; $fsor="" ; $name=""; $seq=""; } else close FS ;

$var = '-lIinuxjpalprogrammes/jp/prog~valides/xblast other fsor N'; open (FSEQ, " sequencg2"); print FSEQ $var; $fsor="" ; $name=""; $seq=""; else { $line = <F>; close (F) ; close (FSOR) ; close (FSE) ; VI. Module pq4 15.p1 #!/usr/bin/perl

<Desc/Clms Page number 62>

if($#ARGV!=1){ print "usage : utilise 2 arguments : - de séquences au format fasta \n"; print " - Banque de séquence au format fasta utilisée \n"; exit ; } $bank = $ARGV[1] ; open (FSE , ">sequencg2"); open (FSOR, ">fsor"); open (F, $ARGV[0]); $line = <F>; while ($line) { if ($line =- /^>#^\s+>/) { $name = $line; $seq = ""; while (($line = <F>) && ($line !# /^>/)) { $seq .= $line; } open (FSOR, ">fsor"); print FSOR $name; print FSOR $seq; print FSOR "\n"; $fsor.=$name; $fsor.=$seq ; system "blastall -p blastn -d $bank -e 1 e-15-a2 -i fsor -o other" ; open(FS, "other")Il die ("fichier output blastn introuvable\n"); while (($line2 = <FS>) && ($line2 !# / No hits found /)) {}

<Desc/Clms Page number 63>

if ($line2 =- / No hits found /) { open (FSE , " sequencg2"); print FSE $fsor; $fsor=""; $name=""; $seq="" ; } else close FS ;

$var = 'IlinuxJpalprogrammesljplprog valideslxblast other fsor N'; open (FSEQ, " sequencg2"); print FSEQ $var; $fsor="" ; $name=""; $seq=""; else $line = <F>; close (F) ; close (FSOR) ; close (FSE) ; VII. Module pg5.p1 system " blastall -p blastn -d tc~bank -a2-i chr1~alu2- > fichier~resultat VIII. Module pg6.p1 #!/usr/bin/perl

<Desc/Clms Page number 64>

if ($#ARGV !=1){ print "usage : 1er argument : <blastall output file> \n"; print "2ieme argument: <valeur variable scalaire trueval> \n"; exit ; } open(FS, $ARGV[0]) Il die ("fichier $ARGV[0] introuvable\n"); $q=-1; $trueval= $ARGV[1] ; while (($line =<FS>) && ($line !# /Query=/)) {} while ($line =# /Query=(.+$)/) { $q++ ; $t=-1; #initialize target chomp $line; $qname=$1; while (($line =<FS>) && ($line !# /^>/) && ($line !# /Query=/)) {} while ($line =# /^>/) { $t++ ; $hsp=-1; #initialize hsp @goodhspinfo=(); $goodhsp=0; $tname=""; while ($line !# /Length/) { $tname .= $line; $line = <FS>; } while (($line =<FS>) && ($line !- /Score =/)){} while ($line =- /Score =/) { $hsp++ ; $tmin=1e10; $tmax=-1e10; $qmin=1e10; $qmax=-1e10;

<Desc/Clms Page number 65>

$!!ne=- /Expect\s\= (.+)$/; $expect=$1 ; while (($!!ne = <FS>) && ($line !# /">/) && ($line !# /Score =/) && ($line !# /Query=/ ) ) { if ($line=~ /Strand =/) { if ($!!ne=- /Minus/) { $minus=1; }else{ $minus=0;

if ($!!ne=- Ildentitiesls=1s(1d+)V(1d+)1s1((1d+)loa1)I) $id1=$1; $id2=$2; $pcent=$3; $truepcent=$1/$2;

$ali=""; if ($line=~ /Sbjct\:\s(\d+).* (\d+)$/) { if ($minus) { $tmin = ( ($2 < $tmin) ? $2 : $tmin); $tmax = ( ($1 > $tmax) ? $tmax); } else{ $tmin = ( ($1 < $tmin) ? $1 : $tmin); $tmax = ( ($2 > $tmax) ? $tmax); if ($line=# /Query\:\s(\d+).* (\d+)$/) { $qmin = ( ($1 < $qmin) ? $1 : $qmin); $qmax = ( ($2 > $qmax) ? $qmax); $ali.=$line; }

<Desc/Clms Page number 66>

$tlen=$tmax-$tmin; $qlen=$qmax-$qmin; if ((!$minus) && ($truepcent ≥ $trueval) && ($tlen>60) && ($tmin≤5)) { print "$qname\n $tname E=$expect $id1/$id2 $pcent +/-:$minus $tmin-$tmax ($tlen) $qmin-$qmax ($qlen)\n $ali\n\n"; } } } } close FS;

<Desc/Clms Page number 67>

REFERENCES Beaucage et al., Tetrahedron Lett 1981,22: 1859-1862 Brown EL, Belagaje R, Ryan MJ, Khorana HG, Methods Enzymol 1979;68:109-151 GAIT (ed.), (1984). Nucleic Acid Hybridization.

GLOVER (ed.), 1985. DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and Il Oligonucleotide Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.

HAMES and HIGGINS, 1985. Nucleic Acid Hybridization : a practical approach, Hames & Higgins Ed. IRL Press, Oxford.

Narang SA, Hsiung HM, Brousseau R, Methods Enzymol 1979;68;90-98# Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers,and David J. Lipman (1990), Basic local alignment search tool ,. J.Mol.Biol.215-. 403- 10.

Claverie J. M. & David J. States (1993), Information Enhancement Methods for Large Scale Sequence Analysis,Computers and Chemistry 17 : Programme xblast.c; site web, http://blast.wustl.edu/pub/xblast/ Wall et al., Programming Perl By Larry Wall, Tom Christiansen & Randal L.

Schwartz ; Second Edition, September 1996., 670 pages.

Programme blast.linux.tar.Z Version 07/2001 , ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/exec utables/

Claims (23)

REVENDICATIONS 1. Procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer une collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, selon les étapes de préparation suivantes : a1) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences nucléotidiques d'origine humaine, dont l'ensemble des séquences recouvrent au moins une fois la totalité du génome humain, les séquences comprenant au moins une copie d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4, puis (ii) créer une première collection de séquences nucléotidiques à partir de chaque séquence précédemment sélectionnée, chaque séquence nucléotidique contenue dans ladite première collection étant constituée, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', de la séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4, suivie des 285 nucléotides consécutifs localisés, dans chaque séquence sélectionnée en (i), immédiatement du côté 3' du dernier nucléotide en 3' de ladite séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4 ; a2) (i) pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans ladite première collection créée à l'étape a1), éliminer la séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4 localisée à l'extémité 5' de ladite séquence nucléotidique et (ii) créer une seconde collection de séquences contenant toutes les séquences modifiées en (i), chacune des séquences contenues dans ladite seconde collection constituant une sonde ; a3) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), de la présence d'au moins une copie d'une séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4, puis (ii) élimination, dans ladite seconde collection, des <Desc/Clms Page number 69> séquences comprenant au moins une copie de l'une des séquences SEQ ID N 1,2, 3 ou 4, grâce à quoi une troisième collection de séquences, ne comprenant pas les séquences ainsi éliminées, est créée ; a4) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la troisième collection de séquences créée à l'étape a3), de chaque enchaînement de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type Alu ou de type répété susceptible d'être contenu dans ladite séquence nucléotidique, puis (ii) modification des séquences comprenant un tel enchaînement de nucléotides, par masquage desdits enchaînements de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type Alu ou de type répété par remplacement de chaque nucléotide A, T, G ou C contenu dans ladite séquence Alu ou répétée par un nucléotide N signifiant indifféremment A, T, G ou C, puis (iii) créer une quatrième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences contenues dans la troisième collection, éventuellement modifiées selon (ii) ; a5) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences contenant des séquences nucléotidiques consistant en des produits de transcription du génome humain, les séquences comprenant au moins l'une des séquences nucléotidiques contenues dans la quatrième collection de séquences créée à l'étape a4), puis (ii) créer une cinquième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences sélectionnées en (i) ; a6) (i) Sélectionner, dans la cinquième collection de séquences créée à l'étape a5), les séquences comprenant au moins 60 nucléotides consécutifs définissant un enchaînement ayant au moins 97% d'identité en nucléotides avec un enchaînement nucléotidique inclus dans au moins l'une des sondes contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), puis (ii) créer une sixième collection de séquences nucléotidiques contenant les séquences ainsi sélectionnées, <Desc/Clms Page number 70> ladite sixième collection de séquences consistant en la collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation ; b) synthétiser une collection de sondes nucléotidiques hybridant spécifiquement avec le produit de transcription d'au moins un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, ledit gène comprenant une séquence nucléotidique contenue dans la sixième collection de séquences préparée à l'étape a6), ladite collection de sondes ainsi synthétisées consistant en l'ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
1. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape c) suivante : c) immobiliser chacune des sondes nucléotidiques synthétisées à l'étape b) sur un support.
2. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques son immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.
3. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur ledit support sous la forme d'une matrice ordonnée de sondes.
4. 5. Ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit ensemble de moyens comprend, pour chaque acide nucléique dont la présence est recherchée, au moins une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec ledit acide nucléique, ledit ensemble de moyens étant préparé par le procédé selon la revendication 1.

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5. 6. Ensemble de moyens selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence de la ou de sondes nucléotidiques a une longueur d'au moins 20 nucléotides.
6. 7. Ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont marquées par une molécule détectable.
7. 8. Ensemble de moyens selon la revendication 7, caractérisé en ce que la ou les sondes sont marquées par une molécule radioactive, par une molécule fluorescente ou par une molécule chimioluminescente.
8. 9. Ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur un support.
9. 10. Ensemble de moyens selon la revendication 9, caractérisé en ce que les sondes sont immobilisées sur le support de manière ordonnée.
10. 11. Ensemble de moyens selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la ou les sondes immobilisées sur le support forme une matrice ordonnée.
11. 12. Dispositif de détection de la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce ledit dispositif comprend au moins une sonde nucléotidique ou une pluralité de sondes nucléotidiques préparées par le procédé selon la revendication 1, la ou les sondes nucléotidiques étant immobilisées sur un support.
12. 13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que la pluralité de sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.

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13. 15. Utilisation d'une sonde ou d'une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies dans l'une des revendications 1 à 4, pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
14. 16. Procédé pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 11, ou un dispositif selon l'une des revendications 12 ou 13, avec un échantillon à tester ; b) détecter les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou dans ledit dispositif et les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon.
15. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine l'identité de la ou des sondes nucléotidiques qui ont hybridé avec le ou les acides nucléiques présents dans l'échantillon.
16. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que, à l'étape b), ont détermine les rapports quantitatifs des différents acides nucléiques contenus dans l'échantillon et qui ont hybridé avec les sondes nucléotidiques.
17. 19. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine l'identité du ou des sondes nucléotidiques ayant hybridé avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
18. 20. Procédé selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain.

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19. 21. Procédé selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ADNc obtenus par transcription inverse d'ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain 22. Procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 11 ou un dispositif selon l'une des revendications 12 ou

    13 avec ledit échantillon ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques comprises dans l'ensemble de moyens ou dans le dispositif qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
20. 23. Procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) réaliser le procédé selon l'une des revendications 16 à 21 avec ledit échantillon ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
21. 24. Kit ou nécessaire pour la réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 11 ou un dispositif selon l'une des revendications 12 ou 13.

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22. 25. Kit ou nécessaire selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les réactifs nécessaires pour effectuer la réaction d'hybridation entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif.
23. 26. Kit ou nécessaire selon l'une des revendications 24 ou 25, caractérisé en qu'il comprend en outre des moyens destinés à révéler les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif et les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.