WO2004072222A2 - Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l’inflammation, et applications - Google Patents

Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l’inflammation, et applications Download PDF

Info

Publication number
WO2004072222A2
WO2004072222A2 PCT/FR2004/050047 FR2004050047W WO2004072222A2 WO 2004072222 A2 WO2004072222 A2 WO 2004072222A2 FR 2004050047 W FR2004050047 W FR 2004050047W WO 2004072222 A2 WO2004072222 A2 WO 2004072222A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleotide
sequences
collection
sequence
sample
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/050047
Other languages
English (en)
Other versions
WO2004072222A3 (fr
Inventor
Philippe Benech
Jean-Philippe Alimi
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority to EP04708383A priority Critical patent/EP1590486A2/fr
Publication of WO2004072222A2 publication Critical patent/WO2004072222A2/fr
Publication of WO2004072222A3 publication Critical patent/WO2004072222A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules

Definitions

  • the present invention relates to a method and tools for detecting inducible genes by inflammation mediators capable of determining the precise physiological situation of an individual in whom an inflammatory condition is suspected or diagnosed.
  • the inflammatory reaction is one of the most common modes of response in the body to aggression.
  • the induction of inflammation can be caused in particular by a bacterial, viral or fungal infection, by the development of cancerous tumors, by physical or chemical trauma or even during tissue necrosis.
  • soluble mediators in particular soluble mediators produced by neutrophils, monocytes / macrophages, lymphocytes, mast cells and platelets, these soluble mediators of inflammation. being commonly designated "cytokines”, among which mention may be made of alpha, beta or gamma interferons, TNF alpha or interleukin-6.
  • the Japanese company TaKaRa Biomedicals markets a DNA chip on which are immobilized approximately 240 fragments of cDNA, with a length of approximately 300 bases each, derived from genes encoding cytokines, such as the genes encoding TNF, interleukin 1 alpha, interleukin 16, “Platelet Derived Growth Factor beta” or “PDGF-beta”, or gamma interferon.
  • this DNA chip essentially contains cDNAs derived from genes encoding many other proteins not specifically linked to inflammation, such as prolactin, the tumor protein p53, integrins, the oncogene GRO2, the activator of the protein.
  • the complementary diagnostic assistance tools available today are very incomplete because the cDNAs immobilized on these DNA chips are not representative of the multiple physiological situations that can be encountered during the triggering of an inflammatory reaction of a given type, in an individual.
  • the present invention relates to a method for preparing a set of means for detecting, in a body sample previously collected from an individual, the expression or level of expression of genes inducible by an inflammation mediator. It also relates to a set of detection means prepared by said method, comprising a collection of specific nucleotide probes.
  • the invention also relates to a device for detecting the expression, or the level of expression of genes inducible by an inflammation mediator.
  • the invention also relates to the use of a probe or of a plurality of nucleotide probes as defined above, for detecting the presence, in a sample, of one or of a plurality of acids ( s) nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of an inducible gene by a mediator of inflammation.
  • a probe or of a plurality of nucleotide probes as defined above, for detecting the presence, in a sample, of one or of a plurality of acids ( s) nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of an inducible gene by a mediator of inflammation.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence, in a sample, of one or a plurality of nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of a gene inducible by an inflammation mediator, characterized in that said method comprises the following steps: a) bringing into contact a set of detection means as defined above or a device as defined above, with a sample to be tested; b) detecting the hybrids formed between the nucleotide probe (s) contained in said set of means or in said device and the nucleic acids possibly present in the sample.
  • the invention also relates to a method for producing an expression profile of inducible genes by an inflammation mediator from a sample containing the messenger RNAs synthesized by the cells of a human or non-human mammal. , or cDNAs obtained from said messenger RNAs, characterized in that it comprises the following steps: a) contacting a set of detection means as defined above or a device as defined above with said sample; c) Determine the identity of the nucleotide probes included in the set of means or in the device which are hybridized with the nucleic acids contained in the sample.
  • kits or kits suitable for implementing the above methods are also forming part of the invention.
  • sample is meant according to the invention a material resulting, directly or indirectly, from the removal of a tissue fragment or an aliquot of biological fluid from a human or non-human mammal whose physiological situation is to be specified. vis-à-vis a possible inflammatory reaction.
  • the initial sample can be the result of a biopsy performed in the individual, or a sample of a biological fluid such as a blood, saliva, tears, urine sample, etc.
  • the sample also includes a medium containing the cellular messenger RNAs extracted from a biopsy or from a sample of biological fluid.
  • the sample can also be a medium containing cDNAs obtained from messenger RNAs previously extracted from the biopsy or from the removal of the biological fluid.
  • nucleic acid nucleoid, etc.
  • any conventional technique of molecular biology, microbiology and recombinant DNA known to those skilled in the art can be used. Such techniques are described for example by SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES and HIGGINS (1984) and AUSUBEL et al. (1994).
  • nucleic acid means a bonuleoside deoxy, a ribonucleoside, a deoxyribonucleotide polymer, a hbonucleotide polymer, either in the form of a single-stranded molecule or of a double-stranded molecule, including RNA, DNA or a hybrid RNA / DNA molecule.
  • nucleic acid embraces unnatural analogs of natural nucleotides.
  • nucleotide designates both natural nucleotides (A, T, G, C) as well as modified nucleotides which comprise at least one modification such as (i) a purine analog, (ii) a analog of a pyrimidine, or (iii) a similar sugar, such modified nucleotides being described for example in PCT application No. WO 95/04064.
  • nucleic acid include RNA, DNA, cDNA or even RNA / DNA hybrid sequences of more than one nucleotide, in single strand form or in double strand form.
  • a nucleic acid “resulting directly” from the transcription of a determined gene essentially includes the messenger RNA (s) synthesized during the transcription step of said gene.
  • a nucleic acid "resulting indirectly" from the transcription of a determined gene essentially includes a cDNA obtained by the reverse transcription of a messenger RNA synthesized during the step of transcription of said gene.
  • reverse transcription of messenger RNA is carried out in the presence of a reverse transcriptase enzyme.
  • a gene "inducible by an inflammation mediator” consists of a gene whose transcription step or translation step is modified under the action of an inflammation mediator. Primarily, this expression encompasses genes whose transcription is activated by the action of an inflammation mediator. However, it also includes genes whose transcription is inhibited or blocked by an inflammation mediator.
  • inflammation mediator within the meaning of the invention, is meant a cytokine produced by the cells during the initiation or the development of an inflammatory reaction, local or systemic, in a human or non-human mammal.
  • Mediators of inflammation include:
  • Cytokines having a biological activity of increasing capillary permeability such as histamine, bradykinin, C3a, C5a, LTC4, LTD4, PGE2, prostaglandins, factor XII, the kiniogenic factor;
  • cytokines having a biological vasoconstriction activity such as Thromboxane A2, leukotrienes C and D;
  • Cytokines having a biological activity of increasing the adhesiveness of phagocytes to endothelial cells such as interleukin-1, TNF- ⁇ or LTB4;
  • Cytokines having a biological activity of inducing or activating the proliferation of medullary stem cells, such as interleukin-1 and C3c;
  • cytokines having a biological activity of cellular chemotaxis such as C5a, LTB4, interleukin-8, PAF (for the “Platelet Agregating Factor”), histamine, laminin, collagen fragments, lymphocyte factors, chemotactic factors;
  • Cytokines having the biological activity of release of lysosomal intragranular mediators, such as C5a, interleukin-8, PAF;
  • Cytokines having the biological activity of increasing the production of oxygen radicals, such as C5a, TNF- ⁇ , PAF, interleukin-8, interferon- ⁇ (gamma);
  • Cytokines having the biological activity of increasing phagocytosis such as C3b, the Fc part of IgG, interferon- ⁇ , fibronectin;
  • cytokines having a biological activity of formation of inflammatory granulomas, such as interferon- ⁇ , TNF- ⁇ and interleukin-1;
  • - pyrogenic cytokines such as PGE2, interleukin-1 and TNF- ⁇
  • - type I interferon cytokines such as interferon- ⁇ , interferon- ⁇ and interferon- ⁇ and type 11 interferon cytokines, such as interferon- ⁇
  • type 11 interferon cytokines such as interferon- ⁇
  • cytokines such as interleukin-1, interleukin-2, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-7, Interleukin-8, Interleukin-9, Interleukin-10, Interleukin-12, Interleukin-13, Interleukin-15, Interleukin-17 or TNF- ⁇ .
  • the "inflammation mediators” capable of inducing the genes selected according to the invention mainly include the type I and type II interferons defined above, TNF- ⁇ , IL-1, l 'IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL -13, IL-15, angiotensin, LIF, CNTF, PDGF, erythropoietin, GCSF, GMCSF, growth hormone, oncostatin, prolactin and thrombopoietin.
  • the present invention provides a method for preparing a set of means making it possible to detect the presence, in a sample, of nucleic acids resulting, directly or indirectly, from the transcription of one or more genes inducible by an inflammation mediator.
  • mediators of inflammation As previously stated, the initiation and development of an inflammatory reaction in an individual is accompanied by the release of various soluble factors by the cells, called mediators of inflammation. Through a cascade reaction, the mediators of inflammation thus released will induce or stimulate the expression of other genes by cells, some of which are already known.
  • Such detection is therefore likely to supplement a prior clinical diagnosis, without this detection, in itself, is not an essential step in a process for diagnosing an inflammatory condition in an individual.
  • the applicant has shown according to the invention that the genes inducible by an inflammation mediator have common nucleic sequence characteristics.
  • sequence of certain genes inducible by an inflammation mediator obligatorily contain a sequence corresponding to the original definition of a first nucleotide consensus motif designated "ISRE / IRF-E” or “ISRE”, or a sequence corresponding to the original definition of a second nucleotide consensus motif designated “IWRM”, the original sequence characteristics of which are described in detail in the present description.
  • the work carried out by the inventors made it possible to define, for the first time, said consensus nucleotide patterns “ISRE” and “IWRM”, which made it possible to develop, according to the invention, a process for the preparation of '' a set of means for detecting the expression, or level of expression, of genes inducible by an inflammation mediator.
  • the person skilled in the art therefore has the basic means enabling him to manufacture nucleotide probes specific for genes inducible by an inflammation mediator.
  • genes inducible by an inflammation mediator consist of genes inducible by at least one inflammation mediator.
  • ISRE insulin receptor RI
  • IFN- ⁇ type I interferons
  • IFN- ⁇ type II interferons
  • IL-6 type II interferons
  • the “IWRM” motif is in particular characteristic of genes inducible by type II interferons (IFN- ⁇ ), and has contributed to highlighting a response of the genes containing the “GIRE” motif to IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, angiotensin, LIF, CNTF, PDGF, erythropoietin, GCSF, GMCSF, growth hormone, oncostatin, prolactin and thrombopoietin.
  • IFN- ⁇ type II interferons
  • each "N” represents, independently of one another, a nucleotide chosen from A, T (or U), G, or C and "x2" is an integer equal to 2 or 3.
  • - (ii) genes which comprise, in their sequence, a nucleotide consensus motif designated "IWRM", "which can be characterized according to the invention by the following sequences:
  • the subject of the invention is a method for the preparation of a set of means for detecting the presence, in a sample, of one or a plurality of nucleic acid (s), each resulting nucleic acid, directly or indirectly, from the transcription of a gene inducible by an inflammation mediator, characterized in that said method comprises the following steps: a) preparing a collection of nucleic acids contained in genes inducible by a mediator of l inflammation, according to the following preparation steps: ai) (i) Select, from one or more collections of nucleotide sequences of human origin, all of the sequences of which cover at least once the entire human genome, the sequences comprising at least one copy of a sequence chosen from sequences SEQ ID No.
  • step a2) for each of the nucleotide sequences contained in said first collection created in step ai), eliminate the sequence SEQ ID No. 1, 2, 3 or 4 located at the 5 'end of said nucleotide sequence and ( ii) create a second collection of sequences containing all the sequences modified in (i), each of the sequences contained in said second collection constituting a "probe";
  • a3) (i) Search, for each of the nucleotide sequences contained in the second collection of sequences created in step a2), of the presence of at least one copy of a sequence SEQ ID No. 1, 2, 3 or 4, then (ii) elimination, in said second collection, of sequences comprising at least one copy of one of the sequences SEQ ID No. 1, 2, 3 or 4, whereby a third collection of sequences, not comprising the sequences thus eliminated, is created;
  • a4) (i) Search, for each of the nucleotide sequences contained in the third collection of sequences created in step a3), of each sequence of nucleotides corresponding to a nucleotide sequence of “Alu” type or of “repeated” type capable of be contained in said nucleotide sequence, then (ii) modification of the sequences comprising such a sequence of nucleotides, by masking said sequences of nucleotides corresponding to a nucleotide sequence of “Alu” type or of “repeat” type by replacement of each nucleotide A , T, G or C contained in said “Alu” or “repeated” sequence with a nucleotide “N” meaning indifferently A, T, G or C, then (iii) create a fourth collection of sequences containing all the sequences contained in the third collection, possibly modified according to (ii); a5) (i) Select, from one or more collections of sequences containing nucleot
  • a6) (i) Select, in the fifth collection of sequences created in step a5), the sequences comprising at least 60 consecutive nucleotides defining a sequence having at least 97% nucleotide identity with a nucleotide sequence included in at least one of the “probes” contained in the second collection of sequences created in step a2), then (ii) creating a sixth collection of nucleotide sequences containing the sequences thus selected, said sixth collection of sequences consisting of the collection of nucleic acids contained in genes inducible by an inflammation mediator;
  • step a) of the above method Six collections of sequences have been designated in step a) of the above method, essentially for the sake of clarity in understanding the method. According to a first embodiment, the six collections of sequences can concretely consist of six distinct collections of sequences.
  • a single collection of sequences is created, the content of which in sequences is modified as each of the steps ai) to a6) is carried out.
  • less than six collections of sequences are created, only some of them being created specifically during the performance of one or more of the steps ai) to a6) of the method, the others collections designated in the process each resulting at a given stage of the process, from a simple modification of the content in sequences of a collection created in the previous stage.
  • the collection of detection means that it makes it possible to prepare comprises, for each gene inducible by an inflammation mediator, several probes hybridizing specifically with the latter.
  • the collection of detection means comprises, on average, at least two, preferably three, and quite preferably at least four probes which hybridize specifically with each gene inducible by a mediator of the 'inflammation.
  • the method described above is characterized in that it further comprises the following step c): c) immobilizing each of the nucleotide probes synthesized in step b) on a support.
  • the above method is characterized in that the nucleotide probes are immobilized in an orderly manner on said support.
  • the above method is characterized in that the nucleotide probes are immobilized on said support in the form of an ordered array of probes.
  • the person skilled in the art is able, by simple routine operations, to synthesize the probes hybridizing specifically with the expression products of said inducible genes by a mediator of the inflammation, these probes constituting a set of detection means according to the invention, which is defined later in the description.
  • Step a) of the method is advantageously carried out using a computer program, said computer program containing all of the instructions necessary to control a computer, in the memory of which it is loaded, the execution of all the sub-steps of step a) of the process.
  • step a) of the method by executing the instructions of a computer program
  • the person skilled in the art may refer to the basic software tools for programming and for searching and comparing. of nucleotide sequences described for example by AltschuI et al. (1990), Claverie et al. (1993), Wall et al. (1996), as well as the “xblast.c” and “blast.linux” software tools, the reference of which is given at the end of this description.
  • Step a) of the method of the invention is described in detail below, and express reference is made to each of the modules of the computer program capable of performing each of the substeps ai) to a6) of the method.
  • said computer program advantageously comprises a central module, called a "master program”, which includes the necessary instructions the execution of subroutines, called “modules”, each of its subroutines containing the instructions necessary for the execution of each of the sub-steps ai) to a6) of the method.
  • master program allowing the realization of step a) of the method for human genomic sequences which contain the first nucleotide consensus motif "ISRE".
  • a person skilled in the art is able to easily adapt this example of a master program for human genomic sequences containing the second nucleotide consensus motif "IWRM", by replacing in the program the structural characteristics of the "ISRE” motif with the structural characteristics of the “IWRM” motif which have been detailed previously in the present description.
  • IWRM in the form of a regular expression within a complete genome (in this case the draft of the human genome, UCSC version of June 13, 2001, http: //genome.ucsc. edu /) with an offset window of +1 followed by a sequence of 285 nucleotides (called "Electronic” Probe) directly downstream of each pattern found.
  • Step a2) corresponding to the pg2.pl program module
  • This step consists of eliminating, from the file resulting from the first step, each pattern found and keeping the adjacent Electronic Probe (so as to exclude a localization of the consensus patterns on a transcribed sequence).
  • Step a3) corresponding to the pq3.pl program module
  • each of the Electronic Probes is tested for the possible presence of a second or more identical patterns in downstream of the first. Only Electronic Probes that do not contain it are kept.
  • the complementary sense and reverse pattern are successively sought.
  • Step a4) filtering step corresponding to the modules pq4 160.pl and pg4 15.pl, respectively
  • each Electronic Probe against this bank is carried out by a program called Blastn (1) by successively setting two values to the parameter E (Expect Value) of the blastn program, respectively 10th-160 and 10th-15.
  • This parameter, E-Value (Expect Value) of the Blastn program measures, after searching in a database, the number of alignments that could be due to chance. Consequently, the smaller this value, that is to say close to zero, the more significant the result obtained.
  • the values set for this parameter successively 10e-160 and 10e-15, are intended to retain only the long alignments and the short alignments that are statistically significant.
  • Step a5) corresponding to the program module pg5.pl
  • the file resulting from step a4) (containing the electronic sequences in which the repeated sequences have been masked) is used by the Blastall program (5) against a bank of transcripts composed of the following files:
  • Hs.fna.gz file (origin: ftp://ftp.ncbi.nih.goV/refseg/H sapiens / mRNA Prot /) retrieved 24-07-2002.
  • blastn program parameters used correspond to those defined by default.
  • Step a6) corresponding to the pg6.pl module
  • the result file from step a5) was processed in order to select the significant homologies between the Electronic Probe and its transcript according to the following criteria:
  • the length of the homology between the Electronic Probe and the homologous transcript is defined as a variable in the program (it was set to a value strictly greater than 60 nucleotides in this algorithm). This value was chosen on the one hand because it corresponds statistically to the size of an exon.
  • the patterns sought (those responsible for early induction by cytokines) being predominantly located 100 nucleotides upstream from the transcription initiation site, it is highly likely that the alignment between the 285 nucleotides of the probe electronics and the first 300 nucleotides of transcripts covers a region of at least 60 nucleotides.
  • the program In order to consider only the alignments starting at the start of the transcript (higher probability of being in the presence of the region immediately downstream of the initiation of the transcription), the program only selected the cases where the 60 nucleotides of the 300 nucleotides of the transcribed sequences are located at the 5 'end. Ideally, alignment begins at the first nucleotide of the 60 nucleotides. However, the program allowed alignment to begin within a window of 1 to 5 nucleotides from the 5 'end of the transcript (the value of 5 means preventing sequencing errors).
  • a collection of nucleotide probes is synthesized specifically hybridizing with the transcript of at least one gene inducible by a mediator. inflammation, said transcript comprising a nucleotide sequence contained in the sixth collection of sequences prepared in step a6), said collection of probes thus synthesized consisting of the set of means for detecting the presence, in a sample; one or more nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of an inducible gene by an inflammation mediator.
  • nucleotide probe within the meaning of the invention, is meant a polynucleotide which hybridizes specifically to a nucleic acid contained in a sample, this nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of a determined gene, said specific gene being inducible by an inflammation mediator.
  • a nucleotide probe of the invention does not hybridize with any other nucleic acid also contained in the same sample, under appropriate stringency conditions used for the hybridization reaction, which are preferably conditions of high stringency.
  • hybridization conditions within the meaning of the invention, is understood the following hybridization conditions:
  • Prehybridization same conditions as for hybridization duration: 1 night.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
  • Tm is defined by the relation:
  • Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) +16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - (600 / number of bases) (SAMBROOK et al., (1989) , pages 9.54-9.62).
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the hybridization temperature is approximately 5 to 30 ° C, preferably 5 to 10 ° C below Tm.
  • hybridization conditions described above are used for the hybridization of a nucleic acid 20 bases in length and can be adapted as a function of the length of the nucleic acid whose hybridization is sought or of the type chosen marking, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or even in the work of AUSUBEL et al. (1989).
  • the level and the specificity of hybridization depends on various parameters, such as: a) the purity of the preparation of the nucleic acid on which the probe or the primer is to hybridize; b) the base composition of the probe or of the primer, the base pairs GC having a greater thermal stability than the base pairs A-T or AU; c) the length of the homologous base sequence between the probe or the primer and the nucleic acid; d) ionic strength: the rate of hybridization increases with increasing ionic strength and the duration of the incubation time; e) the incubation temperature; f) the concentration of the nucleic acid on which the probe or the primer is to hybridize; g) the presence of denaturing agents, such as agents promoting the breaking of hydrogen bonds, such as formamide or urea, which increase the stringency of the hybridization; h) the incubation time, the incubation rate increasing with the duration of the incubation; i) the presence of bulk exclusion agents, such as de
  • a nucleotide probe according to the invention has a nucleotide sequence exactly complementary to the targeted target sequence.
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is paired with the base complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary bases are A and T (or A and U), and C and G.
  • a nucleotide probe according to the invention is a nucleotide probe specifically hybridizing, under high stringency hybridization conditions, with the nucleotide sequence of a messenger RNA, or of the corresponding cDNA, which is the product of the transcription of a gene inducible by an inflammation mediator of the invention.
  • a nucleotide probe of the invention is at least 20 nucleotides in length and can reach a length of several kilobases, for example up to 6 kilobases, the maximum size of the probe being limited by the size of the targeted target sequence.
  • a probe nucleotide according to the invention has a length ranging from 20 to 500 bases in length, preferably from 20 to 250 bases in length.
  • a nucleotide probe according to the invention can comprise 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 7100, 800, 900, 1000, 2000, 3000 or 4000 bases in length, the maximum size of the probe being limited by the size of the target nucleic acid targeted.
  • nucleotide probe in general, can be defined by the following formula:
  • - Ls is the length in bases of the probe
  • - x is an integer equal to or greater than 20, and x is equal to or less than the base length (La) of the target nucleic acid targeted, resulting directly or indirectly from the transcription of an inducible gene by a mediator of l 'inflammation.
  • a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the phosphodiester method of NARANG et al. (1979) or BROWN et al. (1979), the diethylphosphoramidit.es method of BEAUCAGE et al. (1980) or the solid support technique described in European patent N ⁇ P 0 707 592.
  • Each of the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention are included in a single cDNA obtained by reverse transcription of the messenger RNAs constituting a transcription product of a gene inducible by a mediator of inflammation.
  • Each of the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention can therefore only be found in the sequence of a determined gene, or is complementary to a messenger RNA which is not produced only from this unique gene.
  • nucleotide probe which hybridizes with a determined gene whose expression is inducible by a mediator of inflammation
  • a person skilled in the art can synthesize a polynucleotide whose sequence is identical to a sequence of at least 20 consecutive nucleotides of the cDNA corresponding to this gene, or a polynucleotide complementary to a sequence of at least minus 20 consecutive nucleotides of a messenger RNA produced by this gene.
  • the size of the target sequence will depend on the size sought for the nucleotide probe, within the limits specified above.
  • a person skilled in the art can search for the complete mRNA or cDNA sequence of the single gene comprising one of the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of invention according to the following steps:
  • step (iii) select, in the complete sequence selected in step (ii), the sequence of the polynucleotide to be synthesized to manufacture the nucleotide probe
  • a person skilled in the art can synthesize at least one nucleotide primer specific for a single gene, from the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention, then use this primer to produce a complete cDNA from a single messenger RNA with which said primer hybridizes, under the appropriate hybridization conditions, preferably high stringency hybridization conditions.
  • the hybridization step, then the extension of the primer can be carried out by a person skilled in the art according to techniques conventional, by prior extraction of messenger RNAs present in human or non-human mammalian cells, in primary culture or in cell line, then contacting the specific primer under the appropriate hybridization conditions, then elongation of the primer in the presence of reverse transcriptase.
  • nucleotide primer having undergone the elongation described above can then be directly used as a specific probe.
  • the nucleotide primer having undergone the elongation described above can serve as a starting product for the manufacture of the final specific probe, for example by the action of xonucleases, or also by the action of endonucleases of restriction, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • a person skilled in the art can synthesize at least one nucleotide primer specific for a single gene, from the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention, then use this primer to produce complete cDNA from a collection of clones comprising vectors into which cDNAs originating from human or non-human mammal cells are inserted, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the complete cDNA thus generated can then be directly used as a specific probe.
  • the complete cDNA can serve as a starting product for the manufacture of the final specific probe, for example by the action of xonucleases, or also by the action of restriction endonucleases, according to techniques well known in the art. skilled in the art.
  • the subject of the invention is a set of means for detecting the presence, in a sample, of one or a plurality of nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from transcription a gene inducible by an inflammation mediator, characterized in that said set of means comprises, for each nucleic acid whose presence is sought, at least one nucleotide probe hybridizing specifically with said nucleic acid, said set of means being prepared by the process which has been described in detail in the present description.
  • the sixth collection of sequences which consists of the collection of nucleic acids contained in genes inducible by an inflammation mediator, comprises unique sequences contained in genes which had, in the prior art, been more or less less characterized, from the point of view of their function. Thus, we can distinguish according to that for each of these genes:
  • said gene possessed at least one function known in at least one physiological field other than inflammation
  • the set of detection means of the invention comprises at least one probe which hybridizes specifically with a gene belonging
  • said set of detection means comprises at least one probe hybridizing with a gene comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID N ° 5 to SEQ ID N ° 10.
  • the nucleotide sequences SEQ ID N ° 5 to SEQ ID N ° 10 are illustrated in particular by way of example and each consist of a single sequence found in the sequence of a gene of known function, said gene, or its expression products, which have not previously been described as genes whose expression is modified in an individual developing an inflammatory reaction.
  • Said set of detection means can comprise probes each hybridizing specifically with a single one from 1, 2, 3, 4, 5 or 6 of the genes defined by each of the sequences SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 10.
  • said set of detection means comprises at least one probe hybridizing with a gene comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID N ° 11 to SEQ ID N ° 25.
  • the nucleotide sequences SEQ ID N ° 11 to SEQ ID N ° 25 are illustrated in particular in the example and each consist of a unique sequence found in the sequence of a previously unknown function gene.
  • Said set of detection means can comprise probes each hybridizing specifically with a single one from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 of the genes defined by each of the sequences SEQ ID No. 11 to SEQ ID No. 25.
  • said set of detection means comprises at least one probe hybridizing with a gene comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 5 to SEQ ID No. 10 and at least one probe s hybridizing with a gene comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 11 to SEQ ID No. 25.
  • the set of means according to the invention is characterized in that the nucleotide probe or probes are chosen from polynucleotides having at least 20 consecutive nucleotides of the sequences contained in the sixth collection of sequences created at step a6) of the method of the invention, or at least 20 consecutive nucleotides of the sequences complementary to the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention.
  • the set of means according to the invention is characterized in that the nucleotide probe or probes are chosen from the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of invention, or a sequence complementary to the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention, or among the sequences complementary to the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6 ) of the process of the invention.
  • the set of detection means according to the invention is characterized in that each nucleotide probe consists of a polynucleotide included in the sequence of a messenger RNA or of a cDNA corresponding to a gene inducible by an inflammation mediator, which gene comprises a sequence contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention, or in that each nucleotide probe consists of a polynucleotide whose sequence is complementary to that of a polynucleotide included in the sequence of a messenger RNA or of a cDNA corresponding to a gene inducible by an inflammation mediator, which gene comprises a sequence contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention
  • the set of means according to the invention comprises at least one nucleotide probe chosen from the nucleotide probes as defined above.
  • the set of means according to the invention comprises all of the nucleotide probes as defined above.
  • the set of means more includes their probes which hybridize specifically with a determined nucleic acid, resulting, directly or indirectly, from the transcription of a nductible gene by an inflammation mediator.
  • the set of means comprises several nucleotide probes hybridizing with the same target sequence, the number of nucleotide probes of identical sequences can vary from 2 to 10 probes .
  • the set of means of the invention allows a quantitative measurement of the target nucleic acid contained in the sample tested.
  • the set of means comprises several nucleotide probes hybridizing with distinct target sequences included in said nucleic acid, the number of probes possibly varying from 2 to 10 probes.
  • the set of means allows a high detection sensitivity, because of its capacity to detect said target nucleic acid in the test sample, even in the case where said target nucleic acid has undergone physical alterations in the sample, such as cuts by exo- or endonucleases present in the starting source material, for example in a cell extract, or present in the sample to be tested.
  • the set of detection means according to the invention comprises, for a determined target nucleic acid, several nucleotide probes hybridizing specifically with the latter, as described for the probes s' hybridizing with nucleic acids comprising a sequence chosen from the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention, or a sequence complementary to the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention.
  • nucleic acids comprising the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention have common structural characteristics, which are representative of nucleic acids derived from genes inducible by an inflammation mediator .
  • the set of detection means of the invention comprises at least 10, 20, 30, 40, 50, 50, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 nucleotide probes as defined above.
  • the total number of probes contained in the set of detection means of the invention depends first of all on the number of distinct target nucleic acids, each corresponding to a transcription product of a gene inducible by a mediator of inflammation, which one seeks to detect in the sample.
  • the total minimum number of probes contained in the set of detection means of the invention is defined by the following formula:
  • - y represents the number of distinct target nucleic acids that one seeks to detect.
  • the total number of nucleotide probes contained in the set of detection means of the invention also depends on the number of identical nucleotide probes hybridizing with the same target sequence included in a determined nucleic acid which one seeks to detect and also depends on the number of probes hybridizing with distinct target sequences included in said target nucleic acid.
  • the number of probes contained in the set of detection means of the invention can also be expressed according to the following formula:
  • NtotaF [ ⁇ (aa1.A1ai) + (aa2.A1 a2 ) + ... + (any.A1 ay )] + [(ab1.A2 a2 ) + (ab2.A2 a2 ) + ... + (abny. A2 ay )] + ... + [(ax1.AX aX ) + (ax2.A1 a2 ) + ... + (axny.AX ay )]], in which:
  • A1, A2, ..., AX represent the nucleic acids corresponding to the transcription products (mRNA or cDNA) of the A1, A2, ..., AX genes inducible by an inflammation mediator;
  • - X is an integer whose maximum value is equal to the total number of sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention
  • A1 a ⁇ , A1 a 2,, A1 an respectively represent the distinct target sequences ai, a2, ..., an, contained in the target nucleic acid A1, for which at least one probe hybridizes specifically;
  • - n is an integer between 0 and 100, and is preferably equal to 0, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;
  • any represent the number of identical probes hybridizing to the same target sequence A1 a - ⁇ , A1 a2 ,, A1 ay , contained in the target nucleic acid A1 and independently represent the one from the other, an integer between 0 and 100, advantageously between 0 and 50, and are preferably equal to 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20;
  • a mandatory condition is that all of the detection means according to the invention contain at least one hybridizing probe. specifically with a nucleic acid comprising a sequence chosen from the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention, or with a nucleic acid comprising a sequence complementary to a sequence chosen from the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention.
  • the set of detection means of the invention comprises at least one probe hybridizing with each of the nucleic acids comprising a sequence chosen from the sequences contained in the sixth collection of sequences created at step a6) of the method of the invention, or comprising a sequence complementary to a sequence chosen from the sequences contained in the sixth collection of sequences created in step a6) of the method of the invention.
  • all of the detection means according to the invention may comprise only some of the above nucleotide probes, depending on the suspected physiological situation of the human or non-human mammal from which the sample originates. to test.
  • the practical implementation of the set of detection means according to the invention may show that only certain subsets of probes will be necessary to obtain an exhaustive result of the precise physiological situation of the human or non-human mammal from which the sample comes. to be tested, according to the symptoms that this individual expresses, or according to the nature of the pre-diagnosis or clinical diagnosis already established, for example because only some of the genes inducible by an inflammation mediator are activated, or on the contrary inhibited or blocked, in a determined pathophysiological situation.
  • Each of the nucleotide probes described above can be labeled, if desired, by incorporating a label detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers may consist of radioactive isotopes ( 32 P, 33 P,, 3 H, 35 S,), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin), chemiluminescent molecules or even ligands such as biotin.
  • the labeling of the probes is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • the nucleotide probes constituting the set of detection means of the invention can be in free form, in suspension in a solution suitable for carrying out the hybridization reaction with the nucleic acids possibly present in the sample to be tested. .
  • Set of means or devices of the invention comprising the probes immobilized on a support ("DNA chips").
  • the set of detection means according to the invention is characterized in that the nucleotide probe or probes contained therein are immobilized on a support.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces of the wells of microtitration plates, polystyrene beads, magnetic beads, nitrocellulose strips, or even microparticles such as latex particles.
  • the probes according to the invention immobilized on a support are ordered in arrays, as in "DNA chips".
  • arrays as in "DNA chips".
  • Such ordered matrices have been described in particular in US Pat. No. 5,143,854, in PCT applications No. WO 90/150 70 and 92/10092.
  • Supporting arrays on which oligonucleotide probes have been immobilized at a high density are for example described in US Pat. Nos. 5,412,087 and in PCT application No. WO 95/11995.
  • the probes contained in the set of detection means of the invention are immobilized on the support in an orderly manner, for example in the form of an array of probes.
  • the position of each separate probe is predetermined and known.
  • the invention also relates to a device for detecting the presence, in a sample, of one or a plurality of nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from transcription of a gene inducible by an inflammation mediator, characterized in that said device comprises at least one nucleotide probe or a plurality of nucleotide probes as defined in the present description, the nucleotide probe or probes being immobilized on a support.
  • the above device is characterized in that the plurality of nucleotide probes are immobilized in an orderly manner on said support.
  • Said support on which the probes constituting the set of detection means according to the invention are immobilized consists of a solid support.
  • the nucleotide probes are fixed to said support, directly or indirectly, by coupling one or more binding molecules ("linkers") to the support, then by coupling each probe to a free part of the binding molecule.
  • the support may be a polymeric material, a glass, a ceramic, natural fibers, a silicone, a metal and composite materials of the materials mentioned above.
  • the support has at least one substantially flat surface.
  • practically flat is meant a surface which is macroscopically planar for optimal fixation of the nucleotide probes, for example in the form of a two-dimensional matrix network.
  • the surface of the solid support can be functionalized with a silane, as described for example in the American patent application published under the number US 2002/20081597 (Lowe et al.).
  • the immobilization support for the probes comprises olefinic groups, either that the olefinic groups are constitutive of the support material, or that they are incorporated into the support material by chemical reactions or by the surface deposition of molecules containing olefinic groups.
  • the olefinic groups can be provided, for example, by fixing them with chlorosilane derivatives, then by oxidizing the olefinic groups to aldehyde.
  • the surface of the support can also be functionalized by thiol groups, as described in US Patent No. US 5,412,087 (McGall et al.).
  • the nucleotide probes are fixed in a non-covalent manner on the surface of the support, as described for example in American patent application No. 2002/20042069 (Myer et al.).
  • the nucleotide probes are linked to the support by weak bonds such as electrostatic interactions, hydrophobic interactions, Van der Waals forces, etc.
  • a set of detection means or a device according to the invention when it is in the form of a "DNA chip", can be prepared according to the techniques described in American patent n ° US 6,403,320 (Read et al.), The PCT application published under the number WO 95/11995 (Chee et al.) Or the PCT application published under the number WO 92/10092 (Fodor et al.).
  • the set of detection means or the device according to the invention can also be in the form of matrices or stacked or “stacked arrays”, as described in the American patent application No. 2002/20051995 (Kumar).
  • the detection of the hybrids formed can be carried out in particular by measuring fluorescence or measuring radioactivity, for example when the nucleic acids contained in the sample have been labeled, according to techniques known per se, either by a fluorescent molecule or by a molecule radioactive, prior to bringing them into contact with the set of detection means or with the detection device according to the invention.
  • the detection of the presence of a probe / nucleic acid hybrid of the sample can also be carried out by measuring the variation of various physical parameters of the support, such as the variation of the temperature, of the wavelength of a light beam, of the conductivity or resistivity of the surface of the support, at the location of the support on which is immobilized a probe which has hybridized with a nucleic acid present in the sample to be tested.
  • the location, on the surface of the support, of each nucleotide probe of known sequence is predetermined.
  • measuring the presence of a probe / nucleic acid hybrid of the sample, at any point on the surface of the support on which the probes are immobilized makes it possible to first determine the different locations of the surface of the support. which the presence of a probe / nucleic acid hybrid of the sample is detected and / or quantified.
  • a comparison of the spatial coordinates in two dimensions (for the two-dimensional ordered matrices) or in three dimensions (for the stacked or “stacked arrays”) with a preset table of correspondence between the different spatial coordinates of the support and the identity of the probe (s) immobilized at these coordinates makes it possible directly to determine the identity of genes inducible by an inflammation mediator which are active (if a hybridization with the corresponding probe (s) is detected) or inactive (if none hybridization with the corresponding probe (s) is not detected).
  • the set of detection means or the detection device as defined above are useful, in general, for detecting the presence of nucleic acids, mainly messenger RNA or cDNA, indicating the level of activation d one or more genes inducible by an inflammation mediator.
  • a subject of the invention is also the use of a probe or of a plurality of nucleotide probes as defined above, for detecting the presence, in a sample, of one or of a plurality of acids ( s) nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of an inducible gene by a mediator of inflammation.
  • a probe or of a plurality of nucleotide probes as defined above, for detecting the presence, in a sample, of one or of a plurality of acids ( s) nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of an inducible gene by a mediator of inflammation.
  • a human or non-human mammal in which an inflammatory reaction, local or systemic is suspected, or in which a local or systemic inflammatory reaction has already been diagnosed, if necessary generalized, such as for example a septic shock or a SIRS.
  • the inflammatory reactions targeted include bacterial infections, whether acute, subacute or chronic.
  • inflammations occurring in neoplastic pathologies including malignant lymphomas, visceral neoplasias (kidney cancers, cancers of the digestive system, lung cancers).
  • inflammations occurring during systemic diseases such as chronic inflammatory rheumatism (e.g.
  • rheumatoid arthritis e.g., systemic lupus erythematosus
  • vasculitis e.g. Horton's disease or gnarly peri-ertheritis.
  • cardiovascular disease e.g, deep vein thrombosis
  • inflammatory disease e.g, Crohn's disease.
  • various iatrogenic inflammatory reactions caused by side effects induced by drug therapy, such as example the induction of inflammatory side effects by the active antibiotic or anti-epileptic principles.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence, in a sample, of one or a plurality of nucleic acid (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of a gene inducible by an inflammation mediator, characterized in that said method comprises the following steps: a) bringing a set of detection means or a detection device according to the invention into contact with a sample to be tested; b) detecting the hybrids formed between the nucleotide probe (s) contained in said set of means or in said device and the nucleic acids possibly present in the sample.
  • the above method is characterized in that, in step b), the identity of the nucleotide probe (s) which have hybridized with the nucleic acid (s) present in the sample is determined.
  • the above method is characterized in that, in step b), have determined the quantitative ratios of the different nucleic acids contained in the sample and which have hybridized with the nucleotide probes.
  • the above method is characterized in that, in step b), the identity of the nucleotide probe or probes having hybridized with the nucleic acids contained in the sample is determined.
  • the above method is characterized in that the nucleic acids contained in the sample are messenger RNAs synthesized by a human or non-human mammalian cell.
  • the above method is characterized in that the nucleic acids contained in the sample are cDNAs obtained by reverse transcription of messenger RNA synthesized by a human or non-human mammalian cell
  • a main utility of the set of detection means or of the device according to the invention is that it makes it possible to produce a profile of expression of inducible genes by an inflammation mediator, from a sample from an individual to be tested.
  • the invention also relates to a method for producing an expression profile of inducible genes by an inflammation mediator from a sample containing the messenger RNAs synthesized by the cells of a human or non-human mammal. , or cDNAs obtained from said messenger RNAs, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing a set of means or a device according to the invention into contact with said sample; c) Determine the identity of the nucleotide probes included in the set of means or in the device which are hybridized with the nucleic acids contained in the sample.
  • the invention also relates to a method for producing an expression profile of inducible genes by an inflammation mediator from a sample containing the messenger RNAs synthesized by the cells of a human or non-human mammal, or cDNAs obtained from said messenger RNAs, characterized in that it comprises the following steps: a) carrying out the method for detecting the presence, in a sample, of one or more nucleic acid (s) (s), each nucleic acid resulting, directly or indirectly, from the transcription of an inducible gene by an inflammation mediator with said sample, as defined above; c) Determine the identity of the nucleotide probes which are hybridized with the nucleic acids contained in the sample.
  • s nucleic acid
  • the set of results obtained is likely to account for the evolution of the physiological or pathophysiological situation of the individual tested, over time.
  • regular monitoring of the development or reduction of an inflammatory reaction or disease may be performed for a given individual.
  • the drug treatment can be adapted more finely, more rigorously and more precisely than with current investigative tools.
  • the implementation of a set of detection means or of a detection device according to the invention makes it possible to determine the minimum combinatorial required to bring out a lymphocyte population capable of producing a particular type of '', to characterize in detail the responses of helper lymphocytes ("helper") which control inflammatory immunity (Th1 and Th2 lymphocytes), identify the appropriate conditions to suppress the immune response (eg in the case of diseases allergic and parasitic).
  • helper lymphocytes helper lymphocytes
  • Th1 and Th2 lymphocytes helper lymphocytes
  • identify the appropriate conditions to suppress the immune response eg in the case of diseases allergic and parasitic.
  • the implementation of a set of detection means or of a detection device according to the invention allows the evaluation of the effects induced by type I interferons which are commonly used as therapeutic molecules in the treatment of diseases such as cancer, viral hepatitis and multiple sclerosis. Their use has in fact been limited due to the severe side effects, which can however be, to a certain extent, predicted by a precise study of the anti-viral and immunomodulatory properties, the more effectively the more we have the means to identify. the factors responsible for these side effects.
  • the set of detection means and the detection device which are the subject of the present invention constitute one of the possible means of identifying the factors responsible for the aforementioned side effects.
  • the development of a tolerance to the immunoregulatory effect during a daily treatment may require a therapeutic intervention spaced over time.
  • the implementation of a set of detection means or a detection device according to the invention allows the clinician to quickly establish the optimal dose of drug as well as the frequency of treatment for a given individual. .
  • the use of stem cells in order to regenerate differentiated tissues is a therapeutic approach which is being considered more and more seriously.
  • One of the main obstacles lies in the characterization of the combination of factors making it possible to control the passage from the stem cell to a well-defined mature cell.
  • Currently, several scientific teams are working on the development of culture media containing the molecules necessary for the development of differentiated cells of a given tissue type.
  • the implementation of a set of detection means or of a detection device according to the invention makes it possible to identify the appropriate combination or combinations of specific growth factors, which allow the activation of the expression of suitable genes, markers of differentiation into a given cell type.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the production of an expression profile of inducible genes by an inflammation mediator from a sample containing the messenger RNAs synthesized by the cells of a human mammal. or non-human, or cDNAs obtained from said messenger RNAs, characterized in that it comprises a set of means or a device according to the invention.
  • the kit or kit as defined above further comprises the reagents necessary to carry out the hybridization reaction between the nucleotide probe (s) contained in said set of means or contained in said device.
  • the kit or kit as defined above further comprises means intended to reveal the hybrids formed between the nucleotide probe or probes contained in said set of means or contained in said device and the nucleic acids contained in the 'sample.
  • Example 1 Detailed description of 21 genes inducible by an inflammation mediator according to the invention from which the probes constituting the detection means according to the invention are produced.
  • Each nucleotide sequence representative of a gene inducible by an inflammation mediator referenced below in the present description consists of a cDNA obtained from a messenger RNA resulting from the transcription of an inducible gene by a mediator of l 'inflammation according to the invention.
  • Each nucleotide sequence below is contained in the sequence of the corresponding complete gene, said complete gene comprising in its sequence an “ISRE” motif as defined above.
  • the cDNA sequences were classified according to each chromosome containing the corresponding gene.
  • the cDNA sequences For each chromosome, the cDNA sequences have been classified according to whether they are found on the strand (+) or on the strand (-) of the DNA of the chromosome considered.
  • the sequences For each strand (+) or (-) of a chromosome, the sequences have been classified according to whether they are oriented in the “sense” direction or in the “antisense” direction. For each strand of a determined chromosome, the sequences have been numbered as the Nth occurrence of the “ISRE” motif considered in the sequence of said strand (+) or (-) of said chromosome.
  • each sequence also includes the abbreviated name of at least one electronic sequence database in which said sequence is listed:
  • each sequence also includes the access number [identifier number] of the sequence in at least one of the sequence databases above.
  • each sequence includes various annotations such as the DNA clones from which the sequence originates and the name of the protein for which this sequence codes.
  • PINK1 PINK1
  • PINK1 PINK1
  • PINK1 PTEN induced putative kinase 1
  • PINK1 PINK1
  • PINK1 PTEN induced putative kinase 1
  • SPATA1 Homo sapiens spermatogenesis associated 1
  • XM_043407 Homo sapiens splicing factor, arginine / serine-rich 3 (SFRS3), mRNA.
  • IHUMSRP20 Homo sapiens SR protein family, pre-mRNA splicing factor (SRp20) mRNA, complete cds
  • EPSTI1 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1), mRNA
  • EPSTI1 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1), mRNA
  • guanine nucleotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA. > 0NM_021629 Homo sapiens guanine nucleotide binding protein beta subunit 4
  • Homo sapiens cDNA F J11028 is, clone P ACE1004128, highly similar to GUANINE NUCLEOTIDE-BINDING PROTEIN BETA SUBUNIT 4
  • XM_054554 Homo sapiens hypothetical gene supported by AB033071; AB051480; AK000726; NM_015383 (LOC113657), mRNA.
  • X _054260 Homo sapiens similar to KIAA1693 protein; hypothetical protein FLJ20719 (H. sapiens) (LOC91631), mRNA.
  • KIAA0317 Homo sapiens KIAA0317 gene product (KIAA0317), mRNA.
  • FLJ11896 FLJ11896
  • E 4th- 65 128/129 99 + / -. 0 1-129 (128) 157-285 (128)
  • Sbjct 1 caattatagattaaaaatatcagaagcatttccagattattcttaaaagttgatgagatc 60
  • $ j i; open (F, $ ARGV [0])
  • ISRE_PLUS select (ISRE_PLUS); open (ISRE_PLUS, “>isre_plus”); print ISRE_PLUS “$ seq1 ⁇ n"; select (ISRE_MOINS); open (ISRE_MOINS, ">isrejnoins”); print ISRE_MOINS “$ seq2 ⁇ n”; V. Module "pg4 160.p1"
  • Module "pg5.p1" system "blastall -p blastn -d tc_bank -a2 -i chr1_alu2-> filejesultat '
  • Tmax $ -1e10
  • $ lmin (($ 2 ⁇ $ tmin)? $ 2: $ tmin);
  • $ tmax (($ 1> $ tmax)? $ 1: $ tmax); ⁇ else ⁇
  • $ tmin (($ 1 ⁇ $ tmin)? $ 1: $ lmin);

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé et à des outils de détection de gènes inductibles par des médiateurs de l'inflammation, susceptibles de déterminer la situation physiologique précise d'un individu chez lequel on suspecte ou chez lequel on a diagnostiqué un état inflammatoire.

Description

Procédé pour préparer une collection de moyens de détection de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, et applications
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte à un procédé et à des outils de détection de gènes inductibles par des médiateurs de l'inflammation, susceptibles de déterminer la situation physiologique précise d'un individu chez lequel on suspecte ou chez lequel on a diagnostiqué un état inflammatoire.
ART ANTERIEUR
La réaction inflammatoire est un des modes de réponse les plus fréquents de l'organisme face à une agression. L'induction d'une inflammation peut être notamment provoquée par une infection bactérienne, virale ou fongique, par le développement de tumeurs cancéreuses, par des traumatismes physiques ou chimiques ou encore lors d'une nécrose tissulaire.
L'induction d'un état inflammatoire s'accompagne de la libération de nombreux médiateurs solubles, notamment des médiateurs solubles produits par les polynucléaires neutrophiles, les monocytes/macrophages, les lymphocytes, les mastocytes et les plaquettes, ces médiateurs solubles de l'inflammation étant communément désignés « cytokines », parmi lesquelles on peut citer les interférons alpha, bêta ou gamma, le TNF alpha ou encore l'interleukine- 6.
Aujourd'hui, le diagnostic clinique d'un état inflammatoire est principalement réalisé par une observation de différents symptômes retrouvés systématiquement dans des pathologies bien répertoriées, comme par exemple le rhumatisme inflammatoire chronique, ces symptômes pouvant le cas échéant être facilement identifiés, comme par exemple dans le cas d'une pneumopathie aiguë récente. Et lorsque les causes du syndrome inflammatoire ne peuvent être directement déterminées, on recherche des indices cliniques additionnels permettant d'orienter un éventuel diagnostic, indices additionnels qui ne sont pas nécessairement accessibles au diagnostic conventionnel.
Pour compléter le diagnostic conventionnel décrit ci-dessus, il serait possible de procéder à la détection de la présence de l'expression et/ou du niveau de l'expression de certains gènes connus pour être activés lors du développement d'une inflammation, comme certains médiateurs de l'inflammation cités précédemment.
Toutefois, à la connaissance du demandeur, il n'existe aujourd'hui aucun dispositif spécifique permettant de détecter la présence de l'expression et/ou du niveau de l'expression de gènes codant des médiateurs de l'inflammation.
La Société japonaise TaKaRa Biomedicals commercialise une puce à ADN sur laquelle sont immobilisés environ 240 fragments d'ADNc, d'une longueur d'environ 300 bases chacun, dérivés de gènes codant des cytokines, telles que les gènes codant le TNF, l'interleukine 1 alpha, l'interleukine 16, le « Platelet Derived Growth Factor beta » ou « PDGF-beta », ou l'interféron gamma. Toutefois, cette puce à ADN contient essentiellement des ADNc dérivés de gènes codant de nombreuses autres protéines non liées spécifiquement à l'inflammation, telles que la prolactine, la protéine tumorale p53, des intégrines, l'oncogène GRO2, l'activateur de la protéine RAS p21 , la protéine ribosomale S5, des protéines se fixant à la chromatine, la protéine homologue de MutY de E. Coli, la cycline A2, et de nombreuses enzymes appartenant à diverses classes telles que des réductases, des deshydrogénases etc.
Les outils complémentaires d'aide au diagnostic disponibles aujourd'hui sont très incomplets car les ADNc immobilisés sur ces puces à ADN ne sont pas représentatifs des multiples situations physiologiques qui peuvent être rencontrées lors du déclenchement d'une réaction inflammatoire d'un type donné, chez un individu.
Il existe donc un besoin, dans l'état de la technique, pour des outils permettant une détection plus précise de la situation physiologique d'un individu donné, chez lequel on suspecte l'occurrence d'une réaction inflammatoire, ou chez lequel a déjà été diagnostiqué un état inflammatoire, qu'il soit local ou systémique. SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention est relative à un procédé pour préparer un ensemble de moyens permettant la détection, dans un échantillon corporel préalablement collecté chez un individu, de l'expression ou du niveau de l'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation. Elle est aussi relative à un ensemble de moyens de détection préparé par ledit procédé, comprenant une collection de sondes nucléotidiques spécifiques..
L'invention concerne aussi un dispositif de détection de l'expression, ou du niveau d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.
L'invention a également trait à l'utilisation d'une sonde ou d'une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus, pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
L'invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens de détection tels que définis ci-dessus ou un dispositif tel que défini ci-dessus, avec un échantillon à tester ; b) détecter les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou dans ledit dispositif et les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon.
L'invention est également relative à un procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens de détection tels que définis ci-dessus ou un dispositif tel que défini ci-dessus avec ledit échantillon ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques comprises dans l'ensemble de moyens ou dans le dispositif qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
Font également partie de l'invention des kits ou nécessaires adaptés pour la mise en oeuvre des procédés ci-dessus.
Définitions générales
Echantillon
Par « échantillon », on entend selon l'invention un matériel résultant, directement ou indirectement, du prélèvement d'un fragment de tissu ou d'une fraction aliquote de fluide biologique chez un mammifère humain ou non humain dont on veut préciser la situation physiologique vis-à-vis d'une éventuelle réaction inflammatoire. L'échantillon initial peut être le résultat d'une biopsie pratiquée chez l'individu, ou d'un prélèvement d'un fluide biologique comme un prélèvement de sang, de salive, de larmes, d'urine, etc. L'échantillon englobe aussi un milieu contenant les ARN messagers cellulaires extraits à partir d'une biopsie ou d'un prélèvement de fluide biologique. L'échantillon peut être aussi un milieu contenant des ADNc obtenus à partir des ARN messagers préalablement extraits à partir de la biopsie ou du prélèvement du fluide biologique.
Acide nucléique, nucléoiide, etc.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984) et AUSUBEL et al. (1994) .
Selon l'invention, on entend par « acide nucléique » un désoxy bonuléoside, un ribonucléoside, un polymère de désoxyribonucléotides, un polymère de hbonucléotides, indifféremment sous la forme d'une molécule simple brin ou d'une molécule double brin, y compris un ARN, un ADN ou une molécule hybride ARN/ADN. Le terme « acide nucléique » englobe les analogues non naturels des nucléotides naturels.
Ainsi, le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N°WO 95/04064.
Les termes " acide nucléique ", "polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme double brin.
Selon l'invention, un acide nucléique « résultant directement » de la transcription d'un gène déterminé englobe essentiellement le ou les ARN messagers synthétisés durant l'étape de transcription dudit gène.
Selon l'invention, un acide nucléique « résultant indirectement » de la transcription d'un gène déterminé englobe essentiellement un ADNc obtenu par la transcription inverse d'un ARN messager synthétisé durant l'étape de transcription dudit gène. En général, la transcription inverse de l'ARN messager est réalisée en présence d'une enzyme transcriptase inverse.
Gène inductible par un médiateur de l'inflammation
Selon l'invention, un gène « inductible par un médiateur de l'inflammation » consiste en un gène dont l'étape de transcription ou l'étape de traduction est modifiée sous l'action d'un médiateur de l'inflammation. Principalement, cette expression englobe les gènes dont la transcription est activée sous l'action d'un médiateur de l'inflammation. Toutefois, elle englobe aussi les gènes dont la transcription est inhibée ou bloquée par un médiateur de l'inflammation.
Par « médiateur de l'inflammation », au sens de l'invention, on entend une cytokine produite par les cellules lors de l'initiation ou du développement d'une réaction inflammatoire, locale ou systèmique, chez un mammifère humain ou non humain. Les médiateurs de l'inflammation englobent :
- les cytokines ayant une activité biologique d'augmentation de la perméabilité capillaire, telles que l'histamine, la bradykinine, le C3a, le C5a, la LTC4, la LTD4, la PGE2, les prostaglandines, facteur XII, le facteur kiniogénique ;
- les cytokines ayant une activité biologique de vasoconstriction, telles que le Thromboxane A2, les leucotriènes C et D ;
- les cytokines ayant une activité biologique d'augmentation de l'adhésivité des phagocytes aux cellules endothéliales, telles que l'interleukine-1 , le TNF-α ou le LTB4 ;
- les cytokines ayant une activité biologique d'induction ou d'activation de la prolifération des cellules souches médullaires, telles que l'interleukine-1 et le C3c ;
- les cytokines ayant une activité biologique de chimiotactisme cellulaire, telles que le C5a, le LTB4, l'interleukine-8, le PAF (pour le « Platelet Agregating Factor »), l'histamine, la laminine, les fragments de collagène, les facteurs lymphocytaires, les facteurs chimiotactiques ;
- les cytokines ayant l'activité biologique de relargage des médiateurs lysosomiaux intra-granulaires, telles que le C5a, l'interleukine-8, le PAF ;
- les cytokines ayant l'activité biologique d'augmentation de la production de radicaux oxygénés, telles que le C5a, le TNF-α, le PAF, l'interleukine-8, l'interféron-γ (gamma) ;
- les cytokines ayant l'activité biologique d'augmentation de la phagocytose, telles que le C3b, la partie Fc des IgG, l'interféron-τ, la fibronectine ;
- les cytokines ayant une activité biologique de formation de granulomes inflammatoires, telles que l'interféron-γ, le TNF-α et l'interleukine-1 ;
- les cytokines pyrogéniques, telles que le PGE2, l'interleukine-1 et le TNF-α ; - les cytokines interférons de type I, tels que l'interféron-α, l'interféron-β et l'interféron-ω et les cytokines interférons de type 11, tel que l'interféron-γ ;
- d'autres cytokines, telles que l'interleukine-1 , l'interleukine-2, l'interleukine-3, l'interleukine-4, l'interleukine-5, l'interleukine-6, l'interleukine-7, l'interleukine-8, l'interleukine-9, l'interleukine-10, l'interleukine-12, l'interleukine-13, l'interleukine-15, l'interleukine-17 ou encore le TNF-α.
De préférence, les « médiateurs de l'inflammation » capables d'induire les gènes sélectionnés selon l'invention englobent principalement les interférons de type I et de type II définis ci-dessus, le TNF-α , l'IL-1 , l'IL-2, l'IL-3, l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6, l'IL-9, l'IL-10, l'IL-12, l'IL-13, l'IL-15, l'angiotensine, le LIF, le CNTF, le PDGF, l'éerythropoïétine, le GCSF, le GMCSF, l'hormone de croissance, l'oncostatine, la prolactine et la thrombopïétine.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention fournit un procédé pour préparer un ensemble de moyens permettant de détecter la présence, dans un échantillon, d'acides nucléiques résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un ou plusieurs gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.
Comme indiqué précédemment, l'initiation et le développement d'une réaction inflammatoire chez un individu est accompagnée de la libération de divers facteurs solubles par les cellules, appelés médiateurs de l'inflammation. Par une réaction en cascade, les médiateurs de l'inflammation ainsi libérés vont induire ou stimuler l'expression d'autres gènes par les cellules, dont certains sont déjà connus.
La détection de l'expression et/ou du niveau de l'expression de ces gènes inductibles par les divers médiateurs de l'inflammation permettrait donc la détermination de l'état d'activation d'un ensemble de marqueurs associés à l'existence d'une réaction inflammatoire chez l'individu.
Une telle détection est en conséquence susceptible de compléter un diagnostic clinique préalable, sans que cette détection, en elle-même, ne constitue une étape essentielle d'un procédé de diagnostic d'un état inflammatoire chez un individu.
Le demandeur a montré selon l'invention que les gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation possédaient des caractéristiques de séquence nucléique communes.
Plus précisément, il est montré selon l'invention que la séquence de certains gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation contiennent de manière obligatoire une séquence répondant à la définition originale d'un premier motif consensus nucléotidique désigné « ISRE/IRF-E » ou « ISRE », ou une séquence répondant à la définition originale d'un second motif consensus nucléotidique désigné « GIRE », dont les caractéristiques originales de séquence sont décrites en détail dans la présente description.
Les travaux réalisés par les inventeurs ont permis de définir, pour la première fois, lesdits motifs nucléotidiques consensus « ISRE » et « GIRE », ce qui a rendu possible la mise au point, selon l'invention, d'un procédé de préparation d'un ensemble de moyens de détection de l'expression, ou du niveau d'expression, de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.
Grâce à l'invention l'homme du métier dispose donc des moyens de base lui permettant de fabriquer des sondes nucléotidiques spécifiques de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.
L'utilisation de ces sondes nucléotidiques spécifiques, dans des réactions d'hybridation avec des acides nucléiques contenus dans un échantillon, rend désormais accessible à l'homme du métier la détermination fine de la situation physiologique d'un individu, à l'instant du prélèvement d'un échantillon corporel à partir de cet individu, chez lequel est déjà suspectée ou déjà diagnostiquée une réaction inflammatoire quelconque, qu'il s'agisse d'une réaction inflammatoire locale ou généralisée, le cas échéant d'un syndrome inflammatoire systèmique connu sous le nom de SIRS.
Procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens de détection de l'invention.
Gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation selon l'invention Le demandeur a montré selon l'invention que les gènes qui possèdent, dans leur séquence, un motif consensus nucléotidique « ISRE » ou un motif consensus nucléotidique « GIRE », motifs dont la structure est définie en détail ci-dessous, consistaient en des gènes inductibles par au moins un médiateur de l'inflammation.
Plus spécifiquement, le demandeur a montré que le motif «ISRE » est en particulier caractéristique des gènes inductibles par les interférons de type I (IFN-α, IFN-β et IFN-ω) et les interférons de type II (IFN-γ), ainsi que l'IL-6 et la combinaison TNF + IFN-γ.
Plus spécifiquement, le demandeur a montré que le motif «GIRE » est en particulier caractéristique des gènes inductibles par les interférons de type II (IFN-γ), et a contribué à mettre en évidence une réponse des gènes contenant le motif « GIRE » à l'IL-1 , l'IL-2, l'IL-3, l'IL-4, l'IL-5, l'IL- 6, l'IL-9, l'IL-10, l'IL-12, l'IL-13, l'IL-15, l'angiotensine, le LIF, le CNTF, le PDGF, éerythropoïétine, le GCSF, le GMCSF, l'hormone de croissance, l'oncostatine, la prolactine et la thrombopïétine.
Le demandeur a ainsi montré selon l'invention que les gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation sont définis respectivement comme les gènes possédant dans leur séquence les caractéristiques structurales suivantes :
- (i) les gènes qui comprennent, dans leur séquence, un motif consensus nucléotidique désigné « ISRE/IRF-E » ou encore «ISRE », qui est caractérisé, selon l'invention, par les séquences suivantes : (i-1 ) la séquence SEQ ID N°1 suivante « 5'-NNNGAA[N]x GAAACN- 3' » (séquence sens), dans laquelle chaque « N » représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U), G, ou C et «x1 » est un entier égal à 2 ou 3 ; et (i-2) la séquence SEQ ID N°2 suivante «5'- NGTTTC[N]x2TTCNNN -3'» (séquence antisens), dans laquelle chaque « N » représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U), G, ou C et « x2 » est un entier égal à 2 ou 3. - (ii) les gènes qui comprennent, dans leur séquence, un motif consensus nucléotidique désigné «GIRE », », qui peut être caractérisé selon l'invention par les séquences suivantes :
(ii-1) la séquence SEQ ID N°3 suivante « 5'-ATTTC[N]yιGAAA-3' » (séquence sens), dans laquelle chaque « N » représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U), G, ou C et « y1 » est un entier égal à 3, 4 ou 5. (ii-2) la séquence SEQ ID N° 4 suivante « TTTC[N]y2GAAAT » (séquence antisens), dans laquelle chaque « N » représente, indépendamment l'un de l'autre, un nucléotide choisi parmi A, T(ou U), G, ou C et « y2 » est un entier égal à 3, 4 ou 5.
Procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention.
L'invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer une collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, selon les étapes de préparation suivantes : ai ) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences nucléotidiques d'origine humaine, dont l'ensemble des séquences recouvrent au moins une fois la totalité du génome humain, les séquences comprenant au moins une copie d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à 4, puis (ii) créer une première collection de séquences nucléotidiques à partir de chaque séquence précédemment sélectionnée, chaque séquence nucléotidique contenue dans ladite première collection étant constituée, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', de la séquence SEQ ID N°1 , 2, 3 ou 4, suivie des 285 nucléotides consécutifs localisés, dans chaque séquence sélectionnée en (i), immédiatement du côté 3' du dernier nucléotide en 3' de ladite séquence SEQ ID N° 1 , 2, 3 ou 4 ;
a2) (i) pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans ladite première collection créée à l'étape ai ), éliminer la séquence SEQ ID N°1 , 2, 3 ou 4 localisée à l'extrémité 5' de ladite séquence nucléotidique et (ii) créer une seconde collection de séquences contenant toutes les séquences modifiées en (i), chacune des séquences contenues dans ladite seconde collection constituant une « sonde » ;
a3) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), de la présence d'au moins une copie d'une séquence SEQ ID N° 1 , 2, 3 ou 4, puis (ii) élimination, dans ladite seconde collection, des séquences comprenant au moins une copie de l'une des séquences SEQ ID N° 1 , 2, 3 ou 4, grâce à quoi une troisième collection de séquences, ne comprenant pas les séquences ainsi éliminées, est créée ;
a4) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la troisième collection de séquences créée à l'étape a3), de chaque enchaînement de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type « Alu » ou de type « répété » susceptible d'être contenu dans ladite séquence nucléotidique, puis (ii) modification des séquences comprenant un tel enchaînement de nucléotides, par masquage desdits enchaînements de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type « Alu » ou de type « répété » par remplacement de chaque nucléotide A, T, G ou C contenu dans ladite séquence « Alu » ou « répétée » par un nucléotide « N » signifiant indifféremment A, T, G ou C, puis (iii) créer une quatrième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences contenues dans la troisième collection, éventuellement modifiées selon (ii) ; a5) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences contenant des séquences nucléotidiques consistant en des produits de transcription du génome humain, les séquences comprenant au moins l'une des séquences nucléotidiques contenues dans la quatrième collection de séquences créée à l'étape a4), puis (ii) créer une cinquième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences sélectionnées en (i) ;
a6) (i) Sélectionner, dans la cinquième collection de séquences créée à l'étape a5), les séquences comprenant au moins 60 nucléotides consécutifs définissant un enchaînement ayant au moins 97% d'identité en nucléotides avec un enchaînement nucléotidique inclus dans au moins l'une des « sondes » contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), puis (ii) créer une sixième collection de séquences nucléotidiques contenant les séquences ainsi sélectionnées, ladite sixième collection de séquences consistant en la collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation ;
b) synthétiser une collection de sondes nucléotidiques hybridant spécifiquement avec le produit de transcription d'au moins un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, ledit gène comprenant une séquence nucléotidique contenue dans la sixième collection de séquences préparée à l'étape a6), ladite collection de sondes ainsi synthétisées consistant en l'ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
On a désigné six collections de séquences à l'étape a) du procédé ci-dessus, essentiellement pour des raisons de clarté dans la compréhension du procédé. Selon un premier mode de réalisation, les six collections de séquences peuvent consister concrètement en six collections distinctes de séquences.
Selon un second mode de réalisation, une seule collection de séquences est créée, dont le contenu en séquences est modifié au fur et à mesure de la réalisation de chacune des étapes ai ) à a6) du procédé.
Selon encore un autre mode de réalisation, moins de six collections de séquences sont créées, certaines seulement d'entre elles étant créées spécifiquement au cours de la réalisation de l'une ou de plusieurs des étapes ai ) à a6) du procédé, les autres collections désignées dans le procédé résultant chacune à une étape donnée du procédé, d'une simple modification du contenu en séquences d'une collection créée à l'étape précédente.
Selon un aspect particulier du procédé ci-dessus, la collection de moyens de détection qu'il permet de préparer comprend, pour chaque gène inductible par un médiateur de l'inflammation, plusieurs sondes s'hybridant spécifiquement avec ce dernier.
Avantageusement, selon cet aspect particulier, la collection de moyens de détection comprend, en moyenne, au moins deux, de préférence trois, et de manière tout à fait préférée au moins quatre sondes s'hybridant spécifiquement avec chaque gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
Avantageusement, le procédé décrit ci-dessus est caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape c) suivante : c) immobiliser chacune des sondes nucléotidiques synthétisées à l'étape b) sur un support.
Préférentiellement, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.
Préférentiellement, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur ledit support sous la forme d'une matrice ordonnée de sondes. Ainsi, en utilisant le procédé décrit ci-dessus, l'homme du métier est en mesure, par de simples opérations de routine, de synthétiser les sondes s'hybridant spécifiquement avec les produits d'expression desdits gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, ces sondes constituant un ensemble de moyens de détection selon l'invention, qui est défini plus loin dans la description.
Description détaillée du procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention. Etape a) du procédé
Le procédé décrit de manière détaillée ci-dessous a été réalisé successivement pour les séquences sens et antisens de chacun des motifs ISRE et GIRE, successivement sur le brin plus (+) et le brin moins (-) de chacun des chromosomes humains, et ce pour l'ensemble des séquences nucléotidiques contenues dans le génome humain .
L'étape a) du procédé est avantageusement réalisée à l'aide d'un programme d'ordinateur, ledit programme d'ordinateur contenant l'ensemble des instructions nécessaires pour commander à un ordinateur, dans la mémoire duquel il est chargé, l'exécution de l'ensemble des sous-étapes de l'étape a) du procédé.
De manière générale, pour la réalisation de l'étape a) du procédé en exécutant les instructions d'un programme d'ordinateur, l'homme du métier pourra se référer aux outils logiciels de base pour la programmation et pour la recherche et la comparaison de séquences nucléotidiques décrits par exemple par AltschuI et al. (1990), Claverie et al. (1993), Wall et al. (1996), ainsi qu'aux outils logiciels « xblast.c » et « blast.linux » dont la référence est donnée à la fin de la présente description.
Un exemple illustratif d'un programme d'ordinateur permettant la réalisation de l'étape a) du procédé, rédigé dans les langages Perl (Larry Wall et al., 1996) et C, est spécifié à la fin de la présente description.
L'étape a) du procédé de l'invention est décrite en détails ci- dessous, et il est fait expressément référence à chacun des modules du programme d'ordinateur susceptible de réaliser chacune des sous- étapes ai ) à a6) du procédé. Dans le mode de réalisation du procédé dans lequel l'étape a) est réalisée à l'aide d'un programme d'ordinateur, ledit programme d'ordinateur comprend avantageusement un module central, appelé « programme maître », qui comprend les instructions nécessaires à l'exécution de sous-programmes, appelés « modules », chacun de ses sous-programmes contenant les instructions nécessaires à l'exécution de chacune des sous-étapes ai) à a6) du procédé. Dans la présente description , il est décrit le programme maître permettant la réalisation de l'étape a) du procédé pour les séquences génomiques humaines qui contiennent le motif premier consensus nucléotidique « ISRE ». L'homme du métier est à même d'adapter aisément cet exemple de programme maître pour les séquences génomiques humaines contenant le second motif consensus nucléotidique « GIRE », en remplaçant dans le programme les caractéristiques structurales du motif « ISRE » par les caractéristiques structurales du motif « GIRE » qui ont été détaillées précédemment dans la présente description.
Etape ai ) correspondant au module de programme pq1.pl
Rechercher et récupérer successivement le motif consensus ISRE puis GIRE sous forme d'une expression régulière au sein d'un génome complet (en l'occurrence le draft du génome humain, Version UCSC du 13 juin 2001 , http://genome.ucsc.edu/) avec une fenêtre de décalage de +1 suivi d'une séquence de 285 nucléotides (appelée « Sonde » Electronique) directement en aval de chaque motif trouvé.
Etape a2) correspondant au module de programme pg2.pl
Cette étape consiste à éliminer, à partir du fichier résultant de la première étape, chaque motif trouvé et à conserver la Sonde Electronique adjacente (de façon à exclure une localisation des motifs consensus sur une séquence transcrite).
Etape a3) correspondant au module de programme pq3.pl
A cette étape, chacune des Sondes Electroniques est testée pour la présence éventuelle d'un second ou plusieurs motifs identiques en aval du premier. Seules les Sondes Electroniques qui ne le contiennent pas sont conservées.
Le motif sens et reverse complémentaire (antisens) sont successivement recherchés.
Etape a4), étape de filtrage correspondant aux modules pq4 160.pl et pg4 15.pl, respectivement
A cette étape, on compare chacune des Sondes Electroniques avec une banque constituée de séquences Alu et de Séquences répétées (Fichiers: alu.human et repbase.seq récupérés le 3 Mars 2002 au NCBI). Du fichier repbase.seq a été extrait toutes les séquences "primates" et celles-ci ont été ajoutées au fichier alu.human pour constituer la banque nommée alu+primate_repbase.
La comparaison de chaque Sonde Electronique contre cette banque, alu+primate_repbase, est réalisée par un programme nommé Blastn (1) en fixant successivement deux valeurs au paramètre E (Expect Value) du programme blastn, respectivement 10e-160 et 10e- 15. Ce paramètre, E-Value (Expect Value) du programme Blastn, mesure, après recherche dans une banque de données, le nombre d'alignements qui pourrait être dû au hasard. Par conséquent, plus cette valeur est petite, c'est-à-dire proche de zéro, et plus le résultat obtenu est significatif. Dans cette étape, les valeurs fixées pour ce paramètre, successivement 10e-160 et 10e-15, ont pour but de ne retenir respectivement que les longs alignements et les courts alignements statistiquement significatifs.
Seules les Sondes Electroniques répondant aux critères fixés dans le programme Blastn seront masquées par l'intermédiaire d'un autre programme nommé xblast (2,4) c'est-à-dire que les lettres du langage nucléique (A,T,G,C) seront remplacées par des "N". Cette stratégie permet donc d'éviter que des séquences répétées (constituant une suite de N), présentes dans les sondes électroniques, ne puissent s'aligner à des séquences de transcrits (voir ci-dessous tc_bank-Hs). Les autres Sondes Electroniques resteront non modifiées.
Etape a5) correspondant au module de programme pg5.pl Le fichier résultant de l'étape a4) (contenant les séquences électroniques dans lesquelles les séquences répétées ont été masquées) est utilisé par le programme Blastall (5) contre une banque de transcrits composés des fichiers suivants:
Refseq
Fichier rna.gbk.gz (origine: ftp://ftp.ncbi.nih.gOv/refseq/H sapiens/H sapi ens/RNA/) récupéré le 24-07-2002.
Fichier hs.fna.gz (origine: ftp://ftp.ncbi.nih.goV/refseg/H sapiens/mRNA Prot/) récupéré le 24-07-2002.
Fichier mrna.gbk.gz (ohgine:lovelace. infobiogen.fr dans le répertoire suivant: /db/refseq/REFSEQ/H_sapiens/H_sapiens/mRNA/) récupéré le 24-07-2002.
Fichier rscu.gbff.Z (origine: ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/cumulative/) récupéré le 24-07-2002.
UniGene
Fichier Hs.seq.uniq. z (ohqine:ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/Unigene) récupéré le 24-07-02.
GenBank:
Fichier nt.Z (ohgine:ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/) récupéré le 24-07-
2002;données non redondantes de GenBank, EMBL, DDBJ, PDB.
Les séquences des transcrits ou EST récupérés dans chacune des banques n'ont concerné que les 300 premiers nucléotides. L'ensemble a été rassemblé en un seul fichier appelé tc_Bank-Hs.
Les paramètres du programme blastn utilisés correspondent à ceux définis par défaut.
Etape a6) correspondant au module pg6.pl Le fichier résultat de l'étape a5) a été traité dans le but de sélectionner les homologies significatives entre la Sonde Electronique et son transcrit selon les critères suivants:
- la Sonde Electronique et le transcrit sont dans le même sens c'est- à-dire 5' -> 3'.
- la longueur de l'homologie entre la Sonde Electronique et le transcrit homologue est définie comme une variable dans le programme (elle a été fixée à une valeur strictement supérieure à 60 nucléotides dans cet algorithme). Cette valeur a été choisie d'un part parce qu'elle correspond statistiquement à la taille d'un exon. De plus, les motifs recherchés (ceux responsables de l'induction précoce par les cytokines) étant majoritairement localisés à 100 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription, il est fortement probable que l'alignement entre les 285 nucléotides de la sonde électronique et les 300 premiers nucléotides des transcrits couvre une région d'au moins 60 nucléotides.
- Afin de ne considérer que les alignements commençant au début du transcrit (probabilité plus forte d'être en présence de la région immédiatement en aval de l'initiation de la transcription), le programme n'a retenu que les cas où les 60 nucléotides des 300 nucléotides des séquences transcrites sont localisés à l'extrémité 5'. Idéalement, l'alignement débute au premier nucléotide des 60 nucléotides. Cependant, le programme a permis que l'alignement puisse commencer dans une fenêtre de 1 à 5 nucléotides de l'extrémité 5' du transcrit (la valeur de 5 revient à prévenir les erreurs de séquençage).
- le rapport du nombre d'identité entre la Sonde Electronique et celui du transcrit significativement homologue est aussi une variable dans le programme (fixée ici à 0,970).
Etape b) du procédé
A l'étape b) du procédé, on synthétise une collection de sondes nucléotidiques hybridant spécifiquement avec le produit de transcription d'au moins un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, ledit produit de transcription comprenant une séquence nucléotidique contenue dans la sixième collection de séquences préparée à l'étape a6), ladite collection de sondes ainsi synthétisées consistant en l'ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon; d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
Sonde nucléotidiciue
Par « sonde nucléotidique », au sens de l'invention, on entend un polynucléotide qui s'hybride spécifiquement à un acide nucléique contenu dans un échantillon, cet acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène déterminé, ledit gène déterminé étant inductible par un médiateur de l'inflammation. Une sonde nucléotidique de l'invention ne s'hybride pas avec un quelconque autre acide nucléique également contenu dans le même échantillon, dans des conditions de stringence appropriées utilisées pour la réaction d'hybridation, qui sont de manière préférentielle des conditions de forte stringence.
Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes:
Préhybrida ion: mêmes conditions que pour l'hybridation durée: 1 nuit.
Hybridation:
5 x SSPE (0.9 M NaCI, 50 mM phosphate de sodium pH 11, 5 m M EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB)
100 μg/ml ADN de sperme de saumon
0.1 % SDS durée: 1 nuit. Lavages:
2 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C 1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C 0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C 0.1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation:
Tm= 81 ,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) - 0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en- dessous de Tm.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites sont mises en œuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique de 20 bases de longueur et peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
En particulier, il faut prendre en compte que le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en base de la sonde ou de l'amorce, les paires de bases G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologue entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants, tels que des agents favorisant la rupture de liaisons hydrogène , comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'incubation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume , tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou de l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.
De préférence, une sonde nucléotidique selon l'invention possède une séquence nucléotidique exactement complémentaire à la séquence cible visée. Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Sondes nucléotidiques de l'invention
Une sonde nucléotidique selon l'invention est une sonde nucléotidique hybridant spécifiquement, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence nucléotidique d'un ARN messager, ou de I' ADNc correspondant, qui est le produit de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation de l'invention.
Une sonde nucléotidique de l'invention a au moins 20 nucléotides de longueur et peut atteindre une longueur de plusieurs kilobases, par exemple jusqu'à 6 kilobases, la taille maximale de la sonde étant limitée par la taille de la séquence cible visée. Avantageusement, une sonde nucléotidique selon l'invention a une longueur allant de 20 à 500 bases de longueur, de préférence de 20 à 250 bases de longueur.
Par exemple, une sonde nucléotidique selon l'invention peut comprendre 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 7100, 800, 900, 1000, 2000, 3000 ou 4000 bases de longueur, la taille maximale de la sonde étant limitée par la taille de l'acide nucléique cible visé.
De manière générale, la longueur d'une sonde nucléotidique selon l'invention peut être définie par la formule suivante :
Ls= x dans laquelle :
- Ls est la longueur en bases de la sonde, et
- x est un entier égal ou supérieur à 20, et x est égal ou inférieur à la longueur en bases (La) de l'acide nucléique cible visé, résultant directement ou indirectement de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
Une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode aux diethylphosphoramidit.es de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen NΕP 0 707 592.
Chacune des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention sont incluses dans un ADNc unique obtenu par transcription inverse des ARN messagers constituant un produit de transcription d'un gène inductibles par un médiateur de l'inflammation. Chacune des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention ne peut donc être retrouvée que dans la séquence d'un gène déterminé, ou est complémentaire d'un ARN messager qui n'est produit qu'à partir de ce gène unique.
Pour fabriquer une sonde nucléotidique selon l'invention, qui s'hybride avec un gène déterminé dont l'expression est inductible par un médiateur de l'inflammation, l'homme du métier peut synthétiser un polynucléotide dont la séquence est identique à une séquence d'au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc correspondant à ce gène, ou un polynucléotide complémentaire d'une séquence d'au moins 20 nucléotides consécutifs d'un ARN messager produit par ce gène. La taille de la séquence cible sera fonction de la taille recherchée pour la sonde nucléotidique, dans les limites spécifiées précédemment.
A partir de chacune des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention l'homme du métier peut aisément obtenir l'ARN messager complet ou l'ADNc complet correspondant à un gène unique dont l'expression est inductible par un médiateur de l'inflammation.
Selon une première méthode, l'homme du métier peut rechercher la séquence d'ARNm ou d'ADNc complète du gène unique comprenant l'une des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention selon les étapes suivantes :
(i) réaliser une comparaison entre les séquences contenues dans une ou plusieurs bases de données électroniques de séquences et la séquence de référence contenue dans la sixième collection de séquences de l'invention ;
(ii) sélectionner la ou les séquences répertoriées dans ladite ou lesdites bases de données et qui contiennent ladite séquence de référence ;
(iii) sélectionner, dans la séquence complète sélectionnée à l'étape (ii), la séquence du polynucléotide à synthétiser pour fabriquer la sonde nucléotidique
Selon une seconde méthode, l'homme du métier peut synthétiser au moins une amorce nucléotidique spécifique d'un gène unique, à partir des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, puis utiliser cette amorce pour produire un ADNc complet à partir d'un ARN messager unique avec lequel ladite amorce s'hybride, dans les conditions d'hybridation appropriées, de préférence des conditions d'hybridation de forte stringence. L'étape d'hybridation, puis d'allongement de l'amorce peuvent être réalisées par l'homme du métier selon des techniques conventionnelles, par extraction préalable des ARN messagers présents dans des cellules de mammifère humain ou non humain, en culture primaire ou en lignée cellulaire, puis mise en contact de l'amorce spécifique dans les conditions d'hybridation appropriées, puis allongement de l'amorce en présence d'une transcriptase inverse. L'amorce nucléotidique ayant subi l'allongement décrit ci-dessus peut être alors être directement utilisée comme sonde spécifique. Alternativement, l'amorce nucléotidique ayant subi l'allongement décrit ci-dessus peut servir de produit de départ pour la fabrication de la sonde spécifique finale, par exemple par l'action d'xonucléases, ou encore par l'action d'endonucléases de restriction, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Selon une troisième méthode, l'homme du métier peut synthétiser au moins une amorce nucléotidique spécifique d'un gène unique, à partir des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, puis utiliser cette amorce pour produire un ADNc complet à partir d'une collection de clones comprenant des vecteurs dans lesquels sont insérés des ADNc provenant de cellules de mammifère humain ou non humain, selon des techniques connues de l'homme du métier. L'ADNc complet ainsi généré peut alors être directement utilisé comme sonde spécifique. Alternativement, l'ADNc complet peut servir de produit de départ pour la fabrication de la sonde spécifique finale, par exemple par l'action d'xonucléases, ou encore par l'action d'endonucléases de restriction, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ensemble de moyens et dispositif de détection selon l'invention
L'invention a pour objet un ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit ensemble de moyens comprend, pour chaque acide nucléique dont la présence est recherchée, au moins une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec ledit acide nucléique, ledit ensemble de moyens étant préparé par le procédé qui a été décrit en détail dans la présente description.
La sixième collection de séquences, qui consiste en la collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, comprend des séquences uniques contenues dans des gènes qui avaient, dans l'état de la technique, été plus ou moins caractérisés, du point de vue de leur fonction. Ainsi, on peut distinguer selon que pour chacun de ces gènes :
(i) ledit gène avait déjà été caractérisé comme étant impliqué dans l'inflammation ;
(ii) ledit gène possédait au moins une fonction connue dans au moins un autre domaine physiologique que l'inflammation ;
(iii) ledit gène ne possédait encore aucune fonction connue.
L'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins une sonde s'hybridant spécifiquement avec un gène appartenant
(a) à la catégorie ( ii) ci-dessus des gènes dont l'implication dans une réaction inflammatoi ire n'était pas connue avant la présente invention ou
(b) à la catégorie (i ii) ci-dessus des gènes dont aucune fonction n'avait été identifiée avant l'invention.
Ainsi, selon un premier mode de réalisation préféré d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention, ledit ensemble de moyens de détection comprend au moins une sonde s'hybridant avec un gène comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N° 5 à SEQ ID N° 10. Les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 5 à SEQ ID N° 10 sont illustrées notamment à l'exemplel et consistent chacune en une séquence unique retrouvée dans la séquence d'un gène de fonction connue, ledit gène, ou ses produits d'expression, n'ayant pas été décrits auparavant comme des gènes dont l'expression est modifiée chez un individu développant une réaction inflammatoire. Ledit ensemble de moyens de détection peut comprendre des sondes s'hybridant chacune spécifiquement avec un seul parmi 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 des gènes définis par chacune des séquences SEQ ID N°5 à SEQ ID N°10.
Selon un second mode de réalisation préféré d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention, ledit ensemble de moyens de détection comprend au moins une sonde s'hybridant avec un gène comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N° 11 à SEQ ID N° 25. Les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 11 à SEQ ID N° 25 sont illustrées notamment à l'exemplel et consistent chacune en une séquence unique retrouvée dans la séquence d'un gène de fonction auparavant inconnue. Ledit ensemble de moyens de détection peut comprendre des sondes s'hybridant chacune spécifiquement avec un seul parmi 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15 des gènes définis par chacune des séquences SEQ ID N°11 à SEQ ID N°25.
Selon un troisième mode de réalisation préféré, ledit ensemble de moyens de détection comprend au moins une sonde s'hybridant avec un gène comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N° 5 à SEQ ID N° 10 et au moins une sonde s'hybridant avec un gène comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N° 11 à SEQ ID N° 25.
Selon un quatrième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens selon l'invention est caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les polynucléotides ayant au moins 20 nucléotides consécutifs des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou au moins 20 nucléotides consécutifs des séquences complémentaires aux séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.
Selon un cinquième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens selon l'invention est caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou une séquence complémentaire des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou parmi les séquences complémentaires aux séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.
Selon un sixième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens de détection selon l'invention est caractérisé en ce que chaque sonde nucléotidique consiste en un polynucléotide inclus dans la séquence d'un ARN messager ou d'un ADNc correspondant à un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, lequel gène comprend une séquence contenue dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou en ce que chaque sonde nucléotidique consiste en un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de celle d'un polynucléotide inclus dans la séquence d'un ARN messager ou d'un ADNc correspondant à un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, lequel gène comprend une séquence contenue dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention
L'ensemble de moyens selon l'invention comprend au moins une sonde nucléotidique choisie parmi les sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus. Avantageusement, l'ensemble de moyens selon l'invention comprend la totalité des sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.
Selon un septième mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens comprend plus eurs sondes s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique déterm né, résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène nductible par un médiateur de l'inflammation.
Selon un premier aspect de ce septième mode de réalisation, pour un acide nucléique donné, l'ensemble de moyens comprend plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec la même séquence cible, le nombre de sondes nucléotidiques de séquences identiques pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, l'ensemble de moyens de l'invention permet une mesure quantitative de l'acide nucléique cible contenu dans l'échantillon testé.
Selon un second aspect de ce septième mode de réalisation, pour un acide nucléique donné, l'ensemble de moyens comprend plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec des séquences cibles distinctes incluses dans ledit acide nucléique, le nombre de sondes pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, l'ensemble de moyens permet une grande sensibilité de détection, du fait de sa capacité à détecter ledit acide nucléique cible dans l'échantillon testé, même dans le cas où ledit acide nucléique cible a subi des altérations physiques dans l'échantillon, comme par exemple des coupures par des exo- ou des endo- nucléases présentes dans le matériel source de départ, par exemple dans un extrait cellulaire, ou présentes dans l'échantillon à tester.
De même, selon un mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens de détection selon l'invention comprend, pour un acide nucléique cible déterminé, plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant spécifiquement avec ce dernier, comme cela est décrit pour les sondes s'hybridant avec les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou une séquence complémentaire des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.
Les acides nucléiques comprenant les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention possèdent des caractéristiques structurales communes, qui sont représentatives d'acides nucléiques dérivés de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.
Avantageusement, l'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins 10, 20, 30, 40, 50, 50, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.
De manière générale, le nombre total de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention dépend en premier lieu du nombre d'acides nucléiques cibles distincts, correspondant chacun en un produit de transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, que l'on cherche à détecter dans l'échantillon. Ainsi, le nombre minimum total de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention est défini par la formule suivante :
Nsmin=y, dans laquelle :
- Nsmjn est le nombre minimal de sondes ; et
- y représente le nombre d'acides nucléiques cibles distincts que l'on cherche à détecter.
De plus, le nombre total de sondes nucléotidiques contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention dépend également du nombre de sondes nucléotidiques identiques s'hybridant avec la même séquence cible incluse dans un acide nucléique déterminé que l'on cherche à détecter et dépend aussi du nombre de sondes s'hybridant avec des séquences cibles distinctes incluses dans ledit acide nucléique cible. Ainsi, le nombre de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention peut aussi être exprimé selon la formule suivante :
NtotaF [ï(aa1.A1ai) + (aa2.A1a2) +...+ (any.A1ay)] + [(ab1.A2a2) + (ab2.A2a2) +...+ (abny.A2ay)] +... + [(ax1.AXaX) + (ax2.A1a2) +...+ (axny.AXay)]], dans laquelle :
- N total est le nombre total de sondes ; et
- A1 , A2, ..., AX représentent les acides nucléiques correspondant aux produits de transcription (ARNm ou ADNc) des gènes A1 , A2, ..., AX inductibles par un médiateur de l'inflammation ;
- X est un entier dont la valeur maximale est égale au nombre total de séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention ;
- A1aι , A1a2, , A1an représentent respectivement les séquences cibles distinctes ai , a2,..., an, contenues dans l'acide nucléique cible A1 , pour lesquelles au moins une sonde s'hybride spécifiquement ;
- n est un entier compris entre 0 et 100, et est préférentiellement égal à 0, 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;
- an1 , an2, ..., any représentent le nombre de sondes identiques s'hybridant à la même séquence cible A1a-ι, A1a2, ,A1ay, contenue dans l'acide nucléique cible A1 et représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier compris entre 0 et 100, avantageusement entre 0 et 50, et sont de préférence égaux à 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ;
Une condition obligatoire est que l'ensemble des moyens de détection selon l'invention contienne au moins une sonde s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou avec une acide nucléique comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention..
Plus le nombre de sondes s'hybridant spécifiquement avec des acides nucléiques cibles distincts est grand, plus la précision concernant la situation physiologique des cellules du mammifère humain ou non humain dont proviennent les acides nucléiques de l'échantillon est précise.
Selon un premier mode de réalisation préférentiel, l'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins une sonde s'hybridant avec chacun des acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, l'ensemble des moyens de détection selon l'invention peut comprendre certaines seulement des sondes nucléotidiques ci-dessus, en fonction de la situation physiologique suspectée du mammifère humain ou non humain à partir duquel provient l'échantillon à tester.
La mise en œuvre pratique de l'ensemble de moyens de détection selon l'invention pourra montrer que seulement certains sous- ensembles de sondes seront nécessaires pour obtenir un résultat exhaustif de la situation physiologique précise du mammifère humain ou non humain dont provient l'échantillon à tester, selon les symptômes que cet individu exprime, ou selon la nature du pré-diagnostic ou du diagnostic clinique déjà établi, par exemple parce que seulement certains des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation sont activés, ou au contraire inhibés ou bloqués, dans une situation physiopathologique déterminée. Chacune des sondes nucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marquée, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, , 3H, 35S, ), des molécules fluorescentes (5- bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine), des molécules chimioluminescentes ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'
Les sondes nucléotidiques constitutives de l'ensemble de moyens de détection de l'invention peuvent se présenter sous forme libre, en suspension dans une solution adaptée à la réalisation de la réaction d'hybridation avec les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon à tester.
Ensemble de moyens ou dispositifs de l'invention comprenant les sondes immobilisées sur un support (« puces à ADN »).
De manière tout à fait préférée, l'ensemble de moyens de détection selon l'invention est caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques contenues dans celui-ci sont immobilisées sur un support.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
Selon un mode de réalisation préféré, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support sont ordonnées en matrices, comme dans les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N° 5,143,854, dans les demandes PCT N° WO 90/150 70 et 92/10092. Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucleotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N°5,412,087 et dans la demande PCT N°WO 95/11995.
Selon une mode de réalisation particulièrement avantageux, les sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention sont immobilisées sur le support de manière ordonnée, par exemple sous la forme d'une matrice de sondes.
De manière tout à fait préférée, dans la matrice ordonnée de sondes, la position de chaque sonde distincte est prédéterminée et connue.
L'invention a aussi pour objet un dispositif de détection de la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce ledit dispositif comprend au moins une sonde nucléotidique ou une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies dans la présente description, la ou les sondes nucléotidiques étant immobilisées sur un support.
Selon un premier aspect, le dispositif ci-dessus est caractérisé en ce que la pluralité de sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.
Ledit support sur lequel sont immobilisées les sondes constitutives de l'ensemble de moyens de détection selon l'invention consiste en un support solide. Les sondes nucléotidiques sont fixées sur ledit support, directement ou indirectement, par couplage d'une ou plusieurs molécules de liaison (« linkers ») sur le support, puis par couplage de chaque sonde sur une partie libre de la molécule de liaison. A titre illustratif, mais non limitatif, le support peut être un matériau polymère, un verre, une céramique, des fibres naturelles, un silicone, un métal et des matériaux composites des matériaux précédemment cités. Le support possède au moins une surface pratiquement plate. Par « pratiquement plate », on entend une surface qui est macroscopiquement plane pour une fixation optimale des sondes nucléotidiques, par exemple sous la forme d'un réseau matriciel à deux dimensions. La surface du support solide peut être fonctionnalisée par un silane, comme décrit par exemple dans la demande de brevet américain publiée sous le n° US 2002/20081597 (Lowe et al.).
Elle peut être aussi activée comme décrit dans la demande brevet américain publiée sous le numéro 2002/20076709 (Hevesi et al.). Dans ce cas, le support d'immobilisation des sondes comprend des groupes oléfiniques, soit que les groupes oléfiniques soient constitutifs du matériau support, soit qu'ils sont incorporés au matériau support par des réactions chimiques ou par le dépôt de surface de molécules contenant des groupes oléfiniques. Les groupes oléfiniques peuvent être apportés par exemple en les fixant avec des dérivés chlorosilane, puis en oxydant les groupes oléfiniques en aldéhyde.
La surface du support peut être également fonctionnalisée par des groupes thiols, comme décrit dans le brevet américain n° US 5,412,087 (McGall et al.).
Selon encore un autre mode de réalisation, les sondes nucléotidiques sont fixées de manière non covalent sur la surface du support, comme décrit par exemple dans la demande de brevet américain n° 2002/20042069 (Myer et al.). Par exemple, les sondes nucléotidiques sont liées au support par des liaisons faibles telles, que des interactions électrostatiques, des interactions hydrophobes, des forces de Van der Waals, etc.
De manière générale, un ensemble de moyens de détection ou un dispositif selon l'invention, lorsqu'il se présente sous la forme d'une « puce à ADN », peut être préparé selon les techniques décrites dans le brevet américain n° US 6,403,320 (Read et al.), la demande PCT publiée sous le n° WO 95/11995 (Chee et al.) ou encore la demande PCT publiée sous le n° WO 92/10092 (Fodor et al.).
L'ensemble de moyens de détection ou le dispositif selon l'invention peut également se présenter sous la forme de matrices ou empilées ou « stacked arrays », comme décrit dans la demande de brevet américain n° 2002/20051995 (Kumar).
Pour les moyens mise en oeuvre pour la détection du ou des hybrides formés avec une sonde nucléotidique selon l'invention, immobilisée sur un support, et un acide nucléique contenu dans l'échantillon à tester, l'homme du métier se référera avantageusement aux différents demandes de brevet et brevet cités ci-dessus.
La détection des hybrides formés peut être réalisée notamment par mesure de fluorescence ou mesure de radioactivité, par exemple lorsque les acides nucléiques contenus dans l'échantillon ont été marqués, selon des techniques connues en soi, soit par une molécule fluorescente, soit par une molécule radioactive, préalablement à leur mises en contact avec l'ensemble de moyens de détection ou avec le dispositif de détection selon l'invention.
La détection de la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon peut être également réalisée par mesure de la variation de divers paramètres physiques du support, tels que la variation de la température, de la longueur d'onde d'un faisceau lumineux, de la conductivité ou de la résistivité de la surface du support, à l'endroit du support sur lequel est immobilisée une sonde qui s'est hybridée avec un acide nucléique présent dans l'échantillon à tester.
De manière tout à fait préférée, la localisation, sur la surface du support, de chaque sonde nucléotidique de séquence connue est prédéterminée. Ainsi, la mesure de la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon, en tout point de la surface du support sur lequel les sondes sont immobilisées, permet de déterminer dans un premier temps les différentes localisations de la surface du support auxquelles la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon est détectée et/ou quantifiée. Dans un second temps, une comparaison des coordonnées spatiales en deux dimensions (pour les matrices ordonnées bidensionnelles) ou en trois dimensions (pour le matrices empilées ou « stacked arrays ») avec une table préétablie de correspondance entre les différentes coordonnées spatiales du support et l'identité de la ou des sondes immobilisées à ces coordonnées, permet directement de déterminer l'identité des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation qui sont actifs (si une hybridation avec la ou les sondes correspondantes est détectée) ou inactifs (si aucune hybridation avec la ou les sondes correspondantes n'est détectée). Applications de l'ensemble de moyens de détection et du dispositif de détection selon l'invention
Comme indiqué précédemment, l'ensemble de moyens de détection ou le dispositif de détection tels que définis ci-dessus sont utiles, en général, pour détecter la présence d'acides nucléiques, principalement ARN messagers ou ADNc, indiquant le niveau d'activation d'un ou plusieurs gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus, pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
Selon une telle utilisation, il est désormais possible d'accéder à des données physiopathologiques fines concernant un mammifère humain ou non humain chez lequel on suspecte une réaction inflammatoire, locale ou systèmique, ou chez lequel on a déjà diagnostiqué une réaction inflammatoire locale ou systèmique, le cas échéant généralisée, comme par exemple un choc septique ou un SIRS. Les réactions inflammatoires visées englobent les infections bactériennes, qu'elles soient aiguës, subaiguës ou chroniques. Sont également englobées les inflammations survenant dans les pathologies néoplasiques, y compris les lymphomes malins, les néoplasies viscérales (cancers du rein, cancers de l'appareil digestif, cancers du poumon). Sont également englobées les inflammations survenant au cours de maladies systémiques, tels que le rhumatismes inflammatoires chroniques (p. ex. polyarthrite rhumatoïde), les connectivités auto- immunes (p. ex. lupus érythémateux disséminé), les vascularites (p. ex. la maladie de Horton ou la péri-ertérite noueuse). Sont également englobées les réactions inflammatoires survenant au cours des maladies cardio-vasculaires (p. ex. thromboses veineuses profondes), les maladies inflammatoires (p. ex. la maladie de Crohn). Sont également englobées les diverses réactions inflammatoires iatrogènes provoquées par les effets secondaires induits par les traitements médicamenteux, par exemple l'induction d'effets secondaires inflammatoires par les principes actifs antibiotiques ou anti-épileptiques.
L'invention est également relative à un procédé pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens de détection ou un dispositif de détection selon l'invention, avec un échantillon à tester ; b) détecter les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou dans ledit dispositif et les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon.
Selon un premier aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine l'identité de la ou des sondes nucléotidiques qui ont hybride avec le ou les acides nucléiques présents dans l'échantillon.
Selon un second aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que, à l'étape b), ont détermine les rapports quantitatifs des différents acides nucléiques contenus dans l'échantillon et qui ont hybride avec les sondes nucléotidiques.
Selon un troisième aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine l'identité du ou des sondes nucléotidiques ayant hybride avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
Selon un quatrième aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain.
Selon un cinquième aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé ne ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ADNc obtenus par transcription inverse d'ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain
Une utilité principale de l'ensemble de moyens de détection ou du dispositif selon l'invention est qu'il permet de réaliser un profil de l'expression des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, à partir d'un échantillon provenant d'un individu à tester.
L'invention est aussi relative à un procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens ou un dispositif selon l'invention avec ledit échantillon ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques comprises dans l'ensemble de moyens ou dans le dispositif qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
L'invention concerne aussi un procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) réaliser le procédé de détection de la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation avec ledit échantillon, tel qu'il a été défini précédemment ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
Les résultats obtenus, c'est à dire l'identité des gènes actifs et des gènes non actifs, ainsi que, le cas échéant, le niveau d'activation des gènes actifs, est de nature à rendre compte fidèlement de la situation physiologique ou physiopathologique de l'individu testé, une fois que l'étape essentielle d'un diagnostic clinique a été réalisée.
De plus, lorsque plusieurs profils d'expression sont réalisés à partir d'échantillons prélevés chez le même individu, à différentes périodes de temps, par exemple à des intervalles de temps déterminés, l'ensemble des résultats obtenu est de nature à rendre compte de l'évolution de la situation physiologique ou physiopathologique de l'individu testé, au cours du temps.
Par exemple, un suivi régulier du développement ou de la réduction d'une réaction ou d'une maladie inflammatoire peut être réalisé pour un individu donné.
Notamment, en fonction des résultats obtenus, le traitement médicamenteux peut être adapté plus finement, plus rigoureusement et plus précisément qu'avec les outils d'investigation actuels.
Selon encore un autre aspect, la mise en œuvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention, permet de déterminer la combinatoire minimale requise pour faire émerger une population lymphocytaire capable de produire un type particulier d'anticorps, de caractériser de manière fine les réponses des lymphocytes auxiliaires (« helper ») qui contrôlent l'immunité inflammatoires (lymphocytes Th1 et Th2), identifier les conditions appropriées pour supprimer la réponse immunitaire (p. ex. dans le cas de maladies allergiques et parasitaires).
Selon encore un autre aspect, la mise en œuvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention, permet l'évaluation des effets induits par les interférons de type I qui sont couramment utilisés comme molécules thérapeutiques dans le traitement des maladies tels que les cancers, les hépatites virales et la sclérose en plaque. Leur usage a en effet été limité du fait des effets secondaires sévères, qui peuvent cependant être, dans une certaine mesure, prédits par une étude précise des propriétés anti-virales et immunomodulatrices d'autant plus efficacement qu'on dispose du moyen d'identifier les facteurs responsables de ces effets secondaires. L'ensemble de moyens de détection et le dispositif de détection qui font l'objet de la présente invention constituent l'un des moyens d'identification possible des facteurs responsables des effets secondaires précités.
Les études cliniques basées sur l'utilisation des cytokines en cancérologies, du fait de la complexité des activités biologiques auxiliaires induites, montrent combien une thérapie basée sur un effet de dose-réponse peut ne pas conduite aux résultats thérapeutiques recherchés. Par exemple, si une cytokine agit via l'immunomodulation, une dose trop importante peut supprimer la réponse biologique désirée, alors qu'une dose trop réduite peut ne pas induire la réponse biologique désirée.
Selon encore un autre aspect, le développement d'une tolérance à l'effet immunorégulateur lors d'un traitement quotidien peut nécessiter une intervention thérapeutique espacée dans le temps. Egalement dans cette situation, la mise en œuvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention permet au clinicien d'établir rapidement la dose de médicament optimale ainsi que la fréquence du traitement pour un individu donné.
Dans l'état de la technique, l'utilisation de cellules souches afin de régénérer des tissus différenciés est une voie d'approche thérapeutique qui est envisagée de plus en plus sérieusement. L'un des obstacles principaux réside dans la caractérisation de la combinatoire de facteurs permettant de contrôler le passage de la cellule souche vers une cellule mature bien déterminée. Actuellement, plusieurs équipes scientifiques travaillent pour la mise au point de milieux de culture contenant les molécules nécessaires au développement des cellules différenciées d'un type tissulaire donné. Selon encore un autre aspect, la mise en œuvre d'un ensemble de moyens de détection ou d'un dispositif de détection selon l'invention rend possible l'identification de la ou des combinaisons appropriées de facteurs de croissance spécifiques, qui permettent l'activation de l'expression des gènes adéquats, marqueurs de la différenciation en un type cellulaire donné.
L'invention a aussi pour objet un kit ou nécessaire pour la réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de moyens ou un dispositif selon l'invention.
Selon un premier aspect, le kit ou nécessaire tel que défini ci- dessus comprend en outre les réactifs nécessaires pour effectuer la réaction d'hybridation entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif. Selon un second aspect, le kit ou nécessaire tel que défini ci- dessus comprend en outre des moyens destinés à révéler les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif et les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Description détaillée de 21 gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation selon l'invention à partir desguels sont fabriguées les sondes constitutives des moyens de détection selon l'invention.
Description des références aux séquences
Chaque séquence nucléotidique représentative d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation référencée ci-dessous dans la présente description consiste en un ADNc obtenu à partir d'un ARN messager résultant de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation selon l'invention.
Il s'agit des séquences SEQ ID N° 5 à 25 ci-dessous.
Chaque séquence nucléotidique ci-dessous est contenue dans la séquence du gène complet correspondant, ledit gène complet comprenant dans sa séquence un motif « ISRE » tel que défini précédemment.
Les séquences d'ADNc ont été classées selon chaque chromosome contenant le gène correspondant.
Pour chaque chromosome, les séquences d'ADNc ont été classées selon qu'elles se retrouvent sur le brin (+) ou sur le brin (-) de l'ADN du chromosome considéré.
Pour chaque brin (+) ou (-) d'un chromosome, les séquences ont été classées selon qu'elles sont orientées en direction « sens » ou en direction « antisens ». Pour chaque brin d'un chromosome déterminé, les séquences ont été numérotées comme la Nième occurrence du motif « ISRE » considéré dans la séquence dudit brin (+) ou (-) dudit chromosome.
La référence de chaque séquence d'ADNc est constituée comme suit :
- « SeqX » est, pour un brin donné ((+) ou (-)) d'un chromosome donné, la Xième occurrence sur ledit brin du motif « ISRE »;
- La référence de chaque séquence comprend aussi le nom abrégé d'au moins une base de données électronique de séquences dans laquelle ladite séquence est répertoriée :
- « emb » signifie la base de données « EMBL » ;
- « Ref » signifie la base de données « RefSeq » ;
- « UG » signifie la base de données « UNIGENE » ;
- « Dbj » signifie la base de données « Database Japan » ; et
- « gb » signifie la base de données « GenBank »
- La référence de chaque séquence comprend aussi le numéro d'accès [numéro identificateur] de la séquence dans au moins l'une des bases de données de séquences ci-dessus.
- Le cas échéant, la référence de chaque séquence comprend diverses annotations telles que les clones d'ADN dont la séquence provient et le nom de la protéine pour laquelle cette séquence code.
A la connaissance du demandeur, aucun des gènes représentés par chacune des séquences nucléotidiques ci-dessous n'a été décrit comme un gène dont l'expression est reliée à une réaction inflammatoire.
DESCRIPTION DES SEQUENCES
A. Gènes à motif ISRE (codant pour des protéines non connues pour être inductibles par les cytokines)
SEQ ID M°5 (Chromosome 1 - Brin (+) , Sens)
>Seq 11210 : position de départ : 259403167
MOTIF= CTGGAAAGGAAACAG
Seql l 210
>0emb|XM_037495 |XM_037495 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1
(DISC1) , mRNA.
>0NM_018662 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1) , mRNA. >0gi | 11037064 | ref |NM_018662.1 | Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1) , mRNA
>0gnl |UG|Hs#S3220035 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA /cds= (53, 2617) /gb=NM_018662 /gi=11037064
/ug≈Hs.26985 /len=6930
>0gi| 11037064 | ref |NM_018662.1 | Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), mRNA
>0gi| 8163868|gb|AF222980.1 IAF222980 Homo sapiens disrupted in Schizophrenia 1 protein (DISC1) mRNA, complète cds
>0emb|XM_054775 |XM_054775 Homo sapiens disrupted in schizophrenia 1
(DISC1) , mRNA.
>0gi| 3413875 |dbj | AB007926.1 | AB007926 Homo sapiens mRNA for KIAA0 57 protein, partial cds
E=5e-52 100/100 100 +/- -. 0 1-100 (99) 103-202 (99) Identities = 100/100 (100%) Strand = Plus / Plus
Query: 103 ggaaggagcaggaggcagcccaggcggagcgggaggagctggcagcggggcgcatgccag 162
I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sb] et : 1 ggaaggagcaggaggcagcccaggcggagcgggaggagctggcagcggggcgcatgccag 60
Query: 163 gcgggggtcctcagggcgccccagccgccgccggcggcgg 202
I I M I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 61 gcgggggtcctcagggcgccccagccgccgccggcggcgg 100
SEQ ID M°6 (Chromosome 1, brin (+) - antisens)
>Seq 918: position de départ: 22311514
MOTIF= AGTTTCCCTTCTCGA
>0emb|XM_027908|XM_027908 Homo sapiens PTEN induced putative kinase
1 (PINK1), mRNA.
>0emb|XM_027908 |XM_027908 Homo sapiens PTEN induced putative kinase
1 (PINK1), mRNA.
>0NM_032409 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1) , mRNA.
>0gi |14165271| ref |NM_032409.1| Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1) , mRNA >0gnl | UG ] Hs#S3619730 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1
(PINK1), mRNA /cds= (94, 1839) /gb=N _032409 /gi=14165271
/ug=Hs.6163 /len=2700
>0g |14733777| ref |X _027908.1| Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1) , mRNA
>0g | 14149099 I db] | AB053323.il AB053323 Homo sapiens PINK1 mRNA for
PTEN induced putative kinase 1, complète cds
>0emb|XM_027909|X _027909 Homo sapiens PTEN induced putative kinase
1 (PINK1), mRNA.
>0gι| 141652711 ref |NM_032409.1 | Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), mRNA
E=le-49 96/96 100 +/--.0 1-96 (95) 190-285 (95) Identities = 96/96 (100%)
Strand = Plus / Plus
Query 190 cgcagaggcaccgccccaagtttgttgtgaccggcgggggacgccggtggtggcggcagc 249
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbj et • 1 cgcagaggcaccgccccaagtttgttgtgaccggcgggggacgccggtggtggcggcagc 60
Query 250 ggcggctgcgggggcaccgggccgcggcgccaccat 285
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I I M I I I I I I I I Sb^ct- 61 ggcggctgcgggggcaccgggccgcggcgocaccat 96
SEQ ID M°7 (Chromosome 1, Brin (-) , Antisens)
>Seq 7826: position de départ 182700849
MOTIF≈ AGTTTCCGGTTCTGT
>0emb|XM_016238|XM_016238 Homo sapiens spermatogenesis associated 1
(SPATA1), mRNA.
>0emb|XM_016238 |XM_016238 Homo sapiens spermatogenesis associated 1
(SPATA1), mRNA.
>0NM_022354 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1) , mRNA.
>0gι | 11641266 | ref |N _022354.1 | Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA
>0gnl | UG| Hs#S3219762 Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA /cds= (161, 1015) /gb=N _022354 /gι=11641266 /ug=Hs .147403 /len=1510
>0gι | 20533492 | ref |XM 016238.7 | Homo sapiens spermatogenesis associated 1 (SPATA1), mRNA
>0gi|10717164|gb|AF306347.1|AF306347 Homo sapiens sperm- specific protein SP-2 mRNA, complète cds
>0gi| 11641266 | ref |NM_022354.1 | Homo sapiens spermatogenesis associated protein 1 (SPAP1), mRNA
E=le-40 87/89 97 +/-:0 2-90 (88) 108-196 (88) Identities = 87/89 (97%)
Strand = Plus / Plus
Query: 108 gcagtcggtgggcgcggcggctgctggagcgtagcgcgacccgactcttaagttttcttt 167
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I S j et : 2 gcagtcggtgggcgcggcggctgctggaggctagcgcgacccgactcttaagttttcttt 61
Query: 168 tcctctccagaggggccgattagggagag 196
I I I I I I I I I M I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 62 tcctctccagaggggccgattagggagag 90
SEQ ID N°8 (Chromosome 2, Brin (-) , Sens)
>Seq 7130: position de départ: 138255670 MOTIF= TGGGAAAGAGAAACA
>0emb|XM_043407|XM_043407 Homo sapiens splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SFRS3), mRNA.
>0NM_003017 Homo sapiens splicing factor, arginine/serine-rich 3
(SFRS3), mRNA.
>0gi |4506900| ref |NM_003017.1| Homo sapiens splicing factor, arginine/serine-rich 3 (SFRS3) , mRNA
>0gi| 338483 | gb | 10838.1 IHUMSRP20 Homo sapiens SR protein family, pre-mRNA splicing factor (SRp20) mRNA, complète cds
E=3e-38 83/85 97 +/- -. 0 1-85 (84) 201-285 (84) Identities = 83/85 (97%) Strand = Plus / Plus
Query: 201 atgcatcgtgattcctgtccattggactgtaaggtttatgtaggcaatcttggaaacaat 260
I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I I I ! I I I I M I I I Sbj et : 1 atgcatcgtgattcctgtccattggactgtaaggtttatgtaggcaatcttggaaacaat 60
Query: 261 ggcaacaagaccgaactggaacggg 285
I I II I II M I I III II I I I I I II Sbjct: 61 ggcaacaagacggaattggaacggg 85
SEQ ID N° 9 (Chromosome 13 , Brin (- ) , Sens)
>Seq 4101 : position de départ : 76713824 MOTIF= TGAGAAACCGAAACT >0emb|X _054401|XM_054401 Homo sapiens putative breast epithelial stromal interaction protein (BRESI1) , mRNA.
>0NM_033255 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast)
(EPSTI1) ,
>0gi | 15147247 | ref |N _033255.1| Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1) , mRNA
>0gi|1486163 | gb | AF396928.1 | Homo sapiens putative breast epithelial stromal interaction protein mRNA, complète cds
>0gi |15147247| ref |NM_033255.11 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1 (breast) (EPSTI1), mRNA
>0gi|21732483|emb|A 831953.1 IHSM803266 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp667P0410 (from clone DKFZp667P0410)
>gnl | UG| Hs#S3817942 Homo sapiens epithelial stromal interaction 1
(breast) (EPSTI1), mRNA /cds= ( 65, 988) /gb=NM_033255 /gi=15147247 /ug=Hs .343800 /len=1508 E=e-131 236/236 100 +/-:0 1-236 (235) 50-285 (235)
Identities = 236/236 (100%) Strand = Plus / Plus
Query : 50 cgctaagcgtcccagccgcatccctcccgcagcgacggcggcccgggacccgcgggctgt 109
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I Sbjct : 1 cgctaagcgtcccagccgcatccctcccgcagcgacggcggcccgggacccgcgggctgt 60
Query: 110 gaaccatgaacacccgcaatagagtggtgaactccgggctcggcgcctcccctgcctccc 169
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I M Sbj et : 61 gaaccatgaacacccgcaatagagtggtgaactccgggctcggcgcctcccctgcctccc 120
Query : 170 gcccgacccgggatccccaggacccttctgggcggcaaggggagctgagccccgtggaag 229
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I 1 I I I I I I I i I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbj et : 121 gcccgacccgggatccccaggacccttctgggcggcaaggggagctgagccccgtggaag 180
Query: 230 accagagagagggtttggaggcagcccctaagggcccttcgcgggagagcgtcgtg 285
I I I I I I I I I I M I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I I I I I I I I I Sbjct: 181 accagagagagggtttggaggcagcccctaagggcccttcgcgggagagcgtcgtg 236
SEQ N°10.
>Seq 1032: position de départ: 22391622
MOTIF= CAAGAAAACGAAACT
>0emb|XM_037374 |XM_037374 Homo sapiens guanine nucléotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA. >0NM_021629 Homo sapiens guanine nucléotide binding protein beta subunit 4
>0gi |20357531| ref | NM_021629.2 | Homo sapiens guanine nucléotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA
>0gnl |UG| Hs#S3219369 Homo sapiens guanine nucléotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA /cds= (280, 1302) /gb=NM_021629 /gi=20357531 /ug=Hs .172654 /len=3302
>0gi I 20357531 | ref |NM_021629.2 | Homo sapiens guanine nucléotide binding protein beta subunit 4 (GNB4), mRNA
>0gi|7023438|dbj | AK001890.1 | AK001890 Homo sapiens cDNA F J11028 is, clone P ACE1004128, highly similar to GUANINE NUCLEOTIDE-BINDING PROTEIN BETA SUBUNIT 4
>gnl|UG|Hs#S1971121 Homo sapiens cDNA FLJ11028 fis, clone PLACE1004128, highly similar to GUANINE NUCLEOTIDE-BINDING PROTEIN BETA SUBUNIT 4 /cds=UNKNOWN/gb=AK001890 /gi=7023438 /ug=Hs.172654 /len=2567
E=8e-79 148/148 100 +/-:0 1-148 (147) 138-285 (147) Identities = 148/148 (100%)
Strand = Plus / Plus
Query : 138 acgtccccgccgggcccgcgcgcctcgtgcctcgcgcctcgcgcctccagccacgtcccc 197
I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjc : 1 acgtccccgccgggcccgcgcgcctcgtgcctcgcgcctcgcgcctccagccacgtcccc 60
Query: 198 gccccggctccggcgcgccgcggagttggctgctgggaggtgcgggactgggtgtggccg 257
! I I I I I I I I I I I M I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I I I I I I M I I I I Sbjet : 61 gccccggctccggcgcgccgcggagttggctgctgggaggtgcgggactgggtgtggccg 120
Query: 258 gcggctctggtctcggctgtgagctgcg 285
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 121 gcggctctggtctcggctgtgagctgcg 148
B. Gènes à motif ISRE (codant pour des protéines de fonction inconnue)
SEQ ID N°ll (Chromosome 1 , Brin (+) , Antisens)
>Seq 6431 : position de départ : 165375886
MOTIF≈ AGTTTCTCTTTCTTC
>0emb | XM_030965 | XM_030965 Homo sapiens hypothetical gène supported by AB033071; AB051480; AK000726; NM_015383 (LOC90335) , mRNA. >0emb|XM_030964 |XM_030964 Homo sapiens hypothetical gène supported by AB033071; AB051480; AK000726; NM_015383 (LOC90335) , mRNA.
>0emb|XM_034731|XM_034731 Homo sapiens hypothetical protein (DJ328E19.C1.1) , mRNA.
>0emb|XM_044868 |X _044868 Homo sapiens hypothetical gène supported by AB033071; AB051480; AK000726; N _015383 (LOC92396) , mRNA.
>0emb|X _053190|XM_053190 Homo sapiens hypothetical protein FLJ20719
(FLJ20719), mRNA.
>0emb]XM_054554 |XM_054554 Homo sapiens hypothetical gène supported by AB033071; AB051480; AK000726; NM_015383 (LOC113657) , mRNA.
>0emb|XM_016972 |XM_016972 Homo sapiens hypothetical gène supported by AB033071; AB051480; AK000726; NM_015383 (LOC90335) , mRNA.
>0emb|X _054260|XM_054260 Homo sapiens similar to KIAA1693 protein; hypothetical protein FLJ20719 (H. sapiens) (LOC91631) , mRNA.
>0NM_015383 Homo sapiens hypothetical protein DJ328E19.Cl .1 (DJ328E19.C1.1) ,
>0gi | 657016 | ref |NM_015383.1 | Homo sapiens hypothetical protein (DJ328E19.C1.1) , mRNA
E=4e-34 76/78 97 +/- -. 0 1-78 (77) 208-285 (77) Identities = 76/78 (97%)
Strand = Plus / Plus
Query : 208 aagacctcataaaatttatgctgaggaatgagcgacagttcaaggaggagaagcttgcag 267
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I M I I M Sbj et : 1 aagatctcataaaatctatgctgaggaatgagcgacagttcaaggaggagaagcttgcag 60
Query: 268 agcagctcaagcaagctg 285
I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 61 agcagctcaagcaagctg 78 SEQ ID N°12
>Seq 964: position de départ: 20574200 MOTIF= GCAGAAGAGGAAACT >0emb|XM_009277 |XM_009277 Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963) , mRNA. >0NM_014963 Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963) , mRNA.
>0gnl|UG|Hs#S2139651 Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963), mRNA
/cds=(215,4315) /gb=NM_014963 /gi=7662409 /ug=Hs.7724
/len=4877
>0gi 1205455651 ref |XM_009277.5| Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963), mRNA >0gi|4589569|dbj | AB023180.1 | AB023180 Homo sapiens mRNA for KIAA0963 protein, complète cds >0gi| 7662409|ref |NM_014963.1 | Homo sapiens KIAA0963 protein (KIAA0963) , mRNA E=le-30 64/64 100 +/- -. 0 1-64 (63) 222-285 (63)
Identities = 64/64 (100%) Strand = Plus / Plus
Query: 222 gcccgaaacccggaagtgagcggcggcagctgcgaggctcggagaaacaggcgccgcggg 281
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjet : 1 gcccgaaacccggaagtgagcggcggcagctgcgaggctcggagaaacaggcgccgcggg 60
Query: 282 etec 285
Sbjct: 61 etec 64
SEQ ID M°13 (Chromosome 10, Brin (+) , Antisens)
>Seq 5530: position de départ: 104011566 MOTIF= AGTTTCTGTTCCTTT >0emb|XM_005954 |XM_005954 Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894) , mRNA. >0gi| 14745003 | ref |XM_005954.3 | Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA
>0NM_014896 Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA. >0gnl|UG|Hs#S2139630 Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894), mRNA
/cds= (168, 1769) /gb=NM_014896 /gi=7662365 /ug=Hs.199117
/len=4113 >0gi | 4240276 |dbj |AB020701.1| AB020701 Homo sapiens mRNA for KIAA0894 protein, complète cds
>0gi|7662365|ref |NM_014896.1 | Homo sapiens KIAA0894 protein (KIAA0894) , mRNA E=3e-47 99/100 99 +/-:0 1-100 (99) 183-281 (98)
Identities = 99/100 (99%), Gaps = 1/100 (1%) Strand = Plus / Plus
Query : 183 gattattttgcttccggacctcgactggaaattttttaaaagcccttatgacaaatgagc 242
I I I I M I II I I I I II II Mil I I I I III I I II I I I I I II I I II I I I I I 1111 I I I II I I I Sbj et : 1 gattattttgcttccggacctcgactggaaattttttaaaagcccttatgacaaatgagc 60
Query: 243 atgttacctctcc-tttttctttttagcagctttcagctt 281
II I 11 I II I I I II I II I I II III I I I I I Mil I I I I I I I Sbjct: 61 atgttacctctccttttttctttttagcagctttcagctt 100
SEQ ID N°14 (Chromosome 14, Brin (-) , Sens)
>Seq 1684: position de départ: 32572132 MOTIF= CCGGAAGCGGAAACT
>0emb|XM_007430 |XM_007430 Homo sapiens KIAA0317 gène product (KIAA0317) , mRNA.
>0NM_014821 Homo sapiens KIAA0317 gène product (KIAA0317), mRNA.
>0gnl |UG|Hs#S2139475 Homo sapiens KIAA0317 gène product (KIAA0317) , mRNA /cds= (471, 2942) /gb=NM_014821 /gi=7662051 /ug=Hs.20126 /len=5402 >0gi| 7662051 | ref |NM_014821.1 | Homo sapiens KIAA0317 gène product (KIAA0317) , mRNA E=le-49 99/100 99 +/-:0 1-100 (99) 26-125 (99)
Identities = 99/100 (99%) Strand = Plus / Plus
Query: 26 gccggttcccaggccgggtggagaccaac ctggggtctgttggtgggagagtggggagc 85
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbj et : 1 gccggttcccaggccgggtggagaccaactctggggtctcttggtgggagagtggggagc 60
Query: 86 ccgtcttctgctgagtgctgccgccccttcccaggacagc 125
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 61 ccgtcttctgctgagtgctgccgccccttcccaggacagc 100
SEQ ID N°15 (Chromosome 14, Brin (-) , Sens)
>Seq 1961: position de départ: 38133588
MOTIF= GCTGAAACCGAAACC
>0emb|XM_007469|XM_007469 Homo sapiens hypothetical protein
FLJ11271
(FLJ11271), mRNA.
>0NM_018373 Homo sapiens hypothetical protein FLJ11271 (FLJ11271) , mRNA. >0gnl|UG|Hs#S2293578 Homo sapiens hypothetical protein FLJ11271
(FLJ11271), mRNA /cds= (82, 519) /gb=NM_018373 /gi=8922963 /ug=Hs.109654 /len=1354
>0gι | 7023825 |dbj IAK002133.il AK002133 Homo sapiens cDNA FLJ11271 fis, clone PLACE1009319, moderately similar to Rattus norvegicus outer membrane protein mRNA
>0g | 8922963 | ref |NM_018373.1| Homo sapiens hypothetical protein FLJ11271 (FLJ11271), mRNA
E=5e-52 100/100 100 +/- -. 0 1-100 (99) 11-110 (99) Identities = 100/100 (100%)
Strand = Plus / Plus
Query: 11 gggcgcagcgccgagattgattcaccttcacctgtgctgcactccagctgacccaagtag 70
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I 1 Sb et : 1 gggcgcagcgccgagattgattcaccttcacctgtgctgcactccagctgacccaagtag 60
Query: 71 gaagccagacgagctgtaaaacatgaacggaagagtggat 110
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 61 gaagccagacgagctgtaaaacatgaacggaagagtggat 100
SEQ ID N°16 (Chromosome 15, Brin (-) , Sens)
>Ξeq 2089: position de départ: 43348924
MOTIF= CAGGAAATTGAAACT
>0gι | 13375822 | ref |NM_024611.1 | Homo sapiens hypothetical protein
FLJ11896 (FLJ11896), mRNA
E=5e-52 100/100 100 +/-:0 1-100 (99) 185-284 (99) Identities = 100/100 (100%)
Strand = Plus / Plus
Query : 185 ataatagtgatggaaagacagctgttgtgggttctaacttaagttccagaccagctagtc 244
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I S j et : 1 ataatagtgatggaaagacagctgttgtgggttctaacttaagttccagaccagctagtc 60
Query: 245 caaattcttcctcaggacaggcttctgtaggaaaccagac 284
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 61 caaattcttcctcaggacaggcttctgtaggaaaccagac 100
SEQ ID M°17 (Chromosome 2, Brin (-) , Sens)
>Seq 4608: position de départ: 88299855 MOTIF= AGCGAAAGAGAAACT >gnl |UG|Hs#S2532973 AV707659 Homo sapiens cDNA, 5' end /clone=ADBBSAll /clone_end=5 ' /gb=AV707659 /gι=10724924
/ug=Hs.74921 /len=733 E=9e-85 164/166 98 +/- -. 0 1-166 (165) 120-285 (165)
Identifies = 164/166 (98%) Strand = Plus / Plus
Quer : 120 aggctgcggaccagccccccacacttccccctacacctctggcgggttcgcgccgtggac 179
I I I I I I I I I I I 1 I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbj et : 1 aggctgcggtccagccccccacactttcccctacacctctggcgggttcgcgccgtggac 60
Query: 180 gcccccgccctgcgggaggaggggctggcgcggattttagggacttcetgggatgcggag 239
Il I I I I I II I I I I I I llll I I I III III I I Mil I I II I I I III II I UNI I Mil I I I Sbj et : 61 geccccgccctgcgggaggaggggctggcgcggattttagggacttcctgggatgcggag 120
Query: 240 atcggctctgaaccatcccctttctgctgcccggagctggggaagc 285
Il I I I I I I I 1 I llll I I I I II I I I II I I I I I I I I I llll Sbjct: 121 atcggctctgaaccatcccctttctgctgcccggagctggggaagc 166
SEQ ID N°18 (Chromosome 4, Brin (+) , Sens)
>Seq 5668: position de départ: 117322292 MOTIF= GAGGAAATAGAAACT >gnl|UG|Hs#S3365105 602498968F1 Homo sapiens cDNA, 5' end /clone=IMAGE:4612649 /clone_end=5 ' /gb=BG428292 /gi=13334798 /ug=Hs .292472 /len=1008 E--5e-31 68/68 100 +/--.0 5-72 (67) 218-285 (67)
Identities = 68/68 (100%) Strand = Plus / Plus Query: 218 ttagggtcagtgaacagtaatgatttaggtatacagctaggacctacatttaaattctta 277
I I I I I I I 1 I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct: 5 ttagggtcagtgaacagtaatgatttaggtatacagctaggacctacatttaaattctta 64
Query: 278 cetgteta 285
I I I I I I I I Sbjct: 65 cetgteta 72
ID N°l.
>Seq 4720: position de départ: 94183459 MOTIF= AATGAAAAGAAACTT >gnl|UG|Hs#S3552312 602624658F1 Homo sapiens cDNA, 5' end /clone=IMAGE: 4749638 /clone_end=5 ' /gb=BG678948 /gi=13910345 /ug=Hs.17384 /len=955 E=3e-35 82/83 98 +/--.0 4-85 (81) 203-285 (82)
Identities = 82/83 (98%), Gaps = 1/83 (1%) Strand = Plus / Plus
Query: 203 aattcaaaacatactccttatattaaggattatagcaccatattttttgtatattcccta 262
111111111111111 m 1111111 m 11111111111111 1111111111 m 1111
Sbj et : 4 aattcaaaacatactccttatattaaggattatagcaccata-tttttgtatattcccta 62
Query: 263 tgtgtaactttttcctgttggta 285
111111111111111 m 11111
Sbjct: 63 tgtgtaactttttcctgttggta 85
SEQ ID N°20 (Chromosome 5, Brin (+) , antisens) >Seq 6860: position de départ: 137080329 M0TIF= GAAGAAATGAAACTT
>gnl|UG|Hs#S3438451 Homo sapiens FKSG56 (FKSG56) mRNA, complète cds
/cds=(48,422) /gb=AF336883 /gι=13384194 /ug=Hs .344028 /len=799 E=2e-61 131/135 97 +/-:0 1-135 (134) 151-285 (134)
Identities = 131/135 (97%) Strand = Plus / Plus
Query 151 ccttceccagtgtttgtgtccctgggtacttgagattagggagtggtgatgactcttaac 210 m ι n ι m 1 1 n 1 1 1 1 1 1 1 1 m i I I I I M ι n I I I I 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbj et 1 ccttccgcagtgtttgtgtccctgggtacttgagattagggagtggtgatgactcttaac 60
Query 211 tagcatgctgccttcaagcatctgtttaacaaagcacatcttgcactgcccttaatccat 270
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m m 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbjet 61 gagcatgctgccttcaagcatctgtttaacaaagcacatcttgcaccgcccttaatccat 120
Query 271 ttaaccctgagtgga 285 ι ι m 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbj ct 121 tcaaccctgagtgga 135
SEQ ID N°21 (Chromosome 7 , Brin (+) , Sens) >Seq 7018 pos ition de départ 138487975 MOTIF= CTAGAAAGAGAAACT >gnl | UG | Hs#S2649922 Homo sapiens cDNA FLJ11779 fis , clone
HEMBA1005921 /cds=UNKNO N /gb=AR021841 /gι=10433109 /ug=Hs . 196342 /len=1336 E=4e- 65 128 /129 99 +/ - . 0 1-129 ( 128 ) 157-285 ( 128 )
Identifies = 128 / 129 ( 99% ) Strand ≈ Plus / Plus
Query 157 atcatagtagaaccaccgtgttctaaccttattgtgtatcaccataacagtttattgtgg 216
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 M 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m ι m ι m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sb et 1 atcatagtagaaccaccgtgttctaaccttattgtgtatcaccataacagtttattgtgg 60
Query 217 ctetgatgtcataaaggaagagacatggaagaagaaaaagggggaaaaacgtagtattta 276
1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbjet 61 ctctgatgtcataaaggaagagacatggaggaagaaaaagggggaaaaacgtagtattta 120
Query 277 aaattcttt 285 m 1 1 1 1 1 1
Sbj ct 121 aaattcttt 129
SEQ ID N°22
>Seq 2907: position de départ: 56347835 MOTIF= CAGGAAAAGAAACTG >gnl|UG|Hs#S3053159 602303069F1 Homo sapiens cDNA, 5' end
/clone=I AGE: 4394585 /clone_end=5 ' /gb=BG024183
/gι=12409495 /ug=Hs .350159 /len=1130 E=2e-76 161/164 98 +/- : 0 1-164 (163) 117-278 ( 161 )
Identities = 161 /164 ( 98% ) , Gaps = 2/164 ( 1% ) Strand = Plus / Plus
Query : 117 aggttactcactataaacaatatccacccaacacaa-gcaa-agtttattcctactttga 174 n n 1 1 1 n m m I I I I n 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 n 1 1 1 1 i m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1
Sbj et : 1 aggttactcactataaacaatatccaeccaacacaacgcgagagtttattcctactttga 60
Query : 175 atgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagt 234
I I I 11 I III III I I I II I II I I I I I III I I I III I I I III III I III I I II I llll I I I I Sb et : 61 atgccgtgaaaagaagacagaaaactccaaattaaggaaggtgaaatatgaggaaacagt 120
Query: 235 attttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggta 278
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1
Sbjct: 121 attttatgggttgcagtacattcttaataagtacttaaaaggta 164
SEQ ID N°23 (Chromosome 8 , Brin (+) , Sens)
>Seq 1580 : pos ition de départ : 30265967 MOTIF= GGAGAAACTGAAACT >gnl | UG | Hs #S2006324 EST383718 Homo sapiens cDNA /gb=A 971629
/gi=8161475 /ug=Hs . 88218 / len=500 E=e-150 280 /284 98 +/- -. 0 1-284 ( 283 ) 2-285 ( 283 )
Identities = 280 / 284 ( 98 % ) Strand = Plus / Plus
Query : 2 agagattaaatgatttattcagtacatggcagggtcaggactgagccaaggcattgtggc 61
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbjct : 1 agagattaaatgatttattcagtacatggcagggtcaggactgagccaaggcattgtggc 60
Query : 62 tccagttcatctccccgttacggtcaggggtgcttatgaactcatagtggggtcgggggt 121
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I I I I I I I I I ! I I I I I I I I I Sbjct : 61 tccagttcatttccccgttacggtcaggggtgcttatgaactcatagtggggtcgggggt 120
Query : 122 agaggagagacgtaacacaaacatgagaaacaattagaggaccatgcaaggcagggtgta 181
1 1 m 1 1 1 1 1 m m m m 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 m m ι m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbj et : 121 agaggagagacgtaacacaaacatgagaaacaattagaggaccatgcaaggcagggtgta 180
Query: 182 attcagtcctaaatcacataatccagagagcaagtgctagaagaattcgggagaaggagc 241
1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m m 1 1 1 1
Sbjct : 181 atteagtcetaaatcacataatccaaagagcaagtgctagaaaaattcgggagaaggagc 240
Query: 242 atttcctccaggcattcctgggatcctaccaagtgagaaggcag 285
1 1 1 1 m 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 m m 1 1 m 1 1 1 1
Sbjct: 241 atttcctccaggcattcctgggatcctaccaagtgaaaaggcag 284
SEQ ID N°24 (Chromosome 12, Brin (-) , Sens) >Seq 3482: position de départ: 71200075 OTIF= TTAGAAAATGAAACT
>gnl|UG|Hs#S2654527 Homo sapiens cDNA: F J23092 fis, clone NG07245, highly similar to AF007130 Homo sapiens clone 23750 unknown mRNA /cds=UNKNO N /gb=AK026745 /gi=10439667 /ug=Hs.12871 /len=2050 E=le-28 64/64 100 +/-:0 1-64 (63) 222-285 (63)
Identities = 64/64 (100%) Strand = Plus / Plus
Query: 222 aaaatagacgatcgtttaaaattggaagcagagatggaattaaaagacttacaccagcct 281
1 1 1 1 m 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 n 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbj et : 1 aaaatagacgatcgtttaaaattggaagcagagatggaattaaaagacttacaccagcct 60
Query: 282 aaaa 285 llll Sbjct: 61 aaaa 64
SEQ ID N°25 (Chromosome 15, Brin (+) , Sens)
>Seq 3086: position de départ: 77422375
MOTIF= CCAGAAATGAAACTT
>gnl |UG|Hs#S1570556 Homo sapiens mRNA full length insert cDNA clone
EUROIMAGE 28993 /cds≈UNKNOWN /gb=A 109678 /gi=5689803 /ug=Hs.21597 /len=1426 E=e-108 197/197 100 +/-:0 1-197 (196) 89-285 (196)
Identities = 197/197 (100%) Strand = Plus / Plus
Query: 89 caattatagattaaaaatatcagaagcatttccagattattcttaaaagttgatgagatc 148
1 1 1 1 m 1 1 m 1 1 1 1 1 1 m m 1 1 1 1 1 m m m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1
Sbjct: 1 caattatagattaaaaatatcagaagcatttccagattattcttaaaagttgatgagatc 60
Query : 149 ttcccaaaccagaatgacaactgaggatgagatgtgcatagattaaatggtaaagtgggt 208
1 1 1 m 1 1 1 m m 1 1 1 1 m m 1 1 m m 1 1 m 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Sbj et : 61 ttcccaaaccagaatgacaactgaggatgagatgtgcatagattaaatggtaaagtgggt 120
Query: 209 ggttctcaggtgagaagcagtgaggaccattcattttgcagcctaaaaattttaggggat 268
1 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 1 1 m ι m 1 1 1 1 1 1 1 1 m 1 1 m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 n ι m 1 1 1 1
Sbjet : 121 ggttctcaggtgagaagcagtgaggaccattcattttgcagcctaaaaattttaggggat 180
Query: 269 gcaaactgtcatttccc 285
1 1 1 1 1 1 1 1 1 m m 1 1
Sbjct: 181 gcaaactgtcatttccc 197 Exemple 2 : Description d'un exemple illustratif d'un programme d'ordinateur pour la réalisation de l'étape a) du procédé de l'invention
Le programme d'ordinateur illustré ci-dessous a été rédigé dans le langage de programmation « PERL ».
I. Programme « Maître » (pour le motif « ISRE »)
#!/usr/bin/perl
# chrl .fa Brin Plus, Motif Sens, Version UCSC du 13-06-2001
# Motif ISRE Sens: .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}
system "pg1.pl chrl .fa .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} >res_chr1";
system "pg2.pl res_chr1 > ti1" ;
System "pg3.pl ti1 .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}";
system " mv isre noins isre_-_s";
system " mv isre_plus isre_+_s";
# Motif ISRE Reverse Complémentaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}
system "pg3.pl isre_-_s .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}";
system " mv isrejnoins isre2_-_s";
system " mv isre_plus isre2_+_s";
system " pg4_new160.pl isre2_-_s alu+primate_repbase";
system "mv sequencg2 chr1_alu- " ; system " pg4_new15.pl chr1_alu- alu+primate_repbase";
system "mv sequencg2 chr1_alu2- " ;
system " blastall -p blastn -d tc_bank -a2 -i chr1_alu2- > ta1 ";
system " pg6.pl ta1 0.970 > plus_chr1 ";
# chrl .fa, brin Plus, Motif Reverse Complémentaire, #Version UCSC du 13-06-2001
# Motif ISRE Reverse Complémentaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}
system " pg1.pl chrl .fa .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} > res_chr1_as";
system "pg2.pl res_chr1_as > ti1_as" ;
system "pg3.pl ti1_as .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}";
system " mv isre_moins isre_-_as";
system " mv isre_plus isre_+_as";
# Motif ISRE Sens: .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}
system "pg3.pl isre_-_as .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}";
system " mv isrejnoins isre2_-_as";
system " mv isrej lus isre2_+jas";
system "pg4_new160.pl isre2_-_as alu+primate_repbase"; system "mv sequencg2 chr1_alu-_as " ;
system " pg4_new15.pl chr1_alu-_as alu+primate_repbase";
system "mv sequencg2 chr1_alu2-_as " ;
system "blastall -p blastn -d tc_bank -a2 -i chr1_alu2-_as > ta1_as ";
system " pg6.pl ta1_as 0.970 > plus_chr1 as ";
#revcomp_chr1.fa, Brin Moins, Motif ISRE Sens, Version UCSC du 13-06-2001
# Motif ISRE Sens: .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}
system " pg1.pl rβvcomp_chr1.fa .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1} >res_chr1_rc";
system "pg2.pl res_chr1_rc > ti1_rc" ;
system "pg3.pl ti1_rc .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}";
system " mv isrejnoins isre_-_src";
system " mv isre_plus isre_+_src";
# Motif ISRE Reverse Complémentaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}
system "pg3.pl isre_-_src .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}";
system " mv isre_moins isre2_-_src";
system " mv isre_plus isre2_+_src"; system " pg4_new160.pl isre2_-_src alu+primate_repbase";
system "mv sequencg2 chr1_alu-_rc " ;
system " pg4_new15.pl chr1_alu-_rc alu+primate_repbase";
system "mv sequencg2 chr1_alu2-_rc " ;
system " blastall -p blastn -d tc_bank -a2 -i chr1_alu2-_rc > ta1_rc ";
system " pg6.pl ta1 e 0.970 > moins_chr1 ";
# revcomp_chr1.fa, Brin Moins, Motif Reverse Complémentaire, Version #UCSC du 13- 06-2001
# Motif ISRE Reverse Complémentaire: .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}
system " pg1.pl revcomp_chr1.fa .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3} > res_chr1_asrc";
system "pg2.pl res_chr1_asrc > ti1_asrc" ;
system "pg3.pl ti1_asrc .{1}GTTTC.{2,3}TTC.{3}";
system " mv isrejnoins isre_-_asrc";
system " mv isre_plus isre_+_asrc";
# Motif ISRE Sens: .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}
system "pg3.pl isre_-_asrc .{3}GAA.{2,3}GAAAC.{1}";
system " mv isre_moins isre2_-_asrc";
system " mv isre_plus isre2_+_asrc";
system " pg4_new160.pl isre2_-_asrc alu+primate_repbase"; system "mv sequencg2 chr1_alu-_asrc " ;
system " pg4_new15.pl chr1_alu-_asrc alu+primate_repbase";
system "mv sequencg2 chr1_alu2-_asrc " ;
system " blastall -p blastn -d tc_bank -a2 -i chr1_alu2-_asrc > ta1_asrc ";
system " pg6.pl ta1_asrc 0.970 > moins_chr1_as ";
II. Module « pg1.p1 »
#!/usr/bin/perl if ($#ARGV 1 ) { print "usage: utilise 2 arguments: first, fichier chromosome; second, motif recherche \n"; exit; }
$j = i ; open(F, $ARGV[0]) || die ("I can't open this chromosome file\n"); $regexp = $ARGV[1]; $line = <F>; while (Sline) { if ($line =~ /Λ>/) { $name = $line; $seq = ""; while (($line = <F>) && ($line !~ /Λ>/)) { chomp $line; $seq .= $line; #pareil que: $seq = $seq . $line
}
$lseq = length( $seq ) ; for ( $i = 0 ; $i < $lseq ; $i++){ $partseq = substr( $seq , $i, 15); if($partseq =~ /Λ$regexp/o ){ $partseq = substr ($seq, $i, 300); $seqelec {$partseq}++; print ">Seq $j: position de départ: $i \n$partseq \n"; $j = $j +1 ; } } } else {
$line = <F>; } } close F;
III. Module « pg2.p1 »
#!/usr/bin/perl $1 =1 ;
if ($#ARGV !=0){ print "usage: <Fichier de séquences au format fasta>\n"; exit;
3 open (FS, $ARGV[0]);
$x= <FS>; while ($x) {
if ($x =~ /Λ>/) {
$line = $x;
}
if ($x !~ /Λ>/) {
$x=~ s/Λ.{15}//;
$line .= $x; print $line; } $x= <FS>;
close (FS) ;
IV. Module « pg3.p1 »
#!/usr/bin/perl
if ($#ARGV != 1 ) { print "usage: 1 er argument: - fichier output de pg2.pl \n"; print " 2eme argument: - pattern d'expression régulière recherche \n"; exit;
}
$seq1 = "";
$seq2 = ""; open(F, "$ARGV[0]") || die "can't open the file ti1 ";
$regexp = $ARGV[1];
$line = <F>; while ($line) {
if ($line =~ /Λ>|Λ\s+>/) { $name = $line; $seq = "";
while (($line = <F>) && ($line !~ /Λ>/)) { $seq .= $line; } $lseq = length( $seq ) ;
for ( $i = 0 ; $i < $lseq ; $i++){
$partseq = suBstr( $seq , $i, 15); if($partseq =~ /Λ$regexp/o ){
$seqq {$partseq}++;
} } if (%seqq) { #teste le contenu du hachage
$name .= $seq; $seq1 .= $name; $name=""; %seqq = (); } else { $name .= $seq; $seq2 .= $name; $name = ""; %seqq ≈ (); }
} else {
$line = <F>; } }
close F ;
sélect (ISRE_PLUS); open (ISRE_PLUS, ">isre_plus"); print ISRE_PLUS " $seq1 \n " ; sélect (ISRE_MOINS); open (ISRE_MOINS, ">isrejnoins"); print ISRE_MOINS " $seq2 \n " ; V. Module « pg4 160.p1 »
#!/usr/bin/perl
if ($#ARGV != 1 ) { print "usage: utilise 2 arguments: - fichier de séquences au format fasta \n" print " - Banque de séquence au format fasta utilisée \n"; exit;
}
$bank = $ARGV[1] ; open (FSE , ">sequencg2"); open (FSOR, ">fsor"); open (F, $ARGV[0]);
$line = <F>; while ($line) { if ($line =~ /Λ>|Λ\s+>/) {
$name = $line;
$seq = "";
while (($line = <F>) && ($line !~ /Λ>/)) { #chop $line; $seq .= Sline;
} open (FSOR, ">fsor"); pn nt FSOR $name; pri nt FSOR $seq; pri nt FSOR "\n";
$fsor.=$name; $fsor.=$seq; #system "nedit fsor&"; #print $fsor; #exit; system "blastall -p blastn -d $bank -e 1 e-160 -a2 -i fsor -o other"; open(FS, "other") || die ("fichier output blastn introuvable\n");
while (($line2 = <FS>) && ($line2 !~ / No hits found /)) {}
if ($line2 =~ / No hits found /) { open (FSE , "»sequencg2"); print FSE $fsor;
$fsor="";
$name- '";
$seq="";
} else { close FS; $var = '~/linuxJpa/programmes/jp/prog_valides/xblast other fsor N" open (FSEQ, "»sequencg2"); print FSEQ $var; $fsor=""; $name=""; $seq=""; }
else {
$line = <F>;
close (F); close (FSOR); close (FSE);
VI. Module « pg4 15.p1 »
#!/usr/bin/perl if ($#ARGV != 1 ) { print "usage: utilise 2 arguments: - fichier de séquences au format fasta \n"; print " - Banque de séquence au format fasta utilisée \n"; exit;
}
$bank = $ARGV[1] ;
open (FSE , ">sequencg2"); open (FSOR, ">fsor"); open (F, $ARGV[0]); $line = <F>; while ($line) { if ($line =~ /Λ>|Λ\s+>/) {
$name = $line;
$seq = ""; while (($line = <F>) && ($line !~ /Λ>/)) {
$seq .= $line;
} open (FSOR, ">fsor"); print FSOR $name; print FSOR $seq; print FSOR "\n";
$fsor.=$name; $fsor.=$seq;
system "blastall -p blastn -d $bank -e 1e-15 -a2 -i fsor -o other";
open(FS, "other") || die ("fichier output blastn introuvable\n"); while (($line2 = <FS>) && ($line2 !~ / No hits found /)) {}
if ($line2 =~ / No hits found /) { open (FSE , "»sequencg2"); print FSE $fsor;
$fsor="";
$name="";
$seq="";
} else { close FS; $var = '~/linuxj'pa/programmes/jp/prog_valides/xblast other fsor N" open (FSEQ, "»sequencg2"); print FSEQ $var;
$fsor="";
$name- '";
$seq="";
}
else {
$line = <F>; } }
close (F); close (FSOR); close (FSE);
VII. Module « pg5.p1 » system " blastall -p blastn -d tc_bank -a2 -i chr1_alu2- > fichierjesultat '
VIII. Module « pg6.p1 #!/usr/bin/perl
if ($#ARGV != 1 ) { print "usage: 1er argument: <blastall output file> \n"; print "2ieme argument: <valeur variable scalaire trueval> \n"; exit;
} open(FS, $ARGV[0]) || die ("fichier $ARGV[0] introuvable\n");
$q=-1 ;
$trueval= $ARGV[1] ; while (($line =<FS>) && ($line !~ /Query=/ ) ) {} while ($line =~ /Query=(.+$)/) {
$q++;
$t=-1 ; #initialize larget chomp $line;
$qname=$1 ; while (($line =<FS>) && ($line !~ /Λ>/ ) && ($Iine !~ /Ouery=/ )) {} while ($line =~ X>l ) {
$t++;
$hsp=-1 ; #initialize hsp
@goodhspinfo=();
$goodhsp=0;
$tname=""; while ($line !~ /Length/) {
$tname .= $line;
$line = <FS>;
} while (($line =<FS>) && ($line !~ /Score =/ ) ) {}
while ($line =~ /Score =/ ) {
$hsp++;
$tmin=1 e10;
$tmax=-1e10;
$qmin=1 e10; $qmax=-1e10; $line=~ /Expect\s\= (.+)$/; $expect=$1 ; while (($line = <FS>) && ($line !~ /Λ>/) && ($line !~ /Score =/) && ($line !~ /Query≈/ )) {
if ($line=~ /Strand =/) { if ($line=~ /Minus/) {
$minus=1 ; }else{
$minus=0; } } if ($line=~ /ldentities\s=\s(\d+)V(\d+)\s\((\d+)\%\)/) { $id1 =$1 ; $id2=$2; $pcent=S3; $truepcent=$1/$2; $ali="";
} if ($line=~ /Sbjct\:\s(\d+).; (\d+)$/) { if ($minus) {
$lmin = ( ($2 < $tmin) ? $2: $tmin);
$tmax = ( ($1 > $tmax) ? $1 : $tmax); } else{
$tmin = ( ($1 < $tmin) ? $1 : $lmin);
$tmax = ( ($2 > $tmax) ? $2: $tmax); } } if ($line=~ /Query\:\s(\d+).* (\d+)$/) {
$qmin = ( ($1 < $qmin) ? $1 : $qmin); $qmax = ( ($2 > $qmax) ? $2: $qmax);
}
$ali.=$line; }
$tlen=$tmax-$tmin;
$qlen=$qmax-$qmin;
if ((!$minus) && ($truepcent >= $trueval) && ($tlen>60) && ($tmin<=5)) { print "$qname\n $tname E=$expect $id1/$id2 $pcent +/-:$minus $tmin-$tmax ($tlen) $qmin-$qmax ($qlen)\n $ali\n\n";
}
}
} } close FS;
REFERENCES
Beaucage et al., Tetrahedron Lett 1981 , 22: 1859-1862
Brown EL, Belagaje R, Ryan MJ, Khorana HG, Methods Enzymol 1979;68:109-151
GAIT (éd.), (1984). Nucleic Acid Hybridization.
GLOVER (éd.), 1985. DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II Oligonucleotide Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.
HAMES and HIGGINS, 1985. Nucleic Acid Hybridization: a practical approach, Hames & Higgins Ed. IRL Press, Oxford.
Narang SA, Hsiung HM, Brousseau R, Methods Enzymol 1979;68:90-98»
AltschuI, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugène W. Myers,and David J. Lipman (1990), « Basic local alignment search tool »,. J.Mol.Biol.215: 403-10.
Claverie J.M. & David J. States (1993), Information Enhancement Methods for Large Scale Séquence Analysis, Computers and Chemistry 17: 191-201.
Programme xblast.c; site web, http://blast.wustl.edu/pub/xblast
Wall et al., Programming Perl By Larry Wall, Tom Christiansen & Randal L. Schwartz; Second Edition, September 1996., 670 pages.
Programme blast.linux.tar.Z Version 07/2001 ; ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/ exécutables/

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer une collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, selon les étapes de préparation suivantes : ai) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences nucléotidiques d'origine humaine, dont l'ensemble des séquences recouvrent au moins une fois la totalité du génome humain, les séquences comprenant au moins une copie d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°1 à 4, puis (ii) créer une première collection de séquences nucléotidiques à partir de chaque séquence précédemment sélectionnée, chaque séquence nucléotidique contenue dans ladite première collection étant constituée, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', de la séquence SEQ ID N°1 , 2, 3 ou 4, suivie des 285 nucléotides consécutifs localisés, dans chaque séquence sélectionnée en (i), immédiatement du côté 3' du dernier nucléotide en 3' de ladite séquence SEQ ID N° 1 , 2, 3 ou 4 ;
a2) (i) pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans ladite première collection créée à l'étape ai ), éliminer la séquence SEQ ID N°1 , 2, 3 ou 4 localisée à l'extémité 5' de ladite séquence nucléotidique et (ii) créer une seconde collection de séquences contenant toutes les séquences modifiées en (i), chacune des séquences contenues dans ladite seconde collection constituant une « sonde » ;
a3) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), de la présence d'au moins une copie d'une séquence SEQ ID N° 1 , 2, 3 ou 4, puis (ii) élimination, dans ladite seconde collection, des séquences comprenant au moins une copie de l'une des séquences SEQ ID N° 1 , 2, 3 ou 4, grâce à quoi une troisième collection de séquences, ne comprenant pas les séquences ainsi éliminées, est créée ;
a4) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la troisième collection de séquences créée à l'étape a3), de chaque enchaînement de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type « Alu » ou de type « répété » susceptible d'être contenu dans ladite séquence nucléotidique, puis (ii) modification des séquences comprenant un tel enchaînement de nucléotides, par masquage desdits enchaînements de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type « Alu » ou de type « répété » par remplacement de chaque nucléotide A, T, G ou C contenu dans ladite séquence « Alu » ou « répétée » par un nucléotide « N » signifiant indifféremment A, T, G ou C, puis (iii) créer une quatrième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences contenues dans la troisième collection, éventuellement modifiées selon (ii) ;
a5) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences contenant des séquences nucléotidiques consistant en des produits de transcription du génome humain, les séquences comprenant au moins l'une des séquences nucléotidiques contenues dans la quatrième collection de séquences créée à l'étape a4), puis (ii) créer une cinquième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences sélectionnées en (i) ;
a6) (i) Sélectionner, dans la cinquième collection de séquences créée à l'étape a5), les séquences comprenant au moins 60 nucléotides consécutifs définissant un enchaînement ayant au moins 97% d'identité en nucléotides avec un enchaînement nucléotidique inclus dans au moins l'une des « sondes » contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), puis (ii) créer une sixième collection de séquences nucléotidiques contenant les séquences ainsi sélectionnées, ladite sixième collection de séquences consistant en la collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation ;
b) synthétiser une collection de sondes nucléotidiques hybridant spécifiquement avec le produit de transcription d'au moins un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, ledit gène comprenant une séquence nucléotidique contenue dans la sixième collection de séquences préparée à l'étape a6), ladite collection de sondes ainsi synthétisées consistant en l'ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape c) suivante : c) immobiliser chacune des sondes nucléotidiques synthétisées à l'étape b) sur un support.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques son immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur ledit support sous la forme d'une matrice ordonnée de sondes.
5. Ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit ensemble de moyens comprend, pour chaque acide nucléique dont la présence est recherchée, au moins une sonde nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec ledit acide nucléique, ledit ensemble de moyens étant préparé par le procédé selon la revendication 1.
6. Ensemble de moyens selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence de la ou de sondes nucléotidiques a une longueur d'au moins 20 nucléotides.
7. Ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont marquées par une molécule détectable.
8. Ensemble de moyens selon la revendication 7, caractérisé en ce que la ou les sondes sont marquées par une molécule radioactive, par une molécule fluorescente ou par une molécule chimioluminescente.
9. Ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur un support.
10. Ensemble de moyens selon la revendication 9, caractérisé en ce que les sondes sont immobilisées sur le support de manière ordonnée.
11. Ensemble de moyens selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la ou les sondes immobilisées sur le support forme une matrice ordonnée.
12. Dispositif de détection de la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce ledit dispositif comprend au moins une sonde nucléotidique ou une pluralité de sondes nucléotidiques préparées par le procédé selon la revendication 1, la ou les sondes nucléotidiques étant immobilisées sur un support.
13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que la pluralité de sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.
14. Utilisation d'une sonde ou d'une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies dans l'une des revendications 1 à 4, pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
15. Procédé pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 11 , ou un dispositif selon l'une des revendications 12 ou 13, avec un échantillon à tester ; b) détecter les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou dans ledit dispositif et les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine l'identité de la ou des sondes nucléotidiques qui ont hybride avec le ou les acides nucléiques présents dans l'échantillon.
17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que, à l'étape b), ont détermine les rapports quantitatifs des différents acides nucléiques contenus dans l'échantillon et qui ont hybride avec les sondes nucléotidiques.
18. Procédé selon la revendication 15, caractérisé t?u ^ ue, a i ciciμe b), on détermine l'identité du ou des sondes nucléotidiques ayant hybride avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
19. Procédé selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain.
20. Procédé selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que les acides nucléiques contenus dans l'échantillon sont des ADNc obtenus par transcription inverse d'ARN messagers synthétisés par une cellule de mammifère humain ou non humain
21. Procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 11 ou un dispositif selon l'une des revendications 12 ou 13 avec ledit échantillon ; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques comprises dans l'ensemble de moyens ou dans le dispositif qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
22. Procédé de réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) réaliser le procédé selon l'une des revendications 15 à 20 avec ledit échantillon; c) Déterminer l'identité des sondes nucléotidiques qui sont hybridées avec les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
23. Kit ou nécessaire pour la réalisation d'un profil d'expression de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de moyens selon l'une des revendications 5 à 11 ou un dispositif selon l'une des revendications 12 ou 13.
24. Kit ou nécessaire selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les réactifs nécessaires pour effectuer la réaction d'hybridation entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif.
25. Kit ou nécessaire selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisé en qu'il comprend en outre des moyens destinés à révéler les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif et les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.
PCT/FR2004/050047 2003-02-05 2004-02-05 Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l’inflammation, et applications WO2004072222A2 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04708383A EP1590486A2 (fr) 2003-02-05 2004-02-05 Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l'inflammation, et applications

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0350013A FR2850669A1 (fr) 2003-02-05 2003-02-05 Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l'inflammation, et applications.
FR0350013 2003-02-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004072222A2 true WO2004072222A2 (fr) 2004-08-26
WO2004072222A3 WO2004072222A3 (fr) 2005-03-24

Family

ID=32696414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/050047 WO2004072222A2 (fr) 2003-02-05 2004-02-05 Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l’inflammation, et applications

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1590486A2 (fr)
FR (1) FR2850669A1 (fr)
WO (1) WO2004072222A2 (fr)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995011995A1 (fr) * 1993-10-26 1995-05-04 Affymax Technologies N.V. Reseaux de sondes d'acide nucleique sur des microplaquettes biologiques
WO2000006696A2 (fr) * 1998-07-30 2000-02-10 University Of South Florida Procede de modulation du fonctionnement de facteurs de transcription
WO2001040301A2 (fr) * 1999-12-01 2001-06-07 Akzo Nobel N.V. Gene nouvellement identifie, interrompu en cas de schizophrenie

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995011995A1 (fr) * 1993-10-26 1995-05-04 Affymax Technologies N.V. Reseaux de sondes d'acide nucleique sur des microplaquettes biologiques
WO2000006696A2 (fr) * 1998-07-30 2000-02-10 University Of South Florida Procede de modulation du fonctionnement de facteurs de transcription
WO2001040301A2 (fr) * 1999-12-01 2001-06-07 Akzo Nobel N.V. Gene nouvellement identifie, interrompu en cas de schizophrenie

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COHEN B ET AL: "ENHANCER FUNCTIONS AND IN-VITRO PROTEIN BINDING OF NATIVE AND MUTATED INTERFERON-RESPONSIVE SEQUENCES" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 17, no. 4, 1989, pages 1679-1696, XP001155664 ISSN: 0305-1048 *
COLLIE-DUGUID E S R ET AL: "Inhibitory effect of fish oil N-3 polyunsaturated fatty acids on the expression of endothelial cell adhesion molecules" BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 220, no. 3, 1996, pages 969-974, XP002258124 ISSN: 0006-291X *
MERARO DAVID ET AL: "IFN-stimulated gene 15 is synergistically activated through interactions between the myelocyte/lymphocyte-specific transcription factors, PU.1, IFN regulatory factor-8/IFN consensus sequence binding protein, and IFN regulatory factor-4: Characterization of a new subtype of IFN-stimulated response el" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 168, no. 12, 15 juin 2002 (2002-06-15), pages 6224-6231, XP002258123 ISSN: 0022-1767 *
SCHLAAK JOERG F ET AL: "Cell-type and donor-specific transcriptional responses to interferon-alpha. Use of customized gene arrays." JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 51, 20 décembre 2002 (2002-12-20), pages 49428-49437, XP002258300 ISSN: 0021-9258 *
YUAN J ET AL: "THE SIGNALLING PATHWAYS OF INTERLEUKIN-6 AND GAMMA INTERFERON CONVERGE BY THE ACTIVATION OF DIFFERENT TRANSCRIPTION FACTORS WHICHBIND TO COMMON RESPONSIVE DNA ELEMENTS" MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 14, no. 3, 1 mars 1994 (1994-03-01), pages 1657-1668, XP002053442 ISSN: 0270-7306 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2850669A1 (fr) 2004-08-06
EP1590486A2 (fr) 2005-11-02
WO2004072222A3 (fr) 2005-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6607879B1 (en) Compositions for the detection of blood cell and immunological response gene expression
Macedo et al. Genetic variability of Trypanosoma cruzi: implications for the pathogenesis of Chagas disease
US20160194715A1 (en) Molecular predictors of fungal infection
Bogaert et al. Differential mucosal expression of Th17-related genes between the inflamed colon and ileum of patients with inflammatory bowel disease
CA2103933A1 (fr) Fragments d&#39;adn de mycobacteries, amorces d&#39;amplification, sondes d&#39;hybridation, reactifs et procede de detection de mycobacteries
EP1235933A2 (fr) Marqueurs de reaction toxicologique
TW201022492A (en) Blood transcriptional signature of mycobacterium tuberculosis infection
EP2021504A2 (fr) Microréseaux de détection d&#39;une sepsie
EP3384047B1 (fr) Procede d&#39;evaluation du risque de complications chez les patients qui presentent un syndrome de reponse inflammatoire systemique (sirs)
AU2016265726A1 (en) Detection of T cell exhaustion or lack of T cell costimulation and uses thereof
TW200533758A (en) Methods of diagnosis
Gras et al. Changes in gene expression pattern of human primary macrophages induced by carbosilane dendrimer 2G-NN16
CN115135779A (zh) 鉴定宿主rna感染生物标志物
Hart et al. Quantitative gene expression profiling implicates genes for susceptibility and resistance to alveolar bone loss
Chitko-McKown et al. Gene expression profiling of bovine macrophages in response to Escherichia coli O157: H7 lipopolysaccharide
WO2005032347A2 (fr) Determination de la chemosensibilite de cellules a des agents cytotoxiques
JP2004507206A (ja) 診断上重要な組織特異的遺伝子
WO2004072222A2 (fr) Procede pour preparer une collection de moyens de detection de genes inductibles par un mediateur de l’inflammation, et applications
GB2454799A (en) Diagnosing infection, SIRS or sepsis using RT-PCR and biomarkers
Park et al. Towards profiling the gene expression of fibroblasts from atopic dermatitis patients: human 8K complementary DNA microarray
JP6788256B2 (ja) 冠動脈イベント予測のための方法及び試薬
EP1462527A1 (fr) Nouveaux marqueurs des affections intestinales inflammatoires
WO2021064327A1 (fr) Procédé pour déterminer la capacité d&#39;un individu à répondre à un stimulus
JP5726524B2 (ja) 炎症性筋障害を診断および評価するための組成物および方法
KR20030040518A (ko) 생리활성 물질의 스크리닝 방법

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004708383

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004708383

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2004708383

Country of ref document: EP