JP4744778B2 - 特定のランダム粒子アレイを適用した複数の被検体分子の分析方法 - Google Patents
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Description
(発明の属する技術分野)
本発明は、被検体−結合剤相互作用(interaction)に関する親和係数(affinity constant)及び反応速度特性を決定するための方法を含む、被検体及び結合剤間の結合相互作用を分析する多重化バイオアッセイに関する。
【0002】
(従来の技術)
抗体やオリゴヌクレオチド等の複数の結合剤を、平面的な支持体上に点状又は縞状に固定化することは、並行(多重化)結合アッセイにおいて、抗原やDNAのような複数の被検体の同時検出を容易にする。アッセイ処理量を増大させるため及び結合反応速度の研究のためのこのアレイ形式の小型化が開示されている。例えば、R.Ekins,F.W.Chu,Clin.Chem.37,955967(1991)、E.M.Southern,U.Maskos,J.K.Elder,Genomics13,1008-1017(1992)が挙げられる。近年、この手法は、G.Ramsay,Nat.Biotechnol.16,4044(1998)、P.Brown,D.Botstein,Nat.Genet.21,33-37(1999)、D.Duggan,M.Bittner,Y.Chen,P.Meltzer,J.M.Trent,Nat.Gent.21,10-14(1999)、R.Lipshutz,S.P.A.Fodor,T.R.Gingeras,D.J.Lockhart,Nat.Genet.21,20-24(1999)等に記載のように、特に広範な遺伝子分析を行う場合に非常に注目されている。
今日まで報告されているアレイ製作の主な技術は、V.G.Cheung,et al.,Nat.Genet.21,15-19(1999)に示されるように、種々の支持体上への一定少量のプローブ溶液のピントランスファーやインクジェットプリント形式での原料のスポッティングの改良、J.Cheng, et al.,Nat.Biotechnol.,541-546(1998)に示されるように、個々に電気的にアドレス可能な支持体領域内での、結合剤の電気泳動による連続的配置、及び、U.Maskos,E.M.Southern,Nucleic Acids Res.20,16791684(1992)、S.P.A.Fodor, et al.,Science 251,767-773(1991)に示されるような、オリゴヌクレオチドの位置分解性(spatially resolved)のin situ合成促進方法、又はA.V.Vasiliskov, et al.,BioTechniques 27,592-606(1999)に示されるようなオリゴヌクレオチドの共重合、を含むものである。これらの技術は、アレイ中の位置により構成プローブの化学的特徴が示される位置的に標識(encoded)されたアレイを製造する。
【0003】
(発明が解決しようとする課題)
これらの技術による個別化(customized)アレイの再現性ある製作において、定量的アッセイ中での確実な性能を確保するためには、ミクロ流体の制御及び/又は非常に複雑な光化学的操作が必要である。定量的に再現可能な態様で、100μm直径の付着形態を生成するためのミクロ流体のスポッティングは、精緻な容量制御によりナノリットル単位の一定量を分配することを含むが、これは、従来可能な流体操作方法の能力を超える困難な仕事である。更に、付着プロセスにおいて結合剤を大気に連続して通常数時間さらすことは、次の結合アッセイにおいて、分子構造及び結合剤のアクセス性に制御不能な影響を与える。in situのアレイ合成は、アレイ組成の変化に対応して再設計されなければならない一連の複数のマスキング及び光化学反応ステップに依存している。最後に、アッセイ能力は、結合剤の固定化に続いて、それぞれのアレイについてin-situで評価されなければならず、又、質的制御及び実施が困難なアレイ製造の問題が発生する。
【0004】
(課題を解決する手段)
本発明は、2つの種類の分子(被検体及び結合剤)間の定性的及び/又は定量的分子相互作用分析を行うためのバイオアッセイ形式中での粒子アレイの適用のための方法及び装置を提供する。ここで示される方法及び装置は、結合剤及び被検体分子間の結合相互作用を支配する、会合関係(association)の存在又は不存在、会合関係の強度、及び/又は会合関係及び解離関係(dissociation)の割合を決定することを可能とする。本発明は、特に、結合相互作用の定性的及び/又は定量的分析のための多重化(並行)アッセイのために有用である。
「被検体」及び「結合剤」は、結合相互作用に関与する分子をいう。例えば、被検体及び結合剤はDNA又はRNA断片(例えば、オリゴヌクレオチド)を含み、これら断片、のそれらの相補的シークエンスへの結合(ハイブリダイゼーション)が分析される。他の例では、リガンド及び受容体(receptor)間の結合相互作用が分析される。被検体及び結合剤の例として、同様に、アプタマー、ペプチド、ならびに蛋白(例えば、抗体)、抗原及び小有機分子が挙げられる。
「粒子」は、ビーズ化された高分子樹脂(ビーズ)を含むコロイド状粒子をいう。
【0005】
本発明は、同様に、上記に示されたように、選択された位置的構成に従って支持体表面上に置かれた化学的識別性のあるビーズ(例えば、標識(encoded)ビーズ)の選択された混合物からなる平面アレイの、自動化され、注文に対応した製作を提供する。この手法では、ビーズは、結合剤を有するように機能化される。例えば、結合剤が、好ましくは共有結合で、ビーズへ結合される。続いて、オフライン(off-line)でアレイ組立プロセスから独立して、品質制御及び性能評価が行われる。ビーズの標識化、機能化及び試験ステップ、支持体の設計、製作及び評価ステップ、用途に対して特異的な(application-specific)アレイの個別化組み立て(custom assembly)ステップ、ならびにオンライン(on-line)でのアレイの解読ステップ、のようなステップの分離は、計画的プロセス制御を可能にすることにより、柔軟な対応性、確実性、及び低コストのともすれば困難な組み合わせを可能にする。
ここで開示された方法は、プロセス再設計の必要性なしに、DNA又は蛋白配列のすばやい個別化を可能にし、チップ間のバラツキ及びスポット間バラツキの原因となる問題を排除する。更に又、ビーズアレイ形式は、アッセイ条件の最適化と同様に、チップから独立したビーズの特徴化を可能にする。加えて、複数のビーズアレイは、同一チップ上に保たれた分離された流体区画中で同時に形成されることができ、複数のサンプルの同時工程を可能とする。
【0006】
(発明の実施の形態)
用途に対して特異的なビーズアレイの製作は、現存の液体操作及び自動実験技術を使用して自動化できる一連のマルチステップ中の複数のプロセスを含む。ランダム標識アレイ検出(Random Encoded Array Detection、READ)プロセスには、被検体及び結合剤分子の複数の分子相互作用分析を含むアッセイ、ならびにDNA及び蛋白分析を含む、バイオアッセイ中でのそれらのアレイの使用と同様に、個別化ビーズアレイの製作が含まれる。
図1は、機能的構成要素及びプロセスフローの概略を示し、これらにより、個別化(custom)ビーズアレイが調製され、本発明の多重化生体分子分析において使用されることができる。アレイは、用途特異性の支持体(例えば、ウェハスケールチップ)の製造及び化学的に標識化され生物学的に機能化されたビーズ(例えば、108ビーズスケール/100μl懸濁液)の製造をするために、分離されたバッチプロセスを採用して調製される。ビーズは、アレイ組み立ての前に、形態学的及び電気的特性の決定等、それぞれの品質管理(QC)ステップにかけられる。更に、実際のアッセイは、通常、アッセイ感度及び特異性を最大化し、ビーズ間のバラツキを最小化して、アッセイ条件を最適化するために、それらが支持体へ導入される前に懸濁液中のビーズ上で行われる。支持体のためのQCステップは、光学的検査、偏光解析法及び電気的移動測定を含んでいてもよい。
【0007】
一旦、化学的標識付与及び生物学的機能化ビーズが支持体(例えば、チップ)と結合した場合、再製造又はプロセス再設計の必要をなくし、チップ間のバラツキと同様にスポット間バラツキの原因となる問題を排除するため、同一流体相中の支持体上の指定区域上で高密度アレイのすばやい組み立てのために、表面近傍粒子の光制御電気反応速度論的アセンブリ(the Light-controlled Electrokinetic Assembly of Particles near Surfaces、LEAPS)が使用されてもよい。更に又、このビーズアレイ形式は、アッセイ条件を最適化するのと同様に、ビーズのチップから独立した特徴付けを可能にする。加えて、同一チップ上に保持されたそれぞれ別の流体区画中に、複数のビーズアレイが同時に形成されることができる。一旦形成されると、それら複数のビーズアレイは、複数のサンプルの並行処理に使用されることができる。ミクロ流体のLEAPSとの集積化により、自己完備性があり、小型化され、光学的に制御可能な、蛋白及びDNAの並行分析用プラットフォームが製造される。LEAPSは、電解質溶液と電極の境界間で懸濁された粒子を移動させる方法に関するものであり、「表面近傍粒子の光制御電気反応速度論的アセンブリ」の表題の下に、米国特許出願番号09/171,550(同様にPCT国際出願番号PCT/US97/08159)に、公開されており、ここでは、その全体を引用して本書の1部とする。同様に、ここでその全体を引用して本書の1部とするのは米国特許出願番号09/397,793(同様にPCT国際出願番号PCT/US00/25466)であり、「制御可能なパターン形成のためのシステム及び方法」がその題である。
【0008】
本発明のある態様においては、化学的標識は、励起波長、発光波長、励起存続時間、又は発光強度によりスペクトル的に識別可能な1又は2以上の蛍光染料を含むもの等光学的に識別可能な標識によりビーズを染色することにより達成される。例えば、Fulwyler,US4,717,655(1988年1月5日)に開示されたように、光学的に識別可能な標識が、特定割合でビーズを染色するのに使用される。同様に、公知の方法[Molday,Dreyer,Rembaum & Yen,J.Mol Biol 64,75-88(1975)、L.Bangs,「均一ラテックス粒子」,Seragen Diagnostics,1984]に従って、粒子を膨潤させることで、染色が達成できる。例えば、12種までのビーズが、膨潤及び2色のバルク染色がなされ、それぞれ個々に4つの強度レベルを有し4つの規格モル割合で混合されることにより標識を付される。外側及び内側表面の組み合わせ色コードは、国際出願番号PCT/US98/10719に開示されており、ここではその全体を資料として使用する。
【0009】
ビーズは、例えば公知のいくつかのカップリング反応(G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques(Academic Press,1996)、L.Illum,P.D.E.Jones,Methods in Enzymology 112,67-84(1985))の一つによる公知のプロセスに従って、結合剤分子を結合されることにより機能化される。上記結合分子としては、DNA(オリゴヌクレオチド)又はRNA断片、ペプチド又は蛋白、アプタマー及び小有機分子が挙げられる。本発明のある態様では、機能化ビーズは、ビーズと共有結合されている結合剤分子(例えば、DNA、RNA又は蛋白)を有する。ビーズは、必要になるまで緩衝化バルク懸濁液中に保存することができる。機能化は、一般的には、図2に示されるような、多くの目的とする機能性基を、指定されたビーズに共有的に結合させるため、標準的な液体操作ロボット工学及び96−ウェル形式を使用して並列的に行われるワン−ステップ又はツーステップ反応が必要である。好ましい態様としては、コア−シェル構造のビーズが使用される。好ましい組成物の高分子ブロッキング薄層の形態をしたシェルが選ばれる。更に、機能化は、公知の標的アッセイの適用に従って行われる。サンプルは、自動化QC測定のため抽出されてもよい。それぞれのビーズバッチは、数十万のチップの材料を提供するためチップ間のバラツキは最小化される。
【0010】
本発明で使用される支持体(例えば、チップ)は、例えば、印加されるAC電界の存在下で目的とするインピーダンス勾配の構成を形成するための酸化物又は他の絶縁材料のパターン化成長等による、LEAPS境界パターニング法に従ってパターン化される。パターンは、目的とするAC電界−誘導流体流及び対応する粒子移動が構成されるように設計できる。支持体は、図3のように、セミコンダクター処理技術を利用してウェハスケール上でパターン化できる。更に、UV−パターン化可能な光学的に透明な高分子薄膜を支持体に貼り付け、流体管及び区画を目的のとおり配置して、流体を1又はいくつかの分離した区画に区切ることにより、与えられた支持体上の複数のサンプルに対応することが可能となる。
本発明のある態様では、第1平面電極が第2平面電極と実質的に平行(「サンドイッチ」構造)であり、ギャップにより分離され、電解質溶液が満たされている2つの電極を用意することにより、ビーズアレイが調製される。第2平面電極の表面又は内部は、表面パターン法によりパターン化される。標識化及び機能化ビーズは、ギャップに導入される。AC電圧がギャップ間に加えられた場合、ビーズは、第2電極(例えば、「チップ」)上でランダム標識アレイを形成する。そして同様に、LEAPSを使用して、ビーズアレイが「光感受性電極」(チップ)上に形成される。好ましくは、上記記載のサンドイッチ構造には、平面光感受性電極及び他の平面電極が同様に使用される。更に又、2つの電極は、ギャップにより分離され、電解質溶液を保持する。機能化及び標識化されたビーズは、ギャップに導入される。AC電圧を光と共に印加することで、ビーズは光感受性電極上でアレイを形成する。
【0011】
ある態様では、本発明に有用な用途特異性のビーズアレイは、特定のアレイ構成に従ってそれぞれの貯留部から指定標識ビーズ一定量を取り出ことにより製造され、貯留される(pooled)。貯留された懸濁液のそれぞれの一定量は、選択された支持体(例えば、チップ)上に、それらの初期融合を防止する方法で分配される。(分配された)懸濁液は、標識ビーズの多くの平面ランダムサブアレイを形成する。それぞれのサブアレイは、それぞれ別個の貯留から得られるビーズを表し、物理的アレイの配置は、貯留されたビーズ母集団から得られた一定量の分画の物性に一意的に対応する。
化学的又は物理的に標識化された支持体上の標識化ビーズの平面アレイ、もしくはアセンブリが使用できる。この場合、実施されるアッセイ数を増加させるため、位置的標識も加えて使用できる。例えば、アセンブリの過程中での単一流体相中で、表面近傍粒子の光制御電気反応速度論的アセンブリ(LEAPS)を利用することにより、交流電界に応じて、及び/又は支持体上に照射される光パターンに従って、目的とする構造中での平面的ビーズアレイの組み立てのため、位置的標識が達成できる。LEAPSは、アレイアセンブリを仲介する電気流体学的力を調整するために、シリコンチップ及び溶液間の境界のインピーダンスの横方法の勾配を発生させる。電気的な条件は、比較的緩い。2つの平面電極間に、一般的には10Vpp未満の低AC電圧が、一般的には100μmの流体ギャップ間に印加される。この組み立てプロセスは、早く、光学的に制御可能である。数千のビーズを含むアレイが、数秒以内に電界中に形成される。複数のサブアレイの形成も、区画化されたチップ表面上に保持された多くの流体相中で、同様に可能である。
【0012】
本発明の多重化アッセイも、組み立てられているがアレイとなっていない、ビーズ標識ビーズを使用して、支持体表面上で同様に実行できる。例えば、ビーズ懸濁液を支持体の複数の区域にスポッティング配置し、ビーズを重力下に沈着させることで、ビーズアセンブリが支持体上に形成される。LEAPSで形成されるビーズアレイに対して、これらのアセンブリは、通常低密度で乱雑な構造を有すると推定される。しかし、支持体上の多くの分離された位置に化学的標識ビーズ混合物をスポッティング配置することにより達成される位置的及び色彩的標識の組み合わせは、特定のバイオアッセイのために十分な程度の多重性を提供する。
それらのビーズ上の結合剤及び被検体の結合相互作用は、支持体上に標識アレイを組み立てる以前又は以後のどちらで発揮されてもよい。例えば、ビーズアレイがアッセイ後に形成され、続いてアレイのアッセイイメージ及び解読イメージが得られてもよい。一方、例えば、図10に示されるようなアレイ形状のランダム標識アレイを形成するために、ビーズをアレイに組み立て、物理的又は化学的手段により固定化することができる。アレイは、図10に示されるようなアレイ形状のランダム標識アレイを形成するために、例えば、DC電圧を印加することにより固定化できる。DC電圧が、一般的には5−7V(2−6μmビーズ及び100−150μmギャップサイズ用)に設定され、n−ドープされたシリコン支持体が負極を形成するように逆バイアス(reverse bias)配置で30秒未満印加され、アレイ中の近接したビーズ間の接触を促進させる範囲に、アレイを圧縮する。又同時に、上記DC電圧は、電極表面直近の高電界領域方向へのビーズの移動を引き起こす。十分近傍になると、ビーズは物理的吸着を引き起こすファンデルワールス力により固定される。この吸着プロセスは、ビーズ表面上に、ビーズ表面から伸ばされる「つなぎ縄(tethers)」母集団を提供することにより促進される。ポリリジン及びストレプトアビジンがこの目的のため使用される。
【0013】
ある態様によると、例えば、ゲル−粒子複合フィルムを形成することにより、粒子アレイは化学的手段により固定化されることができる。このようなゲル−成分粒子複合フィルムを形成する方法の一例では、次に続くin-situゲル形成のための全ての構成要素、すなわちモノマー、架橋剤及び反応開始剤、を同様に含む微粒子懸濁液が用意される。粒子は、LEAPSを適用して、支持体上の平面アセンブリとして組み立てられる。例えば、数100ヘルツから数キロヘルツ範囲での周波数で、1−20VppのAC電圧が、流体ギャップを挟んで電極にかけられる。アレイ組み立てに続き、印加AC電圧の存在下で、IRランプの使用又は水銀ランプ源の測光学的使用によりセルを40−45℃に熱的に加熱することにより、流体相の高分子化が開始され、ゲル中に粒子アレイを効果的にトラップする。ゲルは、アクリルアミド及びビスアクリルアミドの混合物で、モノマー濃度を20%から5%へ変化させたもの(アクリルアミド:ビスアクリルアミド=37.5:1、モル比)でもよく、又、他の低粘度水溶性モノマーもしくはモノマー混合物も同様に使用できる。このプロセスにより化学的に固定化された機能化微粒子アレイは、種々のバイオアッセイ、例えば、リガンド受容体結合アッセイに使用できる。
一例としては、高分子反応混合物の通算イオン長が、0.1mMから1.0mMの範囲となるように、アゾビスイソブチルアミジン・2塩酸塩を低濃度で熱開始剤として使用してサーマル水性ゲルが形成される。UV高分子反応のために使用される開始剤は、商品名イルガキュア(Irgacure)2959(2−ヒドロキシ−4’−ヒドロキシエトキシ−2−メチルプロピオフェノン、チバガイギー社製、タリータウン市、ニューヨーク州)である。開始剤は、1.5重量%溶液となるようにモノマーへ添加される。
【0014】
ある態様では、粒子アレイは、機械的手段により固定化される。例えば、ミクロウェルアレイは、例えば、シリコン支持体の低インピーダンス領域での標準的セミコンダクター処理法により製造される。粒子アレイは、このような構成、例えば、LEAPSが取り扱う、流体力学的力及び動重力を利用して孔アレイ上の粒子の移動及び蓄積を行わせることにより形成できる。次いで、AC電界は切断され、粒子はミクロウェルアレイ中にトラップされ、機械的に分画される。過度のビーズは、支持体表面上に幾何学的に定められたランダムビーズアレイを残して除去される。
ビーズアレイがアッセイ前に固定化された場合、そのアレイは、アレイに接触する溶液から被検体又はリガンド(DNA、蛋白又は他の小同種リガンド)を捕捉するための受容体又は結合剤(例えば、オリゴヌクレオチド、cDNA、アプタマー、抗体、又は他の蛋白)の機能を発揮させる二次元親和性(two dimensional affinity)マトリックスとして、機能する。例えば、遺伝子型特定、遺伝子発現分析、循環蛋白レベルの分析及び多成分の反応速度研究等の多重化分子分析を行うために、ビーズアレイプラットフォームを使用することができる。
【0015】
支持体(例えば、チップ)は、1又は2以上の閉鎖された区画室の中に置かれ、サンプル及び試薬が流体相互結合手段を通って区画室を出入りして移動されることが可能となる。例えば、インターロイキン(IL−6)等のサイトカイン用オンチップ免疫学的アッセイ(immunoassay)は、この形式で行われる。続いて、血清サンプル及び蛍光標識化第二抗体が反応器中へ導入され、チップ上に固定化されたビーズと反応させられる。図5は、本発明に従って、多重化アッセイ中で使用できる反応器の設計を示す。反応は、同様に、マイクロタイター(microtiter)プレートに似た開放区画室形式でも行うことができる。試薬は、ロボット工学的液体操作装置によりチップ最上部に分注され、複数のサンプルが同時に処理される。このような形式は、現在のマイクロタイタープレート形式のための標準的サンプル処理及び液体操作に適合し、サンプル処理及びアレイ検出を集積化するものである。
ある態様では、被検体−結合剤相互作用の存在は、相互作用及び検出され分析されるそれらの光学的変化に含まれるビーズの光学特性の変化に関連する。相互作用に含まれる結合剤の同一性は、それらのビーズと関連する化学的又は物理的に識別可能な特徴を検出することにより決定される。好ましくは、化学的に識別可能な特徴を有するものは、蛍光染料、発色剤を含む化学分子、及び結合剤アッセイ中で検出目的で使用される他の化学分子を含む。
【0016】
例えば、アレイのアッセイイメージ(画像)及び解読イメージ(画像)を得てその二者を比較する等の化学的又は物理的に識別可能な特徴の検出、及び結合相互作用に関連して変化する光学特性の検出は、粒子が支持体上の平面アレイに組み立てられる間行われる。なお、上記アッセイイメージ及び解読イメージを比較することは、イメージ検出器及びコンピュータイメージ保存装置を含む光学的顕微鏡設備ならびに分析設備の使用を含む。解読イメージは、化学的及び/又は物理的に識別可能な特徴を決定するために得られる。その特徴は、例えば、識別可能な特徴によりアレイ中のそれぞれの粒子上の結合剤を特定する等、一意的にビーズ表面上にその機能が示される結合剤を特定するものである。アレイのアッセイイメージは、結合剤及び被検体複合体の光学特性を検出するために得られる。ある態様によると、被検体がビーズに結合された場合のように、蛍光標識(蛍光染料)が被検体に結合されると、蛍光強度は変化し、ビーズの光学特性の変化が起きる。
ある態様によると、ビーズがアレイに組み立てられ固定化された後であって、アッセイイメージを得る前に、好ましくは、ビーズ上の結合剤と被検体とが接触する前に、解読イメージが得られる。他の例によると、ビーズが溶液中にあり、その後アレイが組み立てられる間に、結合相互作用が起こり、解読イメージ及びアッセイイメージが得られる。混合物−被検体複合体の結合剤の特定は、解読イメージをアッセイイメージと比較することにより行われる。
【0017】
好ましい態様としては、解読イメージ及びアッセイイメージから得られるデータを解析するために、イメージ解析アルゴリズムが有用である。これらのアルゴリズムは、アレイ中のそれぞれのビーズの定量的データを得るために使用される。
図7に要約されるように、分析ソフトウェアは、アレイの明視野イメージを種類に従ったグループビーズのテンプレートとして使用して、自動的にビーズ中心を決定し、個々のビーズの定量的強度を確定し、血清サンプル中の異常形状のマトリックス材料により形成されるもののような欠陥(blemishes)を排除し、背景強度統計を分析し、対応するバラツキと共に背景補正された全ビーズ種の平均強度を評価する。
本発明の方法は、例えば、被検体を時間依存的方法で導入し、時間の関数として結合を分析したり、結合された被検体を時間依存的方法で洗浄し、同様に時間の関数として結合を分析して、会合係数及び解離係数を決定するために使用できる。
本発明の方法は、形成された被検体−結合剤複合体の数を決定するための、被検体−結合剤相互作用の親和係数を決定するために使用される。
本発明は、生物学的サンプル中の被検体濃度を決定するための方法を提供する。
本発明の方法は、又、与えられた被検体の結合剤パネル(一組の結合剤)に対する共親和性マトリックスの構成要素を決定するために使用できる。例えば、競合的多成分平衡反応において被検体及びパネル中の結合剤間の相互作用の範囲が決定される。共親和係数(co-affinity constant)の決定は、下記に示す有用な適用を提供する。
【0018】
種々の臓器移植の成功率は、提供者及び受容者間のヒト白血球抗原(HLA)の適合性に直接的に関係している。パネル反応性抗体(PRA)への受容者の血清学的試験は、可能性のある拒絶反応を避けるため重要なステップの一つである。PRA試験のクロス反応は、いくつかのHLA抗原構造及びそれらの抗体の発達特性の類似性により、ごく普通の現象である。実際、HLA抗原は、そのグループ間の明瞭な血清学的クロス反応性に基づき、グループわけされることができる。
それらのグループは、クロス反応性グループ(CREGs)と名づけられる。現在の臨床状況(clinical setting)において、患者からの抗体は、個別反応において異なった複数抗原に対して試験される。抗体の反応性パターンは異なる反応の結果を組み合わせて生成されるが、異なる抗体及び抗原間相互作用の競合的性格は、そのようなパターンには反映されない。他の場合には、いくつかの抗原は、結合アッセイのために共に混合される。このシステム中のそれぞれの抗原の特定を欠くと、結合の分析結果(プロフィール)の作成が困難になる。その結果は、いくつかの抗原からの平均信号に過ぎない。ビーズアレイシステムにおいては、異なる抗原のパネルは、競合的結合環境において抗体被検体へ提示され、それぞれの抗原は、異なる種類のビーズとの会合によって特定されることができる。このように、競合的反応におけるそれぞれの抗原への結合強度は、単一のアッセイにより得ることができる。この共親和性マトリックスシステムは、CREGsのための結合の分析結果を提供し、反応の性格の理解を非常に促進し、関連する臨床判断の正確性を改良するものである。例えば、N個の抗体及びM個の抗原のシステムは、可能な反応のN×Mマトリックスを提供する。M番目の抗原に対するN番目の抗体間の相互作用を支配する親和係数K−nmを決定することが可能である。ここで、m=1,2,..M、及びn=1,2,...Nである。完全な共親和係数が必要でない場合の応用のためには、結合の分析結果は、本発明の方法に従って種々の抗体のために作成され、患者サンプルの結果は、これらの分析結果又は、これらの分析結果の組み合わせに適合させることができる。
【0019】
共親和性マトリックスも又、被検体を特徴付けるために使用できる。例えば、共親和性マトリックスの係数ならびに、被検体−結合剤複合体を構成している被検体及び結合剤の既知の濃度の組み合わせは、競合的結合相互作用記述子(descriptor)を決定するために寄与する。
例えば、分子相互作用変数、
【0020】
【数1】
【0021】
は、複数の被検体{Lj、1≦j≦N}(それらの全ては、結合剤のための有限親和性Kmj を示す)の存在下で、結合剤Rm及び1の被検体L n 間の分子相互作用の特異性を示す。すなわち、Pn,0≦Pn≦1は、複数成分の競合的反応において、被検体Lnのための結合剤Rmの標準化された特異性を示し、複数成分の競合的反応中で示される共親和性に基づいた結合剤の確かな特徴付け手段として働く。同様に、ここで引用して本書の一部とされるP.H.von Hippel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83,1603(1986)を参照されたい。
結合剤パネルに対する被検体の結合剤相互作用のパターンは、被検体を特徴付け、他の分子と比較するために使用される。更に、結合剤の対照パネルを使用して被検体の共親和性マトリックスを生成することにより、このような親和性は、結合剤パターン中のバラツキを観察することにより、後に結合剤パネル中へ導入されるサンプルが不純物を含有するか否かを決定するために使用される。
本発明は、同様に、米国特許番号5,759,820及び欧州特許番号83901406.5(Sintef)に記載されている超常磁性粒子(磁性粒子)の使用を提供しており、それらは、標識ビーズアレイを含むアッセイステップと共に、集積化されたサンプル準備ステップにおいても使用される。これら参考資料の両方を引用して本書の一部とされる。
【0022】
超常磁性粒子は、化学的又は物理的に識別可能な特徴(例えば、蛍光標識)により標識化され、本発明のバイオアッセイを行うために使用される。ある態様によると、粒子は、非磁性標識ビーズとしてLEAPSを使用して組み立てられる。同様に、標識(ビーズ)は、アレイ生成、組み立てに使用される。本発明は、同様に、上記粒子へ磁界を適用することによる、支持体上に標識化され機能化された超磁性粒子の平面アレイの形成を含む。
単分散超常磁性ミクロスフィアのいくつかの合成方法が公知である。例えば、G.Helgesen et al.,Phys.Rev.Lett.61,1736(1988)では、多孔性であり高度に架橋されたポリスチレンコア粒子を使用し、最初に粒子内側の表面が硝酸処理され、次に鉄酸化物を粒子全体に析出させ、常磁性コアを製造する方法が開示されている。このステップの完結に続き、粒子は、機能性高分子によりコートされて反応性シェルが得られる。Wangらによる米国特許番号5,395,688は、磁気感受性金属酸化物層により均一にコートされている蛍光高分子コア粒子からなる磁気感受性蛍光高分子粒子の製造プロセスを開示している。この方法は、予め形成された蛍光高分子コア粒子を使用し、このコア粒子は、水中でスチレン及び磁性金属酸化物のエマルジョンと混合され、重合される。このような2ステップ反応プロセスは、蛍光染料による高分子化阻害、又はシェル重合プロセスにより蛍光が反対に漂白される可能性の問題を有する。
【0023】
この方法は、又、着色標識磁性ビーズの新規製造プロセス、下記に記載された手順に従って調製され、よく制御された量の磁性ナノ粒子を、よく制御された量の1又は2以上の蛍光染料と共に、予め形成された高分子ミクロ粒子へ導入するための単純で弾力的なワンステッププロセスを提供する。本発明の1の態様では、磁界を磁性ナノ粒子に適用しながら、支持体上にアレイを形成する磁性粒子を製造するために、磁性ナノ粒子の量を制御する。このプロセスは、染料及び磁性ナノ粒子を含有する有機溶媒中で高分子粒子を膨潤させることを含むため、ミクロ粒子の蛍光染色の従来技術で知られているような標準的な膨潤手順を行うことのできるどのような高分子粒子へも適用できる。磁性材料及び蛍光染料がそれぞれ磁性粒子(コア/シェル)の異なった範囲に位置する標識方法と異なり、粒子の均一な膨潤は、内部容量全体に磁性粒子を確実に分散できる。このプロセスは、又、広い範囲の染料含量とナノ粒子の定量的制御を可能にし、従って、蛍光強度と粒子磁性感受性の調整を可能とする。導入制御以外の、ホスト粒子の磁性特性を制御する本発明の更なる方法は、ミセル合成反応(下記参照)の水含量を調整することにより磁性ナノ粒子の大きさを調整することである。
粒子表面上で可能な、生体分子の物理的又は化学的カップリングは、以前から存在する機能性基を使用する。磁性ナノ粒子の浸出は、粒子上のさらなる高分子シェルの成長により容易に排除される。
本発明が更に完全に理解されるために、下記実施例を挙げる。これら実施例は、例示のために使用され、本発明をどのようにも制限するためのものではない。
【0024】
(実施例)
実施例1:光学的に設定可能なアレイ構成
図9に示すように、LEAPSは、複数のランダム標識サブアレイを同時に組み立て、これらサブアレイを、通常の閉鎖した液体環境下のチップ上で、分離しているが近接している位置にドラッグアンドドロップすることができる。別々の貯留部A及びBから供給される2組のビーズ(2.8μm Oligo-(dT)25,Dynal,オスロ市、ノルウェイ国)は、同一流体中で、同時に別個のサブアレイに組み立てられた。そして、サブアレイは、PC−プログラム制御可能な照射パターン製造機(illumination pattern generator)(1999年9月17日付提出U.S.SerialNo.09/397,793号に記載。ここにその全体を引用して本書の一部とする。)により、支持体上に生成され照射された位置的に異なる照射分布により、指定された目的位置に、同時に組み立てられる。このドラッグアンドドロップ操作は、二つのサブアレイ間の距離を約250μmから20μmへ減少させた。ビーズは、波長2kHz、5Vppで移動され、支持体表面へ照射された合計パワーは、〜5mWであった。化学的及び位置的標識の組み合わせは、与えられた種類の化学的ビーズ標識が複数回使用されることを可能とし、大きな標識能力の達成を促進しつつ、いずれかの標識次元での制限を減少させることができる。
【0025】
実施例2:パターン化された表面上のアレイの形成
図10は、水性ビーズ懸濁液で満たされた100μm電極間のギャップに直交して、電圧1−2Vpp及び周波数100−150HzのAC電圧を印加して、パターン化されたシリコンチップ上に組み立てられた標識化ビーズのアレイである。支持体上の熱酸化物(thermal oxide)(〜1000Å)は、130μm中心上で一組の正方形(〜30×30μm2)中で酸化物を厚さ50〜100Åになるようにエッチングしてパターン化された。同様の設計アレイは、適切な照射パターンに応じて生成される。ここで示されるそれぞれのサブアレイは、抗サイトカインモノクローナル抗体と結合した約80ビーズを含む。5.5μm直径のカルボキシル化変成ポリスチレンビーズ(Bangs Laboratory社製、フィッシュ市、インディアナ州)は2種類の蛍光染料で染色され、更に抗サイトカイン−mAbで機能化された。組み立てプロセスにおいては、支持体表面のすべてのビーズが収集された。ビーズ標識は次のとおりである。IL−2(ブライトレッド)、IL−4(薄暗い赤)、IL−6(ブライトグリーン)、M−CSF(薄暗い緑)及びTNF−a(黄色)。
【0026】
実施例3:磁性粒子のアレイの形成
有限な反磁性感受性を示すコロイド状粒子は、平面状の支持体上に置かれた場合、磁界の増加に応じて規則的に組み立てられる。流体懸濁液から、流体セルの二つの平行した境界(「サンドイッチ」構造)の低いほうの平面的な表面上に分散された市販の超常磁性粒子(Dynal社製、オスロ市、ノルウェイ国)は、均一な軸方向の磁界(支持体平面に対し垂直な方向)にさらされた場合、規則的アセンブリを形成する。増加する磁界強度の機能として、そして、公知の製造プロセスにより制御された粒子の特定の反磁性感受性に対し、規則的平面的アセンブリ及び支持体に対して垂直に配向したビーズの直線状の縞が形成できる。永久磁石は、目標とするアセンブリ構造を実現するために必要な磁界強度を生成するように設計できる。必要な磁界構造は公知のソレノイド又はヘルムホルツ構造の電磁石により作成できる。支持体は、磁性孔に置かれたり、孔の外側のコイルに直接隣接しておかれ、支持体平面に対し実質的に正常に磁界の配向を受けるようにすることができる。位置的に調整された磁界は、支持体を公知の方法でパーマロイ(商標名、permalloy)でパターン化することにより作成できる。
【0027】
実施例4:ランダムなビーズアセンブリの形成
懸濁ビーズを含有する一定量の溶液が、酸化シリコン薄膜で覆われたシリコンの平面支持体(他の支持体もここで使用できる)上の数カ所に置かれた。ビーズは、重力によりランダムなアセンブリを形成した。支持体上に分離した区画を描くために、下記二方法の一つが使用された。第一の方法によると、1mm又は2mm直径の多数の円孔の格子を有するシリコンガスケット(250um厚み)(Grace Bio−labs社製、ベンド市、オレゴン州)が、親水性表面上に、ビーズ懸濁液の複数の分離したサンプルのためのミクロウェル(0.25ulから0.5ul容量)を分画するために置かれる。第二の方法によると、ビーズを含有する流体の一定微少量(0.2ulから0.5ul容量)が、1又は2以上の指定された範囲の親水性表面上に直接置かれ、分離した小滴を形成する。この場合、スペーサは必要ない。溶媒が(室温又は急速乾燥のため約60℃に昇温して)蒸発するに従い、ビーズは支持体上にランダム配置で残る。DNA多型(polymorphism)反応は、両方の方法で形成されたアセンブリにより試験できる。任意に、重力下で設置されたビーズは、支持体上に設けられた化学的捕捉層により固定化されてもよい。複合形式における親和係数の決定のためのランダムビーズアセンブリの適用は、実施例6に記載されている。
【0028】
実施例5:自動的チップスケールアレイの製造プロセス
図11に示されるように、このプロセスは、液体の処理及び、シングルチップカートリッジ又はマルチチップカートリッジ中に設けられたチップ上に、ビーズをピペットで移す操作を含む。ビーズアレイは、実施例1、2又は3の方法等を使用して形成された後、アレイ固定化され、解読される。得られる解読イメージは、後に光学的チップID(バーコード)と共に使用するために保存される。
【0029】
実施例6:ビーズアセンブリのポストアッセイ分析による親和係数の決定
サイトカインTNF−α及びIL−6のための定量的結合曲線。結合曲線は、懸濁液中の化学的標識ビーズを使用してサンドイッチ型免疫学的アッセイを実施することにより生成された。上記懸濁液はチップ上に区画された1もしくは2以上の反応区画又はチップ外の1もしくは2以上の反応区画までに制限される。懸濁液中のビーズとの反応を完結させるため、均一アッセイと同様な反応速度アッセイ(assay kinetics)が達成される。結合反応の完結に続き、ビーズはチップ上に組み立てられ、複数の定量的イメージ分析を可能とする。実施例4に従い調製されたランダムアセンブリ、又は実施例1又は2に従い調製された規則的ビーズアレイを使用することができる。実施例1又は2の方法により調製された規則的高密度アセンブリの長所は、更に大量のビーズを処理する場合に達成される、より高度の位置的密度及び高度のアッセイにある。
例えば、図12は、ランダムに分散されたビーズから得られる、TNF−α及びIL−6Aの定量的結合曲線を示す。市販レベルの8ビットビデオCCDカメラ(Cohu社製、サンディエゴ市、カリフォルニア州)が、マルチフレームインテグレーションを遂行するモードで使用された。二つのアッセイ中で使用される抗原濃度範囲は、TNF−αについて700fMから50pM、IL−6について2pMから50pMであった。それぞれの濃度で、ビーズあたりに結合している分子数は、ビーズあたり既知量のCy5.5標識化BSAで被覆されている検定標準ビーズと比較することにより推定できた。必要な補正は、ラベル化第二抗体及びBSA間の蛍光量効率の差異から行われた。
この分析法の構成は、質量作用の法則に従い、[LR]をビーズあたりの受容体−リガンド対の数、[L]をリガンドの溶液濃度とすると、親和係数KA=[LR]/([R0−LR][L])を決定することを可能とする。1mlあたりのビーズ数nBを特定し、ビーズあたりの受容体数としての[R0]値を特定することにより、与えられたKAに対して計算される理論的結合曲線は、バルクリガンド濃度の関数として、ビーズあたりの結合分子数のプロットと比較される。ビーズあたりの結合リガンドの絶対数は、ビーズあたりの平均蛍光強度を測定し、これをアレイ中に含まれる検定標準ビーズから記録される蛍光強度と対照することにより、与えられたバルク濃度に対して決定されることができる。
【0030】
ビーズあたりに結合している分子の推定数は、質量作用の法則から導き出される理論的結合曲線と比較される。表された3つの曲線は、それぞれ1011/モル、1010/モル及び109/モルの親和係数KAに対応する。ビーズあたりの抗体の初期数R0は2×105/ビーズと同じであり、nB=105/mlである。それぞれのデータポイントは、アッセイ同士で<45%のバラツキで、3つの複製物の平均を示す。アッセイイメージ中での単位のシグナル/ノイズレベルを生じる蛍光レベルに対応するアッセイ感度を設定するために、図12に特徴付けられるサイトカインアッセイ感度は、それぞれの検出された濃度であるTNF−αの700fM及びIL−6の2pMに対応して、〜2,000結合リガンド/ビーズに設定されている。
市販のELISAキットは、アッセイ条件及び制御に関するさらなる複雑性の代償を払って、感度を強化するための酵素増幅(enzymatic amplification)を利用するのに対し、本発明のビーズアレイアッセイ形式は、酵素増幅を利用しない。本発明のチップ上アッセイ形式は循環レベルでのサイトカインの監視(血清中での通常のTNF−αレベルは、50−280fMであり、(血清中での通常のIL−6レベルは0−750fMである。www.apbiotech.com/technical/technicalindex.html)を可能にし、例えば、増幅した単一被検体ELISA アッセイ(R&D Systems and Amersham社製アッセイキット(最新の高感度アッセイではない))等の標準的なものに近いダイナミックレンジを提供する。ハードウェア及びソフトウェアレベルについてのさらなる改良が可能である。
【0031】
実施例7:多型(polymorphism)分析による遺伝子型特定
遺伝子型特定の実施への本発明の適用を示すために、図13は、1つの遺伝子の4つの多型(polymorphic)範囲に対応する5対の20−mer結合剤が、染色標識されたビーズと結合されているアッセイの設計を示す。対となるそれぞれの結合剤α1及びα2ならびにβ1及びβ2は、それぞれシークエンス中での一の異なるヌクレオチドを有する。δ3及びδ4の対は、3つのヌクレオチドの違いを示す。γ1、γ3、γ3及びγ4のセット中の結合剤は、挿入及び欠失が少ないことを示す。10の結合剤は、5つずつの2群に分けられ、2つのサブアレイに組み入れられた。この実施例において、それぞれのタイプに対し、数百のビーズがある。ビーズ固定化に続き、55℃、30分間、TMACバッファ(2.25Mテトラメチルアンモニウムクロライド、37mM Tris pH8.0、3mM EDTA pH8.0、及び0.15%SDS)中でオンチップハイブリダイゼーション反応が行われた。被検体は、一人の患者サンプルから調製された254−ベースPCR断片であり、BODIPY 630/650(Molecular Probes社製、ユージン市、オレゴン州)により5’−末端に蛍光ラベル化されている。イメージ捕捉は、アッセイバッファを新しいTMACバッファに交換した後に行われた。
図14は、一つのサブアレイに対する解読イメージ及びアッセイイメージを示す。ハイブリダイゼーション後に得られたアッセイイメージ中のそれぞれのビーズは蛍光強度及びビーズタイプを決定するために分析される。サイトカインアッセイのように、後者の操作は、テンプレートマッチングアルゴリズムを使用してアッセイイメージを解読イメージと比較する。図15は、それぞれのビーズタイプに対して得られた強度柱状グラフを示す。それらの柱状グラフのプロットにおいて、横軸は0から1までの相対信号強度であり、縦軸はビーズ数である。
柱状グラフは、プローブα1を有するビーズの大部分は被検体に結合していない一方、プローブα2を有するビーズの大部分は顕著な結合を示すことを表している。α2ビーズの平均信号レベルは、〜3.2の関数においてはα2ビーズのそれを超えており、被検体が、α1ではなくα2と相補性のDNAシークエンスを含むことを示している。ここに示される患者のサンプルでは、柱状グラフは、遺伝子の多型中で結合剤α2、β2、γ3、γ4及びδ4と相補性を有することで特徴づけられる被検体DNAの遺伝子型を示す。
【0032】
実施例8:遺伝子発現分析:cDNA断片
本発明の方法は、DNA断片(例えば、〜1,000塩基までの長さ)及びオリゴヌクレオチドを有するビーズからなるアレイを作成するために使用される。鎖はニックトランスレーション法により複数の位置でビオチン化(biotinylated)され、ストレプトアビジン(streptavidin)機能化されたビーズ(M−280、Dynal社製、オスロ市、ノルウェイ国)へ結合された。アレイはAC電圧800Hzで10Vppを使用して形成された。
【0033】
実施例9:共通ラベル化のためのループ化プローブ設計
図16のループ化プローブ設計は、ラベル化標的の必要をなくすために蛍光エネルギー移動を利用する。分子標識(molecular beacon)設計(S.Tyagi,D.P.Bratu.F.R.Kramer,Nature Biotech.16,49-53(1998))と同様に、図16のプローブは、閉鎖ループ及び開放ループ構造の2つの異なる蛍光状態が推定される。しかし反対に、競合的ハイブリダイゼーションアッセイにおいて分子の緊縮制御を可能とするために、分子標識は、その幹構造内にその結合モチーフ部分を含む。
【0034】
実施例10:サイトカイン発現の定量的多重化分析
図17は、多重化サンドイッチ型免疫学的アッセイにおいて単一のランダムアレイから記録された一対のアッセイイメージ及び解読イメージを示す。アレイは、それぞれがモノクローナル抗サイトカイン抗体(mAb)を有する5つの異なったビーズ種を含み、2つのサイトカイン抗原(Ag)を含むサンプル溶液(例えば、血清)にさらされた。続いてCy5.5−ラベル化第二抗体(pAb*)を添加することにより、3元複合体mAb−Ag−pAb*が形成される。オンチップ免疫学的アッセイは、チップ上に固定化されたビーズアレイにアッセイバッファ(20mM NaPi pH7.4,150mM NaCl,10mg/ml BSA)中の7nMサイトカインと共にサンプル300μリットルを加え、37℃、1時間で反応させることにより行われる。バッファはアッセイバッファの12nMラベル化第二抗体溶液を加えることにより置換される。37℃、1時間のインキュベーション後、新たなバッファがチップ上に加えられ、イメージ捕捉がなされる。アッセイに使用される抗体及び抗原は、R&D Systems(ミネアポリス市、ミネソタ州)から得られた。第二抗体は、スタンダードキット(Amersham Pharmacia Biotech社製、Piscataway市、ニュージャージー州)を使用してCy5.5によりラベル化された。
解読イメージ図17Bは、擬似カラーディスプレイにおける図10と同様の解読パターンを有する5つのビーズ種を示す。全てのビーズは、同一サイズである(5.5μm直径)。解読イメージ中の異なったタイプのビーズサイズの見かけの違いは、ビーズ内部の染色レベルが異なることを反映したアーティファクト歪み(artifact)及び、解読イメージのCCD記録中における焦点ボケ(blooming)である。図14Aの、解読イメージのアッセイイメージとの(ここで示されたイメージ分析法を使用した)比較は、それぞれTNF−α及びIL−6を捕捉した、黄色及びブライトグリーンタイプのビーズ活性を明らかにする。このアッセイ手順は、次の12のサイトカイン群、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−6、TGF−β1、IL−12、EGF、GM−CSF、M−CSF、MCP−1及びTNF−α、へも適用された。オンチップ免疫学的アッセイは、アッセイステップ間で反応物溶液を変更する以外は更に洗浄する必要がない。アッセイイメージ及び解読イメージの比較は、サンプル中に2つの異なるサイトカイン、すなわちIL−6及びTNF−αが存在することを示す。この実施例で示された予め形成されたアレイは、実施例6に示された分析と同じ手法で親和係数を同様に決定することができる。
【0035】
実施例11:プロテイン分析用アプタマー
アプタマーは、その血清蛋白への高度な結合親和性に関する多くの組み合わせライブラリから選択できる(L.Gold,B.Polisky,O.Uhlenbeck,M.Yarus,4nnu.Rev.Biochem.64:763-797.(1995))。アプタマー−機能化ビーズのランダム標識アレイは、血清蛋白のレベルを監視するために役立つ。アレイ上の結合パターンにおける相関関係(同様に実施例10参照)は、病状の表現型として役立つ。
【0036】
実施例12:混合DNA−蛋白アレイ
遺伝子機能分析における重要な利点として、本発明の方法は、アレイ製造方法を変えなくても蛋白及びDNAアレイに適合することである。特に、DNA及び対応する蛋白を有するビーズからなる混合アレイは、同一流体サンプル中で、遺伝子及び遺伝子産物を分析するために使用されることができる。
これは、免疫学的アッセイ及びDNAハイブリダイゼーションの組み合わせで実証された。例えば、抗サイトカインモノクローナル抗体(mAb)により機能化されたビーズ及びオリゴヌクレオチドにより機能化されたビーズからなる混合アレイが形成された。2つの連続的アッセイが、この単一チップ上で実行された。最初に、免疫学的アッセイが実施例10の手順に従い行われた。続いて、オンチップ免疫学的アッセイが遂行され、イメージが捕捉され、被検体が最終濃度20nMでハイブリダイゼーションバッファ(2SSC、l×Denhardt’s)へ添加され、37℃、1時間で反応が行われた。新鮮なハイブリダイゼーションバッファがチップに加えられ、イメージ捕捉が付加的ハイブリダイゼーションアッセイを記録するために行われた。
【0037】
実施例13:親和性フィンガープリント法
従来方法での受容体−リガンド相互作用の分析は、理想的な特異性を仮定している。すなわち、溶液中の単一のリガンドがその対応(マッチング)する受容体のみと反応し、逆の場合も同様である理想的な条件のみが考えられた。しかし、多くの多重化アッセイシステムにおいて、かなりのレベルの交差反応(cross-reactivities)が存在する。すなわち、いかなる単一リガンドも複数の受容体と関係する可能性があり、いかなる単一受容体タイプも1以上のリガンドに対する有限親和性を持つ。
本発明は、下記仮定の下で、そのようなシステムのために多重化READアッセイを分析するために開発されたモデルを含む。これらそれぞれの可逆反応は、その独自の親和係数により特徴付けられる。バルクな種類同士では反応は起こらない。表面上に形成された複合体同士では相互作用は生じない。これらの仮定は、バルク中及び表面の種間での反応を補正することにより、モデルの複雑性が増加する代償を払って、緩くすることができる。単一の受容体−リガンド対形成の標準的な反応拡散式[R.W.Glaser,Anal.Biochem.213,152-161(1993)]は、それぞれのビーズ表面での複数の反応を許容するように一般化される。
【0038】
【数2】
【0039】
式(1)の右辺の最初の項は、リガンド及び受容体の複合体への会合を表し、表面上のフリーサイトの濃度を含む。第2の項は、リガンドの解離による複合体の分裂と、それにより受容体サイトが更なる反応のためにフリーとなることを表す。最大数(ixj)の二分子複合体が形成できるので、上記平衡式から導かれる多くの境界条件が存在する。平衡状態の場合、式(1)の左側をゼロとして、共親和性マトリックス[Kij]=kon,ij/koff,ijを、バルク中及び表面の複数の種間での交差反応に適合させて決定することができる。平衡状態にあるバッチ式反応器中では、それぞれのビーズ種上に結合したそれぞれのリガンドの分子数を得るための異なった平衡式系を解くことができる。
【0040】
【表1】
【0041】
例示として、2つの異なるビーズセット上に固定化された2つのリガンド及び2種の受容体の対照用セットのためにリガンド分布が(式(1)のモデルから)計算された。共親和性マトリックス(数列)は、対照用セット中のそれぞれのリガンド−受容体組み合わせに対して既知のものと仮定された。ここで、第3リガンドの検出を行うため、2×2マトリックスの対角成分[Kij]は、対角でない成分に比べ大きいと仮定された。2つの当初のリガンドと共に反応器中に第3リガンドが存在することは、対照系内の種々の複合体及び反応物間の平衡を撹乱させる。そして、蛍光ラベル標識されたリガンド分子については、撹乱した系から観測される強度は、対照例で観測されるそれとは異なる。
図18Aは、濃度及び共親和性マトリックスが上記表に示された値に定められた対照例を示す。ビーズ強度は、0−255の直線的目盛上に定められた。後者は、最も明度の高いビーズの強度を示す。図18Aは、それぞれのリガンドのビーズ強度への寄与を示す。L1の低い濃度のために、ビーズ1の強度は、ビーズ2に比較して低く、交差反応性(cross-reactivity)は本質的に検出できない。
【0042】
次に、この系を、第3リガンドにより、濃度L3を1Pmにして新リガンドが受容体それぞれの受容体とかなりの量の交差反応性(K3,1=1x1011/M,K3,2=1x1010/M)を有するとして複雑化させた。第3リガンド存在下でそれぞれのビーズの蛍光強度を計算すると、第3リガンドによりビーズ1の強度の増加が明らかである図18Aのパターンが得られる。一方、系内のより高いL2濃度及びL3のR2へのより低い親和性により、ビーズ2の強度は影響されないままであった。このように、L3は、受容体の一つと比較的高い親和性を有し、競合するリガンドに比べかなり多量である条件下で検出されることができる。
リガンド混合物がランダム標識ビーズアレイ形式で配置されている複数の受容体と共に作用をすることのできる条件下での共親和性マトリックスの評価(及びここに示される理論的モデルとの比較)は、複数のリガンド及び受容体の互いに競合的な結合親和性の特徴的な交差相関関係(cross-correlation)を確立するための方法を提供する。これらの共親和性は、それらの親和性フィンガープリント法パターンにより受容体−リガンド結合の平衡反応を特徴づけるための確実な手段を提供する。よく確定された対照例からのバラツキは、同様に、溶液中の「撹乱させる」リガンドの検出を可能にする。
【0043】
実施例14:反応速度の多重分析
上記実施例に示されるように、通常の十二分な洗浄は、溶液蛍光の背景からのビーズ識別のためには必要とされない。従って、一連のアッセイイメージは、結合反応の進行を記録してそれぞれ発生している結合反応の速度データを決定するために、均一アッセイ形式で記録される。
均一結合アッセイは、ビーズアレイの光学顕微鏡的イメージを形成でき、ビーズのランダム標識アレイを含むチャンバーへ被検体溶液を導入できる単純「サンドイッチ」流体カートリッジ中で行われることができる。より一般的には、アレイは、反応物もしくはバッファを制御された一定量の流体注入又は連続的流入することにより、同様に、被検体又は他の反応混合物へさらされる。理論的モデルの使用や、このビーズアレイ反応器の関連性のある性能制御変数の最適の組み合わせが、平衡化時間を最小化したりアレイにより捕捉される被検体の部分を最大化するために、特定されうる[K.Podual and M.Seul,TM KP99/02]。流速は、多くの入手可能なポンプ機構のいずれかにより制御できる[M.Freemantle,C & EN,77:27-36]。
【0044】
【表2】
【0045】
一連のイメージ分析は、図19中の前記実施例に示されるタイプの反応−拡散速度の理論的モデルを利用して決定されるON率及びOFF率から反応速度データが生成されることを可能とする。
図19Aは、被検体含有溶液、及び「サンドイッチ」型反応器の底部に固定化されているビーズアレイ、を含む吸着−脱離(adsorption-desorption)サイクル段階を示す。最初の図は、初期の吸着工程を示す。第2図は、ビーズのほとんどが平衡に達したときの平衡に近づいた反応器の状態を示す。最後の図は、リガンドを含有しない流体が注入され、吸着された分子がビーズ表面から脱離する脱離サイクル下での反応器の状態を示す。図19Bは、単一型の受容体−リガンド反応の反応−拡散系の数値解法により得られる単一受容体−単一リガンド系の吸着−脱離反応速度を示す。リガンド濃度の異なる2つのケースが示される。シミュレーションに使用された変数は、添付の表2に列挙されている。
従来法[D.G.Myszka,Curr.Opin.Biotechnol.8:5057.]に対し、本方法は、イメージによるものであり、多重化が可能である。更に、実施例6で導入されたタイプの生成モデルは、複数のリガンド及び受容体間の交差反応の存在下においても、複数の同時受容体−リガンド相互作用の複合体結合反応速度の分析を可能にする。
アレイ形式中の反応速度を監視することができるため、複合体混合物中の受容体−リガンド又は結合剤−被検体相互作用の特異性を強調するいくつかの手法が可能となる。例えば、温度制御は、DNAハイブリダイゼーション反応の特異性を高めるのに使用されることができる。同様に、ハイブリダイゼーション反応に適用される条件の緊縮性を、アレイの応答を監視しながら、変化させることができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、過剰の「非特異的」結合へ導く条件下で、ハイブリダイゼーションバッファ中で行うことができる。特異性は、アレイ応答性を監視しながら、緊縮性が増加している洗浄バッファへ変更することにより強化される。
【0046】
実施例15:磁性粒子の標識アレイを使用する一連のマルチステップアッセイ
分子生物学及び細胞生物学のサンプル調製及び種々のビーズ上酵素触媒反応のための、生化学的機能性超常磁性粒子を使用する方法及び装置は文献に記載されている[“Biomagnetic Techniques in Molecular Biology”,Technical Handbook,3rd Edition,1998,Dynal、オスロ市、ノルウェイ国]。これらのビーズベース法は、本発明のランダム標識アレイ検出形式と組み合わせ、オンチップマルチステップアッセイ処理を実行することができる。
例えば、図20は、複数の区画を有する単一チップを使用して、多重遺伝子型用小型形式での一連のステップの集積化を示す。最初に、患者サンプルから機能化磁性ビーズを使用して親和性選択により細胞が採取される。細胞は、第1区画で電気的又は化学的に溶解され(lysis)、遺伝子DNAは、非特異的結合により多くの磁性ビーズ表面に捕捉される。次に、ビーズは、第1区画と流体的に結合している第2区画へ磁力により集められ、第2区画内でビーズ及びDNAは、必要なバッファで洗浄される。次に、ビーズは更にビーズ付着DNAをテンプレートとして使用するPCRが行われる位置へと移動される。公知の多くのPCR手順がこの段階で使用できる[F.Fellmann,et.al.,Biotechniques,21:766-770]。
【0047】
次に、PCR生成物は、PCR増幅の目的である異なる多型分析のために特異性の結合剤を有する、予め組み立てられたランダム標識アレイへのハイブリダイゼーションにより捕捉される。
光学的にプログラム制御可能なLEAPSと連携した、標識磁性粒子の使用は、特定条件下で可逆的固定化アレイを形成し、プログラム制御可能な一連のマルチステップアッセイを実施することを可能とする。上記特定条件とは、例えば、反応速度を高めるために最も好ましくはビーズを懸濁液で使用する場合や、イメージ検出及びアッセイリードアウトのために高度に並行した形式を提供するために最も好ましくはアレイをリアルタイムで形成する場合である。
例えば、図21に示すとおり、cDNAビーズアレイ形成のために下記一連のステップが小型化されて集積化されることができる。最初に、それぞれのビーズタイプが遺伝子特異性プローブを有する標識磁性ビーズプールが、mRNAプールへ導入され、mRNA分子はそれぞれ対応するビーズにハイブリダイズされる。次に、ビーズ上逆転写(RT)が、ビーズ付着mRNAをテンプレートとして行われる[E.Horenes, L.Korsnes,US 005759820]。次に、mRNAはビーズから解離され、次に、ビーズは、個別化設計(custom-designed)されたチップ表面に置かれ、cDNAビーズアレイがLEAPSを使用して形成される。このようなアレイは、他のmRNAセットを標的として使用する遺伝子分析実験中で結合剤を有するものとして使用することができる。一方、このcDNAアレイは、そのアレイ中の標的遺伝子を分析するために、標識DNA結合剤プールを適用することにより発現する態様を分析することもできる。
【0048】
実施例16:超常磁性酸化鉄γ−Fe2O3(マグヘマイト)粒子の合成
アニオン性界面活性剤、ビス(2−エチルヘキシル)ナトリウムスルフォサクシネート(AOT)及びイソオクテン(Kommareddi et al.,Chem.Mater.1996,8,801-809)からなるアルドリッチケミカル(Aldrich Chemical Co.,ミルウォーキ市、ウィスコンシン州)社製の逆性(せっけん)ミセル溶液中で、合成が行われた。反応物FeSO4(Sigma Chemical Co.社製、セントルイス市、ミズーリ州)及びNH4OH(Sigma Chemical Co.社製、セントルイス市、ミズーリ州)を逆性(せっけん)ミセル溶液中で調製する際に、0.5M AOT保存溶液を使用した。特に、0.9MのFeSO4を0.45ml、イソオクテンの0.5M AOT溶液5mlへ添加し、別途NH4OHを0.45ml、イソオクテンの0.5M AOT溶液5mlへ添加した。反応は、NH4OH逆性(せっけん)ミセル溶液をFeSO4逆性(せっけん)ミセル溶液へ激しく攪拌しつつ添加することにより開始された。反応は〜2−3時間行われ、次に溶媒は、〜40℃で蒸発され、乾燥界面活性剤酸化鉄合成物を得た。この合成物は、選択された有機溶媒に再び分散され、濃赤色の透明溶液が得られた。
【0049】
実施例17:蛍光色及び磁性ポリマービーズ合成物の合成
疎水性蛍光染料及び酸化鉄粒子の保存溶液が、乾燥磁性合成物及び染料を、例えば、CHC13(Aldrich Chemical Co.社製、ミルウォーキ市、ウィスコンシン州)又はCH2Cl2/CH3OH混合物(70/30(v/v))(Aldrich Chemical Co.社製、ミルウォーキ市、ウィスコンシン州)等の選択した溶媒中に再度分散させることにより調製された。予め決定された量のポリマービーズが、メタノール(3×)中で完全に洗浄され、エバポレートして乾燥された。同時に、蛍光染料及び酸化鉄ナノ粒子の混和が、有機溶媒/ナノ粒子/染料混合物中でビーズを膨潤させることにより達成された。膨潤プロセスは、〜1時間以内に完了した。続いて、ポリマービーズは遠心分離され、メタノール(3×)洗浄後、イソオクタン(2×)洗浄、更にメタノール(2×)洗浄され、最後に0.2%SDS−DI水溶液に再分散された。
上記簡単な説明で述べられた以外の本発明の目的、態様及び利点は、例示のみであるため理解されやすい下記詳細な態様の説明と、その態様面を反映している添付図面とを共に用いることにより、より明確に理解できるであろう。図面は下記のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 ランダム標識ビーズアレイの製造及び多重化アッセイにおけるそれらの使用を含むプロセスフローの図である。
【図2】 ビーズの機能化の図である。
【図3】 チップ設計及びウェハスケール製造ステップの図である。
【図4】 ランダム標識アレイの注文対応アセンブリの図である。
【図5】 手のひらサイズの微少ラボの図である。
【図6】 READプロセスに使用されるアッセイイメージ及び解読イメージの概略図である。
【図7】 イメージ分析におけるアルゴリズム及びステップを要約したフローチャートである。
【図8】 図7で要約されたイメージ分析アルゴリズムを適用した、ビーズタイプに対応したアッセイイメージの分解ステップの図である。
【図9】 ランダム標識アレイの光学的に制御可能なアレイアセンブリの図である。
【図10】 ランダム標識サブアレイからなる一つのアレイの図である。
【図11】 自動チップスケールビーズアレイ製造及びQCプロセスの機構の図である。
【図12】 2つのサイトカインの定量的結合曲線の図である。
【図13】 多型分析のために設計されたアレイの図である。
【図14】 多型分析において図13に示された一のサブアレイから記録されたアッセイイメージ及び解読イメージの蛍光顕微鏡写真である。
【図15】 図14に示されたようなアッセイイメージの分析により得られる強度柱状グラフの形でのアッセイ結果の図である。
【図16】 ハイブリダイゼーションアッセイ用の「ループ化プローブ」の設計の図である。
【図17】 A及びBは、複数のサイトカイン分析において記録されたアッセイイメージ及び解読イメージの蛍光顕微鏡写真である。
【図18A】 複数の競合的受容体−リガンド相互作用のある受容体−リガンドシステムにおける交差相関関係の数量的シミュレーションの図である。
【図18B】 複数の競合的受容体−リガンド相互作用のある受容体−リガンドシステムにおける交差相関関係の数量的シミュレーションの図である。
【図19】 受容体−リガンド会合反応速度及び解離反応速度の数量的シミュレーション図である。
【図20】 磁性捕捉ビーズを使用した集積化サンプル捕捉ならびにREADを使用したアレイベースの検出の図である。
【図21】 ビーズ上逆転写での遺伝子特異性の捕捉を積層するため、標識磁性ビーズを使用したマルチステップアッセイならびにポストアッセイアレイアセンブリの図である。
Claims (40)
- 競合的多成分系平衡反応における一対の被検体−結合剤相互作用(interaction)を示す共親和性(co-affinity)マトリックスの構成要素の決定方法であり、
少なくとも2つの異なる粒子母集団を含む複数粒子であり、それぞれの母集団は結合されている結合剤により区別でき、粒子は粒子上の結合剤を一意的に特定できる化学的又は物理的に識別可能な特徴を有し、かつそれらの粒子は支持体上に平面に配置されている複数粒子を調製し、
アレイ(array)中のそれぞれの粒子上の結合剤を、それらの有する化学的又は物理的に識別可能な特徴により特定し、
結合剤を被検体分子と接触させて、被検体が1又は2以上の結合剤と被検体−結合剤複合体を形成し、それぞれの複合体の形成が、結合剤が複合体の構成に含まれる粒子の有する光学特性の変化を生じ、
形成されたそれぞれのタイプの被検体−結合剤複合体の粒子の有する光学特性の変化を検出し、更に
複合体の構成中に含まれる結合剤を対応する粒子の有する化学的又は物理的に識別可能な特徴により特定する、方法であり、
それぞれのタイプの被検体−結合剤複合体についての光学特性の変化は、被検体−結合剤相互作用を特徴づける親和性(affinity)を決定し、その親和性は競合的複数の平衡反応における一対の被検体−結合剤相互作用を示す共親和性マトリックスの構成要素を表すものである、決定方法。 - 競合的多成分系平衡反応における一対の被検体−結合剤相互作用を示す共親和性マトリックスの構成要素の決定方法であり、
少なくとも2つの異なる粒子母集団を含む複数粒子であり、それぞれの母集団は結合されている結合剤により区別でき、粒子はその粒子上の結合剤を一意的に特定できる化学的又は物理的に識別可能な特徴を有する複数粒子を調製し、
結合剤を被検体分子と接触させて、被検体が1又は2以上の結合剤と被検体−結合剤複合体を形成し、それぞれの複合体の形成が、結合剤が複合体の構成に含まれる粒子の有する光学特性の変化を生じ、
支持体上に粒子の平面的なアレイを形成し、
形成されたそれぞれのタイプの被検体−結合剤複合体の粒子の有する光学特性の変化を検出し、更に
アレイ中のそれぞれの粒子上の結合剤を、それらの有する化学的又は物理的に識別可能な特徴により特定し、その特定ステップは検出ステップの前でも後でもよい方法であり、
それぞれのタイプの被検体−結合剤複合体についての光学特性の変化は、被検体−結合剤相互作用を特徴づける親和性を決定し、その親和性は競合的複数の平衡反応における一対の被検体−結合剤相互作用を示す共親和性マトリックスの構成要素を表すものである、決定方法。 - 得られた共親和性マトリックスが被検体を特徴付けるために使用される請求項1又は2の方法。
- 共親和性マトリックスの係数ならびに被検体−結合剤複合体の形成に関与する被検体及び結合剤の既知の濃度の組み合わせが、競合的結合相互作用の記述子(descriptor)を確定するために使用されるものである請求項3の方法。
- 更に、それぞれのタイプの被検体−結合剤相互作用の親和係数(affinity constant)を決定することを含み、それぞれの親和係数は、形成されたそれぞれのタイプの被検体−結合剤複合体の光学特性の変化から、形成された被検体−結合剤複合体の数を決定することにより計算される請求項1又は2の方法。
- サンプル中の不純物の有無を決定する方法であり、
請求項1又は2の方法により対照用被検体と一組の結合剤との共親和性マトリックスを調製し、共親和性マトリックスを記録し、
対照用被検体及び場合によっては不純被検体を含むサンプルを導入し、
サンプルの添加に続いて共親和性マトリックスを決定し、
不純物を含むかもしれないサンプルの添加に続いて対照用被検体の共親和性マトリックスの係数のバラツキを検出する方法であり、
共親和性マトリックス中のバラツキは、サンプル中の不純物の存在を示すものである方法。 - 1又は2以上の被検体及び1又は2以上の結合剤の間で形成される被検体−結合剤複合体の会合性(association)を支配する分子結合相互作用の反応速度(kinetics)を分析する方法であり、
少なくとも2つの異なる粒子母集団を含む複数粒子であり、それぞれの母集団は結合されている結合剤により区別でき、粒子は粒子上の結合剤を一意的に特定できる化学的又は物理的に識別可能な特徴を有し、かつそれらの粒子は支持体上に平面的に配置されている複数粒子を調製し、
アレイ中のそれぞれの粒子上の結合剤を、それらの有する化学的又は物理的に識別可能な特徴により特定し、
プリセット開始時にアレイ中の結合剤を被検体分子と接触させ、被検体が1又は2以上の結合剤と被検体−結合剤複合体を形成して、それぞれの複合体の形成が、結合剤が複合体の構成に含まれる粒子の有する光学特性の変化を生じさせ、
プリセット開始時に続くプリセット間隔時において、形成されたそれぞれのタイプの被検体−結合剤複合体の粒子の有する光学特性の変化を検出し、
それぞれのタイプの被検体−結合剤複合体について、粒子の有する光学特性の変化の時間依存性から会合係数(association rate constant)を決定する方法。 - 1又は2以上の被検体及び1又は2以上の結合剤の間で形成される被検体−結合剤複合体の解離性(disassociation)を支配する分子結合相互作用の反応速度を分析する方法であり、
少なくとも2つの異なる粒子母集団を含む複数粒子であり、それぞれの母集団は結合されている結合剤により区別でき、粒子は粒子上の結合剤を一意的に特定できる化学的又は物理的に識別可能な特徴を有し、かつそれらの粒子は支持体上に平面的に配置されている複数粒子を調製し、
アレイ中のそれぞれの粒子上の結合剤を、それらの有する化学的又は物理的に識別可能な特徴により特定し、
アレイ中の結合剤を被検体分子と接触させ、被検体が1又は2以上の結合剤と被検体−結合剤複合体を形成し、それぞれの複合体の形成は、結合剤が複合体の構成に含まれる粒子の有する光学特性の変化を生じさせ、
形成されたそれぞれのタイプの被検体−結合剤複合体の粒子の有する光学特性の変化を検出し、
プリセット交換時において、被検体溶液を被検体を含まない第2溶液に交換し、結合された被検体を被検体−結合剤複合体から解離させ、その解離は、被検体−結合剤複合体を有する粒子の有する光学特性の変化をもたらし、
プリセット交換時に続くプリセット間隔時において、光学特性の変化を記録し、
それぞれのタイプの被検体−結合剤複合体について、粒子の有する光学特性の変化の時間依存性から解離係数(disassociation rate constant)を決定する方法。 - 光学特性の変化が、結合相互作用に含まれる粒子の蛍光強度の変化を含むものである請求項1〜8いずれか1の方法。
- アレイ中の結合剤の特定が、アレイ中のそれぞれのビーズの化学的又は物理的に識別可能な特徴を検出する、アレイの解読イメージ(画像)を得ることを含み、光学特性検出ステップは、ビーズの有する光学特性の変化を検出する、アレイのアッセイイメージ(画像)を得ることを含むものである、請求項1〜8いずれか1の方法。
- アッセイイメージ及び解読イメージがテンプレートマッチングアルゴリズムを使用して比較されるものである請求項10の方法。
- 平面的な粒子アレイが支持体上に固定化されている請求項1〜8いずれか1の方法。
- 粒子が化学的に識別可能な特徴を有する請求項1〜8いずれか1の方法。
- 化学的に識別可能な特徴の標識が蛍光タグである請求項13の方法。
- バイオアッセイを実施する方法であり、
少なくとも2つの異なる粒子母集団を含む複数粒子であり、それぞれの母集団は結合されている結合剤により区別でき、粒子は粒子上の結合剤を一意的に特定できる化学的又は物理的に識別可能な特徴を有し、かつそれらの粒子は支持体上に平面に配置されている複数粒子を調製し、
アレイ中のそれぞれの結合剤の位置を示すアレイの解読イメージを生成し、
結合剤を、被検体を含有するかもしれないサンプルと接触させて、被検体がサンプル中に存在する場合、被検体と1又は2以上の結合剤とで被検体−結合剤複合体を形成し、それぞれの複合体の形成は、結合剤が複合体の構成に含まれる粒子の有する光学特性と対応又は比例する変化を生じ、
粒子の有する光学特性の変化を検出するアレイのアッセイイメージを生成し、形成された被検体−結合剤複合体の数を光学特性の変化から決定し、
解読イメージをアッセイイメージと比較することにより被検体−結合剤複合体中の被検体を特定する方法。 - バイオアッセイを実施する方法であり、
少なくとも2つの異なる粒子母集団を含む複数粒子であり、それぞれの母集団は結合されている結合剤により区別でき、粒子は粒子上の結合剤を一意的に特定できる化学的又は物理的に識別可能な特徴を有する複数粒子を調製し、
結合剤を、被検体分子を含有するかもしれないサンプルと接触させて、被検体がサンプル中に存在する場合、被検体が1又は2以上の結合剤と被検体−結合剤複合体を形成し、それぞれの複合体の形成は、結合剤が複合体の構成に含まれる粒子の有する光学特性と対応又は比例する変化を生じ、
支持体上に粒子の平面的なアレイを形成し、
粒子の有する光学特性の変化を検出するアレイのアッセイイメージを生成し、形成された被検体−結合剤複合体の数を光学特性の変化から決定し、
アレイ中のそれぞれの結合剤の位置を示すアレイの解読イメージを形成し、解読イメージの形成はアッセイイメージの形成の前でも後でもよく、
解読イメージをアッセイイメージと比較することにより、形成された被検体−結合剤複合体中の被検体を特定する方法。 - アッセイイメージ及び解読イメージの比較が、イメージ検出機及びコンピュータイメージ保存装置を含む光学顕微鏡設備ならびに分析設備を使用するものである請求項15又は16の方法。
- 被検体がリガンドを含むものであり、結合剤が受容体を含むものである請求項15又は16の方法。
- 被検体及び結合剤がヌクレオチド断片を含むものであり、ヌクレオチド断片及びその相補的シークエンス断片間で形成されるハイブリッド複合体の数が決定される請求項15又は16の方法。
- 粒子が、結合されている結合剤を一意的に特定できる化学的又は物理的な特徴により識別可能な磁性粒子を含むものである請求項15又は16の方法。
- 化学的又は物理的な特徴を有するものが、励起波長、発光波長、励起存続時間、又は発光強度によりスペクトル的に識別可能な1又は2以上の蛍光染料である請求項20の方法。
- 磁性粒子のアレイが、粒子への磁界の適用により行われる請求項21の方法。
- 更に、被検体及びその結合剤間の結合相互作用の親和係数を、形成された被検体−結合剤複合体の数から算出する請求項15又は16の方法。
- 磁性粒子を使用する、集積化サンプルの調製及びバイオアッセイであり、
少なくとも2つの異なる粒子母集団を含む複数の磁性粒子であり、それぞれの母集団は結合されている識別分子により区別でき、識別分子に選択的に結合する性質を有する標的生体分子を一意的に特定する化学的特徴を有する磁性粒子を調製し、
生体分子を含有する生物学的流体(biological fluid)を調製し、磁性粒子上でその生体分子を識別分子と反応させ、
結合しなかった成分とともに流体を除去し、
磁性粒子に結合した生体分子を形質転換して形質転換生体分子を生成し、その形質転換生体分子はその上で合成された磁性粒子上に結合して残存し、
請求項15又は16のバイオアッセイを行う、方法であり、結合剤は形質転換生体分子を含むものである方法。 - 標的生体分子がmRNAを含み、形質転換がそのmRNAを逆転写して、磁性粒子に結合したcDNAを生成することを含むものである請求項24の方法。
- サンプルの調製とバイオアッセイが同一区画内で起こる請求項24の方法。
- サンプル調製の集積化及び並列的な分子相互作用アッセイ分析法を含むバイオアッセイであり、
少なくともサンプル調製区画及びアッセイ区画ならびにサンプル調製区画及びアッセイ区画を流体的に結合する手段を備えた装置を用意し、
サンプル調製区画中に、標的生体分子及び標的生体分子と結合できる複数の磁性粒子を含む生物学的流体を用意し、磁性粒子を標的生体分子と結合させ、
磁性粒子及びその粒子に結合した生体分子を残したまま、生物学的流体をその流体の結合していない成分とともに除去し、
生体分子を磁性粒子から解離させ、その生体分子をサンプル調製区画からアッセイ区画へ流体結合手段を通して移送し、
請求項15又は16の方法によりバイオアッセイを行う、方法であり、バイオアッセイ中の被検体は、移送される標的生体分子を含むものである方法。 - 更に、標的生体分子を形質転換し、バイオアッセイにおいて被検体として使用する請求項27の方法。
- 標的生体分子がmRNAを含み、形質転換がそのmRNAを逆転写してcDNAを生成することを含み、バイオアッセイ中の被検体がcDNAを含み、結合剤がオリゴヌクレオチド又は他のDNAプローブを含むものである請求項27の方法。
- バイオアッセイにおいて、逆転写がサンプル調製区画で起こり、mRNAが磁性粒子に結合され、逆転写の後にcDNAが磁性粒子から解離され、アッセイ区画へ移送され、バイオアッセイにおいて被検体として使用される請求項29の方法。
- 高分子ミクロ粒子を調製し、1又は2以上及び磁性ナノ粒子を含有する有機溶媒中でそのミクロ粒子を膨潤させ磁性粒子を調製する単分散磁性蛍光粒子の調製方法であり、
蛍光染料及び磁性ナノ粒子が、粒子の特定位置での局在化をせずに磁性粒子全体に分散されている方法。 - その化学的特徴により識別可能な少なくとも2の異なる粒子母集団を含む複数の磁性粒子を含むアレイであり、磁性粒子が化学的特徴に関してランダムに平面的に配置されているアレイ。
- 被検体が特異的に1の結合剤に結合し、存在する他の結合剤には結合していない請求項5の方法。
- 質量作用の法則を使用して、転換生成率[LR]、与えられた[L0]、[R0]及びnB(ここで、[L0]は初期被検体濃度であり、[R0]はビーズあたりの結合剤数であり、nBはビーズ数である)による光学特性の変化から、親和係数Kが決定される請求項33の方法。
- 質量作用の法則を使用して、異なるビーズ数nBを含む少なくとも2回の測定に対する転換生成率[LR]及び与えられた初期被検体濃度[L0]による光学特性の変化から、親和係数Kが決定される請求項33の方法。
- 質量作用の法則を使用して、ビーズあたりの異なる結合剤数[R0]を含む少なくとも2回の測定に対する転換生成率[LR]、及び与えられた初期被検体濃度[L0]による光学特性の変化から、親和係数Kが決定される請求項33の方法。
- 質量作用の法則を使用して、転換生成率[LR]、与えられたK、nB及び[R0]による光学特性の変化から被検体濃度[L]が決定される請求項33の方法。
- 第一結合反応で初期標識(encoded)標的被検体を使用し、次に既知の親和係数K’を有する第二被検体を注入する2ステップアッセイにおいて、親和係数Kは、転換生成率[LR]1及び[LR]2、与えられた初期被検体濃度、[L0]、[L0]’及び[R0]によって、第二被検体の注入前及び後の光学特性から決定される請求項33の方法。
- 第一結合反応で初期標識標的被検体を使用し、次に既知の親和係数K’を有する第二被検体を注入する2ステップアッセイにおいて、親和係数Kは、転換生成率[LR]1及び[LR]2、与えられた初期被検体濃度、[L0]、[L0]’、[R0]及びnBによって、第二被検体の注入前及び後の光学特性から決定される請求項33の方法。
- 質量作用の法則を使用して、転換生成率[LR]、与えられたK、[R0]及びnBによる光学特性の変化から、初期被検体濃度[L0]が決定される請求項33の方法。
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