CN103571831A - 一种dna分子机器和基于dna分子机器的单碱基突变检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA分子机器；还提供了一种基于DNA分子机器的单碱基突变检测的方法，该方法是利用不同催化链引发DNA分子机器运转能力的不同，结合金纳米粒子的组装，对比实验观察加入了完全互补的催化链以及存在单碱基突变的催化链体系反应差异，最终实现基于DNA分子机器的单碱基突变检测。本发明的检测手段无需严格的操作条件，操作简单。信号的检测手段简单，在实际应用中通过颜色以及紫外图谱就可以进行识别。解决了在之前的检测技术中存在复杂操作或者使用精密的仪器观察的困难。检测的碱基突变种类全面，包括了所有的碱基突变形式：碱基错配、碱基缺失以及碱基插入，并且被检测DNA链存在突变位置可以在任意位置。
Description
技术领域
本发明涉及DNA分子检测技术技术领域，具体涉及一种DNA分子机器和基于DNA分子机器的单碱基突变检测方法及其应用。
背景技术
单碱基突变是一种普遍存在的基因变异种类，在人类基因组中几乎有1%的等位基因会出现单碱基突变。单碱基突变的检测现在也开始越来越受关注，因为在人类DNA基因序列中的变异对疾病的诊断以及药物设计都具有很大的意义。
目前为止，实现单碱基突变检测的方法有很多种，其中重要的方法有酶辅助方法以及DNA杂交的方法。酶辅助的方法可以在室温下操作并且具有很高的灵敏度以及强的特异性，但是操作的过程复杂，反应体系的特异性跟酶的活性相关。在DNA杂交的方法中主要存在荧光标记方法以及金纳米粒子辅助的方法，金纳米粒子辅助的方法相对于荧光标记的方法的优势在于可以有效的克服荧光淬灭的影响以及避免使用复杂的检测设备。
在目前已经实现的金纳米粒子辅助的DNA单碱基突变检测手段中主要有金纳米粒子均相反应体系以及金纳米粒子参与的微阵列体系。利用金纳米粒子的均相反应实现单碱基突变的检测技术首先由Mirkin提出[Mirkin CA.science1997.227,1078]，该技术的关键则是利用了互补的杂交链存在单碱基突变以后发生Tm值的变化，控制实验的温度可以有效的区分开存在单碱基突变的体系。而金纳米粒子参与的微阵列体系[Mirkin CA.science2000.289,1757]具有更高的灵敏度。但是操作中反复的冲洗步骤是实验的关键所在，这为该技术在实际中的应用增加了难度。
因此，为了克服现有技术中在DNA单碱基突变上检测的困难，本发明人进行了深入研究，发现基于DNA分子机器再结合金纳米粒子的组装可以在简单操作下实现单碱基突变的检测，在现有的技术文献的进一步检索中没有发现在室温下通过存在单碱基突变的催化链引发DNA分子机器从而推动金纳米粒子组装的实验，另外没有利用DNA分子机器结合金纳米粒子可控组装实现单碱基突变的检测的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一目的是提供一种DNA分子机器。
本发明的第二目的是提供一种基于DNA分子机器的单碱基突变检测的方法。
本发明的第三目的是提供上述方法在检测碱基错配、碱基缺失或碱基插入中的应用。
本发明的第四目的是提供上述方法在药物设计中的应用。
首先，本发明提供了一种DNA分子机器，其包括如图4所示的结构：其中，链1为保护链，链2为连接链，链3为连接在金纳米粒子上的探针链，链1与链2上的22区和链23区互补，链3与链2上的25区互补；链2中，22区作为保护链的toehold，碱基数为1-7个；24区作为催化链的toehold，碱基数为3-9个。
进一步地，本发明提供了一种基于DNA分子机器的单碱基突变检测的方法，该方法是利用不同催化链引发DNA分子机器运转能力的不同，结合金纳米粒子的组装，对比实验观察加入了完全互补的催化链以及存在单碱基突变的催化链体系反应差异，最终实现基于DNA分子机器的单碱基突变检测。该检测手段无需严格的操作条件， 操作简单。
优选的，所述DNA分子机器包括如图4所示的结构：其中，链1为保护链，链2为连接链，链3为连接在金纳米粒子上的探针链，链1与链2上的22区和链23区互补，链3与链2上的25区互补；链2中，22区作为保护链toehold，碱基数为1-7个；24区作为催化链的toehold，碱基数为3-9个。
本发明的检测方法中首次利用DNA分子机器结合金纳米粒子可控组装实现单碱基突变的检测。其原理见图1，首先连接链DNA与保护链DNA杂交形成一种二元杂交链，二元杂交链跟一种修饰在金纳米粒子表面的探针链发生杂交以后该连接链有两个裸露的区域，一个位于连接链的末端,，一个则处于连接链中间。保护链的存在则是为了使体系在没有催化链的条件下保持稳定。在单碱基突变检测的过程中所有反应体系经过两步链替换反应。首先是中间空白区域的DNA为催化链的替换反应提供足够的toehold长度，促使催化链（无论是否存在突变）能够将保护链替换下来，保护链toehold区域的碱基显露出来。基于此，第二步替换反应才得以开始。在新的二元杂交链的末端有足够长的碱基序列为修饰在金纳米粒子表面的探针链的替换反应提供toehold。两步替换反应结束，两种金纳米粒子被连接链连接到一起。从体系的颜色以及紫外吸收光谱的差异可以检测到催化链是否发生突变。该发明充分利用了不同的催化链替换能力的不同，最终实现了单碱基突变的检测。
优选的，更具体的，本发明的检测方法包括如下步骤：
第一步：根据被检DNA寡核苷酸的实际长度设计DNA分子机器中所需要的各种单链DNA序列，所述单链DNA序列的设计按照实际的需要可以进行调整；
第二步：金纳米粒子的表面探针链的修饰;
第三步：退火得到二元杂交链；
第四步：杂交金纳米粒子表面的探针链与二元杂交链，组装成所述的DNA分子机器；
第五步：利用所述DNA分子机器检测待检寡核苷酸催化链体系，同时对比实验加入与所述DNA分子机器连接链完全互补的催化链体系，检测两个反应体系催化链的反应差异，最终实现单碱基突变的检测
优选的，步骤四中所述二元杂交链与金纳米粒子溶液的摩尔比例在5:1到50:1的之间的范围。
优选的，所述被检DNA寡核苷酸长度范围在10-50个碱基之间。
优选的，所述催化链体系的浓度为二元杂交链摩尔浓度的1%-100%。
优选的，所述催化链体系的反应条件为室温。
进一步地，本发明还提供了所述方法在检测碱基错配、碱基缺失或碱基插入中的应用。
更进一步地，本发明还提供了所述方法在药物设计中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明是首次基于DNA分子机器的单碱基突变检测。本发明是一种全新的检测单碱基突变的手段，该检测手段无需严格的操作条件，操作简单。信号的检测手段简单，在实际应用中通过颜色以及紫外图谱就可以进行识别。解决了在之前的检测技术中存在复杂操作或者使用精密的仪器观察的困难。检测的碱基突变种类全面，包括了所有的碱基突变形式：碱基错配、碱基缺失以及碱基插入，并且被检测DNA链存在突变位置可以在任意位置。
附图说明
图1为基于DNA分子机器的单碱基突变检测方法原理图。
图2为实施例1～5紫外动力学结果图。
图3为应用例中紫外动力学以及颜色结果图。
图4为本发明DNA分子机器结构图示。
以下结合附图和具体实施例对本发明的具体技术方案进行具体的说明。
本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了比较详细的实施方式和过程。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明保护的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步的调整，未注明的 实验条件通常按照常规实验中的条件。
本实施例主要通过对比实验验证基于DNA分子机器的单碱基突变检测的可行性，并且对乳腺癌基因片段BRCA1发生突变实现检测，从颜色以及紫外动力学谱图观察比较。以下实例进一步验证基于DNA分子机器的单碱基突变检测的可行性。
实施例1：
第一步，利用巯基与金之间的反应将金纳米粒子表面修饰上探针链1和探针链2：
①寡核苷酸与13nm纳米金摩尔浓度比350:1混合，4°环境下保存16小时；
②加入终浓度10mM磷酸缓冲液，4°环境下保存12小时；
③加入NaCl浓溶液使得终浓度从0.1M变化至0.2M再至0.3M，每个浓度下4°环境下保存8小时；
④在13000rpm下离心30分钟，弃上清；
⑤加入10mM磷酸缓冲液，终浓度0.1M NaCl清洗两次；
⑥加入10mM PBS，0.1M NaCl，PH=7.4，4°保存。
⑦13nm纳米金溶液浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。
第二步，退火制备二元杂交链：
a.将连接链与保护链溶解在10mM PBS缓冲液中（0.1M NaCl），溶液中单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定。
b.连接链与保护链等摩尔浓度混合，在90°下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，退火过程超过2小时。二元杂交链4°保存。
第三步，预杂交一种探针链与二元杂交链：
1)修饰有探针链的纳米金有两种：探针链1修饰后的纳米金以及探针链2修饰后的纳米金。
2)探针链1修饰后的纳米金与二元杂交链按照摩尔浓度比为1：12的比例混合。
3)室温下放置一小时。
第四步，对比实验观察加入了完全互补的催化链以及存在单碱基突变的催 化链体系反应差异，最终实现基于DNA分子机器的单碱基突变检测：
1)在反应器1中加入将修饰有探针链2的纳米金与预先孵育好二元杂交链的纳米金按照等摩尔混合后的混合物，最后加入完全互补的催化链DNA，所述催化链DNA的摩尔数是二元杂交链摩尔数的1/5；
2)在反应器2中加入将修饰有探针链2的纳米金与预先孵育好二元杂交链的纳米金按照等摩尔混合后的混合物，最后加入存在单碱基突变的催化链DNA，所述催化链DNA的摩尔数是二元杂交链摩尔数的1/5。通过紫外动力学谱图进行观察。
连接链的序列（从左到右为5'—3'）
CATCCCACTCCACCTTCATCTCACTACGATCTTCACTCTCACCCTAC
保护链的序列（从左到右为5'—3'）
TAGTGAGATGAAGGTGGAGTG
巯基修饰探针1的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAGTGA
巯基修饰探针2的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTGTAGTGAGATGAAGGTGGAGTGGGATG
完全互补的催化链序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATGAAGGTG
存在单碱基突变的序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATTAAGGTG
通过颜色对比以及紫外动力学结果可以得到验证。在图2a中可以清楚的区分开是否存在单碱基突变，本实例的操作简单，无需严格操作条件，成本低。
实施例2：
采用同实施例1相同的操作步骤，只是将保护链的5'端减少一个碱基，导致DNA分子机器的结构发生变化，实例1中22区=5,24区=6，在该实例中2区=5,24区=7。同样可以在4小时左右有效的区分开碱基突变的存在。紫外动力学过程见图2b.
连接链的序列（从左到右为5'—3'）
CATCCCACTCCACCTTCATCTCACTACGATCTTCACTCTCACCCTAC
保护链的序列（从左到右为5'—3'）
AGTGAGATGAAGGTGGAGTG
巯基修饰探针1的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAGTGA
巯基修饰探针2的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTGTAGTGAGATGAAGGTGGAGTGGGATG
完全互补的催化链序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATGAAGGTG
存在单碱基突变的序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATTAAGGTG
实施例3：
采用同实施例1相同的操作步骤，只是将探针链1修饰后的纳米金与二元杂交链按照摩尔比为1：21的比例混合。在反应进行到4小时左右可以有效的区分开碱基突变的存在。紫外动力学过程见图2c.
连接链的序列（从左到右为5'—3'）
CATCCCACTCCACCTTCATCTCACTACGATCTTCACTCTCACCCTAC
保护链的序列（从左到右为5'—3'）
TAGTGAGATGAAGGTGGAGTG
巯基修饰探针1的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAGTGA
巯基修饰探针2的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTGTAGTGAGATGAAGGTGGAGTGGGATG
完全互补的催化链序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATGAAGGTG
存在单碱基突变的序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATTAAGGTG
实施例4：
采用同实施例1相同的操作步骤，只是将被检测链的浓度增加到100%。同样可以有效的区分开碱基突变的存在。紫外动力学过程见图2d.
连接链的序列（从左到右为5'—3'）
CATCCCACTCCACCTTCATCTCACTACGATCTTCACTCTCACCCTAC
保护链的序列（从左到右为5'—3'）
TAGTGAGATGAAGGTGGAGTG
巯基修饰探针1的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAGTGA
巯基修饰探针2的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTGTAGTGAGATGAAGGTGGAGTGGGATG
完全互补的催化链序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATGAAGGTG
存在单碱基突变的序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATTAAGGTG
实施例5：
采用同实施例1相同的操作步骤，改变被检测链发生单碱基突变的形式。在实例1中单碱基突变的种类是碱基错配，在该实例中碱基突变的方式是碱基缺失。同样可以有效的区分开碱基突变的存在。紫外动力学过程见图2e.
连接链的序列（从左到右为5'—3'）
CATCCCACTCCACCTTCATCTCACTACGATCTTCACTCTCACCCTAC
保护链的序列（从左到右为5'—3'）
TAGTGAGATGAAGGTGGAGTG
巯基修饰探针1的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAGTGA
巯基修饰探针2的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTGTAGTGAGATGAAGGTGGAGTGGGATG
完全互补的催化链序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATGAAGGTG
存在单碱基突变的序列（从左到右为5'—3'）
AGATCGTAGTGAGATAAGGTG
应用例——对乳腺癌基因BRCA1发生突变实现检测：
第一步，利用巯基与金之间的反应将金纳米粒子表面修饰上探针链1和探针链2：
①寡核苷酸与13nm纳米金摩尔浓度比350:1混合，4°环境下保存16小时；
②加入终浓度10mM磷酸缓冲液，4°环境下保存12小时；
③加入NaCl浓溶液使得终浓度从0.1M变化至0.2M再至0.3M，每个浓度下4°环境下保存8小时；
④在13000rpm下离心30分钟，弃上清；
⑤加入10mM磷酸缓冲液，终浓度0.1M NaCl清洗两次；
⑥加入10mM PBS，0.1M NaCl，PH=7.4，4°保存。
⑦13nm纳米金溶液浓度利用520nm波长紫外吸收峰测定。
第二步，退火制备二元杂交链：
a.将连接链与保护链溶解在10mM PBS缓冲液中（0.1M NaCl），溶液中
单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定。
b.连接链与保护链等摩尔浓度混合，在90°下保持15分钟，然后再逐渐
降温至室温，退火过程超过2小时。二元杂交链4°保存。
第三步，预杂交一种探针链与二元杂交链：
1)修饰有探针链的纳米金有两种：探针链1修饰后的纳米金以及探针链2修饰后的纳米金。
2)探针链1修饰后的纳米金与二元杂交链按照摩尔浓度比为1：12的比例混合。
3)室温下放置一小时。
第四步，对比实验观察加入了完全互补的催化链以及存在单碱基突变的催化链体系反应差异，最终实现基于DNA分子机器的单碱基突变检测：
3)在反应器1中加入将修饰有探针链2的纳米金与预先孵育好二元杂交链的纳米金按照等摩尔混合后的混合物，最后加入完全互补的催化链DNA，述催化链DNA的摩尔数是二元杂交链摩尔数的1/5；在反应器2中加入将修饰有探针链2的纳米金与预先孵育好二元杂交链的纳米金按照等摩尔混合后的混合物，最后加入存在单碱基突变的催化链DNA，述催化链DNA的摩尔数是二元杂交链摩尔数的1/5。
4)通过观察12小时内溶液的颜色或者紫外动力学谱图。
连接链的序列（从左到右为5'—3'）
CTTCATCCCAGATTTTCTTCCTTTTGTTCTCACTCTCACCCTAC
保护链的序列（从左到右为5'—3'）
AGGAAGAAAATCTGGGA
巯基修饰探针1的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTTTTTTGTAGGGTGAGAGTGA
巯基修饰探针2的序列（从左到右为5'—3'）
SH-TTTTTTTTTTAAAGGAAGAAAATCTGGGATGAAG
正常的人类乳腺癌基因BRCA1序列（从左到右为5'—3'）
GAACAAAAGGAAGAAAATC
发生变异的乳腺癌基因BRCA1序列（从左到右为5'—3'）
GAACAAAAGGAATAAAATC
本实例通过颜色对比以及紫外动力学结果可以得到验证。见图3。本实例的操作简单，无需严格操作条件，成本低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要指出的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，而且，在阅读了本发明的内容之后，本领域相关技术人员可以对本发明做出各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种DNA分子机器，其特征在于，其包括如图4所示的结构：其中，链1为保护链，链2为连接链，链3为连接在金纳米粒子上的探针链，链1与链2上的22区和链23区互补，链3与链2上的25区互补；链2中，22区作为保护链的toehold，碱基数为1-7个；24区作为催化链的toehold，碱基数为3-9个。
2.一种基于DNA分子机器的单碱基突变检测的方法，其特征在于，该方法是利用不同催化链引发DNA分子机器运转能力的不同，结合金纳米粒子的组装，对比实验观察加入了完全互补的催化链以及存在单碱基突变的催化链体系反应差异，最终实现基于DNA分子机器的单碱基突变检测。该检测手段无需严格的操作条件，操作简单。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA分子机器包括如图4所示的结构：其中，链1为保护链，链2为连接链，链3为连接在金纳米粒子上的探针链，链1与链2上的22区和链23区互补，链3与链2上的25区互补；链2中，22区作为保护链的toehold，碱基数为1-7个；24区作为催化链的toehold，碱基数为3-9个。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
第一步：根据被检DNA寡核苷酸的实际长度设计DNA分子机器中所需要的各种单链DNA序列，所述单链DNA序列的设计按照实际的需要可以进行调整；
第二步：金纳米粒子的表面探针链的修饰;
第三步：退火得到二元杂交链；
第四步：杂交金纳米粒子表面的探针链与二元杂交链，组装成所述的DNA分子机器；
第五步：利用所述DNA分子机器检测待检寡核苷酸催化链体系，同时对比实验加入与所述DNA分子机器连接链完全互补的催化链体系，检测两个反应体系催化链的反应差异，最终实现单碱基突变的检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤四中所述二元杂交链 与金纳米粒子溶液的摩尔比例在5:1到50:1的之间的范围。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述被检DNA寡核苷酸长度范围在10-50个碱基之间。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述催化链体系的浓度为二元杂交链摩尔浓度的1%-100%。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述催化链体系的反应条件为室温。
9.权利要求2～8任意一项所述方法在检测碱基错配、碱基缺失或碱基插入中的应用。
10.权利要求2～8任意一项所述方法在药物设计中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310471003.9A CN103571831A (zh) | 2013-10-10 | 2013-10-10 | 一种dna分子机器和基于dna分子机器的单碱基突变检测方法及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140212 |