CN1900312B - 实时pcr检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针 - Google Patents
实时pcr检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1900312B CN1900312B CN200610036633.3A CN200610036633A CN1900312B CN 1900312 B CN1900312 B CN 1900312B CN 200610036633 A CN200610036633 A CN 200610036633A CN 1900312 B CN1900312 B CN 1900312B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- fluorescent probe
- real time
- exonuclease
- real
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 82
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 95
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 51
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 33
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 25
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 25
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000006863 thiophosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 abstract description 22
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 8
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 2
- 101710200523 DNA polymerase 3 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N boric acid;phosphoric acid Chemical compound OB(O)O.OP(O)(O)=O ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
实时PCR检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针，涉及一类荧光探针。提供在实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶核酸外切酶活性的一类荧光探针。是一类具有二级结构即包含互补序列的荧光探针，包含互补序列的荧光探针包括置换探针、分子信标探针、蝎子引物等。给出经修饰使其在实时PCR检测中能抗高温聚合酶每的5′→3′核酸外切酶活性且不产生非特异信号的荧光探针、经修饰使其在长片段实时PCR扩增检测中能抗高温聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性且不产生非特异信号的荧光探针和经修饰使其在长片段实时PCR扩增检测中能同时抗5′→3′核酸外切活性和3′→5′核酸外切酶活性且不产生非特异信号的荧光探针。
Description
技术领域
本发明涉及一类荧光探针，特别是涉及一种实时聚合酶链式反应检测中能够抵抗高温聚合酶核酸外切酶活性的一类荧光探针。
背景技术
实时聚合酶链式反应(Real-timePCR，简称实时PCR)是指扩增与检测同步进行，通过检测扩增循环中荧光信号的变化以指示核酸扩增过程。
与常规PCR一样，实时PCR需要使用高温聚合酶进行扩增。多数情况下，实时PCR使用普通的高温聚合酶Taq。Taq酶除了具有聚合酶活性外，还具有5′→3′核酸外切酸活性。在少数情况下，人们会使用经基因改造去除了5′→3′核酸外切酶活性Taq如KlenTaq等。当需要高保真扩增时，则经常使用具有校正能力的高温聚合酶Pfu等。后者除了具有聚合酶活性外，还具有3′→5′核酸外切酶活性。另外，在进行长片段扩增时，经常使用上述Taq或者KlenTaq和具有3′→5′核酸外切酶活性如Pfu等两种酶的混合物(美国专利号：US5436149，专利授予日期：1995年7月25日)。
目前，根据是否使用荧光探针，实时PCR可以分为探针式和非探针式两种形式。由于探针式实时PCR由于增加了对模板特异识别的探针，比非探针实时PCR检测结果更加特异。探针式实时PCR还可以通过对不同的靶序列探针标记不同的荧光染料，达到同时检测多个靶序列的目的，因此探针式实时PCR相对更为常用。
探针式实时PCR使用的探针有多种，包括TaqManTM探针、TaqMan-MGBTM探针、分子信标探针(MolecularBeacons)、荧光能量共振转移探针(又称LightCyclerTM探针)、置换探针、UT探针(ZhangY.，NycleicAcidsResearch，2003，31(20)，e123)、蝎子引物(Scorpions)、LUXTM引物(Invitrogen)和AmplifierTM引物(Nazarenko，I.Q.，etal，NucleicAcidsResearch，1997，15(1)，2518-2521)等。这些荧光探针可以分为依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针(如TaqManTM探针等)和不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针(如分子信标探针和置换探针等)。
原理上，无论是依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针还是不依赖聚合酶5′→3′外切核酸活性的探针，在实时PCR中，若与模板杂交后产生荧光，则该荧光能真实反映特异靶序列的扩增，这种荧光称作特异信号。相反，若未与靶序列结合时即产生荧光，则该荧光不能真实反映把序列的扩增，这种荧光称作非特异信号。非特异荧光信号会干扰特异信号的测定，降低测定的效果。
然而在目前的实时PCR检测领域，对于非特异信号的产生以及对特异信号的影响情况，人们了解并不是很多。Wilhelm等(WilhelmJ.，etal，BioTechniques，30：1052-1062，2001)观察到使用LightCyclerTM探针时，采用具有5′→3′外切核酸活性的Taq酶会引起探针的酶切，导致扩增效率的下降和检测信号的降低，而改用5′→3′外切酶活性的Taq酶的Stoffel片段，则会明显改善上述情况。
美国专利US6395518B1(专利授予日期：2002年5月28日)公开了一种使用TaqManTM探针但使用缺乏5′→3′外切酶活性的聚合酶进行检测的方法。在这种情况下，荧光信号的产生完全依赖TaqManTM探针杂交前后荧光强度的变化。该专利的目的是为了拓展TaqManTM探针的应用范围，使之不完全依赖Taq酶的5′→3′外切活性。然而，作为单链线性探针的TaqManTM，杂交前后荧光信号变化有限。迄今，在实际检测中并未见到使用该专利的报道。实际上，已经观察到，当使用TaqManTM探针时，如果采用缺乏5′→3′外切酶活性聚合酶，可能导致扩增反应抑制的发生(Yu，D.，et，al，BioTechniques23：714-720，1997)。
具有3′→5′外切活性的所谓高保真高温聚合酶如Pfu，Vent，DeepVent和UITma等对线性单链DNA都具有一定的剪切作用(JaniceCline，J.，NucleicAcidsResearch，24，18，3546-3551，1996)。TaqManTM探针属线性单链结构，本身就是这些聚合酶的3′→5′外切活性的底物，因此TaqManTM探针在高保真酶体系中会发生非特异酶切，从而产生非特异信号。公开号为US2006/0088855A1的美国专利申请(公开日：2006年4月27日)公开了一种使用能够抗3′→5′外切酶活性的荧光能量转移探针的方法，这样的探针可用于高保真PCR。该专利发现一些3′端标记的淬灭剂发BHQ1等具有抗高保真聚合酶3′→5′外切酶活性的能力，因此可以直接采用这些3′端标记的荧光探针用于高保真PCR中。而一些常用的淬灭剂如DABCYL和TAMRA等却不具备这种能力，因而无法用于高保真扩增。
可以看出，人们已经发现在实时PCR检测中聚合酶的外切酶活性对于检测性能是有影响的，并且针对具体的情况采取了相应的措施，包括使用不具有5′→3′外切酶活性的聚合酶，或者利用独特的淬灭剂克服3′→5′外切酶活性。然而对于核酸外切酶活性与探针之间直接作用是否产生非特异荧光信号，这些非特异信号在实时PCR检测中对特异信号产生的影响如何，以及克服这些影响的方式等仍然缺乏深入的理解。
早期的大量研究已经发现，高温聚合酶的5′→3′活性对于靶核酸的作用具有结构趋向性(MichaelW.Kaiser，TheJournalofBiologicalChemistry，274，30，20387-21394，1999；Longley，M.J.，NucleAcidsResearch，18(24)：7317-7322，1990；Landre，T.A.etal，Biochemistry，34.4994-5002，1995；Auer，T.，etal，Biochemistry，34，4994-5002，1995；Lyamichev，V.，etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，6143-6148，1999等)。根据这些研究结果，可以判断TaqManTM探针是线性单链结构，不是高温聚合酶的5′→3′外切酶活性的合适底物，因此TaqManTM探针在实时PCR检测中很难产生非特异信号。
我们发现，具有二级结构的荧光探针如置换探针(Li，Q.，NucleicAcidsResearch，30，2，e5，2002)、分子信标(Tyagi，S.，NatureBiotechnology，14，303-308，1996)等则可以是高温聚合酶5′→3′外切活性识别的底物，会在实时PCR中产生非特异信号，造成对特异性扩增信号的干扰。
另外，如前所述，已经发现属于线性单链结构TaqManTM探针高温聚合酶的3′→5′外切酶活性的底物(JaniceCline，J.，NucleicAcidsResearch，24，18，3546-3551，1996)。因此TaqManTM探针在高保真酶体系中会发生非特异酶切，从而产生非特异信号(美国专利公开号：US2006/0088855A1，公开日期：2006年4月27日)。
我们发现，具有二级结构的荧光探针如置换探针和分子信标等同样是高温聚合酶的3′→5′外切活性的底物，会在实时PCR中产生非特异信号，造成对特异性扩增信号的干扰。
因此，对于具有二级结构的荧光探针，无论使用具有5′→3′外切活性还是3′→5′外切活性高温聚合酶，都要求这些探针具有抵抗外切酶活性的能力，以消除其在实时PCR中产生的非特异信号。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的荧光探针被外切酶酶切的问题，提供在实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶核酸外切酶活性的一类荧光探针。
本发明的第二个目的是提供一类经修饰使其在实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，且不产生非特异信号的荧光探针。
本发的第三个目的是提供一类经修饰使其在高保真实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶3′→5′核酸外切酶活性，且不产生非特异信号的荧光探针。
本发明的第四个目的是提供一类经修饰使其在长片段实时PCR扩增检测中能够同时抵抗5′→3′核酸外切活性和3′→5′核酸外切酶活性(比如使用Taq和Pfu的混合物)，也可以是只抵抗3′→5′核酸外切酶活性(比如使用KlenTaq和Pfu的混合物)，且不产生非特异信号的荧光探针。
本发明所述的实时PCR检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的一类荧光探针是指具有二级结构即包含互补序列的荧光探针。
所述的具有二级结构即包含互补序列的荧光探针包括置换探针、分子信标探针、蝎子引物、双链引物、AmplifluorTM引物、LUXTM引物、UT探针等。置换探针由两条互补的单链寡核苷酸组成，其互补部分形成二级结构。分子信标探针具有茎环结构，其茎部形成二级结构；蝎子引物由一条延伸引物分子信标组合而成，茎部分形成二级结构；双链引物与置换探针类似，由两条互补的单链寡核苷酸组成，其互补部分形成二级结构；AmplifluorTM引物和LUXTM引物包含发夹结构，茎部分形成二级结构；UT探针与引物的5′端互补，形成二级结构。
目前已经证明，二级结构直接影响了这些探针的特异性。在多数情况下，具有二级结构的探针可以获得比线性单链探针更高的杂交特异性。
所述的具有二级结构的荧光探针的共同特点是，在与靶序列杂交后，会产生荧光信号。也就是说，所产生的荧光来自于与靶序列杂交，荧光信号的强度在一定条件下能够反映靶序列的量。我们将这种荧光信号称之为特异信号。若在其它与把序列无关的因素作用下，发生了探针二级结构的破坏，引起荧光信号的产生，则荧光信号的强度与靶序列的量无关，我们将这种荧光信号称之为非特异信号。
所述的具有二级结构的荧光探针用于实时PCR检测时，即可以用作模板的定量，也可用于模板序列的检测。
所述的实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶的核酸外切酶活性的一类荧光探针是一种经修饰使其在实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，且不产生非特异信号的荧光探针。所述的修饰，其中一种方式是指能够抵抗高温DNA聚合酶5′→3′核酸外节酶活性的各种修饰，优选的方式是使探针的5′端能抗核酸聚合酶5′→3′核酸外切酶活性，修饰方式包括修饰5′端碱基之间的连接，采修饰的碱基衍生物(如使用锁定核酸，lockednucleicacids，LNA)或者是增加化学功能团等。一种优选的方式是修饰5′端碱基之间的连接，例如采用硫代磷酸化(phosphorothioate)连接，甲基磷酸键(methylphosphonate)连接，硼酸磷酸(boranophosphate)化连接，肽核酸(peptidenucleicacid)连接等抗核酸外切活性的连接。优选的方式是采用硫代磷酸化连接修饰，这种修饰仅限于5′端的第一个碱基和第二个碱基之间。
所述的实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶核酸外切酶活性的一类荧光探针是一种经修饰使其在长片段实时PCR扩增检测中能够抵抗高温聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性且不产生非特异信号的荧光探针。所述的修饰，一种方式是能够抵抗高温DNA聚合酶3′→5′核酸外切酶活性的各种修饰，优选的方式是使探针的3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，修饰方式包括修饰3′端碱基之间的连接，彩修饰的碱基衍生物(如使用锁定核酸，lockednucleicacids，LNA)，或者是增加化学功能团等。一种优选的方式是修饰3′端碱基之间的连接，例如采用硫代磷酸化连接，甲基磷酸键连接，硼酸磷酸化连接，肽核酸连接等抗核酸外切活性的连接。优选的方式是采用硫代磷酸化连接修饰，而且这种修饰仅限于3′端的第一个碱基和第二个碱基之间。
所述的实时PCR检测中能够抵抗高温聚合酶核酸外切酶活性的一类荧光探针是一种经修饰使其在长片段实时PCR扩增检测中能够同时抵抗5′→3′核酸外切活性和3′→5′核酸外切酶活性(比如使用Taq和Pfu的混合物)，也可以是只抵抗3′→5′核酸外切酶活性(比如使用KlenTaq和Pfu的混合物)，且不产生非特异信号的荧光探针。所述的修饰，另一种方式是能够同时抵抗高温DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性和3′→5′核酸外切酶活性的各种修饰。优选的方式是使探针的5′端能抵抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，3′端能抗核酸聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性。修饰方式包括修饰5′端以及3′端碱基之间的连接，采用修饰的碱基衍生物(如使用锁定核酸，lockednucleicacids，LNA)，或者是增加化学功能团等。一种优选的方式是修饰5′端以及3′端碱基之间的连接，例如采用硫代磷酸化连接，甲基磷酸键连接，硼酸磷酸化连接，肽核酸连接等抗核酸外切活性的连接。优选的方式是采用硫代磷酸化连接修饰，而且这种修饰仅限于5′端以及3′端的第一个碱基和第二个碱基之间。
利用本发明提供的经过修饰能够抵抗高温DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性的荧光探针，可以有效消除使用具有5′→3′核酸外切酶活性的高温聚合酶进行实时PCR检测时产生的非特异信号，显著改善荧光探针在实时PCR检测中的性能。
利用本发明提供的经过修饰能够抵抗高温DNA聚合酶3′→5′核酸外切酶活性的荧光探针，可以有效消除使用具有3′→5′核酸外切酶活性的高温聚合酶进行实时PCR检测时产生的非特异信号，该修饰探针的用途之一是高保真实时PCR扩增检测，另一个用途是用于长片段的扩增体系，该扩增体系是将具有3′→5′核酸外切酶活性的高温聚合酶如Pfu等掺入到去除5′→3′核酸外切酶活性的高温聚合酶如KlenTaq中。
利用本发明提供的经过修饰能够同时抵抗高温DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶活性和3′→5′核酸外切酶活性的荧光探针，可以有效消除混合使用具有5′→3′核酸外切酶活性和具有3′→5′核酸外切酶活性的高温聚合酶进行实时PCR检测时产生的非特异信号，该修饰探针用途之一是用于长片段的扩增体系，该扩增体系是将具有3′→5′核酸外切酶活性的高温聚合酶如Pfu等掺入到具有5′→3′核酸外切酶活性的高温聚合酶如Taq中。
附图说明
图1表明使用SmpliTaqGoldTMDNA聚合酶扩增淀粉状前体蛋白基因，分别用未经修饰的置换探针和5′端硫代磷酸修饰的置换探针进行实时PCR扩增检测的结果。在图1中，左图使用的置换探针未经修饰；右图使用的置换探针的正链5′第一个碱基和第二个碱基之间的连接为硫代磷酸修饰。
图2表示使用PfuDNA聚合酶扩增淀粉状前体蛋白基因，分别用未经修饰置换探针和3′端硫代磷酸修饰置换探针进行实时PCR扩增检测的结果。在图2中，左图使用的置换探针未经修饰；右图使用的置换探针的负链3′端第一个碱基和第二个碱基之间为硫代磷酸修饰。
图3表示使用EXTaqDNA聚合酶扩增淀粉状前体蛋白基因，分别用未经修饰置换探针，5′端和3′端硫代磷酸修饰置换探针进行长片段实时PCR扩增检测的结果。在图3中，左图使用的置换探针未经修饰；右图使用的置换探针的正链5′和负链3′端的第一碱基和第二个碱基之间的连接为硫代磷酸修饰。
在图1～3中，横坐标为循环数(Cyclenumber)，纵坐标为荧光值(Fluorescence)；黑色实线代表阴性控制(Negative)，灰色虚线代表阳性标本(Positive)。
具体实施方式
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步了解本发明。
实施例1：AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶扩增淀粉状前体蛋白基因，用未修饰置换探针和正链5′端硫代磷酸修饰置换探针实时检测。
淀粉状前体蛋白(APP)基因位于人类21号染色体上，该基因的异常表达跟一些疾病如：唐氏综合症、阿尔茨海默病等相关。
本实施例APP基因为靶基因，设计引物和靶特异性置换探针进行实时PCR检测，所用引物为Primer1和Primer2，扩增产物片段长为100bp，检测所用探针为Probe1和Probe2(序列见表1，下同)。
25μl反应液中10XPCRGoldbuffer2.5μL，2.0mMMgCl2，200μMdNTE，1.0UAmpliTaqGoldTMDNA聚合酶，10pmol上游引物，10pmol下游引物(序列见表1，下同)，10pmolprobe1或probe2，5μL人类全血基因组模板或超纯水(阴性控制)。反应条件：95℃3min，循环周期为94℃15s，55℃20s，72℃20s共40个循环，每次在退火时实时采集FAM频道的荧光数据。利用MX3000P实时PCR仪进行检测。
实时PCR检测结果见图1，左图检测所用的置换探针为Probe1，右图检测所用的置换探针为Probe2。未修饰置换探针进行实时PCR检测时，即使是阴性控制，实时检测曲线也不是一条平直的线，其荧光值从一开始就慢慢增加，产生非特异荧光信号，这说明置换探针在PCR过程中被具有5′→3′端外切酶活性的AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶酶切，而采用正链5′末端硫代磷酸修饰的置换探针进行检测时，则不会出现这种情况，这说明AmpliTaqGoldTM通过切除正链5′端来导致荧光的增加，而正链5′末端硫代磷酸修饰的置换探针能抵制AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶的外切活性，使探针检测靶基因能得到理想的结果。
表1引物和探针序列
| 名称 | 序列 |
| Primerl | 5′GGGAGCTGGTACAGAAATGACTTC-3′5 --> |
| Primer2 | 5′-TTGCTCATTGCGCTGACAA-3′ |
| Primer3 | 5′-GTGGACTCTGCAAGCTTTGTAGC-3′ |
| Primer4 | 5′-GCAGGACCTGGCAAAGAAGC-3′ |
| Probe1 | 5′-FAM-AGCCATCCTTCCCGGGCCTAGG-PO4-3′5′-GCCCGGGAAGGATGGCT-DABCYL-3′ |
| Probe2 | 5′-FAm-A*GCCATCCTTCCCGGGCCTAGG-PO4-3′5′-GCCCGGGAAGGATGGCT-DABCYL-3′ |
| Probe3 | 5′-FAM-AGCCATCCTTCCCGGGCCTAGG-PO4-3′5′-GCCCGGGAAGGATGGC*T-DABCYL-3′ |
| Probe4 | 5′-FAM-A*GCCATCCTTCCCGGGCCTAGG-PO4-3′5′-GCCCGGGAAGGATGGC*T-DABCYL-3′ |
“*”代表硫代磷酸化连接
实施例2：pfuDNA聚合酶扩增淀粉状前体蛋白基因，用未修饰置换探针和负链3′端硫代磷酸修饰置换探针实时检测。
本实施例靶基因和引物与实例1相同，检测所用探针为Probe1或Probe3。
25μl反应液中含10XPfu反应缓冲液(含20mMMgCl2)2.5μl，200μMdNTP，1.0UpfuDNA聚合酶，10pmol上游引物，10pmol下游引物，10pmolprobe1或probe3.5μLPCR产生稀释模板或超纯水(阴性控制)。反应条件：95℃3min，循环周期为94℃15s，55℃20s，72℃20s共40个循环，每次在退火时实时采集FAM频道的荧光数据。利用MX3000P实时PCR仪进行检测。
实时PCR检测结果见图2，左图检测所用的置换探针为Probe1，右图检测所用的置换探针为Probe3。未修饰置换探针进行实进PCR检测时，即使是阴性控制，实时检测曲线也不是一条平直的线，其荧光值从一开始就迅速增加，最后接近平台，产生非特异荧光信号，这说明置换探针在PCR过程中被具有3′→5′端外切酶活性的PfuDNA聚合酶酶切，而采用负链3′末端硫代磷酸修饰的置换探针进行检测时，则不会出现这种情况，这说明Pfu通过切除负链3′端来导致荧光的增加，而负链3′末端硫代磷酸修饰的置换探针能抵制PfuDNA聚合酶的外切活性，使探针检测靶基因能得到理想的结果。
实施例3：RXTaqDNA聚合酶扩增淀粉状前体蛋白基因，分别用未经修饰置换探针，5′端和3′端硫代磷酸修饰置换探针进行长片段实时PCR扩增检测。
本实施例APP基因为靶基因，所用引物Primer3和Primer4，扩增产物片段长1082bp，检测所用探针为Probe1或Probe4。
25μL反应液中含10XEXTaq反应缓冲液2.5μL，2.0mMMgCl2，200μMdNTP，1.0UEXTaq酶，10pmol上游引物，10pmol下游引物，10pmolprobe1或probe4，5μL基因组模板或超纯水(阴性控制)。反应条件：95℃3min,循环周期为94℃15s，55℃30s，72℃45s共40个循环，每次在退火时实时采集FAM频道的荧光数据。利用MX3000P实时PCR仪进行检测。
实时PCR检测结果见图3，左图检测所用的置换探针为Probe1，右图检测所用的置换探针为Probe4。未修饰置换探针进行实进PCR检测时，即使是阴性控制，实时检测曲线也不是一条平直的线，其荧光值从一开始就迅速增加，最后接近平台，这说明置换探针在PCR过程中被EXTaq酶的外切酶活性所酶切，而采用正链5′末端和负链3′末端都硫代磷酸修饰的置换探针进行检测时，则不会出现这种情况，这说明正链5′末端和负链3′末端都硫代磷酸修饰的置换探针能抵抗EXTaq酶外切活性，使长片段实时PCR扩增检测得到理想的结果。需要说明的是，在本实施例中，我们只知道EXTaq具有长片段PCR扩增能力，无法了解EXTaq的具体组成。它可能是将具有3′→5′核酸外切酶活性的高温聚合酶如Pfu等掺入到具有5′→3′核酸外切酶活性的高温聚合酶如Taq中，也可能是将具有3′→5′核酸外切酶活性的高温聚合酶如Pfu等掺入到去除5′→3′核酸外切酶活性的高温聚合酶如KlenTaq中。因此，我们使用了正链使用了5′末端和负链3′末端均硫代磷酸修饰的置换探针进行检测，如属第二种情况，该探针则仅需进行负链3′末端硫代磷酸修饰。
Claims (3)
1.实时PCR检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针，其特征在于是指具有二级结构即包含互补序列的荧光探针，所述的具有二级结构即包含互补序列的荧光探针包括置换探针、分子信标探针、蝎子引物、双链引物、AmplifluorTM引物、LUXTM引物或UT探针；
所述的具有二级结构即包含互补序列的荧光探针是一种经修饰使其在实时PCR扩增检测中能够抵抗高温聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，且不产生非特异信号的荧光探针；
所述的修饰的方式是使探针的5′端能抗核酸聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，修饰的方式包括修饰5′端碱基之间的连接；所述修饰5′端碱基之间的连接包括在修饰5′端碱基之间的连接情况下采用修饰的碱基衍生物，使用锁定核酸；或在修饰5′端碱基之间的连接的情况下增加化学功能团。
2.如权利要求1所述实时PCR检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针，其特征在于所述修饰5′端碱基之间的连接，包括采用硫代磷酸化连接，或甲基磷酸键连接，或硼酸磷酸化连接，或肽核酸连接。
3.如权利要求2所述实时PCR检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针，其特征在于所述修饰5′端碱基之间的连接，采用硫代磷酸化连接，修饰仅限于5′端的第一个碱基和第二个碱基之间。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610036633.3A CN1900312B (zh) | 2006-07-24 | 2006-07-24 | 实时pcr检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610036633.3A CN1900312B (zh) | 2006-07-24 | 2006-07-24 | 实时pcr检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1900312A CN1900312A (zh) | 2007-01-24 |
| CN1900312B true CN1900312B (zh) | 2016-08-03 |
Family
ID=37656298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200610036633.3A Expired - Fee Related CN1900312B (zh) | 2006-07-24 | 2006-07-24 | 实时pcr检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1900312B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102449167B (zh) | 2009-05-26 | 2014-12-17 | 厦门大学 | 一种检测核酸序列变异的方法 |
| CN104131100B (zh) * | 2014-07-31 | 2016-03-23 | 深圳市亿立方生物技术有限公司 | 分枝杆菌分型鉴定荧光pcr反应液及试剂盒 |
| CN104560972A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-04-29 | 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 | 一种pcr引物及其修饰方法及基于平行高通量单分子高保真扩增方法 |
| CN109652501B (zh) * | 2017-10-12 | 2022-06-07 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒 |
| CN107868780B (zh) * | 2017-11-27 | 2020-08-07 | 云南大学 | 在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法 |
| CN107828859A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-03-23 | 济南大学 | 一种检测miRNA‑122的荧光生物传感器及其制备方法和应用 |
| CN108277273B (zh) * | 2018-04-19 | 2021-07-06 | 亚能生物技术（深圳）有限公司 | 检测非缺失型α地贫基因突变的探针、引物及试剂盒 |
| CN117802237A (zh) * | 2023-10-20 | 2024-04-02 | 艾普拜生物科技(苏州)有限公司 | 信标探针及其组合、用于检测flt3-itd基因突变的pcr扩增试剂及试剂盒 |
-
2006
- 2006-07-24 CN CN200610036633.3A patent/CN1900312B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 廖晓兰等.植原体TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立.《植物病理学报》.2002,第32卷(第4期),361－367. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1900312A (zh) | 2007-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1900312B (zh) | 实时pcr检测中抗高温聚合酶核酸外切酶活性的荧光探针 | |
| CN102770556B (zh) | 靶区分性探针及其用途 | |
| US10472668B2 (en) | Double stranded linear nucleic acid probe | |
| EP2660336B1 (en) | Isothermal nucleic acid amplification | |
| JP6375230B2 (ja) | 分子計数のための組成物およびキット | |
| US20100069250A1 (en) | Digital PCR Calibration for High Throughput Sequencing | |
| AU2017328613A1 (en) | Methods for performing multiplexed PCR | |
| CN1981052A (zh) | 检测染色体病 | |
| CN104245959B (zh) | 基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列的核苷酸变异检测 | |
| CN109022544A (zh) | 一种检测dna甲基化转移酶活性的试剂盒及其方法 | |
| CN111100935A (zh) | 一种细菌耐药基因检测的方法 | |
| KR20120084320A (ko) | Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출 | |
| EP3180448A1 (en) | Multifunctional oligonucleotides | |
| CN106574304A (zh) | 基于链侵入的dna扩增方法 | |
| US20130203057A1 (en) | Step-wise detection of multiple target sequences in isothermal nucleic acid amplification reactions | |
| KR20160097193A (ko) | 다중 프로브 | |
| CN105154534A (zh) | 微小rna的实时恒温指数扩增方法 | |
| US11952617B2 (en) | Methods for multiplex detection of polynucleotides using unbound fluorescent probes and quencher oligonucleotides | |
| US20240209420A1 (en) | Compositions and methods for multiplex detection of mirna and other polynucelotides | |
| CN105063190A (zh) | 微小rna的固相芯片恒温检测方法 | |
| CN115943217A (zh) | 一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160803 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |