CN108254347B - 一种基于金属纳米颗粒耦合的荧光增强检测dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于金属纳米颗粒耦合的荧光增强检测DNA的方法，向含有DNA修饰的金纳米颗粒和银包金纳米颗粒溶液中加入目标DNA后，由于互补DNA链之间的氢键作用，金纳米颗粒和银包金纳米颗粒发生聚集；该聚集引起纳米颗粒之间电磁场增强，并且表面等离子体吸收发生移动，会引起特定荧光分子荧光信号的增强，用于检测DNA。该方法处理过程简单，背景低，灵敏度高，从根本上消除了高背景的荧光信号对目标物检测带来的影响。

Description

一种基于金属纳米颗粒耦合的荧光增强检测DNA的方法

技术领域

本发明涉及的是一种基于金属纳米颗粒耦合的荧光增强检测DNA的方法。

背景技术

DNA是遗传信息的基本单元，DNA序列的改变通常会导致疾病的发生。因此对特定DNA序列的检测对于疾病的早期诊断和预防具有重要意义。目前常见的DNA检测方法有基于金银纳米颗粒聚集的比色法，传统的荧光法，电化学方法等。但是这些方法存在背景高，检测灵敏度低、检出限高、重复性差等缺点。

发明内容

针对现有的DNA片段检测技术的局限性，例如背景高、灵敏度低、检出限高、耗时长、稳定性差等，本发明要解决的问题是提供一种荧光增强的方法实现到对DNA高选择性、高灵敏度的检测。

一种基于金属纳米颗粒耦合的荧光增强检测DNA的方法，向含有DNA修饰的金纳米颗粒和银包金纳米颗粒溶液中加入目标DNA后，由于互补DNA链之间的氢键作用，金纳米颗粒和银包金纳米颗粒发生聚集；该聚集引起纳米颗粒之间电磁场增强，并且表面等离子体吸收发生移动，会引起特定荧光分子荧光信号的增强，用于检测DNA。

所述的方法，金纳米颗粒用柠檬酸钠还原法制得；银包金纳米颗粒的制备是以金纳米颗粒为核，在其表面原位还原Ag原子得到的；金纳米颗粒和银包金纳米颗粒经特定的DNA序列修饰；由于粒径较小的金纳米颗粒具有荧光淬灭的效果，经共价修饰后，其表面的荧光分子发生淬灭，从而降低体系本身的荧光背景。金纳米粒子和银纳米粒子通过DNA之间的相互作用发生聚集。由于聚集导致的纳米颗粒之间电磁场的增强，以及由表面等离子体共振吸收的红移，聚集体的SPR吸收与染料分子的激发光谱或发射光谱发生重叠，二者共同作用，导致荧光强度得到恢复甚至增强，从而实现对目标DNA的检测。

所述的方法，金纳米颗粒的平均粒径分别为17nm或27nm；银包金纳米颗粒通过种子合成法制得，以17nm的金纳米颗粒为核，在其表面生长Ag壳制得，所制得的银包金纳米颗粒的粒径分别为30nm或65nm。

所述的方法，直径为27nm的金纳米颗粒由含有荧光基团的DNA 1修饰，并通过改变DNA 0的浓度来调节金纳米颗粒表面DNA 1的密度；经修饰后，荧光基团发生淬灭；银包金纳米颗粒表面修饰DNA 2，表面功能DNA 2链的浓度可以通过控制改变DNA 0的比例调节；

所述的方法，所述金纳米颗粒由柠檬酸钠还原法制得，其粒径为27nm。

所述的方法，银纳米颗粒由种子生长法制得，以17nm的金纳米颗粒为核，其粒径为30或65nm。

所述的方法，具体方法为：

步骤一：制备27nm金纳米颗粒：取100mL milli-Q水于三颈瓶中，置于油浴中加热磁力搅拌并回流，待煮沸后依次向其中加入2mL 1wt％HAuCl₄和3mL柠檬酸钠溶液(30mM)，溶液颜色迅速从淡黄色变为浅灰色，蓝色，最终变成酒红色；继续加热20min，搅拌冷却至室温，得到27nm的金纳米颗粒；

步骤二：种子生长法制备银包金纳米颗粒：1)取100mL milli-Q水于三颈瓶中，置于油浴中加热磁力搅拌并回流，待煮沸后依次向其中加入2mL 1wt％HAuCl₄和3.5mL柠檬酸钠溶液(30mM)，继续加热20min，搅拌冷却至室温，得到17nm的金纳米颗粒；2)取3mL 17nm的金纳米粒子溶液加入到27mL含有4mM柠檬酸钠和1mM抗坏血酸的水中，并用0.01M的NaOH将溶液pH调至中性；30min内逐滴向其中加入1mL浓度为18mM的AgNO₃水溶液，然后置于油浴中加热回流1小时，即得到30nm的银包金纳米颗粒；

步骤三：制备DNA链修饰的金纳米颗粒和银包金纳米颗粒：末端二硫键修饰的DNA与DTT在黑暗环境下培养后用NAP-5柱分离得到巯基修饰的DNA；向500μL浓度为2nM直径为27nm的金纳米颗粒中加入一定量的DNA混合溶液(2％的DNA 1和98％的DNA 0，序列见表1)，孵育过夜，加NaCl到终浓度为30mM，超声10s；然后每隔2h重复以上步骤，直到NaCl终浓度为0.5M；离心除去多余的DNA，并用水洗两次，所得溶液置于冰箱待用；DNA修饰银包金纳米颗粒的方法与上述方法类似，将DNA序列改为2％的DNA 2和98％的DNA 0即可：

向500μL浓度为2nM直径为30nm的银包金纳米颗粒中加入一定量的DNA混合溶液(2％的DNA 2和98％的DNA 0，序列见表1)，孵育过夜，加NaCl到终浓度为30mM，超声10s；然后每隔2h重复以上步骤，直到NaCl终浓度为0.5M；离心除去多余的DNA，并用水洗两次，所得溶液置于冰箱待用；

步骤四：将DNA修饰过的银包金纳米颗粒和金纳米颗粒以2:1的体积比例混合，测得其荧光强度，加入不同浓度的目标DNA后，再次测其荧光信号，并根据标准曲线计算DNA浓度。

所述的方法，步骤二中，取3mL 17nm的金纳米粒子溶液加入到27mL含有4mM柠檬酸钠和1mM抗坏血酸的水中，并用0.01M的NaOH将溶液pH调至中性；30min内逐滴向其中加入3mL浓度为18mM的AgNO₃水溶液，然后置于油浴中加热回流1小时，即得到65nm的银包金纳米颗粒。

该方法处理过程简单，背景低，灵敏度高，从根本上消除了高背景的荧光信号对目标物检测带来的影响。

附图说明

图1为本发明的原理示意图。

图2为27nm的金纳米颗粒的TEM图。

图3为30nm的银包金纳米颗粒的TEM图。

图4为65nm的银包金纳米颗粒的TEM图。

图5为不同粒径的银包金纳米颗粒对荧光的增强效果。

图6为该体系对不同浓度目标DNA的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：

步骤一：制备27nm金纳米颗粒：取100mL milli-Q水于三颈瓶中，置于油浴中加热磁力搅拌并回流，待煮沸后依次向其中加入2mL 1wt％HAuCl₄和3mL柠檬酸钠溶液(30mM)，溶液颜色迅速从淡黄色变为浅灰色，蓝色，最终变成酒红色。继续加热20min，搅拌冷却至室温，得到27nm的金纳米颗粒。

步骤二：种子生长法制备银包金纳米颗粒：1)取100mL milli-Q水于三颈瓶中，置于油浴中加热磁力搅拌并回流，待煮沸后依次向其中加入2mL 1wt％HAuCl₄和3.5mL柠檬酸钠溶液(30mM)，继续加热20min，搅拌冷却至室温，得到17nm的金纳米颗粒。2)取3mL 17nm的金纳米粒子溶液加入到27mL含有4mM柠檬酸钠和1mM抗坏血酸的水中，并用0.01M的NaOH将溶液pH调至中性。30min内逐滴向其中加入1mL浓度为18mM的AgNO₃水溶液，然后置于油浴中加热回流1小时，即得到30nm的银包金纳米颗粒。

步骤三：制备DNA链修饰的金纳米颗粒和银包金纳米颗粒：末端二硫键修饰的DNA与DTT在黑暗环境下培养后用NAP-5柱分离得到巯基修饰的DNA。向500μL浓度为2nM直径为27nm的金纳米颗粒中加入一定量的DNA混合溶液(2％的DNA 1和98％的DNA 0，序列见表1)，孵育过夜，加NaCl到终浓度为30mM，超声10s。然后每隔2h重复以上步骤，直到NaCl终浓度为0.5M。离心除去多余的DNA，并用水洗两次，所得溶液置于冰箱待用。DNA修饰银包金纳米颗粒的方法与上述方法类似，将DNA序列改为2％的DNA 2和98％的DNA 0即可：

向500μL浓度为2nM直径为30nm的银包金纳米颗粒中加入一定量的DNA混合溶液(2％的DNA 2和98％的DNA 0，序列见表1)，孵育过夜，加NaCl到终浓度为30mM，超声10s。然后每隔2h重复以上步骤，直到NaCl终浓度为0.5M。离心除去多余的DNA，并用水洗两次，所得溶液置于冰箱待用。

表1本发明所用的DNA序列

步骤四：将DNA修饰过的银包金纳米颗粒和金纳米颗粒以2:1的物质的量比例混合，测得其荧光强度，加入不同浓度的目标DNA后，再次测其荧光信号，并根据标准曲线计算DNA浓度。

实施例2：

制备27nm金纳米颗粒：同实施例1。

种子生长法制备银包金纳米颗粒：1)粒径为17nm的金纳米颗粒制备方法同实施例1。2)取3mL 17nm的金纳米粒子溶液加入到27mL含有4mM柠檬酸钠和1mM抗坏血酸的水中，并用0.01M的NaOH将溶液pH调至中性。30min内逐滴向其中加入3mL浓度为18mM的AgNO₃水溶液，然后置于油浴中加热回流1小时，即得到65nm的银包金纳米颗粒。

制备DNA链修饰的金属纳米颗粒方法同上。

将DNA修饰过的银纳米颗粒和金纳米颗粒以2:1的比例混合，测得其荧光强度，加入不同浓度的目标DNA后，再次测其荧光信号，根据标准曲线计算目标DNA浓度。

如图6所示，随着目标DNA浓度的增加，荧光信号逐渐增强，其检出限可达30pM。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种基于金属纳米颗粒耦合的荧光增强检测DNA的方法

<130> 12345667

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> DNA 0

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(13)

<223> n is CH2

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n is SH

<400> 1

tttttttttt nnnn 14

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> DNA 1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is Cy5

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> n is CH2

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is SH

<400> 2

ngtccgtctt gtcttttttt tttnnnn 27

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> DNA 2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is SH

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(7)

<223> n is CH2

<400> 3

nnnnnnnttt tttttttctg tgcttcctg 29

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> target DNA

<400> 4

gacaagacgg accaggaagc acag 24

Claims (3)

1.一种基于金属纳米颗粒耦合的荧光增强检测DNA的方法，其特征在于：向含有DNA修饰的金纳米颗粒和银包金纳米颗粒溶液中加入目标DNA后，由于互补DNA链之间的氢键作用，金纳米颗粒和银包金纳米颗粒发生聚集；该聚集引起纳米颗粒之间电磁场增强，并且表面等离子体吸收发生移动，会引起特定荧光分子荧光信号的增强，用于检测DNA；金纳米颗粒的平均粒径分别为17 nm和27 nm；银包金纳米颗粒的制备以17 nm金颗粒为核，在其表面生长Ag壳制得，制备的银包金纳米颗粒的粒径为30 nm或65 nm；直径为27 nm的金纳米颗粒由含有荧光基团的DNA 1修饰，并通过改变DNA 0的浓度来调节金纳米颗粒表面DNA 1的密度；经修饰后，荧光基团发生淬灭；银包金纳米颗粒表面修饰DNA 2，表面功能DNA 2链的浓度通过控制改变DNA 0的比例调节；

DNA编号 DNA序列（5’端到3’端） DNA 0 T₁₀-(CH₂)₃-SH DNA 1 Cy5-GTC CGT CTT GTC T₁₀-(CH₂)₃-SH DNA 2 HS-(CH₂)₆-T₁₀ CTG TGC TTC CTG 目标DNA GAC AAG ACG GAC CAG GAA GCA CAG

金纳米颗粒用柠檬酸钠还原法制得；银包金纳米颗粒的制备是以金纳米颗粒为核，在其表面原位还原Ag原子得到的；金纳米颗粒和银包金纳米颗粒经特定的DNA序列修饰；由于粒径较小的金纳米颗粒具有荧光淬灭的效果，经共价修饰后，其表面的荧光分子发生淬灭，从而降低体系本身的荧光背景。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：具体方法为：

步骤一：制备27 nm金纳米颗粒：取100 mL milli-Q水于三颈瓶中，置于油浴中加热磁力搅拌并回流，待煮沸后依次向其中加入2 mL 1 wt % HAuCl₄和3 mL柠檬酸钠溶液，溶液颜色迅速从淡黄色变为浅灰色，蓝色，最终变成酒红色；继续加热20 min，搅拌冷却至室温，得到27 nm的金纳米颗粒；

步骤二：种子生长法制备银包金纳米颗粒：1）取100 mL milli-Q水于三颈瓶中，置于油浴中加热磁力搅拌并回流，待煮沸后依次向其中加入2 mL 1 wt % HAuCl₄和3.5 mL、30 mM的柠檬酸钠溶液，继续加热20 min，搅拌冷却至室温，得到17 nm的金纳米颗粒；2）取3 mL17 nm的金纳米颗粒溶液加入到27 mL含有4 mM柠檬酸钠和1 mM抗坏血酸的水中，并用0.01M的NaOH将溶液pH调至中性；30 min内逐滴向其中加入1 mL浓度为18 mM的AgNO₃水溶液，然后置于油浴中加热回流1小时，即得到30 nm的银包金纳米颗粒；

步骤三：制备DNA链修饰的金纳米颗粒和银包金纳米颗粒：末端二硫键修饰的DNA与DTT在黑暗环境下培养后用NAP-5柱分离得到巯基修饰的DNA；向500 μL浓度为2 nM直径为27nm的金纳米颗粒中加入一定量的DNA混合溶液，DNA混合溶液包含2%的DNA 1和98%的DNA 0；孵育过夜，加NaCl到终浓度为30 mM，超声10 s；然后每隔2 h重复以上步骤，直到NaCl终浓度为0.5 M；离心除去多余的DNA，并用水洗两次，所得溶液置于冰箱待用；

向500 μL浓度为2 nM直径为30 nm的银包金纳米颗粒中加入一定量的DNA混合溶液，DNA混合溶液包含2%的DNA 2和98%的DNA 0，序列见表，孵育过夜，加NaCl到终浓度为30 mM，超声10 s；然后每隔2 h重复以上步骤，直到NaCl终浓度为0.5 M；离心除去多余的DNA，并用水洗两次，所得溶液置于冰箱待用；

步骤四：将DNA修饰过的银包金纳米颗粒和金纳米颗粒以2:1的体积比例混合，测得其荧光强度，加入不同浓度的目标DNA后，再次测其荧光信号，并根据标准曲线计算DNA浓度。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：将步骤二中 “2）取3 mL 17 nm的金纳米颗粒溶液加入到27 mL含有4 mM柠檬酸钠和1 mM抗坏血酸的水中，并用0.01 M的NaOH将溶液pH调至中性；30 min内逐滴向其中加入1 mL浓度为18 mM的AgNO₃水溶液，然后置于油浴中加热回流1小时，即得到30 nm的银包金纳米颗粒”替换为“取3 mL 17 nm的金纳米颗粒溶液加入到27 mL含有4 mM柠檬酸钠和1 mM抗坏血酸的水中，并用0.01 M的NaOH将溶液pH调至中性；30 min内逐滴向其中加入3 mL浓度为18 mM的AgNO₃水溶液，然后置于油浴中加热回流1小时，即得到65 nm的银包金纳米颗粒”；同时，将步骤三中“直径为30 nm的银包金纳米颗粒”替换为“65 nm的银包金纳米颗粒”。

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