CN109696428B - 一种银纳米颗粒聚集增强异硫氰酸罗丹明b荧光强度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种银纳米颗粒聚集增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度的方法，包括如下步骤：（1）银纳米颗粒的制备；（2）在银纳米颗粒表面修饰异硫氰酸罗丹明B，得表面修饰异硫氰酸罗丹明B的银纳米颗粒；（3）加入连接剂，表面修饰异硫氰酸罗丹明B的银纳米颗粒发生聚集，增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度。本发明主要是利用贵金属纳米颗粒聚集耦合产生的“热点”，导致纳米颗粒间的局域电场显著增强，从而提高在其表面异硫氰酸罗丹明B的荧光发射效率，恢复甚至增强单分散下被银纳米颗粒淬灭的异硫氰酸罗丹明B荧光。该方法荧光增强明显，且样品能分散在水相，聚集前后荧光变化显著。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料合成及应用领域，具体涉及是一种增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度的方法，该技术可用于生物成像、分析检测等。
背景技术
贵金属纳米粒子，如金、银纳米颗粒，由于其独特的光学性质----表面等离子体共振效应(SPR)而在诸多领域中得到广泛的应用，如生物传感，细胞成像和非线性光学等。金属纳米颗粒与入射光相互作用，导致表面自由电子集体震荡而产生表面等离子共振效应。表面等离子共振吸收峰位置对环境、尺寸和颗粒形状敏感，同时也可以通过纳米颗粒聚集耦合来改变。纳米颗粒聚集时，表面等离子耦合导致吸收峰红移，同时在纳米颗粒间隙处产生“热点”，导致间隙处的局域电场显著增强。这种利用纳米颗粒聚集导致局域电场显著增强的方法，已被广泛应用在金属增强荧光、表面增强拉曼散射、二次谐波的产生和双光子荧光等领域。
荧光技术由于简单快速、重复性高和价格低廉等优势广泛应用生命科学、食品安全、环境保护等领域。但传统的有机荧光染料亮度不高，还存在光漂白和自淬灭效应，导致荧光强度进一步降低，同时光稳定性也较差，这些不足限制荧光技术在诸多领域的应用。二十世纪七十年代，Drexhage发现了金属增强荧光现象：当荧光物质分布在金和银等贵金属表面或溶胶附近时，其发射强度能够大大增加，增强效果强烈依赖于染料分子和金属表面两者距离。这一现象的发现促进了荧光技术的发展。但是大多数实验方法都是利用金属薄膜作为基质，不利用其在生物体内成像，而利用金属纳米颗粒作为基质，需要表面包覆一层二氧化硅或聚电解质来调控距离，合成过程复杂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种AgNPs聚集增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度的方法。本发明利用银纳米颗粒（AgNPs）聚集增强染料分子荧光。该方法合成步骤简单，荧光增强效果明显，纳米颗粒分散在水相，利于在生物体内成像。通过聚集产生“热点”导致局域电场显著增强，提高染料分子的荧光强度，减少了荧光寿命，提高了光稳定性，不需要包覆二氧化硅或聚电解质来调控距离，实验过程更加精简。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种银纳米颗粒聚集增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度的方法，包括如下步骤：
（1）AgNPs的制备；
（2）在AgNPs表面修饰异硫氰酸罗丹明B分子，得表面修饰异硫氰酸罗丹明B的AgNPs；
（3）加入连接剂，所述表面修饰异硫氰酸罗丹明B的银纳米颗粒的紫外—可见吸收光谱发生明显变化，412nm处的吸收强度降低，同时在600-700nm波长范围内出现新的共振吸收峰，表面修饰荧光染料分子的AgNPs发生聚集，增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度。
优选地，步骤（1）具体包括：
1）分别配置浓度为59.4mmol/L的硝酸银溶液、浓度为34mmol/L的柠檬酸钠溶液、浓度为0.1-0.2mol/L的抗败血酸溶液、浓度为0.2mol/L的氯化钠溶液；
2）取49mL去离子水在110-140℃、300-400转/分钟的条件下加热搅拌，至煮沸时加入1mL所述柠檬酸钠溶液、100 μL所述抗败血酸溶液和20 μL所述氯化钠溶液，继续在110-140℃、300-400转/分钟的条件下加热搅拌5分钟；
3）在110-140℃、300-400转/分钟的条件下，加入0.25mL所述硝酸银溶液，溶液颜色由无色变为黄色后，继续搅拌并保温1-1.5小时使反应完全，关闭加热，持续以300-400转/分钟的速度搅拌，自然冷却到室温时关闭搅拌，即得AgNPs溶液。
优选地，步骤（2）具体包括：
1)分别配置浓度为0.1mol/L碳酸钾溶液，溶解有异硫氰酸罗丹明B的二甲基亚砜溶液，其中异硫氰酸罗丹明B的浓度为1mmol/L，质量分数为1%的十二烷基硫酸钠溶液；
2)将步骤（1）所述的AgNPs溶液用去离子水稀释2-3倍，得稀释的AgNPs溶液；
3)取6mL稀释的AgNPs溶液，加入20-25μL所述碳酸钾溶液，调节溶液PH为8，搅拌8-10分钟，混合均匀后加入1.5μL所述溶解有异硫氰酸罗丹明B的二甲基亚砜溶液，搅拌2-3小时，搅拌完成后放置在摇床中过夜，使异硫氰酸罗丹明B能充分修饰到AgNPs表面，得混合溶液；
4)取所述混合溶液0.8mL，加入5.0 uL 所述十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，离心，去除上层清液，将离心产物重新分散在0.8 mL去离子水中，得到表面修饰有异硫氰酸罗丹明B的分散AgNPs（简称分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B）溶液。
优选地，步骤（3）具体包括：
1)配置浓度为40 μmol/L的连接剂溶液；
2)取0.4mL步骤（2）的4）所得分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液，加入4μL所述连接剂溶液，引发AgNPs聚集，静置15-25分钟，溶液颜色由黄色变为无色，得表面修饰有异硫氰酸罗丹明B的聚集银纳米颗粒（简称聚集AgNPs-异硫氰酸罗丹明B）溶液。
优选地，所述连接剂包括半胱胺，其分子中的巯基和氨基能与AgNPs表面连接，导致AgNPs聚集。
由上述方法制备的AgNPs的尺寸为40-50 nm。
将步骤（2）中3）制得的混合溶液用二硫苏糖醇溶液洗脱，得到AgNPs表面洗脱的异硫氰酸罗丹明B溶液。取0.4mL溶液装入微量的石英比色皿中，测试溶液的荧光发射光谱和荧光寿命。
与现有技术相比，本发明的有益效果和优点包括：
金属增强荧光技术，大多数是将染料分子固定在石英或硅片表面的金属薄膜上进行，不能在水相中使用，这限制了在生物体内成像追踪、分析检测等应用；少数利用金属纳米颗粒作为基质增强荧光，虽然可以在水相中使用，但需要复杂的修饰过程，在其表面包覆合适厚度的二氧化硅或聚电解质调控距离，实现增强效果。本发明的纳米颗粒聚集增强染料荧光不仅可以在水相中使用，而且不需要表面包覆，过程简单，只需要加入适量连接剂引发AgNPs聚集，就能实现明显的荧光增强效果。最后聚集增强的荧光寿命相较于洗脱下的染料分子荧光寿命更短，极大的提高了光稳定性。本发明可以使异硫氰酸罗丹明B的荧光效果有明显增强。本发明方法反应条件温和，制备过程简单，重现性好，增强效果明显。
附图说明
图1为AgNPs的透射电镜图；
图2为分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液和聚集AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液的紫外-可见吸收光谱图；
图3为AgNPs表面洗脱的异硫氰酸罗丹明B（简称异硫氰酸罗丹明B洗脱）溶液、分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液和聚集AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液的荧光发射光谱图；
图4为异硫氰酸罗丹明B洗脱溶液、分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液和聚集AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液的的荧光寿命光谱图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不受限于这些实施例。
实施例：
(1)制备AgNPs
1）分别配置浓度为59.4mmol/L的硝酸银溶液、浓度为34mmol/L的柠檬酸钠溶液、浓度为0.2mol/L的抗败血酸溶液、浓度为0.2mol/L的氯化钠溶液；
2）取49mL去离子水在120℃、350转/分钟的条件下加热搅拌，至煮沸时加入1mL所述柠檬酸钠溶液、100μL所述抗败血酸溶液和20μL所述氯化钠溶液，继续在120℃、350转/分钟的条件下加热搅拌5分钟；
3）在120℃、350转/分钟的条件下，加入0.25mL所述硝酸银溶液，溶液颜色迅速由无色变成黄色，表明AgNPs形成。继续搅拌并保温1小时使反应完全，关闭加热，持续以350转/分钟的速度搅拌，自然冷却到室温时关闭搅拌，即得AgNPs溶液。
取步骤（1）中3）所得的AgNPs溶液，在透射电镜下观察，图1电镜照片可以看出，合成的AgNPs尺寸分布比较均匀，颗粒大小为40-50nm。
(2)在AgNPs表面修饰异硫氰酸罗丹明B
1)分别配置浓度为0.1mol/L碳酸钾溶液，溶解有异硫氰酸罗丹明B的二甲基亚砜溶液，其中异硫氰酸罗丹明B的浓度为1mmol/L，质量分数为1%的十二烷基硫酸钠溶液；
2)将步骤（1）所述的AgNPs溶液用去离子水稀释2.5倍，得稀释的AgNPs溶液；
3)取6mL稀释的AgNPs溶液，加入22.8 μL所述碳酸钾溶液，调节溶液PH为8，搅拌8-10分钟，混合均匀后加入1.5 μL所述溶解有异硫氰酸罗丹明B的二甲基亚砜溶液，搅拌2小时，摇床过夜，使异硫氰酸罗丹明B能充分修饰到AgNPs表面，得混合溶液；
4) 取上述溶液0.8mL分别装入两管0.6mL的微量离心管中，每管0.4 mL，每管加入2.5 μL1%的十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，用高速离心机离心10分钟，转速为10000转/分钟；去除上层清液，将离心产物重新分散在0.8mL去离子水中，分散均匀后每管0.4 mL溶液再次加入2.5 μL1%的十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，高速离心机离心10分钟，转速10000转/分钟；去除上清液，将离心产物再次分散在0.8 mL去离子水中，得到分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液。
取上述溶液0.4 mL分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液放入微量的石英比色皿中，用紫外—可见（UV）吸收光谱仪测试溶液吸收光谱，如图2所示；荧光光谱仪（PL）测试溶液荧光发射光谱，如图3所示；用时间相关单光子计数器（TCSPC）测试溶液荧光寿命，如图4所示。
(3)表面修饰异硫氰酸罗丹明B的 AgNPs的聚集：
1)配置浓度为40 μmol /L的半胱胺溶液；
2)取0.4mL步骤（2）的4）所得分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液，加入4 μL所述半胱胺溶液，引发AgNPs聚集，静置15分钟，得聚集AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液。
装入微量的石英比色皿中，测试聚集AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液的吸收光谱（图2），荧光发射光谱（图3）和荧光寿命（图4）。
(4)AgNPs表面异硫氰酸罗丹明B的洗脱：
1)配置浓度为0.5mol/L二硫苏糖醇溶液；
2)取0.4mL步骤（2）中3）所得混合溶液装入0.6mL微量离心管，加入2.5 μL1%十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，高速离心机离心10分钟，转速10000转/分钟，离心两次。第二次离心前，同样加入2.5μL1%十二烷基硫酸钠溶液；
3)去除上清，重新分散在0.4mL的0.5mol/L二硫苏糖醇溶液中，放入烘箱，50℃保温2小时，摇床10分钟，保证二硫苏糖醇分子能充分将染料洗脱，再离心10分钟，转速10000转/分钟。取上液，即得到异硫氰酸罗丹明B洗脱溶液；
4)取0.4mL异硫氰酸罗丹明B洗脱溶液装入微量的石英比色皿中，测试溶液的荧光发射光谱（图3）和荧光寿命（图4）。
利用上述技术，AgNPs聚集能极大的增强异硫氰酸罗丹明B荧光。图2吸收光谱结果表明：分散AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液的吸收光谱只有一个吸收峰，大约在412nm左右；当加入连接剂半胱胺后，AgNPs发生聚集，此时聚集AgNPs-异硫氰酸罗丹明B溶液的吸收光谱412nm处的吸收峰降低，同时在长波方向，600-700nm之间出现一个新的等离子共振吸收峰，这与文献上报道的金银纳米颗粒聚集时吸光光谱变化一致。（《金银纳米颗粒应用于氨基酸的可视化检测》，李剑芳，南昌大学；Cuifeng Jiang et al. Two-photon ratiometricsensing of Hg2+ by using cysteine functionalized Ag nanoparticles. Nanoscale,2011, 3, 3316–3320）。图3荧光光谱结果表明：异硫氰酸罗丹明B修饰的分散AgNPs能有效淬灭了AgNPs洗脱的异硫氰酸罗丹明B的荧光强度，异硫氰酸罗丹明B的荧光被淬灭为原来的0.338倍，由于染料与金属表面距离太近，异硫氰酸罗丹明B的荧光被纳米颗粒淬灭，这可以降低荧光背景；当AgNPs聚集时，纳米颗粒间隙产生“热点”，局域电场显著增强，提高了异硫氰酸罗丹明B的荧光发射效率，荧光寿命缩短，异硫氰酸罗丹明B的荧光不仅被恢复，而且增强了3.8倍，荧光增强显著,相较于分散时淬灭的荧光强度，聚集时荧光强度增强了11.3倍，对比效果明显。图4荧光寿命结果表明：相较于AgNPs表面洗脱的异硫氰酸罗丹明B溶液的荧光寿命，异硫氰酸罗丹明B修饰的聚集AgNPs溶液的荧光寿命显著缩短，大大提高了染料的光稳定性。
Claims (3)
1.一种银纳米颗粒聚集增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）银纳米颗粒的制备；具体包括：
1）分别配置浓度为59.4mmol/L的硝酸银溶液、浓度为34mmol/L的柠檬酸钠溶液、浓度为0.1-0.2mol/L的抗败血酸溶液、浓度为0.2mol/L的氯化钠溶液；
2）取49mL去离子水在110-140℃、300-400转/分钟的条件下加热搅拌，至煮沸时加入1mL所述柠檬酸钠溶液、100 μL所述抗败血酸溶液和20 μL所述氯化钠溶液，继续在110-140℃、300-400转/分钟的条件下加热搅拌5分钟；
3）在110-140℃、300-400转/分钟的条件下，加入0.25 mL所述硝酸银溶液，溶液颜色由无色变为黄色后，继续搅拌并保温1-1.5小时使反应完全，关闭加热，持续以300-400转/分钟的速度搅拌，自然冷却到室温时关闭搅拌，即得银纳米颗粒溶液；
（2）在银纳米颗粒表面修饰异硫氰酸罗丹明B分子，得表面修饰异硫氰酸罗丹明B的银纳米颗粒；具体包括：
1)分别配置浓度为0.1mol/L碳酸钾溶液，溶解有异硫氰酸罗丹明B的二甲基亚砜溶液，异硫氰酸罗丹明B的浓度为1mmol/L，质量分数为1%的十二烷基硫酸钠溶液；
2)将步骤（1）所得的银纳米颗粒溶液用去离子水稀释2-3倍，得稀释的银纳米颗粒溶液；
3)取6mL稀释的银纳米颗粒溶液，加入20-25μL所述碳酸钾溶液，调节溶液pH 为8，搅拌8-10分钟，混合均匀后加入1.5μL所述溶解有异硫氰酸罗丹明B的二甲基亚砜溶液，搅拌2-3小时，搅拌完成后放置在摇床中过夜，使异硫氰酸罗丹明B能充分修饰到银纳米颗粒表面，得混合溶液；
4)取所述混合溶液0.8mL，加入5.0 μL 所述十二烷基硫酸钠溶液，混合均匀，离心，去除上层清液，将离心产物重新分散在0.8 mL去离子水中，得到表面修饰有异硫氰酸罗丹明B的分散银纳米颗粒溶液；
（3）表面修饰异硫氰酸罗丹明B的 AgNPs的聚集：
加入连接剂半胱胺，所述表面修饰异硫氰酸罗丹明B的银纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱发生明显变化，412nm处的吸收强度降低，同时在600-700nm波长范围内出现新的共振吸收峰，表面修饰荧光染料分子的银纳米颗粒发生聚集，增强异硫氰酸罗丹明B的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的银纳米颗粒聚集增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度的方法，其特征在于，步骤（3）具体包括：
1)配置浓度为40 μmol/L的连接剂溶液；
2)取0.4mL步骤（2）的4）所得表面修饰有异硫氰酸罗丹明B的分散银纳米颗粒溶液，加入4μL所述连接剂溶液，引发银纳米颗粒聚集，静置15-25分钟，溶液颜色由黄色变为无色，得表面修饰有异硫氰酸罗丹明B的聚集银纳米颗粒溶液。
3.根据权利要求1或2所述的银纳米颗粒聚集增强异硫氰酸罗丹明B荧光强度的方法，其特征在于，所述银纳米颗粒的尺寸为40-50nm。
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