CN109975220A - 一种精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种精浆中性α‑葡萄糖苷酶测定试剂盒，所述试剂盒采用双底物模式，将酶分解方式分为两步，改变精浆空白方式，去掉糖苷酶抑制剂，改用氢氧化钠终止反应，调整反应模式，降低反应成本，缩短反应时间，结果准确稳定，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒。

背景技术

中性α-葡糖苷酶(中性α-葡萄糖苷酶)是附睾分泌功能的指标。比左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱对附睾更特异更灵敏。结合激素和睾丸其他指标，对远端输精管阻塞有较好的诊断价值。果糖结合中性α-葡糖苷酶检测，可大大提高其诊断阻塞性无精子症的价值。

世界卫生组织(WHO)编写的《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)中第113页-115页推荐的精浆中性α-葡糖苷酶测定的原理为：葡萄糖苷酶将合成的吡喃葡糖苷底物转化为对硝基苯酚，加入碳酸钠后变为黄色。世界卫生组织推荐的方法中，底物P-硝基苯酚吡喃葡糖苷配制过程复杂且每次测试需配制新鲜试剂现配现用，用于配制精液空白的castanospermine(澳洲栗精胺)难以购买，检测过程中需孵育2小时，使该方法不适用于大规模投入生产产品；

深圳华康生物医学工程有限公司生产的精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂盒(酶法)(注册证编号：粤械注准20152400611)检验原理为：酸性条件下，通过对精浆酸性α-葡糖苷酶的抑制，保留中性α-葡糖苷酶活性，后者分解底物生成终产物对硝基酚，对硝基酚在405nm波长有最大吸收波长，颜色深浅与单位时间内精浆中性α-葡糖苷酶活力成正比；其组份有：底物(冻干粉)、糖苷酶抑制剂(冻干粉)、酸性抑制剂、底物溶解液、终止液、校准液1、校准液2、校准液3、校准液4、校准液5、质控液。深圳华康生物医学工程有限公司生产的精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂盒(酶法)中，底物为冻干粉状态溶解后2-8℃保存可用5天，糖苷酶抑制剂冻干粉状态溶解后2-8℃可使用20天，且试剂盒试剂组份多达11个，手工操作比较复杂，不利于客户大规模使用。而且这两种方法都需要专业技术人员进行操作。

CN103760331A公开了一种精浆联检试剂盒，包括九种检测试剂：白细胞酯酶检测试剂、卵磷脂小体检测试剂、酸性磷酸酶检测试剂、果糖检测试剂、中性α-葡萄糖苷酶检测试剂、pH值检测试剂、柠檬酸检测试剂、锌检测试剂和弹性蛋白酶检测试剂，可将精浆内含有的九大指标pH值、白细胞酯酶、卵磷脂小体、柠檬酸、锌、酸性磷酸酶、弹性蛋白酶、果糖和中性α-葡萄糖苷酶联合进行快速、准确、简便、实用的一次性检测。CN1243834C公开了一种男性不育症的检测方法及其检测试剂的制备方法，其中检测方法包括：制备含2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷的酶活力检测试剂液；制备精浆样品，在测定的条件下进行酶促反应，检测α-葡萄糖苷酶的活性。该检测试剂的制备方法包括：制备五乙酰氧基葡萄糖苷；采用得到的五乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷；用2-氯-4-硝基苯基-α-四乙酰氧基葡萄糖苷制备2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷；和取适量缓冲液固体、2-氯-4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷和还原型谷胱甘肽混合制成粉剂，并确定检测方法。上述现有技术试剂种类繁多，操作步骤复杂，不易推广应用，有待进一步改进和提高。

因此，提供一种快速高效、符合自动化潮流的测定试剂盒，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒，所述试剂盒采用双底物模式，将酶分解方式分为两步，改变精浆空白方式，去掉糖苷酶抑制剂，改用氢氧化钠终止反应，调整反应模式，降低反应成本，缩短反应时间，结果准确稳定，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒，所述试剂盒包括底物A和底物B；

其中，所述底物A包括对硝基酚-麦芽糖苷，底物B包括β-葡萄糖苷酶。

本发明中，发明人通过大量文献查阅和实验筛选，选择了一种新的酶分解方式来检测精浆中性a-葡萄糖苷酶含量并研发出一种新的检测试剂盒，采用双底物模式，将底物保存改为溶液状态，创新的将酶分解方式分为两步，底物A主要成分为对硝基酚-麦芽糖苷，底物B为β-葡萄糖苷酶，麦芽糖属于双糖(二糖)类，由两个D-葡萄糖分子通过α构型的1，4键连接起来的双糖，具有还原性。对硝基酚-麦芽糖苷经β-葡萄糖苷酶催化被水解成两个对硝基酚葡萄糖苷后，被中性α-葡萄糖苷酶分解生成对硝基酚；改变精浆空白方式，在试剂盒中去掉了糖苷酶抑制剂，改用终止液直接终止酶催化反应来获得空白值，终止液主要成分为氢氧化钠；调整反应模式，将反应操作转移到空白微孔板，减少实验步骤操作，使该项目能整合至各设备操作平台。

所述精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒还包括终止液；

优选地，所述终止液包括氢氧化钠；

优选地，所述精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒还包括稀释液和校准液；

优选地，所述校准液包括对硝基酚；

优选地，所述稀释液包括氯化钠。

试剂盒检测分析原理是：中性α-葡萄糖苷酶分解底物生成终产物对硝基酚(PNP)，对硝基酚在405nm波长有最大吸收波长，其吸光度与精浆中性α-葡萄糖苷酶含量成正比，试剂盒配有PNP校准液，通过校准曲线计算得出中性α-葡萄糖苷酶含量。

优选地，所述底物A的pH为7.2-7.6，例如可以是7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。

优选地，所述底物B的pH为7.2-7.6，例如可以是7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。

第二方面，本发明提供一种检测体系，所述检测体系由第一方面所述的试剂盒配制得到。

优选地，所述检测体系中对硝基酚-麦芽糖苷的浓度为0.6-0.8g/L；

优选地，所述检测体系中β-葡萄糖苷酶的浓度为8-10KU/L；

优选地，所述检测体系中氢氧化钠的浓度为2-4mol/L。

第三方面，本发明提供一种精浆中性α-葡萄糖苷酶的检测方法，采用第一方面所述的试剂盒和/或第二方面所述的检测体系。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测精浆采用稀释液稀释，设置对照孔和测定孔，每孔加入稀释精浆、底物A和底物B，混匀后孵育，测定孔孵育后加入终止液，对照孔孵育前加入终止液，得到检测体系，比色读取吸光度值，计算测定孔与对应对照孔吸光度差值；

(2)将校准液采用终止液进行梯度稀释，并以终止液为零校准液，比色读取吸光度值，结合中性α-葡萄糖甘酶浓度，得到校正曲线；

(3)根据步骤(2)的校准曲线计算步骤(1)的差值对应的中性α-葡糖苷酶浓度含量。

因精浆成分复杂颜色多样(如血精成红色等)，故会干扰吸光度值，例如某份精浆直接读数吸光度值为0.1，另一份可能为0.5，需要设置对照孔将干扰排除。

优选地，步骤(1)所述精浆的稀释倍数为8-12倍，例如可以是8倍、9倍、10倍、11倍或12倍。

优选地，步骤(1)所述比色的波长为405nm。

优选地，步骤(1)所述检测体系中对硝基酚-麦芽糖苷的浓度为0.6-0.8g/L；

优选地，步骤(1)所述检测体系中β-葡萄糖苷酶的浓度为8-10KU/L；

优选地，步骤(1)所述检测体系中氢氧化钠的浓度为2-4mol/L。

优选地，步骤(1)所述孵育的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。

优选地，步骤(1)所述孵育的时间为20-30min，例如可以是20min、22min、24min、25min、26min、28min、29min或30min。

优选地，步骤(2)所述比色的波长为405nm。

作为优选技术方案，具体包括如下步骤：

(1)将待测精浆采用稀释液稀释8-12倍，设置对照孔和测定孔，每孔加入稀释精浆、底物A和底物B，混匀后35-40℃孵育20-30min，测定孔孵育后加入终止液，对照孔孵育前加入终止液，得到检测体系，对硝基酚-麦芽糖苷的浓度为0.6-0.8g/L，β-葡萄糖苷酶的浓度为8-10KU/L，步骤(1)所述检测体系中氢氧化钠的浓度为2-4mol/L，405nm波长比色读取吸光度值，计算测定孔与对应对照孔吸光度差值；

(2)将校准液采用终止液进行梯度稀释，并以终止液为零校准液，405nm波长比色读取吸光度值，结合中性α-葡萄糖甘酶浓度，得到校正曲线；

(3)根据步骤(2)的校准曲线计算步骤(1)的差值对应的中性α-葡糖苷酶浓度含量。

降低试剂盒成本

精浆中性a-葡萄糖苷酶测定试剂盒(酶法)相比之前的精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂盒(酶法)(注册证编号：粤械注准20152400611)，通过实验调整反应体系，将试剂盒组份大量减少，降低了底物的配比，不仅减少了生产过程中的人工操作，还将原料成本控制到了原成本的50％以下。

降低试剂盒操作复杂性

WHO推荐方法实验操作时间大概为3小时以上，只能由手工操作；前试剂精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂盒(酶法)整体实验操作工序较多，操作中需将反应物从反应容器中转移至微孔板中读数，操作时间约为1小时以上，也只能由手工操作；本发明的试剂盒可手工操作，也可由全自动生化仪平台操作，节约了大量人力，反应时间也缩短为30分钟左右。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的技术方案简化检测中性α-葡萄糖苷酶的操作步骤，通过实验调整反应体系，将试剂盒组份大量减少，降低了底物的配比，不仅减少了生产过程中的人工操作，还将原料成本控制到了原成本的50％以下；提高试剂盒的稳定性，降低试剂盒成本，使试剂盒既能依靠手工操作也能整合到全自动生化分析仪平台，本发明的试剂盒可手工操作，也可由全自动生化仪平台操作，节约了大量人力，反应时间也缩短为30分钟左右；快速高效，符合自动化潮流，填补了市场空缺，易于在临床上推广。

附图说明

图1是本发明的试剂盒的生产工艺流程图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1试剂盒的组成和制备

底物A的制备：在100mL配液瓶中加入7.5g磷酸氢二钾、4.5g磷酸二氢钾，搅拌20min混匀，用pH计检测溶液PH值为7.2-7.6，加入对硝基酚-麦芽糖苷0.07g。

底物B的制备：在100mL配液瓶中加入7.5g磷酸氢二钾、4.5g磷酸二氢钾，搅拌20min混匀，用pH计检测溶液pH值为7.2-7.6，加入β-葡萄糖苷酶0.9KU。

终止液的制备:将纯化水100ml、氢氧化钠准确称量12g，然后投入配液瓶中，震荡或搅拌使溶解。

校准液的制备：将纯化水1000ml、对硝基酚0.022g、氢氧化钠4g准确称量，然后投入配液瓶中。

稀释液的制备：将纯化水100ml、氯化钠0.7g准确称量，然后投入配液瓶中。

将上述试剂盒说明书组装成试剂盒，生产工艺流程图见图1。

实施例2试剂盒操作和结果计算

将校准液向下稀释3个梯度，连续稀释方法：取3支离心管，每管加终止液300μL，第一管加校准液300μL，充分混匀后从中取300μL至第二管，如此类推等倍稀释至第三管。

另取终止液为零校准液，各校准液取270μL于微孔板中，405nm波长比色读取吸光度值，用校准液吸光度值与对应中性α-葡糖苷酶浓度绘制二次曲线作为校准曲线。

将待检精浆标本1:10稀释：取1体积的精浆加9体积的稀释液混匀(例如取20μL精浆加180μL稀释液)，在微孔板内完成操作，每个待检标本需同时设测定孔和对照孔，每孔加入稀释标本20μL，底物A100μL，底物B100μL，对照孔加入终止液50μL，混匀，37℃孵育25min后测定孔加入终止液50μL，405nm波长比色读取吸光度值，计算测定孔与对应对照孔吸光度差值，依据校准曲线计算每个标本对应则中性α-葡糖苷酶浓度含量。

例如5个校准液吸光度值分别为：0.040、0.365、0.673、1.268、2.396，对应中性α-葡糖苷酶浓度为0、5.25、10.5、21、42(U/L)，绘制标准曲线得回归方程为y＝0.6663x2+16.229x-0.6991，R2＝1.某标本对照管吸光度为0.099，测定管吸光度为0.765，代入校准曲线计算中性α-葡糖苷酶浓度＝10.4U/L。

实施例3试剂盒整合至全自动生化平台

以深圳市库贝尔生物科技股份有限公司生产的iMagic-M7型全自动生化分析仪(产品注册号：粤食药监械(准)字2014第2401079号)为实验平台，本试剂盒可完全整合至该设备自主操作完成。

实施例4试剂盒稳定性实验

为考察产品的实时稳定性，将实施例1制得的精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒(酶法)置于储存温度条件(2-8℃贮存)下保存13个月，在第0、3、6、7、9、10、12、13个月各进行一次准确度参考品项目检验(测试已知中性α-葡萄糖苷酶标示浓度的准确度参考物质Z1、Z2、Z3浓度，每个重复测量3次，求平均值为其实测浓度,相对偏差R＝∣(实测浓度-标示浓度)∣/标示浓度×100％，技术要求为参考物质测试值相对偏差R不超过±15％)；要求试剂盒在储存温度条件下(2-8℃)保存应稳定在12个月以上，即在此条件下储存12个月后，试剂盒的质量必须仍能达技术要求。

表1

从表1结果来看，试剂盒在2-8℃保存13个月内，准确度参考品Z1、Z2、Z3检测相对偏差R均不超过±15％，符合技术要求，认定试剂盒在储存温度条件下(2-8℃)保存稳定在12个月以上。

实施例5底物稳定性

以下为试剂盒保存于2-8℃每隔三个月取出检测室内质控Q1、Q2、Q3的中性α-葡萄糖苷酶浓度，结果如下表2；

表2

WHO推荐推荐方法中底物配制后使用过程中溶液保持在37℃，每次测试时需配制新鲜试剂，不可保存；前试剂盒底物冻干粉溶解后2-8℃保存时间仅为5天。这两种方法给客户使用均带来极大的困难；而本发明试剂盒中的底物A、底物B均为溶液状态，2-8℃保存有效期为12个月。

实施例6终止液效果

WHO推荐方法和深圳华康生物医学工程有限公司生产的精浆中性α-葡糖苷酶定量检测试剂盒(酶法)均采用castanospermine作为糖苷酶抑制剂，该原料采购自进口厂商如美国SIGMA公司，货号C3784，价格约为1000RMB/MG，购买渠道困难，且对生态环境有一定的影响。本试剂盒创新使用终止液(主要配方为氢氧化钠)替代糖苷酶抑制剂来提供精液标本的空白值，依据三种方案检测内控样本的精浆空白值，放置一段时间考察对酶活性的抑制效果见表3：

表3

由以上结果可认为本发明所使用的终止液方案与其它两种方案中castanospermine对精浆中性α-葡糖苷酶的活性抑制效果相同。

综上所述，本发明提供一种精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒，所述试剂盒采用双底物模式，将酶分解方式分为两步，改变精浆空白方式，去掉糖苷酶抑制剂，改用氢氧化钠终止反应，调整反应模式，降低反应成本，缩短反应时间，结果准确稳定，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括底物A和底物B；

其中，所述底物A包括对硝基酚-麦芽糖苷，底物B包括β-葡萄糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒，其特征在于，所述精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒还包括终止液；

优选地，所述终止液包括氢氧化钠；

优选地，所述精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒还包括稀释液和校准液；

优选地，所述校准液包括对硝基酚；

优选地，所述稀释液包括氯化钠。

3.根据权利要求1或2所述的精浆中性α-葡萄糖苷酶测定试剂盒，其特征在于，所述底物A的pH为7.2-7.6；

优选地，所述底物B的pH为7.2-7.6。

4.一种检测体系，其特征在于，所述检测体系由权利要求1-3中任一项所述的试剂盒配制得到。

5.根据权利要求4所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系中对硝基酚-麦芽糖苷的浓度为0.6-0.8g/L；

优选地，所述检测体系中β-葡萄糖苷酶的浓度为8-10KU/L；

优选地，所述检测体系中氢氧化钠的浓度为2-4mol/L。

6.一种精浆中性α-葡萄糖苷酶的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-3中任一项所述的试剂盒和/或权利要求4或5所述的检测体系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测精浆采用稀释液稀释，设置对照孔和测定孔，每孔加入稀释精浆、底物A和底物B，混匀后孵育，测定孔孵育后加入终止液，对照孔孵育前加入终止液，得到检测体系，比色读取吸光度值，计算测定孔与对应对照孔吸光度差值；

(2)将校准液采用终止液进行梯度稀释，并以终止液为零校准液，比色读取吸光度值，结合中性α-葡萄糖甘酶浓度，得到校正曲线；

(3)根据步骤(2)的校准曲线计算步骤(1)的差值对应的中性α-葡糖苷酶浓度含量。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述精浆的稀释倍数为8-12倍；

优选地，步骤(1)所述比色的波长为405nm；

优选地，步骤(1)所述检测体系中对硝基酚-麦芽糖苷的浓度为0.6-0.8g/L；

优选地，步骤(1)所述检测体系中β-葡萄糖苷酶的浓度为8-10KU/L；

优选地，步骤(1)所述检测体系中氢氧化钠的浓度为2-4mol/L；

优选地，步骤(1)所述孵育的温度为35-40℃；

优选地，步骤(1)所述孵育的时间为20-30min。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述比色的波长为405nm。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将待测精浆采用稀释液稀释8-12倍，设置对照孔和测定孔，每孔加入稀释精浆、底物A和底物B，混匀后35-40℃孵育20-30min，测定孔孵育后加入终止液，对照孔孵育前加入终止液，得到检测体系，对硝基酚-麦芽糖苷的浓度为0.6-0.8g/L，β-葡萄糖苷酶的浓度为8-10KU/L，步骤(1)所述检测体系中氢氧化钠的浓度为2-4mol/L，405nm波长比色读取吸光度值，计算测定孔与对应对照孔吸光度差值；

(2)将校准液采用终止液进行梯度稀释，并以终止液为零校准液，405nm波长比色读取吸光度值，结合中性α-葡萄糖甘酶浓度，得到校正曲线；

(3)根据步骤(2)的校准曲线计算步骤(1)的差值对应的中性α-葡糖苷酶浓度含量。