CN110514655A - 一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法 - Google Patents

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沙涛
王丁卉
张亚平
张�林
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何志红
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Abstract

本发明公开了一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，属于生物酶技术领域。本发明采用梯度的质量浓度的葡萄糖溶液作为标准样；分别测定葡萄糖溶液标准样的吸光度值A；建立浓度(y)‑吸光度A(x)标准曲线，并拟合出浓度(y)‑吸光度A(x)函数关系表达式；称重干巴菌菌丝得测定样，取相等质量的干巴菌菌丝测定样煮沸得干巴菌菌丝对照样；分别进行酶促反应和煮沸处理得对照样糖化液和待测样糖化液；分别测定对照样糖化液和待测样糖化液的吸光度值A；将吸光度值A代入浓度(y)‑吸光度A(x)函数关系表达式得对照样糖化液和待测样糖化液中葡萄糖浓度，计算待测样糖化液的相对葡萄糖浓度；根据酶活力计算公式计算待测样的酶活力值。

Description

一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法
技术领域
本发明涉及一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，属于生物酶技术领域。
背景技术
根据研究可知，在真菌侵染宿主的过程中，菌丝会分泌纤维素酶等水解酶，在酶促作用下，菌丝通过侵染点进入到皮层细胞间隙；分布于根表皮外表面的菌丝则会形成菌套将根尖包裹，从而完成侵染过程。所以，纤维素酶等水解酶的分泌情况会影响侵染的效果。而干巴菌的侵染率低，可能与纤维素酶的分泌有关系。
纤维素酶通常是胞外酶，胞外酶是分泌到细胞外质中的酶，以游离的状态存在，可以直接通过取发酵液离心后的上清液测定酶活性。发酵液酶活性测定：发酵液离心取上清液，稀释后直接测定酶活。而胞内酶(endoenzyme)是在细胞内起催化作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布，通常通过液氮研磨、超声破碎等方法释放胞内酶进行蛋白定量、酶活性测定等。液氮研磨法：搜集菌体后，加入液氮研磨，用缓冲液溶解，低温离心，取上清，置冰上备用。超声破碎法：搜集菌体，加入缓冲液，用超声破碎仪进行低温超声破碎(破碎条件视材料而定)，低温离心，取上清，置冰上备用。
发酵液酶活性测定、液氮研磨法和超声破碎法均无法测出干巴菌所分泌的内切葡聚糖酶的酶活性，考虑所产酶既不是胞外酶，也不是胞内酶，而膜蛋白酶活性测定的参考方法较少。通过提取膜蛋白测定酶活性，不能保证提取的效果，并且成本相对较高。
发明内容
针对检测干巴菌中内切葡聚糖酶酶活性的技术问题，提供了一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，本发明方法能快速的、简便的测定干巴菌菌丝分泌的内切葡聚糖酶的酶活性。
酶活力定义：每g菌丝体在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位，结果以U/g表示。
一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，具体步骤如下：
(1)采用葡萄糖粉配制一系列梯度的质量浓度的葡萄糖溶液作为标准样；分别在标准样中加入等量的3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色不少于15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色标准样，显色标准样中加入等量的双蒸水混合均匀得到葡萄糖溶液标准样；
(2)以浓度为0mg/mL的葡萄糖溶液标准样调零，分别测定步骤(1)葡萄糖溶液标准样的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(3)以浓度(y)为纵坐标，吸光度A(x)为横坐标建立标准曲线，并拟合出浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式；
(4)采用蒸馏水洗净干巴菌菌丝，再用吸水纸吸尽水分即得干巴菌菌丝测定样，称重；取相等质量的干巴菌菌丝测定样煮沸处理不少于15min得干巴菌菌丝对照样；
(5)分别在对照管和待测管中加入羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液和双蒸水，在对照管中加入步骤(4)干巴菌菌丝对照样并混匀作为对照样，在待测管中加入相同质量的干巴菌菌丝测定样并混匀作为待测样；其中缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
(6)将步骤(5)的对照样和待测样同时置于温度为25～60℃条件下酶促反应30min，取出对照样和待测样并进行煮沸处理不少于15min得到对照样糖化液和待测样糖化液；
(7)分别取等量的步骤(6)对照样糖化液上清液和待测样糖化液上清液，加入3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色不少于15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A，分别在显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A中加入双蒸水混匀得到显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B；
(8)以蒸馏水调零，分别测定步骤(7)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(9)分别将步骤(8)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值A代入步骤(3)浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式得到对照样葡萄糖浓度和待测样葡萄糖浓度，待测样的相对葡萄糖浓度y＝待测样葡萄糖浓度-对照样葡萄糖浓度；
(10)将步骤(9)待测样的相对葡萄糖浓度y代入酶活力计算公式中计算得出待测样的酶活力值。
所述步骤(5)中对照管和待测管中羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液、双蒸水和干巴菌菌丝的加入量均相同，羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液和双蒸水的体积比为1:4:1，干巴菌菌丝与羧甲基纤维素钠溶液的固液比g:mL为(1.5～4):25。
所述步骤(5)中对照样和待测样酶促反应温度和时间相同，煮沸处理的时间相同。
所述步骤(1)中标准样、步骤(7)中对照样糖化液上清液和待测样糖化液上清液中3,5-二硝基水杨酸试剂的加入量相同。
进一步地，所述3,5-二硝基水杨酸试剂与标准样、糖化液上清液的体积比均为3:1。
所述步骤(1)中标准样、步骤(7)对照样糖化液和待测样糖化液煮沸时间相同。
所述步骤(1)标准样、步骤(7)中显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A中双蒸水的加入量相同。
进一步地，所述双蒸水与显色对照样糖化液A、显色待测样糖化液A的体积比均为21:1。
所述酶活力计算公式为
其中y为待测样的相对葡萄糖浓度；V反总为反应体系总体积mL；W为样本质量g；T为反应时间min。
羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液(醋酸-醋酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)、3,5-二硝基水杨酸试剂均为市购纤维素酶(CL)活性检测试剂盒产品，但是为了避免误差，同一次检测，需要采用同一厂家同一批次的纤维素酶(CL)活性检测试剂盒。
本发明的有益效果：
(1)本发明方法能够快速的测定干巴菌菌丝体分泌的内切葡聚糖酶的酶活性；
(2)本发明操作简单，成本较低；
(3)干巴菌的侵染率低，可能与纤维素酶的分泌有关系，本发明对于干巴菌的侵染具有重要的指导意义。
附图说明
图1为实施例2酶活性测定标准曲线；
图2为实施例2不同培养时间干巴菌菌丝体的内切葡聚糖酶的酶活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1：一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，具体步骤如下：
(1)采用葡萄糖粉配制一系列梯度的质量浓度的葡萄糖溶液作为标准样；分别在标准样中加入等量的3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色不少于15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色标准样，显色标准样中加入等量的双蒸水混合均匀得到葡萄糖溶液标准样；
(2)以浓度为0mg/mL的葡萄糖溶液标准样调零，分别测定步骤(1)葡萄糖溶液标准样的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(3)以浓度(y)为纵坐标，吸光度A(x)为横坐标建立标准曲线，并拟合出浓度(y)-吸光度A(x)关系表达式；采用R2代表实验数据与拟合函数表达式之间的吻合程度，R2越接近于1，吻合程度越高；
(4)采用蒸馏水洗净干巴菌菌丝，再采用吸水纸吸尽水分即得干巴菌菌丝测定样，天平称重；取相等质量的干巴菌菌丝测定样煮沸处理不少于15min得干巴菌菌丝对照样；
(5)分别在对照管和待测管中加入羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液(醋酸-醋酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)和双蒸水，在对照管中加入步骤(4)干巴菌菌丝对照样并混匀作为对照样，在待测管中加入相同质量的干巴菌菌丝测定样并混匀作为待测样；其中对照管和待测管中羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液、双蒸水和干巴菌菌丝的加入量均相同，羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液和双蒸水的体积比为1:4:1，干巴菌菌丝与羧甲基纤维素钠溶液的固液比g:mL为(1.5～4):25；
(6)将步骤(5)的对照样和待测样同时置于温度为25～60℃条件下酶促反应30min，取出对照样和待测样并进行煮沸处理不少于15min得到对照样糖化液和待测样糖化液；其中对照样和待测样酶促反应温度和时间相同，煮沸处理的时间相同；
(7)分别取等量的步骤(6)对照样糖化液上清液和待测样糖化液上清液，加入3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色不少于15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A，分别在显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A中加入双蒸水混匀得到显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B；其中步骤(1)标准样、对照样糖化液和待测样糖化液中3,5-二硝基水杨酸试剂的加入量相同，3,5-二硝基水杨酸试剂与标准样、糖化液上清液的体积比均为3:1；步骤(1)标准样、对照样糖化液和待测样糖化液煮沸时间相同；步骤(1)标准样、显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A中双蒸水的加入量相同，双蒸水与步骤(1)标准样、显色对照样糖化液A、显色待测样糖化液A的体积比均为21:1；
(8)以蒸馏水调零，分别测定步骤(7)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(9)分别将步骤(8)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值A代入步骤(3)浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式得到对照样葡萄糖浓度和待测样葡萄糖浓度，待测样的相对葡萄糖浓度y＝待测样葡萄糖浓度-对照样葡萄糖浓度；
(10)将步骤(9)待测样的相对葡萄糖浓度y代入酶活力计算公式中计算得出待测样的酶活力值；
其中酶活力计算公式为
其中y为待测样的相对葡萄糖浓度；V反总为反应体系总体积mL；W为样本质量g；T为反应时间min。
实施例2：一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，具体步骤如下：
(1)采用葡萄糖粉配制梯度的质量浓度1.6mg/mL、1.4mg/mL、1.2mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL和0.0mg/mL的葡萄糖溶液作为标准样；分别在50μL标准样中加入等量的150μL的3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色标准样，显色标准样中加入等量的1050μL双蒸水混合均匀得到葡萄糖溶液标准样；其中3,5-二硝基水杨酸试剂与标准样的体积比为3:1，双蒸水与标准样的体积比为21:1；
(2)以浓度为0mg/mL的葡萄糖溶液标准样调零，分别测定步骤(1)葡萄糖溶液标准样的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(3)以浓度(y)为纵坐标，吸光度A(x)为横坐标建立标准曲线(见图1)，并拟合出浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式：y＝0.13333x+0.0335，R2代表实验数据与拟合函数表达式之间的吻合程度，R2越接近于1，吻合程度越高；本实施例R2为0.9959，表明吻合程度较高，浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式(y＝0.13333x+0.0335)可靠可用；
(4)采用蒸馏水洗净干巴菌菌丝，再采用吸水纸吸尽水分即得干巴菌菌丝测定样，天平称重干巴菌菌丝质量为0.003g；取相等质量的干巴菌菌丝测定样煮沸处理15min得干巴菌菌丝对照样；
(5)分别在对照管和待测管中加入羧甲基纤维素钠溶液50μL、缓冲液(醋酸-醋酸钠缓冲液)200μL和双蒸水50μL，在对照管中加入步骤(4)干巴菌菌丝对照样并混匀作为对照样，在待测管中加入相同质量的干巴菌菌丝测定样并混匀作为待测样；其中对照管和待测管中羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液、双蒸水和干巴菌菌丝的加入量均相同，羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液和双蒸水的体积比为1:4:1，干巴菌菌丝与羧甲基纤维素钠溶液的固液比g:mL为1.5:25；
(6)将步骤(5)的对照样和待测样同时置于温度为40℃条件下酶促反应30min，取出对照样和待测样并进行煮沸处理15min得到对照样糖化液和待测样糖化液；
(7)取步骤(6)50μL的对照样糖化液上清液和50μL的待测样糖化液上清液，加入150μL3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A，分别在显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A中加入1050μL双蒸水混匀得到显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B；
(8)以蒸馏水调零，分别测定步骤(7)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(9)分别将步骤(8)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值A代入步骤(3)浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式得到对照样葡萄糖浓度和待测样葡萄糖浓度，待测样的相对葡萄糖浓度y＝待测样葡萄糖浓度-对照样葡萄糖浓度；
(10)将步骤(9)待测样的相对葡萄糖浓度y代入酶活力计算公式中计算得出待测样的酶活力值；
其中酶活力计算公式为
其中y为待测样的相对葡萄糖浓度；V反总为反应体系总体积mL；W为样本质量g；T为反应时间min；
干巴菌菌丝酶活性的测定结果见表1和图2，
表1不同培养时间干巴菌菌丝的酶活性
随着培养时间的增加，酶活性呈现先增加后减少的趋势，在培养14天时达到酶活性最大值为39.9990U/g；
根据文献“Measurement of cellulase activities”中的方法分别对干巴菌中内切葡聚糖酶酶活性进行测定，试剂采用实施例2相同的试剂；干巴菌发酵液方法测定的酶活性见表2，液氮研磨法测定的干巴菌菌丝的酶活性见表3；
表2干巴菌发酵液的酶活性
表3液氮研磨干巴菌菌丝的酶活性
经实验验证，使用干巴菌发酵液和通过液氮研磨干巴菌菌丝两种方法，在540nm处，测定管的吸光度值A与对照管非常接近，均无法测定出干巴菌中的内切葡聚糖酶的酶活力。

Claims (9)

1.一种干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)采用葡萄糖粉配制一系列梯度的质量浓度的葡萄糖溶液作为标准样；分别在标准样中加入等量的3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色不少于15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色标准样，显色标准样中加入等量的双蒸水混合均匀得到葡萄糖溶液标准样；
(2)以浓度为0mg/mL的葡萄糖溶液标准样调零，分别测定步骤(1)葡萄糖溶液标准样的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(3)以浓度(y)为纵坐标，吸光度A(x)为横坐标建立标准曲线，并拟合出浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式；
(4)采用蒸馏水洗净干巴菌菌丝，再用吸水纸吸尽水分即得干巴菌菌丝测定样，称重；取相等质量的干巴菌菌丝测定样煮沸处理不少于15min得干巴菌菌丝对照样；
(5)分别在对照管和待测管中加入羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液和双蒸水，在对照管中加入步骤(4)干巴菌菌丝对照样并混匀作为对照样，在待测管中加入相同质量的干巴菌菌丝测定样并混匀作为待测样；其中缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
(6)将步骤(5)的对照样和待测样同时置于温度为25～60℃条件下酶促反应30min，取出对照样和待测样并进行煮沸处理不少于15min得到对照样糖化液和待测样糖化液；
(7)分别取等量的步骤(6)对照样糖化液上清液和待测样糖化液上清液，加入3,5-二硝基水杨酸试剂并混合均匀，煮沸显色不少于15min，冰浴中快速冷却至室温得到显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A，分别在显色对照样糖化液A和显色待测样糖化液A中加入双蒸水混匀得到显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B；
(8)以蒸馏水调零，分别测定步骤(7)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值，记录波长540nm时的吸光度值A；
(9)分别将步骤(8)显色对照样糖化液B和显色待测样糖化液B的吸光度值A代入步骤(3)浓度(y)-吸光度A(x)函数关系表达式得到对照样葡萄糖浓度和待测样葡萄糖浓度，待测样的相对葡萄糖浓度y＝待测样葡萄糖浓度-对照样葡萄糖浓度；
(10)将步骤(9)待测样的相对葡萄糖浓度y代入酶活力计算公式中计算得出待测样的酶活力值。
2.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：步骤(5)中对照管和待测管中羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液、双蒸水和干巴菌菌丝的加入量均相同，羧甲基纤维素钠溶液、缓冲液和双蒸水的体积比为1:4:1，干巴菌菌丝与羧甲基纤维素钠溶液的固液比g:mL为(1.5～4):25。
3.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：步骤(5)中对照样和待测样酶促反应温度和时间相同，煮沸处理的时间相同。
4.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：步骤(1)标准样、步骤(7)对照样糖化液上清液和待测样糖化液上清液中3,5-二硝基水杨酸试剂的加入量相同。
5.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：3,5-二硝基水杨酸试剂与标准样、糖化液上清液的体积比均为3:1。
6.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：步骤(1)标准样、步骤(7)对照样糖化液和待测样糖化液煮沸时间相同。
7.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：步骤(1)标准样、步骤(7)对照样糖化液和待测样糖化液中双蒸水的加入量相同。
8.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：双蒸水与显色对照样糖化液A、显色待测样糖化液A的体积比均为21:1。
9.根据权利要求1所述干巴菌中内切葡聚糖酶酶活力的测定方法，其特征在于：酶活力计算公式为
其中y为待测样的相对葡萄糖浓度；V反总为反应体系总体积mL；W为样本质量g；T为反应时间min。
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